Выделение и культивирование первичных холангиоцитов у мышей с поликистозом печени с использованием двухступенчатого метода пищеварения

Rongjie Ji; Bo Qing; Jiayuan Chen; Zhigang Zhao; Lirong Zhang

doi:10.3791/68202

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и культивирование первичных холангиоцитов у мышей с поликистозом печени с использованием двухступенчатого метода пищеварения

974 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68202

⸱

16 мая 2025 г.

Rongjie Ji¹ , Bo Qing² , Jiayuan Chen² , Zhigang Zhao¹ , Lirong Zhang²

¹Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, ²The Province and Ministry Co-sponsored Collaborative Innovation Center for Medical Epigenetics, Key Laboratory of Immune Microenvironment and Disease (Ministry of Education), State Key Laboratory of Experimental Hematology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает оптимизированный двухэтапный метод пищеварения для выделения первичных холангиоцитов высокой чистоты и высокой жизнеспособности от мышей дикого типа и мышей с поликистозом печени.

Аннотация

В этом протоколе мы оптимизировали двухэтапный метод пищеварения для выделения первичных холангиоцитов высокой чистоты и высокой жизнеспособности от мышей дикого типа и мышей с поликистозом печени (PLD). После обезболивания мышей печень перфузировали через нижнюю полую вену 50 мл раствора А, а затем 30 мл раствора В при 37 °С для ферментативного переваривания ткани печени. Механическую диссоциацию, встряхивание и микродиссекцию проводили для удаления адгезивных паренхиматозных клеток, оставляя неповрежденное желчное дерево. Затем желчное дерево мелко измельчали и переваривали путем встряхивания в течение 60 минут при 37 °C. Полученную одноклеточную суспензию собирали с помощью клеточного фильтра размером 70 мкм. Холангиоциты очищали с помощью иммуномагнитной изоляции. Клеточную суспензию инкубировали с антителом против EpCAM при вращении в течение 45 мин при 4°С, с последующим добавлением гранул протеина G и дальнейшим вращением в течение еще 45 мин при 4°С. После трех промываний PBS холангиоциты собирали с помощью магнитного сепаратора. Очищенные первичные холангиоциты ресуспендировали в питательной среде для холангиоцитов и высевали на чашки для клеточных культур, покрытые коллагеном крысиного хвоста I типа 1 мг/мл. Чистота холангиоцитов была подтверждена иммуноокрашиванием на холангиоцит-специфический маркер цитокератин-19 (CK19). Хотя это исследование было сосредоточено на выделении первичных холангиоцитов от мышей дикого типа и PLD, мы уверены, что протокол может быть применен и к другим моделям мышей. Этот подробный двухэтапный метод пищеварения облегчает исследования холангиопатий in vitro и разработку таргетной терапии.

Введение

Холангиоциты, эпителиальные клетки, выстилающие внутрипеченочное желчное дерево, образуют монослой и составляют примерно 3-5% от общей популяции клеток печени¹. Эти клетки соединяются между собой в печени, создавая сложную трехмерную протоковую^сеть2. В нормальных условиях холангиоциты выполняют жизненно важные функции, включая секрецию, всасывание, восстановление повреждений и служат иммунным барьером, тем самым играя решающую роль в физиологии и патологии печени. Тем не менее, дисфункция холангиоцитов может привести к различным заболеваниям, включая PLD, первичный склерозирующий холанги....