Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В естественных условиях Применение бесконтактного мечения на основе TurboID у Drosophila melanogaster

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68193

⸱

13 июня 2025 г.

 , 
1Soonchunhyang Institute of Medi-bio-Science, Soonchunhyang University, 2Department of Integrated Biomedical Science, Soonchunhyang University

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании мы разработали подробный протокол для бесконтактного мечения (PL) на основе TurboID в яичниках D. melanogaster , охватывающий этапы от приема добавок биотина и рассечения яичников до валидации экспрессии трансгенов и обогащения биотинилированных пептидов для масс-спектрометрии.

Аннотация

Бесконтактное мечение (PL) является мощным методом картирования сетей белок-белковых взаимодействий. Достижения в области маркировки ферментов, особенно TurboID, расширили его использование в биологических системах. TurboID особенно выгоден для применения in vivo благодаря своей надежности, нетоксичности и простоте использования. Этот фермент беспорядочно биотинилирует близлежащие биомолекулы, включая белки и нуклеиновые кислоты, в диапазоне примерно 10 нм в присутствии биотина. Мы применили этот метод для исследования интерактома кабачков (Zuc), ключевого фактора биогенеза пиви-взаимодействующей РНК (пиРНК) на внешней митохондриальной мембране (ОММ) в клетках зародышевой линии яичника Drosophila melanogaster . Экспрессируя Zuc-TurboID в половых клетках и добавляя биотин, мы индуцировали биотинилирование проксимальных белков Zuc. Масс-спектрометрический анализ после обогащения биотинилированными пептидами идентифицировал белки в непосредственной близости от Zuc, в том числе хорошо известных интеракторов в биогенезе piRNA. Интересно, что мы обнаружили новых интеракторов Zuc, участвующих в сворачивании белка, организации мембран и транспортировке везикул.

Введение

Традиционные методы картирования белок-белковых взаимодействий (ИПП), такие как аффинная очистка-масс-спектрометрия (AP-MS) и системы дрожжей-2-гибридов (Y2H), часто не могут охватить низкораспространенные, временно экспрессируемые или связанные с мембраной белки. Это ограничение возникает из-за их неспособности воспроизводить естественные физиологические условия живой клетки 1,2,3. Для преодоления этих проблем PL стала мощным методом картирования протеома с высоким разрешением на суборганелльном уровне in vivo. PL использует слияние неразборчивого фермента с белком-приманкой, что позволяет ферменту катализировать образование короткоживущих реактивных молекул1. Эти реактивные молекулы, такие как биотин, ковалентно помечают белки в пределах нескольких нанометров от гибридного белка4. Впоследствии биотинилированные белки выделяют и анализируют с помощью масс-спектрометрии, чтобы облегчить крупномасштабную идентификацию белков 5,6.

За последние годы были разработаны различные ферменты, вызывающие неразборчивые половые связи, для совершенствования методов PL. Двумя широко используемыми ферментами являются мутантная биотинлигазаза R118G (BioID) на основе Escherichia coli и фермент 2 аскорбатпероксидаза 2 на основе гороха (APEX2). BioID преобразует биотин и АТФ в биотинил-5'-аденилат (bioAMP)1. Эта реакционноспособная молекула ковалентно связывается с остатками лизина близлежащих белков в радиусе ± 10 нм. Ключевым преимуществом PL на основе BioID является использование биотина. Это встречающаяся в природе и нетоксичная биомолекула в живых организмах, что позволяет безопасно мечить in vivo 6. Однако BioID имеет ограничения, в том числе медленную кинетику мечения (18-24 ч) и требование высокой температуры (37 °C) для оптимальной каталитическойактивности. Эти черты могут препятствовать его применению в изучении динамических биологических процессов. Между тем, APEX2 катализирует образование биотин-феноксильных радикалов в присутствии биотин-фенола и перекиси водорода (H2O2)7. Эти радикалы в основном реагируют с боковой цепью богатых электронами аминокислот, таких как тирозин, а также могут связывать цистеин, гистидин и триптофан8. Способность фермента пероксидазы к быстрому мечению (< 1 мин) подходит для захвата динамических и переходных ИПП9. Более того, он имеет более широкую дальность обнаружения (до 20 нм), чем биотинлигаза. Однако PL на основе APEX2 имеет свои недостатки, в том числе потребность в токсичном окислителе H2O2 и низкую проницаемость биотин-фенола, что ограничивает применимость in vivo10.

В 2018 году Branon et al. разработали новую биотин-лигазу под названием TurboID, мутантную версию BirA (биотин-лигазы, обнаруженной в E. coli) с массой 35 кДа. Этот фермент включает мутацию в положении R118 (R118S) вместе с 15 другими мутациями относительно BirA. Он проявляет в два раза более высокую каталитическую активность, чем BioID. Биотинилирование, индуцированное TurboID, за 10 мин дает протеомные данные с размером и специфичностью, сравнимыми с 18 ч мечения с помощью BioID. Кроме того, он демонстрирует отличную маркировочную активность при 30 °C4. Таким образом, TurboID больше подходит для применения у таких организмов, как дрозофила или Caenorhabditis elegans, которые обычно выращиваются при температуре 25 °C и 20 °C соответственно.

В этом исследовании мы стремимся использовать PL на основе TurboID для интерактомного исследования яичников дрозофилы. Описанные здесь протоколы используются для картирования интерактатома Zuc в клетках зародышевой линии. Zuc представляет собой эндонуклеазу, локализованную на внешней митохондриальной мембране (ОММ), которая опосредует биогенез пиРНК, малых некодирующих РНК, критически важных для поддержания целостности генома 11,12,13. Сравнивая биотинилированные белки, идентифицированные в результате анализа Zuc-TurboID, с белками из двух дополнительных контрольных белков, NES-TurboID и Tom20-TurboID, мы определили отдельных кандидатов, взаимодействующих с Zuc.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. PL у взрослой мухи

  1. Приготовление пищи с биотином
    1. Приготовьте 1 М раствор NaOH, разбавив 10 М раствора NaOH в тройной дистиллированной воде (TDW). Храните его при комнатной температуре (RT). Приготовьте 1 М раствор биотина, растворив 0,0049 г порошка биотина в 20 мл TDW. Добавьте 150-200 мкл 1 М NaOH для повышения растворимости биотина. Вортекс для гомогенизации раствора. Хранить исходный раствор биотина при температуре 4 °C.
    2. Достаньте из флакона корм от мух и поставьте его в микроволновую печь на 2 минуты, пока он не растает.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный корм для мух содержит 5% кукурузной муки, 3% дрожжей, 10% сахарозы, 1% агара, 0,3% пропионовой кислоты и 0,3% метил4-гидроксибензоата13.
    3. Добавьте бульон биотина в растопленный корм с конечной концентрацией 100 μМ, затем перемешайте путем вортексирования. Немедленно внесите 4,5 мл пищи с добавлением биотина в каждый пустой флакон с помощью серологической пипетки. Дайте пище остыть в течение 30 минут, наденьте ватный колпачок на флакон, затем храните биотин при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Биотин необходимо добавить до того, как пища остынет и затвердеет.
  2. Кормление биотином
    1. Скрещивание трансгенных мух, которые сверхэкспрессируют гибридный белок TurboID, с тканевыми или клеткоспецифическими мухами GAL4 14,15,16. В качестве отрицательного контроля используйте скрещивание мушек дикого типа с мушками-драйверами GAL4, чтобы обеспечить отсутствие индукции биотинилирования.
    2. Примерно через 10 дней после скрещивания начнет вылупляться потомство. Сухой дрожжевой порошок растворить в TDW и размешать в однородную пасту. Нанесите лабораторную ложку дрожжевой пасты на стенку нового флакона. Осторожно постучите по старому флакону с только что вылупившимися мухами, чтобы собрать мух на дне. Переверните старый флакон на новый флакон с дрожжевой пастой, убедившись, что края обоих флаконов выровнены, чтобы предотвратить побег мух.
    3. Постучите по этим флаконам, чтобы перенести мух из старого флакона в нижнюю часть нового флакона. После того, как мухи будут перенесены, надежно наденьте ватные колпачки обратно на новые и старые флаконы. Подождите 3 дня. Дрожжевая паста может храниться при РТ в течение нескольких дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перенос мух должен быть выполнен как можно быстрее, потому что мухи будут оглушены только временно.
    4. Приготовьте 0,5% раствор пропионовой кислоты, разбавив 250 мкл пропионовой кислоты в 50 мл TDW. Храните его в RT.
    5. На3-е сутки готовят 100 мкМ рабочий раствор биотина, разводя 1 М биотиновый запас в TDW, затем добавляют 500 мкл 0,5% пропионовой кислоты. Смешайте рабочий раствор биотина с сухим дрожжевым порошком и размешайте до образования пасты. Добавьте лабораторную ложку биотин-дрожжевой пасты на стенку пищевого флакона с биотином. Биотин-дрожжевая паста может храниться при РТ в течение нескольких дней.
    6. Разделите мух на две группы. Храните одну группу в обычном флаконе с пищей в качестве контроля, а другую группу переложите в пробирку с биотином (с добавлением биотин-дрожжевой пасты), чтобы начать биотинилирование. После 16 ч биотинилирования переложите мух в новый обычный флакон с пищей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее мы проводили тест на кормление биотином в течение 4, 8 и 16 часов. Сигнал биотинилирования был наиболее сильным после 16-часового кормления, поэтому мы выбрали эту временную точку для последующих экспериментов.
  3. Сбор яичников дрозофилы
    1. Посадите мух в площадку для мух CO2 , оставьте самок и выбросьте самцов. После того, как мухи будут должным образом обезболены (больше не двигаются), нанесите пипеткой 1 мл холодной среды для насекомых Grace на чашку для вскрытия.
    2. Поднесите муху к чашке для вскрытия с помощью щипцов с тонким концом и дайте ей погрузиться в среду. Придерживайте грудь мухи щипцами, будьте осторожны, чтобы не раздавить тело. Затем с помощью других щипцов аккуратно удалите кончик задней части живота (где находится гениталиевая часть).
    3. С помощью щипцов медленно выдавите яичники (начиная с верхней части живота вниз к нижней).
    4. Как только они выйдут, удалите мышечные сетки и другие ткани, которые окружают яичники. Будьте осторожны, чтобы не повредить завязи.
    5. Аккуратно переложите чистые яичники в трубку объемом 1,7 мл с помощью щипцов; Держите трубку на льду. Повторите шаги 1.3.2 - 1.3.4 для следующих мух.
    6. Вращайте пробирку при давлении 3 500 x g в течение 30 с при 4 °C, затем используйте наконечники для микропипеток для удаления оставшейся среды. Будьте осторожны и не прикасайтесь к яичникам.
    7. Заморозьте трубу жидким азотом, затем храните яичники при температуре -80 °C. Образцы яичников стабильны в течение 1 года.

2. Экспрессия трансгенов и определение биотинилированного белка методом вестерн-блоттинга

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа вестерн-блоттинга соберите около пяти пар яичников в образце.

  1. Лизис тканей
    1. Разморозьте замерзшую ткань яичника. Добавьте 50 мкл буфера для лизиса RIPA (50 мМ Tris-HCl pH 8, 150 мМ NaCl, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), 0,5% дезоксихолата натрия, 1% Triton X-100), дополненный 1x коктейлем ингибитора протеазы (PI) и 1 мМ фенилметансульфонилфторида (PMSF). Храните буфер для лизиса RIPA (без 1x коктейля PI и 1 мМ PMSF) при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коктейль PI и PMSF следует добавлять только непосредственно перед экспериментом.
    2. Разрушьте завязи с помощью ручного гомогенизатора в сочетании с пластиковым пестиком (1 мин на трубку). Для обеспечения полного лизиса тканей на льду в течение 10 мин необходим процесс лизиса тканей с последующей гомогенизацией.
    3. Центрифугируйте при 13 500 x g в течение 10 минут при 4 °C для отделения лизата белка от мусора.
    4. Пипеткой нанесите прозрачный лизат белка в новую пробирку объемом 1,7 мл (избегайте взятия липидного слоя сверху), затем храните лизат при температуре -20 °C до дальнейшего использования.
  2. Измерение концентрации белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (ВСЦ)
    1. Приготовьте рабочий реагент (WR) бицинхониновой кислоты (BCA), смешав реагент A и реагент B в соотношении 50:1. Смешайте 1 мкл лизата или разбавленного стандарта BSA с 200 мкл WR в 96-луночном планшете (в двух экземплярах), затем инкубируйте планшет при 37 °C в течение 30 минут.
      1. Рассчитайте, какой объем WR необходим, используя эту формулу:
        (# стандартов + # сэмплов) × (# повторяет) × (объем WR на сэмпл)
        Чтобы составить набор стандартов белка, готовят несколько разведений 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) в буфере для лизиса RIPA (без коктейля PI и PMSF) с конечными концентрациями 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 и 2000 мкг/мл.
    2. Измерьте поглощение с помощью считывателя микропланшетов на длине волны 495 нм. Постройте стандартную кривую на основе значений абсорбции BSA, затем определите концентрацию белка.
  3. Вестерн-блоттинг
    1. Гель-электрофорез
      1. Добавьте 30-50 мкг белка лизата в 2x загрузочный буфер SDS. Добавьте TDW (при необходимости), чтобы получить окончательную концентрацию белка 2 мкг/мкл и конечную концентрацию 1x SDS, затем кипятите образец при 95 °C в течение 10 минут.
      2. Приготовьте рабочий буфер, смешав 25 мл буфера 20x MOPS с 500 мл TDW, чтобы получить 1x концентрацию рабочего буфера. Храните его в RT.
      3. Промойте лунки геля Bis-Tris 1 мл проточного буфера (3x), затем поместите гель Bis-Tris в камеру электрофореза. Заполните переднюю сторону камеры новым рабочим буфером до тех пор, пока все лунки не будут погружены в воду (± 250 мл). Заполните заднюю часть камеры использованным рабочим буфером (достаточно половины объема нового используемого рабочего буфера).
      4. Загрузите образец в гель Bis-Tris и используйте 4 мкл предварительно окрашенного белкового лестницы в качестве маркера. Проведите электрофорез (200 В, 30 мин). Извлеките гель из кассеты и смойте TDW.
    2. Мембранная промокательность
      1. Сделайте трансферный буфер, добавив 20 мл трансферного буфера (25x стоковый) и 50 мл метанола в 430 мл TDW.
      2. Разложите бутерброд, состоящий из промокательных салфеток, фильтровальной бумаги, геля и нитроцеллюлозной мембраны в блот-модуль. Перед укладкой нового слоя используйте валик для удаления пузырей.
      3. Установите блоттинг-модуль на передаточную камеру, затем заполните камеру 500 мл передаточного буфера. Перенос белков в течение 1 ч при 175 мА.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для переноса должен быть свежеприготовленным перед экспериментом.
    3. Блокировка
      1. Добавьте 5 мл Tween20 stock к 45 мл TDW, чтобы получить 10% исходный раствор Tween20. Растворите две таблетки фосфатно-солевого буфера (PBS) в 400 мл TDW. Удалите 4 мл раствора, затем добавьте 4 мл 10% Tween20 (конечная концентрация 0,1%), чтобы получить 1x раствор PBST. Храните его в RT.
      2. Удалите промокающую мембрану из передаточной камеры, затем промойте 1x PBST.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если мембрану необходимо инкубировать с различными антителами, разрежьте ее чистым лезвием из нержавеющей стали в соответствии с ожидаемым размером белка перед выполнением этапа блокирования.
      3. Чтобы проверить экспрессию генов, используйте 2% BSA в 1x PBST для этапа блокирования (1 ч, RT). Приготовьте 2% раствор БСА, добавив 1 г БСА в 50 мл 1x PBST. Для обнаружения биотинилированного белка выполните блокирование с использованием 3% BSA в 1x PBST (на ночь, 4 °C). Растворите 1,5 г порошка BSA в 50 мл 1x PBST до получения 3% раствора BSA. Храните блокирующие растворы при температуре 4 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый BSA отличается от используемого в анализе BCA. BSA для анализа BCA входит в набор BCA.
    4. Первичная инкубация антител
      1. Разведите 1 мкл α-V5 в 10 мл 2% BSA (1: 10 000) и 10 мкл гена α-HSP90 в 2% BSA (1: 1 000). Добавьте 2,7 мкл конъюгата стрептавидин-хренпероксидазы (SA-HRP) в 9 мл 1x раствора PBST для получения 0,3 мкг/мл раствора SA-HRP.
      2. Чтобы проверить экспрессию генов, инкубируйте мембрану с первичным антителом в течение ночи при температуре 4 °C. Для обнаружения биотинилированного белка инкубируйте мембрану в течение 1 ч при 4 °C. Храните первичные антитела при температуре 4 °C. Его можно использовать многократно.
      3. Промойте мембрану 1x PBST в течение 3x RT в течение 15 минут каждая.
    5. Вторичная инкубация антител
      1. Приготовьте вторичный раствор антитела, добавив 2 мкл IgG против коз или мышей (конъюгированная пероксидаза хрена (HRP)) в 10 мл 2% BSA (1: 5000).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для SA-HRP вторичное антитело не требуется. Переходим непосредственно к этапу визуализации. Вторичные антитела должны быть предварительно разведены перед экспериментом.
      2. Инкубировать мембрану в растворе вторичного антитела в течение 40 мин при РТ. Промыть мембрану 1x PBST в течение 3x при РТ в течение 15 мин каждая.
    6. Обнаружение белка методом усиленной хемилюминесценции (ECL)
      1. Смешайте 750 μL люминола и 750 μL раствора HRP (соотношение 1:1). Поддерживайте мембрану влажной в буфере для стирки во время приготовления смеси.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эта смесь должна быть свежеприготовленной перед экспериментом. Поскольку химические вещества чувствительны к свету, держите их подальше от солнечного света или других интенсивных источников света (кратковременное воздействие лабораторного освещения допустимо).
      2. Опустите мембрану в раствор на 30 с, затем поместите ее между прозрачными пластиковыми листами. Наблюдайте за промокшими белковыми полосами с помощью инструмента Chemidoc.

3. Валидация экспрессии и локализации трансгенов методом иммунофлуоресцентного окрашивания

Примечание: Чтобы проверить экспрессию и локализацию генов, препарируйте около пяти пар яичников на образец у 2-дневных самок, которых кормили дрожжевой пастой. Молодые яичники преимущественно содержат ранние стадии яйцеклеток, которые идеально подходят для иммунофлуоресцентного окрашивания из-за обилия клеток-кормилиц (клеток зародышевой линии) и их относительно проницаемых мембран17. Поздние стадии яйцевых камер более жесткие и труднопроходимые из-за формирования комплекса яичной скорлупы, которое начинается на стадии 918. Для теста на биотинилирование белка препарируйте около пяти пар яичников на образец у 4-дневных самок, которых кормили биотином, как описано в шаге 1.2.

  1. Подготовка образцов
    1. Удерживайте заднюю часть рассеченного яичника на месте с помощью щипцов. С помощью других щипцов аккуратно раздразните яичник на отдельные яйцекамеры. Работайте осторожно, чтобы не допустить разрыва яйцевых камер. Протокол изоляции яйцевой камеры был подробно описан в19. Осторожно издайте яйцевые камеры пипеткой в пробирку объемом 1,7 мл, затем промойте 1 мл 1x PBS (RT). Перед пипетированием обрежьте край кончиков пипетки, чтобы яйцевые камеры не застряли в кончиках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте камеры для яиц только на стадии ≤ 9 (прозрачные). Отбраковывайте зрелые ооциты и яйцекамеры поздней стадии ≥ 10. Пипетирование приведет к тому, что яйцевые камеры будут плавать в растворе. Поэтому дайте яйцевым камерам осесть на дне (в течение 5 минут), прежде чем приступать к следующим шагам.
  2. Фиксация
    1. Разведите 3,125 мл 16% формальдегида (ЖК) в 6,875 мл 1x PBS до получения 5% раствора ЖК. Храните его в RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FA светочувствительна, поэтому держите ее подальше от света.
    2. Внесите пипеткой 1 мл 5% формальдегида (ЖК) в пробирку, содержащую ооциты. Поместите трубку на мультивращатель, затем зафиксируйте ооциты на 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: От фиксации до этапа ядерного окрашивания проводятся эксперименты с мультивращателем с мягким вращением.
    3. Приготовьте 0,5% Triton X-100 в 1x PBS (1x PBT) в качестве моющего раствора, добавив 10 мл 10% Triton X-100 в 190 мл 1x PBS. Храните его в RT.
    4. Промойте неподвижные камеры для яиц 1 раз, затем промойте 3 раза при температуре RT в течение 10 минут. Используйте 1 мл 1x PBT как для полоскания, так и для стирки.
  3. Блокировка
    1. Приготовьте 5% фетальную бычью сыворотку (FBS), добавив 250 мкл FBS в 4,75 мл 1x PBT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор должен быть свежим перед экспериментом.
    2. Добавьте в пробирку 1 мл 5% FBS и выполните этап блокировки в течение 1 ч во время ОТ. Промойте ооциты 1 раз.
  4. Первичная инкубация антител
    1. Для проверки экспрессии и локализации трансгена разведите 2 мкл α-V5 и 2 мкл α-ATP5A или α-Tom20 (в качестве митохондриального маркера) в 400 мкл 1x PBT (соотношение 1:200).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя два антитела могут быть использованы вместе для окрашивания одного образца, их хозяева должны быть разными. Это необходимо для того, чтобы избежать перекрывающегося связывания последующих вторичных антител.
    2. Инкубировать яйцевые камеры с 400 мкл разбавленного раствора первичного антитела (на ночь, 4 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подобно вестерн-блоттингу, первичные антитела можно использовать многократно для иммуноокрашивания. Прежде чем хранить раствор антител, убедитесь, что он не содержит яйцевых камер.
    3. Промыть яйцевые камеры 1 раз, после чего промыть 3 раза по RT в течение 10 минут.
  5. Вторичная инкубация антител
    1. Разведите 2 мкл козьего α-Rb IgG Alexa Fluor 488 и 2 мкл козьего α-M IgG Alexa Fluor 594 в 400 мкл 1x PBT (соотношение 1:200). Инкубировать яйцевые камеры с 400 мкл разбавленного раствора вторичного антитела в течение 2 ч в режиме ЛТ. Для обнаружения биотинилирования добавьте 2 мкл стрептавидин-конъюгированного Alexa Fluor 594 в 1x PBT (соотношение 1:200) и инкубируйте вместе со вторичным антителом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе защищайте образец от света. Вторичные антитела должны быть предварительно разведены перед экспериментом. Несколько вторичных антител могут быть использованы вместе, но каждое первичное антитело должно быть отнесено к разным флуорофорам, которые также происходят от разных хозяев, чтобы избежать наложения сигналов. Например, 488 Goat α-Rb привяжется к кролику α-V5. Что касается мышиного α-ATP5A, то в качестве его комплементарного вторичного антитела используется 594 Goat α-M. В случае обнаружения биотинилирования следует отказаться от использования других красителей с той же длиной волны, что и конъюгат стрептавидина.
    2. Промыть яйцевые камеры 1 раз, после чего промыть 3 раза по RT в течение 10 минут.
  6. Ядерное окрашивание
    1. Разведите 1 мкл DAPI в 1 мл 1x PBS (соотношение 1:1 000). Инкубировать яйцевые камеры с 1 мл разбавленного раствора DAPI в течение 5 мин при РТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI следует только что разбавить перед экспериментом.
    2. Промыть яйцевые камеры 1 раз, после чего промыть 3 раза по RT в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Камеры для яиц можно хранить в растворе 1x PBS при температуре 4 °C в течение нескольких часов перед монтажом, но рекомендуется приступить к этому как можно скорее.
  7. Скользящее крепление
    1. Очистите предметное стекло безворсовой салфеткой, затем запишите на нем информацию о пробе. Удалите 1x PBS из пробирки, но оставьте небольшое количество, чтобы предотвратить сухость.
    2. Обрежьте край наконечников микропипетки, затем аккуратно направьте яйцекамеры пипетками на предметное стекло. С помощью щипцов аккуратно распределите яичные камеры на предметном стекле и не допускайте комков. Наблюдайте за предметными стеклами под микроскопом (достаточно 2-кратного увеличения), чтобы убедиться, что камеры с яйцами распределены равномерно.
    3. Удалите остатки PBS со предметного стекла с помощью микропипетки. Нанесите 15-30 μл раствора антивыцветания (светочувствительного) на предметное стекло и убедитесь, что он соприкасается со всеми камерами для яиц.
    4. С помощью щипцов удерживайте край крышки предметного стекла, затем поместите его поверх стеклянного предметного стекла (от одного края к другому) так, чтобы он закрывал камеры для яиц. Делайте это медленно, чтобы избежать появления пузырей. Промокните излишки раствора безворсовой салфеткой, затем запечатайте края покровного стекла лаком для ногтей. Дайте лаку как следует высохнуть (± 5 минут).
    5. Визуализируйте предметные стекла с помощью конфокального микроскопа. Хранить предметные стекла при температуре -20 °C.

4. Обогащение биотинилированными пептидами для масс-спектрометрического анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Для образца масс-спектрометрии необходимо около 3 мг белков. Поэтому рассеките около 100 пар завязей, чтобы получить это количество.

  1. Лизис тканей
    1. Разморозьте замерзшую ткань яичника. Тем временем приготовьте 1x Трис-буферный солевой раствор (TBS), растворив 1 таблетку TBS в 500 мл TDW. Храните его в RT. Приготовьте 2% SDS в 1x TBS в качестве буфера для лизиса, разбавив 4 мл 10% SDS stock в 16 мл 1x TBS. Храните при RT. Храните при RT.
    2. Добавьте 500 мкл 2% SDS в 1x TBS (с добавлением 1x PI-коктейля) в пробирку, содержащую яичники. Подождите несколько минут, пока клетки лизируются и раствор станет липким.
    3. Дозатор лизат до 1 мл милитуба, содержащего волокно адаптивной сфокусированной акустики (AFA). Перед использованием вырежьте кончики пипетки. Для обеспечения эффективного ультразвукового исследования необходимо перекачивать не более 500 мкл лизата на пробирку.
    4. Выполнять ультразвуковую обработку при следующих условиях: пиковая падающая мощность 75 Вт, коэффициент заполнения 10%, циклы на всплеск 200, время 180 с, температура 6 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец необходимо подвергнуть ультразвуковой обработке несколько раз, установите несколько интервалов между ними, чтобы избежать выделения избыточного тепла.
  2. Осаждение ацетона
    1. Переместите лизат в пробирку с низким уровнем связывания объемом 5 мл, затем добавьте в пробирку холодный ацетон в 6 раз больше объема образца. Например, добавьте 3 мл ацетона к 500 мкл лизата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием ацетон следует предварительно охладить до -20 °C.
    2. Вихревую трубку, загрузите ее в мультивращатель и инкубируйте в течение ночи (± 16 часов) при температуре -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это точка остановки, что означает, что эксперимент может быть на мгновение приостановлен после этого шага.
    3. Гранулы осаждали белки при 15 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, затем поверните трубку вниз при температуре 4 °C.
    4. Добавьте 2 мл раствора смеси, состоящего из 90% холодного ацетона и 10% 1x TBS. Пипеткой движением вверх-вниз смешайте гранулу и раствор. Перед использованием отрежьте кончики пипетки.
    5. Вортексную трубку, затем загрузите ее в мультивращатель и инкубируйте в течение 2 ч при -20 °C.
    6. Гранулированные белки при 15 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, затем поверните трубку вниз при температуре 4 °C. Откройте пробирку и высушите гранулу на воздухе в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не пересушивайте пеллеты, так как позже их будет трудно повторно суспендировать.
    7. Приготовьте 500 мМ стоковый раствор бикарбоната аммония (АВК), растворив 0,7906 г АВС в 20 мл TDW. Приготовьте рабочий раствор ABC 50 мМ, разбавив 3 мл стокового раствора ABC 500 мМ в 27 мл TDW.
    8. Приготовьте 8 М раствор мочевины, добавив 0,4805 г мочевины в 1 мл 50 мМ ABC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор мочевины должен быть свежеприготовлен перед экспериментом.
    9. Ресуспендируйте белковую гранулу в 500 мкл 8 М мочевины. Объем 8 М мочевины может быть уменьшен для увеличения концентрации белка.
    10. Перенесите ресуспендированный белок в 1 мл милитуба, содержащую волокно AFA, затем выполните ультразвук с теми же условиями, которые описаны в шаге 4.1.4.
    11. Проведите анализ БЦА для определения концентрации белка. Этот шаг является конечной точкой. Храните образец белка при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
  3. Переваривание трипсина
    1. Смешайте 3 мг белков с TDW (при необходимости) в пробирке с низким связыванием объемом 5 мл, чтобы получить в общей сложности 500 мкл раствора.
    2. Денатурирует белки с помощью термоблока при 450 об/мин в течение 1 ч при 37 °C.
    3. Добавьте 5 мкл 1 М DTT (растворенного в TDW) в пробирку, чтобы получить конечную концентрацию 10 мМ DTT, затем восстановите белки с помощью термоблока при 450 об/мин в течение 1 ч при 37 °C.
    4. Приготовьте 400 мМ йодоацетамида, растворив 0,0111 г йодоацетамида в 150 мкл ABC. Добавьте в пробирку 55 мкл 400 мМ йодоацетамида (конечная концентрация 40 мМ), затем алкилатируйте белки с помощью термоблока при 450 об/мин в течение 1 ч при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Йодоацетамид чувствителен к свету, и все растворы йодоацетамида должны быть свежеприготовлены перед экспериментом.
    5. Разбавить образец добавлением 50 мМ раствора ABC до тех пор, пока общий объем не достигнет 4 мл. После разведения концентрация мочевины в растворе составляет около 1 М.
    6. Приготовьте 1 М раствор CaCl2 , растворив 1,1098 г CaCl2 в 10 мл TDW. Добавьте 4 мкл 1 М CaCl2 в пробирку, чтобы получить конечную концентрацию 1 мМ, затем пипеткой вверх и вниз для гомогенизации раствора.
    7. Приготовьте стоковый раствор трипсина в дозе 1 мг/мл, добавив 0,001 г трипсина к 1 мл АВК. Добавьте в пробирку 150 мкл трипсина (соотношение трипсин: образец = 1:20). Переваривайте белок с помощью термоблока при 450 об/мин в течение 16 ч при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсин должен быть свежерастворенным перед экспериментом. Этот шаг является конечной точкой. Храните переваренные пептиды при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
  4. Обогащение биотинилированными пептидами
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы для промывки и элюирования должны быть свежеприготовлены перед экспериментом.
    1. Приготовьте 2 М мочевину в растворе 1x TBS, добавив 1,2012 г мочевины в 10 мл 1x TBS.
    2. Используйте 150 мкл стрептавидин-конъюгированных магнитных шариков на образец дозой 3 мг. Промойте шарики стрептавидина 1 мл 2 М мочевины в 1 столовой ложке. Повторите этот шаг 4 раза. После каждой стирки поместите трубку на магнитную решетку на 1 минуту, затем выбросьте буфер для стирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать магнитные шарики Pierce Streptavidin, поскольку они минимизируют фоновые сигналы, подобные PEG, в результатах масс-спектрометрии.
    3. Нанесите пипеткой 1 мл расщепленных пептидов в пробирку, содержащую шарики, аккуратно перемешайте, а затем соедините смесь с оставшимся образцом в пробирке объемом 5 мл с низким связыванием. Поместите пробирку на мультивращатель и инкубируйте в течение 1 ч при РТ.
    4. Перелейте 1 мл смеси в пробирку объемом 1,5 мл и поместите ее на магнитный штатив на 1 минуту. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторяйте этот шаг, пока не соберутся все бусины.
    5. Приготовьте 2 М мочевину в 50 мМ ABC, растворив 0,7207 г мочевины в 6 мл 50 мМ ABC. Промойте шарики с 1 мл 2 М мочевины в 50 мМ 2 раза и с 1 мл TDW один раз. После каждой стирки поместите трубку на магнитную решетку на 1 минуту, затем выбросьте буфер для стирки.
    6. Приготовьте 10% исходный раствор муравьиной кислоты, растворив 1 мл муравьиной кислоты в 9 мл TDW. Приготовьте элюирующий буфер, состоящий из 80% ацетонитрила и 0,1% муравьиной кислоты в TDW. Например, смешайте 1,2 мл ацетонитрила, 15 мкл 10% муравьиной кислоты и 285 мкл TDW, чтобы получить 1,5 мл элюирующего буфера.
      ВНИМАНИЕ: Ацетонитрил и муравьиная кислота вредны из-за их летучих свойств, поэтому носите маску и будьте осторожны при обращении с ними.
    7. Внесите пипеткой 100 μл элюирующего буфера в пробирку, мягко гомогенизируйте, а затем элюируйте пептиды с помощью термоблока при 300 об/мин в течение 5 минут при 60 °C. После элюирования поместите пробирку на магнитный штатив и перенесите элюат в новую пробирку объемом 1,5 мл. Избегайте взятия бусин при переносе элюата. Повторите этот шаг 5 раз.
    8. Поместите пробирку, содержащую 500 μл элюата, на магнитный штатив на 5 минут, затем переложите ее в новую пробирку объемом 1,5 мл, чтобы обеспечить полное удаление шариков. Затем элюированные образцы можно высушить и использовать для масс-спектрометрического анализа.
    9. Для получения дополнительной информации об анализе ЖХ-МС/МС образцов обогащенных пептидов и обработке данных МС см. Nguyen et al.20.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Примеры выходных данных представлены на рисунке 1, рисунке 2, рисунке 3, рисунке 4 были ранее опубликованы Nguyen et al.20. На рисунке 1 показана экспериментальная процедура использования PL на основе TurboID в яичниках дрозофилы . Сначала была сгенерирована конструкция, объединяющая Zuc и TurboID (Zuc-V5-Tur...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье мы предлагаем комплексную процедуру бесконтактного мечения (PL) на основе TurboID в яичнике дрозофилы , разработанную в результате тщательного устранения неполадок для решения различных проблем. Одна из ключевых проблем была связана с генетическими конструкциями, поскольку различные схемы слияния существенно влияли на экспрессию белков и эффективность биотинилирования. Например, NES-V5-TurboID продемонстрировал более слабую экспрессию и биотинилирование по сравнени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лаборатории за их обсуждения и помощь. Эта работа была поддержана Национальным исследовательским фондом (NRF), финансируемым правительством Кореи (MSIT) (RS-2024-00345327 для M.L.; RS-2023-00219563 к М.Л.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Антитела
Козьего против мыши IgG (H+L) вторичного антитела, HRPInvitrogen31430Аналитический класс, светочувствительное
Козье антитело против кролика IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции, alexa fluor plus 488InvitrogenA32731Аналитический класс, светочувствительное
Козье антитело против кролика IgG (H+L) вторичного класса, HRPInvitrogen31460Аналитический класс, светочувствительное
антитело HSP90 (кролик)Технология клеточной сигнализации4874Поликлональное антитело
Пирс Стрептавидин белок, HRPThermo Fisher Scientific21126Аналитический класс
стрептавидин, Alexa Fluor 594 конъюгатInvitrogenS11227Светочувствительный, аналитический класс
Антитело V5-tag (мышь)InvitrogenR960-25Моноклональное антитело
V5-tag антитело (кролик) (D3H8Q)Технология клеточной сигнализации13202Моноклональное
антителоFly LinesCompanyНомер в каталогеComments/Description
pUASp Tom20 V5-TurboID/ TM3Korea Drosophila Stock Center2373-2Fly stock
pUASp Zucchini V5-TurboID/CyoKorea Drosophila Stock Center2188Fly stock
pUASP_attB_V5-TurboID-NES/CyoKorea Drosophila Stock Center2635-4Fly stock
w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2HBloomington Drosophila Stock Center7062Fly stock
Оборудование и расходные материалыCompany<strong>Номер в каталогеКомментарии/Описание
Аналитические весыMettler ToledoME2040,1 мг для чтения
Amersham Protran 0,45 NC нитроцеллюлоза вестерн-блоттинг мембраны (300 мм & раз; 4 м)Cytiva
10600002-Axygen 1,7 мл MaxyClear Snaplock микроцентрифужная трубкаCorningMCT-175-Cсополимер
БРЕНД  Покровное стекло (22 мм x 22 мм)Sigma-AldrichBR470055боросиликатное стекло
(10 & микро; L)Vertex4110N00пропилена
(1000 &; L)Vertex4330N00пропилена
(200 & микро; L)Vertex4230N00клеток пропилена
(96 лунок)SPL300096Полистирольная
центрифуга плоского типа (с ротором размером с пробирку объемом 1,5-2 мл)Eppendorf5424 Rфиксированным углом наклона, охлаждаемая
центрифуга (с ротором размером с пробирку объемом 5 мл)Eppendorf5425 Rфиксированным углом, охлаждаемая
химическая ложка--
Система визуализации ChemiDocBiorad12003153система визуализации Вестерн<
суб>2 площадка для мух--Анестезиологическая доска
CO<суб>2 бак и регулятор--Осторожно при высоком давлении газа и головокружении
Компактный инкубаторJSR JSGI-10TОсторожность при высоком давлении температура
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопZeissLSM 710Предостережение при интенсивном лазерном луче
Коническая трубка (15 мл)SPL50015Полипропилен /Полиэтилен высокой плотности 
Коническая трубка (50 мл)SPL50050Полипропилен / Полиэтилен высокой плотности 
Цифровые весы---
Цифровой таймер--
-Диссекционная чашка--Silicon
Dumont #5SF щипцами Fine Science Tools11252-00Сверхтонкие наконечники, предостережение от острых предметов
магнит DynaMag-2Invitrogen12321DДля микроцентрифужных пробирок объемом 1,5-2 мл
Fisherbrand  Предметные стекла для микроскопа Superfrost Plus (25 мм x 75 мм)Fisher Scientific12-550-15Осторожно при обращении с острыми предметами
Флаконы с едой от мух (с бумажной пробкой)Hansol TechFFB-21010-Флаконы
с едой от мух (с ватным колпачком)Hansol TechFFV-11010-Фокусно-ультразвуковой
аппаратCovarisM220Осторожно при ультразвуковой волне
Гелевый ножInvitrogenEI9010Нержавеющая сталь с пластиковой ручкой
Марка 3MM Chr промокательная бумага (46 см & раз; 57 см)Cytiva3030-917Ватманн бумага
Ручной гомогенизатор и пластиковый пестикKimble749540-0000Аккумуляторный двигатель
Нагревательный блокТонкая ПЦРALB6400Осторожность при высокой температуре
Безворсовая салфеткаYuhan-Kimberly41112-
Жидкий азот--Осторожность при обморожении и ожоге
Микропланшетный спектрофотометрAgilent TechnologiesEpochОптика на основе монохроматора
Микроволновая печь-Осторожность при высоких температурах
milliTUBE 1 мл волокна AFACovarisPN 520135Стекло
Мини гелевый бакThermo Fisher ScientificA25977Предостережение при высокой температуре
NuPAGE Bis-tris мини протеиновые гели, 4– 12%, 1.0– 1,5 мм, 10-луночныйInvitrogenNP0323BOXСодержит полиакриламид, предостережение о токсичности
NuPAGE Bis-tris мини протеиновые гели, 4– 12%, 1.0– 1,5 мм, 15-луночныйInvitrogenNP0321BOXСодержит полиакриламид, предостережение по токсичности
Кисть для рисования (Ø 1,8 мм)Hwa hong791240-Pipetman
L (P1000L)GilsonFA10006MОдноканальная микропипетка с металлическим эжектором
Pipetman L (P200L)GilsonFA10005MОдноканальная микропипетка с металлическим эжектором
Pipetman L ( P20L)GilsonFA10003MОдноканальная микропипетка с металлическим эжектором
Pipetman L (P2L)GilsonFA10001MОдноканальная микропипетка с металлическим эжектором
Источник питанияMajor scienceMP-310Предостережение при высоком напряжении электричества
Программируемый ротаторBiosanRS-24-Protein
LoBind  трубки Eppendorf
30108302-Бритвенное лезвиеDorco304020Нержавеющая сталь, осторожность при нахождении острых предметов
Ролик--
Серологическая пипетка (10 мл)SPL91010Полистирольная
серологическая пипетка (25 мл)SPL91025Полистирольная
серологическая пипетка (5 мл)SPL91005Полистирольная
серологическая пипетка (50 мл)SPL91050Полистирольная
защелкивающаяся крышка микроцентрифужные пробирки с низким удержанием (1,5 мл)Thermo Scientific3451PKПолипропиленовая
губчатая прокладкаInvitrogenEI9052-Стереомикроскоп
ZeissStemi 508-Стерео
микроскоп Термомиксер Leica
  CEppendorf5382000015с блоками размером 1,5 и 5 мл
ПинцетAven Tools18526Пластиковый, плоские наконечники
Вихревой смесительScientific IndustriesSI-0236-XCell
II Блот-модульInvitrogenEI9051Осторожность при высоких температурах
XCell  SureLock mini-cellInvitrogenEI0001Предостережение при высоких температурах
ChemicalsCompanyНомер в каталоге<strong>Комментарии/Описание
АцетонSigma-Aldrich650501Аналитический класс
АцетонитрилSupelco1.00029.1000Класс LC-MS, предостережение при ингаляционной токсичности и легковоспламеняющиеся
ампулы с альбумином (содержащим бычий сывороточный альбумин (БСА) в концентрации 2 мг/мл в 0,9% физиологическом растворе и 0,05% азиде натрия)Thermo Scientific23209Входит в состав наборов для анализа белка BCA Pierce (Thermo Scientific, 23225)
Альбумин, бычья сывороткаBioshopALB001Аналитический сорт
бикарбонат аммонияSigma-Aldrich09830Биотин аналитического сорта
 Sigma-AldrichB4639Культура клеток и тканей
Хлорид кальция (CaCl2)Sigma-AldrichC5670Клеточная культура
Clarity западный субстрат ECLBiorad1705060Аналитический класс
DAPISigma-AldrichMBD0015Светочувствительный, аналитический
дитиотреитол (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861Аналитический сорт
Фетальная бычья сывороткаCorning35-015-CVСорт клеточной культуры
Муравьиная кислотаSigma-AldrichF0507Реагентный сорт, предостережение ингаляционной токсичности
Среда для насекомыхГрейс Gibco11595030Клеточная культура
Быстрорастворимые сухие дрожжиБезмарки N1019-
ЙодоацетамидSigma-AldrichI1149Светочувствительный, аналитический сорт
МетанолCarlo Erba41484Аналитический класс
Лак для ногтей--Прозрачный
тип Novex Tris-глицин SDS буфер для проб (2X)InvitrogenLC2676Аналитический класс
NuPAGE MOPS SDS Беговой буфер (20X)InvitrogenNP0001Аналитический сорт
PageRuler Престейнированный белковый лестничный фильтрThermo Fisher Scientific26616Аналитический сорт
Фенилметансульфонилфторид Thermo Fisher Scientific36978Аналитический сорт
Фосфатный буферный физиологический растворSigma-AldrichP4417Аналитический сорт
Pierce 16% формальдегид (w/v)Thermo Fisher Scientific28908Аналитический сорт, светочувствительный
набор для анализа белка Pierce BCAThermo Scientific23225Аналитический класс
Реагент Pierce BCA A (содержит карбонат натрия, бикарбонат натрия, бицинхониновую кислоту и тартрат натрия в 0,1 М гидроксиде натрия)Thermo Scientific23228входит в состав наборов для анализа белка Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Реактив Pierce BCA B (содержит 4% сульфата меди)Thermo Scientific1859078входит в состав наборов для анализа белка Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Пропионовая кислотаSigma-Aldrich402907
Набор коктейлей ингибиторов протеазы класса ACS IIICalbiochem539134Класс клеточных и тканевых культур
SlowFade Gold Antifade MountantInvitrogenS36936Светочувствительный
хлорид натрия (NaCl)BioneerC-9025Аналитический класс
Дезоксихолат натрияSigma-AldrichD6750Аналитический класс
Додецилсульфат натрияSigma-Aldrich71736Молекулярный
гидроксид натрия (NaOH)BiosesangSR2018-100-00Аналитический класс
Тройная дистиллированная вода--Сверхчистая (тип 1)
Трис-буферный физиологический растворSigma-Aldrich94158Аналитический
класс Трис-глицинKoma BiotechK0341001Аналитический сорт
Tris-HCl, pH 8BioneerC-9006Аналитический сорт
Triton x-100Sigma-Aldrich93443Молекулярный
трипсинThermo Fisher Scientific20233Клеточный культурный класс
Tween 20Sigma-AldrichP9416Молекулярный сорт
мочевиныSigma-AldrichU5378Молекулярные и Сорт клеточной культуры
Наконечники для пипеток Наконечники для пипеток из Наконечники для пипеток из Планшет для культивирования Центрифуга с Центрифуга с из нержавеющей стали -- стандартные трансферный буфер

Ссылки

  1. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells. Trend Cell Biol. 26 (11), 804-817 (2016).
  2. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by turboid. eLife. 8, e47864(2019).
  3. Qi, Y., Katagiri, F. Purification of low-abundance Arabidopsis plasma-membrane protein complexes and identification of candidate components. Plant J. 57 (5), 932-944 (2009).
  4. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with turboid. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  5. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  6. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).
  7. Quantitative Proteomics. , https://case.edu/medicine/nutrition/centers-and-collaborations/case-center-proteomics-and-bioinformatics/proteomics-and-small-molecule-mass-spectrometry-core/quantitative-proteomics (2025).
  8. Udeshi, N. D., et al. Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins. Nat Meth. 14 (12), 1167-1170 (2017).
  9. Ummethum, H., Hamperl, S. Proximity labeling techniques to study chromatin. Front Genet. 11, 450(2020).
  10. Han, S., Li, J., Ting, A. Y. Proximity labeling: Spatially resolved proteomic mapping for neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 50, 17-23 (2018).
  11. Nishimasu, H., et al. Structure and function of zucchini endoribonuclease in pirna biogenesis. Nature. 491 (7423), 284-287 (2012).
  12. Zamudio, N., et al. DNA methylation restrains transposons from adopting a chromatin signature permissive for meiotic recombination. Genes Dev. 29 (12), 1256-1270 (2015).
  13. Cha, S. J., et al. Therapeutic modulation of gsto activity rescues fus-associated neurotoxicity via deglutathionylation in als disease models. Dev Cell. 57 (6), 783-798.e8 (2022).
  14. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing Drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. J Undergrad Neurosci Educ. 11 (1), A139-A148 (2012).
  15. Feizy, N., et al. In vivo identification of Drosophila rhodopsin interaction partners by biotin proximity labeling. Sci Rep. 14 (1), 1986(1986).
  16. Zhang, B., Zhang, Y., Liu, J. L. Highly effective proximate labeling in Drosophila. G3. 11 (5), jkab077(2021).
  17. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  18. Waring, G. L. Morphogenesis of the eggshells in Drosophila. Int Rev Cytol. 198, 67-108 (2000).
  19. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), e3679(2012).
  20. Nguyen, T. T. M., et al. In vivo profiling of the zucchini proximal proteome in the Drosophila ovary. Development. 150 (4), dev201220(2023).
  21. Ahmadi, S., Winter, D. Identification of poly(ethylene glycol) and poly(ethylene glycol)-based detergents using peptide search engines. Anal Chem. 90 (11), 6594-6600 (2018).
  22. Zada, A., Khan, I., Zhang, M., Cheng, Y., Hu, X. Airid-based proximity labeling for protein-protein interaction in plants. J Vis Exp. (187), e64428(2022).
  23. Fang, B., et al. Lowering sample requirements to study tyrosine kinase signaling using phosphoproteomics with the tmt calibrator approach. Proteomics. 20 (24), 2000116(2020).
  24. Park, N., et al. One-stage tip method for tmt-based proteomic analysis of a minimal amount of cells. ACS Omega. 8 (22), 19741-19751 (2023).
  25. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. J Vis Exp. (159), e60728(2020).
  26. Trinkle-Mulcahy, L. Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. F1000Res. 8, Faculty Rev-135 F1000(2019).
  27. Wei, X. F., Li, S., Hu, J. L. A turboid-based proximity labelling approach for identifying the DNA-binding proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102139(2023).
  28. Bosch, J. A., Chen, C. L., Perrimon, N. Proximity-dependent labeling methods for proteomic profiling in living cells: An update. WIREs Dev Biol. 10 (1), e392(2021).
  29. Rayaprolu, S., et al. Cell type-specific biotin labeling in vivo resolves regional neuronal and astrocyte proteomic differences in mouse brain. Nat Commun. 13, 2927(2022).
  30. Uckun, E., et al. In vivo profiling of the alk proximitome in the developing Drosophila brain. J Mol Biol. 433 (23), 167282(2021).
  31. Xiong, Z., et al. In vivo proteomic mapping through gfp-directed proximity-dependent biotin labelling in zebrafish. Elife. 10, e64631(2021).
  32. Holzer, E., Rumpf-Kienzl, C., Falk, S., Dammermann, A. A modified turboid approach identifies tissue-specific centriolar components in C. elegans. PLoS Genet. 18 (4), e1010150(2022).
  33. Artan, M., et al. Interactome analysis of Caenorhabditis elegans synapses by turboid-based proximity labeling. J Biol Chem. 297 (3), 101094(2021).
  34. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling reveals that ubr7 is a regulator of n nlr immune receptor-mediated immunity. Nat Comm. 10 (1), 3252(2019).
  35. Baumgartner, L., et al. The Drosophila zad zinc finger protein kipferl guides rhino to pirna clusters. eLife. 11, e80067(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

TurboID
В естественных условиях Применение бесконтактного мечения на основе TurboID у Drosophila melanogaster
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.