Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и культивирование первичных холангиоцитов у мышей с поликистозом печени с использованием двухступенчатого метода пищеварения

919 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68202

⸱

16 мая 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, 2The Province and Ministry Co-sponsored Collaborative Innovation Center for Medical Epigenetics, Key Laboratory of Immune Microenvironment and Disease (Ministry of Education), State Key Laboratory of Experimental Hematology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает оптимизированный двухэтапный метод пищеварения для выделения первичных холангиоцитов высокой чистоты и высокой жизнеспособности от мышей дикого типа и мышей с поликистозом печени.

Аннотация

В этом протоколе мы оптимизировали двухэтапный метод пищеварения для выделения первичных холангиоцитов высокой чистоты и высокой жизнеспособности от мышей дикого типа и мышей с поликистозом печени (PLD). После обезболивания мышей печень перфузировали через нижнюю полую вену 50 мл раствора А, а затем 30 мл раствора В при 37 °С для ферментативного переваривания ткани печени. Механическую диссоциацию, встряхивание и микродиссекцию проводили для удаления адгезивных паренхиматозных клеток, оставляя неповрежденное желчное дерево. Затем желчное дерево мелко измельчали и переваривали путем встряхивания в течение 60 минут при 37 °C. Полученную одноклеточную суспензию собирали с помощью клеточного фильтра размером 70 мкм. Холангиоциты очищали с помощью иммуномагнитной изоляции. Клеточную суспензию инкубировали с антителом против EpCAM при вращении в течение 45 мин при 4°С, с последующим добавлением гранул протеина G и дальнейшим вращением в течение еще 45 мин при 4°С. После трех промываний PBS холангиоциты собирали с помощью магнитного сепаратора. Очищенные первичные холангиоциты ресуспендировали в питательной среде для холангиоцитов и высевали на чашки для клеточных культур, покрытые коллагеном крысиного хвоста I типа 1 мг/мл. Чистота холангиоцитов была подтверждена иммуноокрашиванием на холангиоцит-специфический маркер цитокератин-19 (CK19). Хотя это исследование было сосредоточено на выделении первичных холангиоцитов от мышей дикого типа и PLD, мы уверены, что протокол может быть применен и к другим моделям мышей. Этот подробный двухэтапный метод пищеварения облегчает исследования холангиопатий in vitro и разработку таргетной терапии.

Введение

Холангиоциты, эпителиальные клетки, выстилающие внутрипеченочное желчное дерево, образуют монослой и составляют примерно 3-5% от общей популяции клеток печени1. Эти клетки соединяются между собой в печени, создавая сложную трехмерную протоковуюсеть2. В нормальных условиях холангиоциты выполняют жизненно важные функции, включая секрецию, всасывание, восстановление повреждений и служат иммунным барьером, тем самым играя решающую роль в физиологии и патологии печени. Тем не менее, дисфункция холангиоцитов может привести к различным заболеваниям, включая PLD, первичный склерозирующий холангит, холангиокарциному и холестатическое повреждение печени 3,4,5.

Среди заболеваний, связанных с холангиопатией, PLD выделяется как наследственное заболевание, характеризующееся образованием многочисленных заполненных жидкостью кист, происходящих из холангиоцитов. Прогрессирующее увеличение этих кист значительно снижает качество жизни пациентов6. Существующие варианты лечения PLD остаются недостаточными, предлагая ограниченную эффективность и часто связанные с высокой частотой рецидивов и осложнений7. Это подчеркивает настоятельную необходимость разработки безопасных и эффективных терапевтических стратегий для удовлетворения неудовлетворенных клинических потребностей в лечении PLD.

Исследования механизмов холангиопатий, в том числе PLD, были значительно затруднены отсутствием подходящих клеточных линий. Чтобы устранить это ограничение, использование мышиных моделей заболевания и выделение первичных холангиоцитов из этих моделей для экспериментов in vitro оказалось неоценимым для раскрытия молекулярных механизмов, лежащих в основе холангиопатий, и определения потенциальных терапевтических стратегий.

В нашем недавнем исследовании8 мы успешно создали мышиную модель PLD с использованием мышей с условным нокаутом Pkd1 (KO). Кисты печени наблюдались уже через 1 месяц после делеции Pkd1 и постепенно увеличивались в размерах с течением времени. В то время как протоколы выделения холангиоцитов у крыс и человека хорошо задокументированы 9,10, выделение первичных холангиоцитов у мышей остается особенно сложным из-за их небольшого размера и сложной архитектуры воротной вены и желчевыводящей системы. Существующие методы сталкиваются со значительными ограничениями, включая низкую чистоту клеток, плохую жизнеспособность, сложные процедуры и высокую стоимость11,12.

В данной рукописи представлен подробный протокол выделения первичных холангиоцитов высокой чистоты от мышей с использованием двухступенчатого метода пищеварения. Этот оптимизированный подход направлен на поддержку исследований in vitro , облегчение изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе холангиопатий, и продвижение разработки новых терапевтических стратегий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы лечения и экспериментов с мышами были одобрены Этическим комитетом Тяньцзиньского медицинского университета (Doc. No: TMUa-MEC 2022016).

1. Подготовка оборудования и решений

  1. Стерилизуйте хирургические инструменты (ножницы, щипцы и ручки скальпеля) путем автоклавирования не менее чем за 1 день до выделения клеток.
  2. Не менее чем за 1 день до выделения клеток приготовьте питательную среду для холангиоцитов с использованием реагентов, перечисленных в таблице 1. Простерилизуйте питательную среду холангиоцитов, отфильтровав ее через фильтр 0,22 мкм.
  3. Не менее чем за 1 день до выделения клеток приготовьте раствор А и раствор В с использованием реагентов, перечисленных в таблице 2 , для перфузии печени мышей. Раствор А и раствор В стерилизуйте автоклавированием или фильтруйте через фильтр 0,22 мкм и отрегулируйте их pH до 7,35 с помощью стерильного NaOH при осторожном перемешивании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Питательная среда для холангиоцитов, раствор А и раствор В можно хранить при температуре 4°C не менее одного месяца.
  4. Перед началом эксперимента добавьте порошок коллагеназы II в раствор B и аккуратно перемешайте до достижения конечной концентрации 0,5 мг/мл. Перед использованием разогрейте раствор А и раствор В на водяной бане при температуре 37 °C.
  5. Непосредственно перед началом эксперимента приготовьте 6-сантиметровую посуду, наполненную стерильным ПБС, и положите ее на лед, чтобы они оставались холодными во время процедуры.

2. Перфузия пищеварения печени

  1. Обезболите мышь с помощью ингаляции с передозировкой изофлурана. Поместите мышь под наркозом в положение лежа на спине и закрепите ее клейкой лентой, чтобы облегчить процедуру.
  2. Откройте брюшную полость мыши после стерилизации брюшной полости с помощью 75% этанола, а затем завяжите узел вокруг нижней полой вены с помощью обжатой иглы. Промойте внутривенный катетер 24 г раствором А с помощью шприца объемом 20 мл.
  3. Вставьте внутривенный катетер в нижнюю полую вену ниже скользящего узла, зафиксируйте скользящий узел и зафиксируйте катетер на месте с помощью клейкой ленты.
  4. Перфузируйте печень 50 мл раствора А через нижнюю полую вену с помощью шприца объемом 20 мл и надрежьте воротную вену печени для дренирования перфузионного раствора. Поддерживайте скорость перфузии на уровне 10 мл/мин.
  5. Продолжайте перфузию 30 мл раствора В, содержащего коллагеназу II, со скоростью потока 3,5 мл/мин с помощью перистальтического насоса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап предназначен для переваривания тканей печени.
  6. Удалите успешно перфузированную ткань печени и поместите ее в 6-сантиметровую посуду, наполненную холодным стерильным ПБС.

3. Выделение холангиоцитов

Примечание: Поскольку количество холангиоцитов у нормальных мышей относительно невелико, рекомендуется использовать для процедуры группу из 2-6 мышей. Тем не менее, для моделей заболеваний мышей с аномальной пролиферацией холангиоцитов, таких как PLD, достаточно холангиоцитов от одной мыши. Если не указано иное, образцы и реагенты всегда должны храниться на льду, а все процедуры должны выполняться в шкафу биологической безопасности.

  1. Механически диссоциируйте и встряхните ткани печени с помощью изогнутых щипцов. Впоследствии проводят микродиссекцию под препарирующим микроскопом для удаления адгезивных паренхиматозных клеток, оставляя неповрежденным желчевыводящее дерево. Удалите ткань желчного пузыря, прежде чем переходить к следующему этапу.
    Промойте салфетку 2 раза с PBS.
  2. Измельчите желчевыводящее дерево с помощью хирургического лезвия и разварите его в 3 мл раствора для сбраживания (Таблица 3) на каждую мышь с встряхиванием (90 об/мин) при температуре 37 °C в течение 60 минут. На отметке 30 минут аккуратно нанесите смесь пипеткой с помощью наконечника пипетки, чтобы тщательно перемешать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для дигестона должен быть свежеприготовленным перед использованием.
  3. Пропустите клеточную суспензию через сетчатое фильтр 70 мкм. С помощью поршня шприца объемом 5 мл или 10 мл аккуратно надавите на клеточную суспензию через сетчатое фильтр. Промойте ситечко с помощью PBS.
  4. Центрифугируйте клеточную суспензию при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Промойте ячейки 3 раза средой RPMI.
  5. Снова центрифугируйте при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  6. Отбраковать надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в 900 мкл среды RPMI, содержащей 40 Ед/мл ДНКазы I. Добавить 2 мкг антитела против EpCAM и инкубировать суспензию на ротаторе (20 об/мин) при 4 °C в течение 45 мин.
  7. Центрифугируйте при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  8. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл среды RPMI, содержащей 40 Ед/мл ДНКазы I. Предварительно промойте шарики протеина G 1 мл среды RPMI. Добавьте 20 мкл гранул белка G в клеточную суспензию и инкубируйте с вращением (20 об/мин) при 4 °C еще 45 мин.
    Примечание: Антитело против EpCAM также может быть предварительно инкубировано с гранулами белка G для создания комплекса гранулы-антитела перед введением клеточной суспензии.
  9. Промойте ячейки 3 раза PBS с помощью магнитного сепаратора.
  10. Подсчет клеток и оценка жизнеспособности клеток с помощью окрашивания Trypan Blue (0,04%, 3 мин) на гемоцитометре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости удалять шарики из холангиоцитов, они отделятся естественным образом после начала культивирования и не будут мешать культивированию клеток.

4. Культура холангиоцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежие блюда для культуры клеток крысиного хвоста I типа, покрытые коллагеном, перед культивированием холангиоцитов. Предварительно охладите все реагенты на льду.

  1. Следуя инструкциям производителя, смешайте стерильный ddH2O, 10x PBS, 1 N NaOH и коллаген крысиного хвоста типа I для достижения конечной концентрации 1 мг/мл коллагена крысиного хвоста типа I в 1x PBS. Равномерно покройте смесью чашки для клеточных культур и поместите чашки в инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2 на 30 минут, чтобы дать коллагену застыть.
  2. Вымойте посуду для клеточных культур типа I типа крысиного хвоста, покрытую коллагеном, предварительно подогретым PBS.
  3. Ресуспендируйте холангиоциты в предварительно подогретой среде для культивирования холангиоцитов. Поместите клеточную суспензию в 1 мг/мл 1 мг/мл типа I типа в чашки для клеточных культур, покрытые коллагеном, и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2. Заменяйте среду каждые 2 дня.

5. Пассирование и криоконсервация холангиоцитов

  1. Холангиоциты дважды промыть PBS, затем инкубировать клетки в 0,25% трипсине при 37 °C в течение 5-10 минут.
  2. Добавьте равный объем питательной среды для холангиоцитов для нейтрализации трипсина, затем центрифугируйте при 500 x g в течение 5 минут.
  3. Приготовьте чашки для клеточных культур типа I крысиного хвоста, покрытые коллагеном, как описано в шаге 4.1.
  4. Выполните шаги 4.2 и 4.3.
  5. Если требуется криоконсервация, повторно суспендируйте холангиоциты в среде хранения (9:1 FBS: DMSO) и храните в морозильной камере при температуре -80 °C или жидком азоте. Разморозьте ячейки по мере необходимости для дальнейшего использования.

6. Валидация холангиоцитов

Примечание: Чистоту холангиоцитов оценивали путем окрашивания на маркер холангиоцитов CK19.

  1. Промыть холангиоциты 2 раза с PBS, затем зафиксировать клетки в 4% параформальдегиде на 15 минут.
  2. Промыть холангиоциты PBS, затем проникнуть в клетки 1% Triton X-100 в течение 8 минут.
  3. Промойте холангиоциты PBS, затем заблокируйте клетки в 5% BSA на 1 ч.
  4. Промойте холангиоциты PBS, затем инкубируйте клетки с первичным антителом против CK19 (разведение 1:12 с 2% BSA) в течение ночи при 4 °C.
  5. Промойте холангиоциты 2 раза с PBS, затем инкубируйте клетки с вторичным антителом Alexa Fluor 488 против крыс (разведение 1:1000 с PBS) в течение 1 часа при комнатной температуре.
  6. Холангиоциты промыть PBS, окрашивать 4',6-диамидино-2-фенилиндолом в течение 15 мин и наблюдать под микроскопом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Схема рабочего процесса двухэтапного расщепления, используемого для выделения холангиоцитов, показана на рисунке 1. Вся процедура занимает ~5 часов. Сначала печень перфузируется раствором А через нижнюю полую вену для удаления крови, на что указывает бледность печени. Затем печень перфузируют раствором В, содержащим коллагеназу II, чтобы инициировать переваривание тканей. Этот начальный этап пищеварения чувствителен ко времени, и об успешном переваривании сви...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол предоставляет подробный метод выделения первичных холангиоцитов высокой чистоты от мышей с использованием двухступенчатого процесса пищеварения, что позволяет изучить молекулярные механизмы, лежащие в основе холангиопатий. Для обеспечения успешной изоляции холангиоцитов необходимо выполнить несколько критических шагов.

Первым важным шагом является обеспечение эффективной перфузии и пищеварения с помощью раствора А и раствора В. Успешная перфузия ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Муниципальной комиссии по образованию Тяньцзиня (2022ZD054 для L.Z.)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 μ м фильтрPALL4612
0,25% ТрипсинGibco25200-056
10 мл шприцKONSMED10 мл 1,2*30TWLB
20 мл шприцKONSMED20 мл 1,2*30TWLB
24 G внутривенный катетерWEGO24GX19  мм/Y-G
3,3',5-трийодо-L-тиронинSigmaT55161,7 мг/мл стоковый
4% параформальдегидSolarbioP1110
5 мл шприцKONSMED5 мл 0,7*30TWLB
6 см посудаThermo Scientific150462
70 &; m клеточный фильтрCorning352350
антитело против CK19DSHBTROMA-III
антитело против EpCAMDSHBG8.8
BSASolarbioA8020
CaCl2Sangon BiotechA5013302 M stock
Химически определенный липидный концентрат (100x)Gibco11905-031
Коллагеназа IIWorthingtonLS004176
Коллагеназа XISigmaC76573,2 мг/мл стоковый
ДексаметазонSigmaD175610 мг/мл стоковый
препарирующий микроскопLeicaEZ4
DMEM/F12 (1:1)VivaCell biosciencesC3130-0500
DMSOSigmaD2650
ДНКаза IСигмаD451310 U/μ L stock
Donkey antirat Alexa Fluor 488 вторичное антителоInvitrogenA21208
EGTASolarbioE805050 мМ (PH = 8) stock
Эпидермальный фактор роста (1 мг/мл)SigmaSRP3196
этаноламинSigmaE9508
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаVivaCell biosciencesC04001-500
ForskolinSigmaF391720 мМ стоковый
раствор гентамицина/амфотерицина (500x)GibcoR01510
ГемоцитометрQIUJINGXB. К.25.
HEPESSigmaH4034
ГиалуронидазаSigmaH350610 мг/мл
сток Инсулин-трансферрин-селен (100x)Gibco41400045
ИзофлуранRWDR510-22-10
KClSangon BiotechA100395
L-глутамин (200 мМ)SigmaG7513
Магнитный сепараторPromegaZ5342
MEM заменимые аминокислоты (100x)Gibco11140050
раствор витамина MEM (100x)Gibco11120052
sub>2Sangon BiotechA1002881,5 М сток
Na Pyruvate  (100 мМ)Gibco11360070
Na2HPO4Sangon BiotechA600487
NaClSangon BiotechA610476
NaOHSangon BiotechA6206171 N stock
PBSVivaCell biosciencesC3580-0500
PBSSolarbioP1010
Пенициллин-стрептомицин (100x)Gibco15140-122
Перистальтический насосBaodingRongbaiYZ1515PPS
Протеин G шарикиInvitrogen10004D
RotatorKylin-BellQB-528
RPMIVivaCell biosciencesC3010-0500
Ингибитор трипсина соиSigmaT652210 мг/мл стоковая
игла обжатаяJinhuan MedicalHM601
Triton X-100SolarbioT8200
Трипановый синийSigmaT614610 мг/мл сток
Тип I крысиный хвост коллагенBD354236
MgCl<

Ссылки

  1. Wang, Z., et al. Human cholangiocytes form a polarized and functional bile duct on hollow fiber membranes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 868857(2022).
  2. Li, P., et al. Three-dimensional human bile duct formation from chemically induced human liver progenitor cells. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1249769(2023).
  3. Fabris, L., et al. Pathobiology of inherited biliary diseases: a roadmap to understand acquired liver diseases. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (8), 497-511 (2019).
  4. Jalan-Sakrikar, N., et al. Central role for cholangiocyte pathobiology in cholestatic liver diseases. Hepatology. , (2024).
  5. Ilyas, S. I., Gores, G. J. Pathogenesis, diagnosis, and management of cholangiocarcinoma. Gastroenterology. 145 (6), 1215-1229 (2013).
  6. Perugorria, M. J., et al. Polycystic liver diseases: advanced insights into the molecular mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (12), 750-761 (2014).
  7. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., LaRusso, N. F. Polycystic liver disease: Advances in understanding and treatment. Annu Rev Pathol. 17, 251-269 (2022).
  8. Ji, R., et al. Multi-omics profiling of cholangiocytes reveals sex-specific chromatin state dynamics during hepatic cystogenesis in polycystic liver disease. J Hepatol. 78 (4), 754-769 (2023).
  9. Tabibian, J. H., et al. Characterization of cultured cholangiocytes isolated from livers of patients with primary sclerosing cholangitis. Lab Invest. 94 (10), 1126-1133 (2014).
  10. Muff, M. A., et al. Development and characterization of a cholangiocyte cell line from the PCK rat, an animal model of autosomal recessive polycystic kidney disease. Lab Invest. 86 (9), 940-950 (2006).
  11. Nagaya, M., Katsuta, H., Kaneto, H., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Adult mouse intrahepatic biliary epithelial cells induced in vitro to become insulin-producing cells. J Endocrinol. 201 (1), 37-47 (2009).
  12. Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. J Vis Exp. (88), e51621(2014).
  13. Kudira, R., et al. Isolation and culturing primary chaolangiocytes from mouse liver. Bio Protoc. 11 (20), e4192(2021).
  14. Ueno, Y., et al. Evaluation of differential gene expression by microarray analysis in small and large cholangiocytes isolated from normal mice. Liver Int. 23 (6), 449-459 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение печени мышииммуномагнитная изоляцияжелчевыводящие путикультура клетокцитокератин-19антитела к EpCAMмагнитный сепаратор

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.