В естественных условиях Применение бесконтактного мечения на основе TurboID у Drosophila melanogaster

Традиционные методы картирования белок-белковых взаимодействий (ИПП), такие как аффинная очистка-масс-спектрометрия (AP-MS) и системы дрожжей-2-гибридов (Y2H), часто не могут охватить низкораспространенные, временно экспрессируемые или связанные с мембраной белки. Это ограничение возникает из-за их неспособности воспроизводить естественные физиологические условия живой клетки ^1,2,3. Для преодоления этих проблем PL стала мощным методом картирования протеома с высоким разрешением на суборганелльном уровне in vivo. PL использует слияние неразборчивого фермента с белком-приманкой, что позволяет ферменту катализировать образование короткоживущих реактивных молекул¹. Эти реактивные молекулы, такие как биотин, ковалентно помечают белки в пределах нескольких нанометров от гибридного белка⁴. Впоследствии биотинилированные белки выделяют и анализируют с помощью масс-спектрометрии, чтобы облегчить крупномасштабную идентификацию белков ^5,6.

За последние годы были разработаны различные ферменты, вызывающие неразборчивые половые связи, для совершенствования методов PL. Двумя широко используемыми ферментами являются мутантная биотинлигазаза R118G (BioID) на основе Escherichia coli и фермент 2 аскорбатпероксидаза 2 на основе гороха (APEX2). BioID преобразует биотин и АТФ в биотинил-5'-аденилат (bioAMP)¹. Эта реакционноспособная молекула ковалентно связывается с остатками лизина близлежащих белков в радиусе ± 10 нм. Ключевым преимуществом PL на основе BioID является использование биотина. Это встречающаяся в природе и нетоксичная биомолекула в живых организмах, что позволяет безопасно мечить in vivo ⁶. Однако BioID имеет ограничения, в том числе медленную кинетику мечения (18-24 ч) и требование высокой температуры (37 °C) для оптимальной каталитической^{активности.} Эти черты могут препятствовать его применению в изучении динамических биологических процессов. Между тем, APEX2 катализирует образование биотин-феноксильных радикалов в присутствии биотин-фенола и перекиси водорода (H₂O₂)⁷. Эти радикалы в основном реагируют с боковой цепью богатых электронами аминокислот, таких как тирозин, а также могут связывать цистеин, гистидин и триптофан⁸. Способность фермента пероксидазы к быстрому мечению (< 1 мин) подходит для захвата динамических и переходных ИПП⁹. Более того, он имеет более широкую дальность обнаружения (до 20 нм), чем биотинлигаза. Однако PL на основе APEX2 имеет свои недостатки, в том числе потребность в токсичном окислителе H₂O₂ и низкую проницаемость биотин-фенола, что ограничивает применимость in vivo¹⁰.

В 2018 году Branon et al. разработали новую биотин-лигазу под названием TurboID, мутантную версию BirA (биотин-лигазы, обнаруженной в E. coli) ^с массой 35 кДа. Этот фермент включает мутацию в положении R118 (R118S) вместе с 15 другими мутациями относительно BirA. Он проявляет в два раза более высокую каталитическую активность, чем BioID. Биотинилирование, индуцированное TurboID, за 10 мин дает протеомные данные с размером и специфичностью, сравнимыми с 18 ч мечения с помощью BioID. Кроме того, он демонстрирует отличную маркировочную активность при 30 °C⁴. Таким образом, TurboID больше подходит для применения у таких организмов, как дрозофила или Caenorhabditis elegans, которые обычно выращиваются при температуре 25 °C и 20 °C соответственно.

В этом исследовании мы стремимся использовать PL на основе TurboID для интерактомного исследования яичников дрозофилы. Описанные здесь протоколы используются для картирования интерактатома Zuc в клетках зародышевой линии. Zuc представляет собой эндонуклеазу, локализованную на внешней митохондриальной мембране (ОММ), которая опосредует биогенез пиРНК, малых некодирующих РНК, критически важных для поддержания целостности генома 11,12,13. Сравнивая биотинилированные белки, идентифицированные в результате анализа Zuc-TurboID, с белками из двух дополнительных контрольных белков, NES-TurboID и Tom20-TurboID, мы определили отдельных кандидатов, взаимодействующих с Zuc.

1. PL у взрослой мухи

1. Приготовление пищи с биотином
   1. Приготовьте 1 М раствор NaOH, разбавив 10 М раствора NaOH в тройной дистиллированной воде (TDW). Храните его при комнатной температуре (RT). Приготовьте 1 М раствор биотина, растворив 0,0049 г порошка биотина в 20 мл TDW. Добавьте 150-200 мкл 1 М NaOH для повышения растворимости биотина. Вортекс для гомогенизации раствора. Хранить исходный раствор биотина при температуре 4 °C.
   2. Достаньте из флакона корм от мух и поставьте его в микроволновую печь на 2 минуты, пока он не растает.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный корм для мух содержит 5% кукурузной муки, 3% дрожжей, 10% сахарозы, 1% агара, 0,3% пропионовой кислоты и 0,3% метил4-гидроксибензоата¹³.
   3. Добавьте бульон биотина в растопленный корм с конечной концентрацией 100 μМ, затем перемешайте путем вортексирования. Немедленно внесите 4,5 мл пищи с добавлением биотина в каждый пустой флакон с помощью серологической пипетки. Дайте пище остыть в течение 30 минут, наденьте ватный колпачок на флакон, затем храните биотин при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Биотин необходимо добавить до того, как пища остынет и затвердеет.
2. Кормление биотином
   1. Скрещивание трансгенных мух, которые сверхэкспрессируют гибридный белок TurboID, с тканевыми или клеткоспецифическими мухами GAL4 14,15,16. В качестве отрицательного контроля используйте скрещивание мушек дикого типа с мушками-драйверами GAL4, чтобы обеспечить отсутствие индукции биотинилирования.
   2. Примерно через 10 дней после скрещивания начнет вылупляться потомство. Сухой дрожжевой порошок растворить в TDW и размешать в однородную пасту. Нанесите лабораторную ложку дрожжевой пасты на стенку нового флакона. Осторожно постучите по старому флакону с только что вылупившимися мухами, чтобы собрать мух на дне. Переверните старый флакон на новый флакон с дрожжевой пастой, убедившись, что края обоих флаконов выровнены, чтобы предотвратить побег мух.
   3. Постучите по этим флаконам, чтобы перенести мух из старого флакона в нижнюю часть нового флакона. После того, как мухи будут перенесены, надежно наденьте ватные колпачки обратно на новые и старые флаконы. Подождите 3 дня. Дрожжевая паста может храниться при РТ в течение нескольких дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перенос мух должен быть выполнен как можно быстрее, потому что мухи будут оглушены только временно.
   4. Приготовьте 0,5% раствор пропионовой кислоты, разбавив 250 мкл пропионовой кислоты в 50 мл TDW. Храните его в RT.
   5. На^3-е сутки готовят 100 мкМ рабочий раствор биотина, разводя 1 М биотиновый запас в TDW, затем добавляют 500 мкл 0,5% пропионовой кислоты. Смешайте рабочий раствор биотина с сухим дрожжевым порошком и размешайте до образования пасты. Добавьте лабораторную ложку биотин-дрожжевой пасты на стенку пищевого флакона с биотином. Биотин-дрожжевая паста может храниться при РТ в течение нескольких дней.
   6. Разделите мух на две группы. Храните одну группу в обычном флаконе с пищей в качестве контроля, а другую группу переложите в пробирку с биотином (с добавлением биотин-дрожжевой пасты), чтобы начать биотинилирование. После 16 ч биотинилирования переложите мух в новый обычный флакон с пищей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее мы проводили тест на кормление биотином в течение 4, 8 и 16 часов. Сигнал биотинилирования был наиболее сильным после 16-часового кормления, поэтому мы выбрали эту временную точку для последующих экспериментов.
3. Сбор яичников дрозофилы
   1. Посадите мух в площадку для мух CO₂ , оставьте самок и выбросьте самцов. После того, как мухи будут должным образом обезболены (больше не двигаются), нанесите пипеткой 1 мл холодной среды для насекомых Grace на чашку для вскрытия.
   2. Поднесите муху к чашке для вскрытия с помощью щипцов с тонким концом и дайте ей погрузиться в среду. Придерживайте грудь мухи щипцами, будьте осторожны, чтобы не раздавить тело. Затем с помощью других щипцов аккуратно удалите кончик задней части живота (где находится гениталиевая часть).
   3. С помощью щипцов медленно выдавите яичники (начиная с верхней части живота вниз к нижней).
   4. Как только они выйдут, удалите мышечные сетки и другие ткани, которые окружают яичники. Будьте осторожны, чтобы не повредить завязи.
   5. Аккуратно переложите чистые яичники в трубку объемом 1,7 мл с помощью щипцов; Держите трубку на льду. Повторите шаги 1.3.2 - 1.3.4 для следующих мух.
   6. Вращайте пробирку при давлении 3 500 x g в течение 30 с при 4 °C, затем используйте наконечники для микропипеток для удаления оставшейся среды. Будьте осторожны и не прикасайтесь к яичникам.
   7. Заморозьте трубу жидким азотом, затем храните яичники при температуре -80 °C. Образцы яичников стабильны в течение 1 года.

2. Экспрессия трансгенов и определение биотинилированного белка методом вестерн-блоттинга

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа вестерн-блоттинга соберите около пяти пар яичников в образце.

1. Лизис тканей
   1. Разморозьте замерзшую ткань яичника. Добавьте 50 мкл буфера для лизиса RIPA (50 мМ Tris-HCl pH 8, 150 мМ NaCl, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), 0,5% дезоксихолата натрия, 1% Triton X-100), дополненный 1x коктейлем ингибитора протеазы (PI) и 1 мМ фенилметансульфонилфторида (PMSF). Храните буфер для лизиса RIPA (без 1x коктейля PI и 1 мМ PMSF) при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коктейль PI и PMSF следует добавлять только непосредственно перед экспериментом.
   2. Разрушьте завязи с помощью ручного гомогенизатора в сочетании с пластиковым пестиком (1 мин на трубку). Для обеспечения полного лизиса тканей на льду в течение 10 мин необходим процесс лизиса тканей с последующей гомогенизацией.
   3. Центрифугируйте при 13 500 x g в течение 10 минут при 4 °C для отделения лизата белка от мусора.
   4. Пипеткой нанесите прозрачный лизат белка в новую пробирку объемом 1,7 мл (избегайте взятия липидного слоя сверху), затем храните лизат при температуре -20 °C до дальнейшего использования.
2. Измерение концентрации белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (ВСЦ)
   1. Приготовьте рабочий реагент (WR) бицинхониновой кислоты (BCA), смешав реагент A и реагент B в соотношении 50:1. Смешайте 1 мкл лизата или разбавленного стандарта BSA с 200 мкл WR в 96-луночном планшете (в двух экземплярах), затем инкубируйте планшет при 37 °C в течение 30 минут.
      1. Рассчитайте, какой объем WR необходим, используя эту формулу:
         (# стандартов + # сэмплов) × (# повторяет) × (объем WR на сэмпл)
         Чтобы составить набор стандартов белка, готовят несколько разведений 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) в буфере для лизиса RIPA (без коктейля PI и PMSF) с конечными концентрациями 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 и 2000 мкг/мл.
   2. Измерьте поглощение с помощью считывателя микропланшетов на длине волны 495 нм. Постройте стандартную кривую на основе значений абсорбции BSA, затем определите концентрацию белка.
3. Вестерн-блоттинг
   1. Гель-электрофорез
      1. Добавьте 30-50 мкг белка лизата в 2x загрузочный буфер SDS. Добавьте TDW (при необходимости), чтобы получить окончательную концентрацию белка 2 мкг/мкл и конечную концентрацию 1x SDS, затем кипятите образец при 95 °C в течение 10 минут.
      2. Приготовьте рабочий буфер, смешав 25 мл буфера 20x MOPS с 500 мл TDW, чтобы получить 1x концентрацию рабочего буфера. Храните его в RT.
      3. Промойте лунки геля Bis-Tris 1 мл проточного буфера (3x), затем поместите гель Bis-Tris в камеру электрофореза. Заполните переднюю сторону камеры новым рабочим буфером до тех пор, пока все лунки не будут погружены в воду (± 250 мл). Заполните заднюю часть камеры использованным рабочим буфером (достаточно половины объема нового используемого рабочего буфера).
      4. Загрузите образец в гель Bis-Tris и используйте 4 мкл предварительно окрашенного белкового лестницы в качестве маркера. Проведите электрофорез (200 В, 30 мин). Извлеките гель из кассеты и смойте TDW.
   2. Мембранная промокательность
      1. Сделайте трансферный буфер, добавив 20 мл трансферного буфера (25x стоковый) и 50 мл метанола в 430 мл TDW.
      2. Разложите бутерброд, состоящий из промокательных салфеток, фильтровальной бумаги, геля и нитроцеллюлозной мембраны в блот-модуль. Перед укладкой нового слоя используйте валик для удаления пузырей.
      3. Установите блоттинг-модуль на передаточную камеру, затем заполните камеру 500 мл передаточного буфера. Перенос белков в течение 1 ч при 175 мА.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для переноса должен быть свежеприготовленным перед экспериментом.
   3. Блокировка
      1. Добавьте 5 мл Tween20 stock к 45 мл TDW, чтобы получить 10% исходный раствор Tween20. Растворите две таблетки фосфатно-солевого буфера (PBS) в 400 мл TDW. Удалите 4 мл раствора, затем добавьте 4 мл 10% Tween20 (конечная концентрация 0,1%), чтобы получить 1x раствор PBST. Храните его в RT.
      2. Удалите промокающую мембрану из передаточной камеры, затем промойте 1x PBST.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если мембрану необходимо инкубировать с различными антителами, разрежьте ее чистым лезвием из нержавеющей стали в соответствии с ожидаемым размером белка перед выполнением этапа блокирования.
      3. Чтобы проверить экспрессию генов, используйте 2% BSA в 1x PBST для этапа блокирования (1 ч, RT). Приготовьте 2% раствор БСА, добавив 1 г БСА в 50 мл 1x PBST. Для обнаружения биотинилированного белка выполните блокирование с использованием 3% BSA в 1x PBST (на ночь, 4 °C). Растворите 1,5 г порошка BSA в 50 мл 1x PBST до получения 3% раствора BSA. Храните блокирующие растворы при температуре 4 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый BSA отличается от используемого в анализе BCA. BSA для анализа BCA входит в набор BCA.
   4. Первичная инкубация антител
      1. Разведите 1 мкл α-V5 в 10 мл 2% BSA (1: 10 000) и 10 мкл гена α-HSP90 в 2% BSA (1: 1 000). Добавьте 2,7 мкл конъюгата стрептавидин-хренпероксидазы (SA-HRP) в 9 мл 1x раствора PBST для получения 0,3 мкг/мл раствора SA-HRP.
      2. Чтобы проверить экспрессию генов, инкубируйте мембрану с первичным антителом в течение ночи при температуре 4 °C. Для обнаружения биотинилированного белка инкубируйте мембрану в течение 1 ч при 4 °C. Храните первичные антитела при температуре 4 °C. Его можно использовать многократно.
      3. Промойте мембрану 1x PBST в течение 3x RT в течение 15 минут каждая.
   5. Вторичная инкубация антител
      1. Приготовьте вторичный раствор антитела, добавив 2 мкл IgG против коз или мышей (конъюгированная пероксидаза хрена (HRP)) в 10 мл 2% BSA (1: 5000).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для SA-HRP вторичное антитело не требуется. Переходим непосредственно к этапу визуализации. Вторичные антитела должны быть предварительно разведены перед экспериментом.
      2. Инкубировать мембрану в растворе вторичного антитела в течение 40 мин при РТ. Промыть мембрану 1x PBST в течение 3x при РТ в течение 15 мин каждая.
   6. Обнаружение белка методом усиленной хемилюминесценции (ECL)
      1. Смешайте 750 μL люминола и 750 μL раствора HRP (соотношение 1:1). Поддерживайте мембрану влажной в буфере для стирки во время приготовления смеси.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эта смесь должна быть свежеприготовленной перед экспериментом. Поскольку химические вещества чувствительны к свету, держите их подальше от солнечного света или других интенсивных источников света (кратковременное воздействие лабораторного освещения допустимо).
      2. Опустите мембрану в раствор на 30 с, затем поместите ее между прозрачными пластиковыми листами. Наблюдайте за промокшими белковыми полосами с помощью инструмента Chemidoc.

3. Валидация экспрессии и локализации трансгенов методом иммунофлуоресцентного окрашивания

Примечание: Чтобы проверить экспрессию и локализацию генов, препарируйте около пяти пар яичников на образец у 2-дневных самок, которых кормили дрожжевой пастой. Молодые яичники преимущественно содержат ранние стадии яйцеклеток, которые идеально подходят для иммунофлуоресцентного окрашивания из-за обилия клеток-кормилиц (клеток зародышевой линии) и их относительно проницаемых мембран¹⁷. Поздние стадии яйцевых камер более жесткие и труднопроходимые из-за формирования комплекса яичной скорлупы, которое начинается на стадии 9¹⁸. Для теста на биотинилирование белка препарируйте около пяти пар яичников на образец у 4-дневных самок, которых кормили биотином, как описано в шаге 1.2.

1. Подготовка образцов
   1. Удерживайте заднюю часть рассеченного яичника на месте с помощью щипцов. С помощью других щипцов аккуратно раздразните яичник на отдельные яйцекамеры. Работайте осторожно, чтобы не допустить разрыва яйцевых камер. Протокол изоляции яйцевой камеры был подробно описан в¹⁹. Осторожно издайте яйцевые камеры пипеткой в пробирку объемом 1,7 мл, затем промойте 1 мл 1x PBS (RT). Перед пипетированием обрежьте край кончиков пипетки, чтобы яйцевые камеры не застряли в кончиках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте камеры для яиц только на стадии ≤ 9 (прозрачные). Отбраковывайте зрелые ооциты и яйцекамеры поздней стадии ≥ 10. Пипетирование приведет к тому, что яйцевые камеры будут плавать в растворе. Поэтому дайте яйцевым камерам осесть на дне (в течение 5 минут), прежде чем приступать к следующим шагам.
2. Фиксация
   1. Разведите 3,125 мл 16% формальдегида (ЖК) в 6,875 мл 1x PBS до получения 5% раствора ЖК. Храните его в RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FA светочувствительна, поэтому держите ее подальше от света.
   2. Внесите пипеткой 1 мл 5% формальдегида (ЖК) в пробирку, содержащую ооциты. Поместите трубку на мультивращатель, затем зафиксируйте ооциты на 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: От фиксации до этапа ядерного окрашивания проводятся эксперименты с мультивращателем с мягким вращением.
   3. Приготовьте 0,5% Triton X-100 в 1x PBS (1x PBT) в качестве моющего раствора, добавив 10 мл 10% Triton X-100 в 190 мл 1x PBS. Храните его в RT.
   4. Промойте неподвижные камеры для яиц 1 раз, затем промойте 3 раза при температуре RT в течение 10 минут. Используйте 1 мл 1x PBT как для полоскания, так и для стирки.
3. Блокировка
   1. Приготовьте 5% фетальную бычью сыворотку (FBS), добавив 250 мкл FBS в 4,75 мл 1x PBT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор должен быть свежим перед экспериментом.
   2. Добавьте в пробирку 1 мл 5% FBS и выполните этап блокировки в течение 1 ч во время ОТ. Промойте ооциты 1 раз.
4. Первичная инкубация антител
   1. Для проверки экспрессии и локализации трансгена разведите 2 мкл α-V5 и 2 мкл α-ATP5A или α-Tom20 (в качестве митохондриального маркера) в 400 мкл 1x PBT (соотношение 1:200).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя два антитела могут быть использованы вместе для окрашивания одного образца, их хозяева должны быть разными. Это необходимо для того, чтобы избежать перекрывающегося связывания последующих вторичных антител.
   2. Инкубировать яйцевые камеры с 400 мкл разбавленного раствора первичного антитела (на ночь, 4 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подобно вестерн-блоттингу, первичные антитела можно использовать многократно для иммуноокрашивания. Прежде чем хранить раствор антител, убедитесь, что он не содержит яйцевых камер.
   3. Промыть яйцевые камеры 1 раз, после чего промыть 3 раза по RT в течение 10 минут.
5. Вторичная инкубация антител
   1. Разведите 2 мкл козьего α-Rb IgG Alexa Fluor 488 и 2 мкл козьего α-M IgG Alexa Fluor 594 в 400 мкл 1x PBT (соотношение 1:200). Инкубировать яйцевые камеры с 400 мкл разбавленного раствора вторичного антитела в течение 2 ч в режиме ЛТ. Для обнаружения биотинилирования добавьте 2 мкл стрептавидин-конъюгированного Alexa Fluor 594 в 1x PBT (соотношение 1:200) и инкубируйте вместе со вторичным антителом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе защищайте образец от света. Вторичные антитела должны быть предварительно разведены перед экспериментом. Несколько вторичных антител могут быть использованы вместе, но каждое первичное антитело должно быть отнесено к разным флуорофорам, которые также происходят от разных хозяев, чтобы избежать наложения сигналов. Например, 488 Goat α-Rb привяжется к кролику α-V5. Что касается мышиного α-ATP5A, то в качестве его комплементарного вторичного антитела используется 594 Goat α-M. В случае обнаружения биотинилирования следует отказаться от использования других красителей с той же длиной волны, что и конъюгат стрептавидина.
   2. Промыть яйцевые камеры 1 раз, после чего промыть 3 раза по RT в течение 10 минут.
6. Ядерное окрашивание
   1. Разведите 1 мкл DAPI в 1 мл 1x PBS (соотношение 1:1 000). Инкубировать яйцевые камеры с 1 мл разбавленного раствора DAPI в течение 5 мин при РТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI следует только что разбавить перед экспериментом.
   2. Промыть яйцевые камеры 1 раз, после чего промыть 3 раза по RT в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Камеры для яиц можно хранить в растворе 1x PBS при температуре 4 °C в течение нескольких часов перед монтажом, но рекомендуется приступить к этому как можно скорее.
7. Скользящее крепление
   1. Очистите предметное стекло безворсовой салфеткой, затем запишите на нем информацию о пробе. Удалите 1x PBS из пробирки, но оставьте небольшое количество, чтобы предотвратить сухость.
   2. Обрежьте край наконечников микропипетки, затем аккуратно направьте яйцекамеры пипетками на предметное стекло. С помощью щипцов аккуратно распределите яичные камеры на предметном стекле и не допускайте комков. Наблюдайте за предметными стеклами под микроскопом (достаточно 2-кратного увеличения), чтобы убедиться, что камеры с яйцами распределены равномерно.
   3. Удалите остатки PBS со предметного стекла с помощью микропипетки. Нанесите 15-30 μл раствора антивыцветания (светочувствительного) на предметное стекло и убедитесь, что он соприкасается со всеми камерами для яиц.
   4. С помощью щипцов удерживайте край крышки предметного стекла, затем поместите его поверх стеклянного предметного стекла (от одного края к другому) так, чтобы он закрывал камеры для яиц. Делайте это медленно, чтобы избежать появления пузырей. Промокните излишки раствора безворсовой салфеткой, затем запечатайте края покровного стекла лаком для ногтей. Дайте лаку как следует высохнуть (± 5 минут).
   5. Визуализируйте предметные стекла с помощью конфокального микроскопа. Хранить предметные стекла при температуре -20 °C.

4. Обогащение биотинилированными пептидами для масс-спектрометрического анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Для образца масс-спектрометрии необходимо около 3 мг белков. Поэтому рассеките около 100 пар завязей, чтобы получить это количество.

1. Лизис тканей
   1. Разморозьте замерзшую ткань яичника. Тем временем приготовьте 1x Трис-буферный солевой раствор (TBS), растворив 1 таблетку TBS в 500 мл TDW. Храните его в RT. Приготовьте 2% SDS в 1x TBS в качестве буфера для лизиса, разбавив 4 мл 10% SDS stock в 16 мл 1x TBS. Храните при RT. Храните при RT.
   2. Добавьте 500 мкл 2% SDS в 1x TBS (с добавлением 1x PI-коктейля) в пробирку, содержащую яичники. Подождите несколько минут, пока клетки лизируются и раствор станет липким.
   3. Дозатор лизат до 1 мл милитуба, содержащего волокно адаптивной сфокусированной акустики (AFA). Перед использованием вырежьте кончики пипетки. Для обеспечения эффективного ультразвукового исследования необходимо перекачивать не более 500 мкл лизата на пробирку.
   4. Выполнять ультразвуковую обработку при следующих условиях: пиковая падающая мощность 75 Вт, коэффициент заполнения 10%, циклы на всплеск 200, время 180 с, температура 6 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец необходимо подвергнуть ультразвуковой обработке несколько раз, установите несколько интервалов между ними, чтобы избежать выделения избыточного тепла.
2. Осаждение ацетона
   1. Переместите лизат в пробирку с низким уровнем связывания объемом 5 мл, затем добавьте в пробирку холодный ацетон в 6 раз больше объема образца. Например, добавьте 3 мл ацетона к 500 мкл лизата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием ацетон следует предварительно охладить до -20 °C.
   2. Вихревую трубку, загрузите ее в мультивращатель и инкубируйте в течение ночи (± 16 часов) при температуре -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это точка остановки, что означает, что эксперимент может быть на мгновение приостановлен после этого шага.
   3. Гранулы осаждали белки при 15 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, затем поверните трубку вниз при температуре 4 °C.
   4. Добавьте 2 мл раствора смеси, состоящего из 90% холодного ацетона и 10% 1x TBS. Пипеткой движением вверх-вниз смешайте гранулу и раствор. Перед использованием отрежьте кончики пипетки.
   5. Вортексную трубку, затем загрузите ее в мультивращатель и инкубируйте в течение 2 ч при -20 °C.
   6. Гранулированные белки при 15 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, затем поверните трубку вниз при температуре 4 °C. Откройте пробирку и высушите гранулу на воздухе в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не пересушивайте пеллеты, так как позже их будет трудно повторно суспендировать.
   7. Приготовьте 500 мМ стоковый раствор бикарбоната аммония (АВК), растворив 0,7906 г АВС в 20 мл TDW. Приготовьте рабочий раствор ABC 50 мМ, разбавив 3 мл стокового раствора ABC 500 мМ в 27 мл TDW.
   8. Приготовьте 8 М раствор мочевины, добавив 0,4805 г мочевины в 1 мл 50 мМ ABC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор мочевины должен быть свежеприготовлен перед экспериментом.
   9. Ресуспендируйте белковую гранулу в 500 мкл 8 М мочевины. Объем 8 М мочевины может быть уменьшен для увеличения концентрации белка.
   10. Перенесите ресуспендированный белок в 1 мл милитуба, содержащую волокно AFA, затем выполните ультразвук с теми же условиями, которые описаны в шаге 4.1.4.
   11. Проведите анализ БЦА для определения концентрации белка. Этот шаг является конечной точкой. Храните образец белка при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
3. Переваривание трипсина
   1. Смешайте 3 мг белков с TDW (при необходимости) в пробирке с низким связыванием объемом 5 мл, чтобы получить в общей сложности 500 мкл раствора.
   2. Денатурирует белки с помощью термоблока при 450 об/мин в течение 1 ч при 37 °C.
   3. Добавьте 5 мкл 1 М DTT (растворенного в TDW) в пробирку, чтобы получить конечную концентрацию 10 мМ DTT, затем восстановите белки с помощью термоблока при 450 об/мин в течение 1 ч при 37 °C.
   4. Приготовьте 400 мМ йодоацетамида, растворив 0,0111 г йодоацетамида в 150 мкл ABC. Добавьте в пробирку 55 мкл 400 мМ йодоацетамида (конечная концентрация 40 мМ), затем алкилатируйте белки с помощью термоблока при 450 об/мин в течение 1 ч при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Йодоацетамид чувствителен к свету, и все растворы йодоацетамида должны быть свежеприготовлены перед экспериментом.
   5. Разбавить образец добавлением 50 мМ раствора ABC до тех пор, пока общий объем не достигнет 4 мл. После разведения концентрация мочевины в растворе составляет около 1 М.
   6. Приготовьте 1 М раствор CaCl₂ , растворив 1,1098 г CaCl₂ в 10 мл TDW. Добавьте 4 мкл 1 М CaCl₂ в пробирку, чтобы получить конечную концентрацию 1 мМ, затем пипеткой вверх и вниз для гомогенизации раствора.
   7. Приготовьте стоковый раствор трипсина в дозе 1 мг/мл, добавив 0,001 г трипсина к 1 мл АВК. Добавьте в пробирку 150 мкл трипсина (соотношение трипсин: образец = 1:20). Переваривайте белок с помощью термоблока при 450 об/мин в течение 16 ч при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсин должен быть свежерастворенным перед экспериментом. Этот шаг является конечной точкой. Храните переваренные пептиды при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
4. Обогащение биотинилированными пептидами
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы для промывки и элюирования должны быть свежеприготовлены перед экспериментом.
   1. Приготовьте 2 М мочевину в растворе 1x TBS, добавив 1,2012 г мочевины в 10 мл 1x TBS.
   2. Используйте 150 мкл стрептавидин-конъюгированных магнитных шариков на образец дозой 3 мг. Промойте шарики стрептавидина 1 мл 2 М мочевины в 1 столовой ложке. Повторите этот шаг 4 раза. После каждой стирки поместите трубку на магнитную решетку на 1 минуту, затем выбросьте буфер для стирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать магнитные шарики Pierce Streptavidin, поскольку они минимизируют фоновые сигналы, подобные PEG, в результатах масс-спектрометрии.
   3. Нанесите пипеткой 1 мл расщепленных пептидов в пробирку, содержащую шарики, аккуратно перемешайте, а затем соедините смесь с оставшимся образцом в пробирке объемом 5 мл с низким связыванием. Поместите пробирку на мультивращатель и инкубируйте в течение 1 ч при РТ.
   4. Перелейте 1 мл смеси в пробирку объемом 1,5 мл и поместите ее на магнитный штатив на 1 минуту. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторяйте этот шаг, пока не соберутся все бусины.
   5. Приготовьте 2 М мочевину в 50 мМ ABC, растворив 0,7207 г мочевины в 6 мл 50 мМ ABC. Промойте шарики с 1 мл 2 М мочевины в 50 мМ 2 раза и с 1 мл TDW один раз. После каждой стирки поместите трубку на магнитную решетку на 1 минуту, затем выбросьте буфер для стирки.
   6. Приготовьте 10% исходный раствор муравьиной кислоты, растворив 1 мл муравьиной кислоты в 9 мл TDW. Приготовьте элюирующий буфер, состоящий из 80% ацетонитрила и 0,1% муравьиной кислоты в TDW. Например, смешайте 1,2 мл ацетонитрила, 15 мкл 10% муравьиной кислоты и 285 мкл TDW, чтобы получить 1,5 мл элюирующего буфера.
      ВНИМАНИЕ: Ацетонитрил и муравьиная кислота вредны из-за их летучих свойств, поэтому носите маску и будьте осторожны при обращении с ними.
   7. Внесите пипеткой 100 μл элюирующего буфера в пробирку, мягко гомогенизируйте, а затем элюируйте пептиды с помощью термоблока при 300 об/мин в течение 5 минут при 60 °C. После элюирования поместите пробирку на магнитный штатив и перенесите элюат в новую пробирку объемом 1,5 мл. Избегайте взятия бусин при переносе элюата. Повторите этот шаг 5 раз.
   8. Поместите пробирку, содержащую 500 μл элюата, на магнитный штатив на 5 минут, затем переложите ее в новую пробирку объемом 1,5 мл, чтобы обеспечить полное удаление шариков. Затем элюированные образцы можно высушить и использовать для масс-спектрометрического анализа.
   9. Для получения дополнительной информации об анализе ЖХ-МС/МС образцов обогащенных пептидов и обработке данных МС см. Nguyen et ^al.20.

Примеры выходных данных представлены на рисунке 1, рисунке 2, рисунке 3, рисунке 4 были ранее опубликованы Nguyen et al.20. На рисунке 1 показана экспериментальная процедура использования PL на основе TurboID в яичниках дрозофилы . Сначала была сгенерирована конструкция, объединяющая Zuc и TurboID (Zuc-V5-TurboID). Хорошо известные и отдельные суборганеллы-резиденты, а именно ядерный экспортный сигнал (NES) и транслоказная наружная митохондриальная мембрана (Tom20), также были слиты с TurboID (NES-V5-TurboID и Tom20-V5-TurboID). NES-V5-TurboID используется для биотинилирования цитозольных белков и функционирует как негативный контроль. В качестве положительного контроля Tom20-V5-TurboID помечает протеом OMM. Мухи с гиперэкспрессией этих трансгенов скрещивались с мухами matα-GAL4 для стимулирования экспрессии генов в клетках зародышевой линии. Потомков кормили биотином в течение 16 ч для инициации ЛП; Затем их яичники были рассечены и подвергнуты различным анализам. На рисунке 2 представлен результат эксперимента, описанный в разделе 2 протокола. Обнаружение антител V5 показывает, что трансгены хорошо экспрессируются в яичнике, как с дополнительным биотином, так и без него. Кроме того, присутствие экзогенного биотина усиливает способность трансгенов к биотинилированию белков, как описано в SA-HRP. Результаты вестерн-блоттинга были дополнительно подтверждены иммунофлуоресцентным окрашиванием яичников (рис. 3). Конфокальные изображения показали сильную перекрывающуюся экспрессию между трансгенами и проксимальными белками после кормления биотином, что было зафиксировано антителом V5 и стрептавидин-конъюгированным Alexa Fluor 594 соответственно. Данные протеома Zuc-V5-TurboID, полученные в ходе масс-спектрометрического анализа, были дополнительно охарактеризованы проведением онтологического анализа генов (GO). Обогащенные биотинилированные белки участвуют в различных биологических процессах, начиная от шаперон-опосредованного сворачивания белка и организации эндомембранных систем до регуляции эндоплазматического ретикулума (ER) и опосредованного Гольджи-везикулой транспорта (рис. 4).

Рисунок 1: Стратегия PL на основе TurboID у яичников дрозофилы. Сокращения: POI = Белок, представляющий интерес. Мечение биотина проводили в течение 0 или 16 ч. Эта цифра была изменена с20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Вестерн-блоттинг для подтверждения экспрессии трансгенов и паттернов биотинилированных белков в клетках зародышевой линии. Экспрессия NES-, Tom20- и Zuc-V5-TurboID была обнаружена антителами V5 при 36, 56 и 65 кДа соответственно, как указано черными стрелками. Блоттинг SA-HRP показал более сильные и разнообразные сигналы биотинилирования в группах трансгенов, чем в контрольной группе. В группах трансгенов активность биотинилирования увеличивалась после 16 ч добавления экзогенного биотина по сравнению с состоянием без добавления биотина. HSP90 используется в качестве регулятора загрузки. Эта цифра была изменена с20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Конфокальные изображения совместной экспрессии трансгенов и проксимальных биотинилированных белков в клетках зародышевой линии. Окрашивание с использованием антитела V5 и конъюгированного вторичного антитела Alexa Fluor 488 (зеленого цвета) показало, что NES-V5-TurboID равномерно распределяется по всей цитоплазме. Экспрессия Zuc-V5-TurboID была более концентрирована в митохондриях, подобно экспрессии Tom20-V5-TurboID. Окрашивание стрептавидин-конъюгированным Alexa Fluor 594 (красным) подтвердило активность биотинилирования. TurboID может активировать биотинилирование белка в определенных местах в клетках зародышевой линии, о чем свидетельствует перекрывающийся сигнал между слитыми с TurboID белками и проксимальными биотинилированными белками (желтый). DAPI (синий) использовался для ядерного окрашивания. Масштабные линейки: 20 μм. Эта цифра была изменена с20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Роль обогащенного протеома Zuc-V5-TurboID в биологических процессах с помощью анализа GO. Карта взаимодействия изображает несколько обогащенных биотинилированных белков в качестве кандидатов во взаимодействующие партнеры Zuc. Узлы одного и того же цвета связывают кандидатов и их предсказанные функции. Размер узла представляет собой уровень значимости. Потенциальные партнеры, взаимодействующие с Zuc, в основном занимаются шаперон-опосредованным сворачиванием белка, организацией эндомембранных систем и регуляцией переноса ER в Гольджи-везикул-опосредованный транспорт. Эта цифра была изменена с20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.