Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение ретиноидсодержащих клеток легких методом сортировки клеток

849 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68205

⸱

11 апреля 2025 г.

 ,  , 
1Department of Animal Sciences, School of Environmental and Biological Sciences, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Undergraduate Program in Biochemistry, School of Environmental and Biological Sciences, Rutgers, The State University of New Jersey, 3Rutgers Center for Lipid Research, 4Rutgers Center for Environmental Exposures & Disease

В этой статье

Краткое содержание

Описанный ниже протокол представляет собой простой и эффективный способ выделения ретиноидсодержащих клеток из высокогетерогенных популяций клеток легких с использованием специфической ретиноидной автофлуоресценции и сортировки флуоресцентно-активируемых клеток.

Аннотация

Ретиноиды (витамин А и его метаболиты) являются важным липидным компонентом альвеолярного микроокружения, и специфический для клеточного типа метаболизм ретиноидов необходим для поддержания функционального здоровья развивающихся и взрослых легких. Клетки легких используют специфические пути, что позволяет эффективно поглощать циркулирующие ретиноиды из крови в виде ретинола (ROH) с последующим внутриклеточным ступенчатым превращением ROH в транскрипционно активные виды ретиноидов, полностью транс-ретиноевую кислоту (ATRA). ATRA-опосредованная (или ретиноид-опосредованная) передача сигналов имеет решающее значение для регуляции альвеоляризации легких, продукции сурфактанта, ангиогенеза, проницаемости и иммунитета. Важно отметить, что специфические клетки легких, включая фибробласты, могут накапливать ретиноиды в форме ретиниловых эфиров (РЗ), которые могут храниться или дополнительно мобилизоваться в виде ООЗ для переноса в соседние клетки при необходимости. Клетки, содержащие ретиноиды легких, могут быть выделены и собраны из одноклеточной суспензии переваренных легких с использованием ретиноидной аутофлуоресценции (излучение при длине волны 455 нм при возбуждении при длине волны 350 нм) и с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS). Дополнительное клеточно-специфическое мечение клеток легких красным флуоресцентным белком in vivo позволяет выделять и собирать специфические популяции клеток легких, содержащие ретиноиды. Собранные клетки могут быть непосредственно проанализированы или культивированы для дальнейшего анализа морфологии клеток, экспрессии генов и реакции на фармакологические манипуляции. Этот метод выделения и применения важен для исследований здоровья легких и повреждения легких на животных моделях, чтобы получить более глубокое представление о клеточных аспектах метаболизма ретиноидов в легких и липид-опосредованных клеточных коммуникациях.

Введение

Ретиноиды (витамин А и его метаболиты) являются важным липидным компонентом альвеолярного микроокружения, и специфический для клеточного типа метаболизм ретиноидов и передача сигналов необходимы для поддержания функционального здоровья развивающихся и взрослых легких 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14. Клетки легких используют специфические пути, позволяющие эффективно поглощать циркулирующие ретиноиды пищевого происхождения из крови в виде ретинола (ROH)15,16,17,18,19 с последующим внутриклеточным ступенчатым превращением ROH в транскрипционно активные виды ретиноидов, полностью транс-ретиноевую кислоту (ATRA)20. ATRA-опосредованная (или ретиноид-опосредованная) передача сигналов достигается за счет взаимодействия ATRA с тремя различными родственными рецепторами ядерных гормонов, рецепторами ретиноевой кислоты (RARα, RARβ и RARγ21,22), и имеет решающее значение для регуляции альвеоляризации легких 23,24,25,26,27,28,29, производства сурфактанта30,31,32,33,34,35, ангиогенез36, проницаемость37 и иммунитет 38,39,40. Важно отметить, что специфические клетки легких, особенно легкие фибробласты, могут накапливать ретиноиды в форме ретиниловых эфиров (РЭ), которые могут сохраняться или далее мобилизоваться в виде ROH для переноса в соседние клетки при необходимости1.

Сложность метаболизма ретиноидов и передачи сигналов, а также клеточная сложность легких затрудняют исследования, направленные на изучение метаболизма ретиноидов в легких in vivo . Мы описали простой и надежный протокол выделения ретиноидсодержащих клеток (рис. 1) из высокогетерогенных популяций клеток легких с использованием специфической ретиноидной аутофлуоресценции (излучение при длине волны 455 нм при возбуждении при длине волны 350 нм) и с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS). Протокол не требует дополнительной маркировки клеток, за исключением окрашивания на жизнеспособность, если целью исследования является выделение и характеристика первичных живых клеток легких на основе их способности хранить ретиноиды. Это значительно сокращает время подготовки к сортировке клеток, исключает необходимость в дополнительном окрашивании, позволяет выделять высокие выходы жизнеспособных первичных клеток. Однако, если целью исследования является выделение и характеристика конкретных популяций клеток легких (фибробластов, эндотелиальных, эпителиальных или иммунных клеток), дополнительная сортировка клеток может быть выполнена после мечения отсортированных ретиноидсодержащих клеток клеточно-специфическими антителами.

Ретиноидная аутофлуоресценция использовалась в опубликованных исследованиях для установления идентичности ретиноидсодержащих клеток и/или для количественной оценки численности этих клеток в печени 41,42,43,44, поджелудочной железе 45,46, почках41,47 и легких41. Кроме того, несколько исследовательских групп сообщили об использовании флуоресценции ретиноидов для выделения с помощью FACS и изучения первичных ретиноидсодержащих клеток из живых тканей, включая печень 44,48,49,50,51,52,53 и легкое 1. В текущем протоколе мы показываем, как конкретные клеточные популяции могут быть помечены in vivo перед выделением клеток, содержащих ретиноиды, с помощью tdTomato (красный флуоресцентный белок). Спектральные характеристики tdTomato's (излучение на длине волны 581 нм при возбуждении на длине волны554 нм 54) и яркость не влияют на автофлуоресценцию ретиноидов и, следовательно, позволяют удобно добиваться специфичности клеток при сортировке. Учитывая критическую роль ненарушенного метаболизма ретиноидов и передачи сигналов в нормальном альвеолярноммикроокружении1, описанный метод выделения клеток легких является полезным инструментом в исследованиях здоровья и заболеваний легких на животных моделях для получения более глубокого понимания клеточных аспектов метаболизма ретиноидов в легких и липид-опосредованных клеточных коммуникаций in vivo.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные процедуры и эксперименты с участием мышей были проведены с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Рутгерса (IACUC ID: PROTO202200111) в соответствии с критериями, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных, подготовленном Национальной академией наук55.

1. Соображения и подготовка к эксперименту

  1. Животноводство и манипуляции
    ПРИМЕЧАНИЕ: В исследованиях могут использоваться трехмесячные (10-12 недель) самцы и самки мышей. В описанных экспериментах использовали мышей с дефицитом лецитина-ацилтрансферазы (Lrat-дефицитные, Lrat-/- мыши56) на генетическом фоне C57BL/6J и однопометников соответствующего возраста (дикий тип, мыши Lrat+/+). Мышей, экспрессирующих ген tdTomato в фибробластах (мышей F-tdT), получали путем скрещивания мышей, у которых была репортерная кассета tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J, штамм Jackson Lab #007914) с мышами Col1a2-CreER (B6. Cg-Tg(Col1a2-Cre/ERT,-ALPP)7Cpd/2J, штамм Jackson Lab #029567).
    1. Используйте мышиную модель с экспрессией Cre, один из многих доступных вариантов для мечения популяции клеток-мишеней in vivo.
      Примечание: В зависимости от выбора клетки-мишени, экспрессии Cre, эффективности Cre-опосредованной рекомбинации и специфичности клеток, исследователи могут использовать любую надежную мышиную модель Cre-экспрессии.
    2. Используйте экспрессию трансгена tdTomato (после лечения тамоксифеном, как описано ниже) для мечения фибробластов Col1a2+ с последующим их выделением из суспензий одиночных клеток переваренного легкого, как описано ниже.
  2. Кре-опосредованная рекомбинация и активация трансгена in vivo
    1. Индуцирование экспрессии Cre у мышей F-tdT путем внутрибрюшинного (IP) введения 2 мг тамоксифена один раз в 24 ч в течение 5 дней подряд.
    2. Перед инъекцией продезинфицируйте место инъекции 70% этанолом. Используйте мышей для экспериментов через 1 месяц после последней инъекции тамоксифена.
    3. Проверьте эффективность Cre-рекомбинации перед проведением экспериментов по сортировке. Подтвердите эффективную рекомбинацию Cre и экспрессию tdTomato путем выделения популяции клеток-мишеней фибробластов легких от мышей, получавших F-tdT, получавших тамоксифен, с использованием анти-Pdgfrα магнитных шариков и магнитно-активируемой сортировки клеток (MACS).
  3. Приготовление растворов, пластиковой и стеклянной посуды
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для процедур, описанных ниже, следует придерживаться асептических методов. Процедуры, включающие приготовление раствора, переваривание тканей и выделение клеток, должны проводиться под ламинарным колпаком. Растворы должны быть стерилизованы путем фильтрации с помощью фильтра 0,2 мкм; Хирургические инструменты, а также лабораторная посуда должны быть стерилизованы автоклавированием.
    1. Под ламинарным колпаком приготовьте сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS), не содержащий кальция и магния (HBSS без Ca2+/Mg2+, содержащий 5,3 мМ KCl, 0,4 мМ KH2PO4, 4,2 мМ NaHCO3, 137,9 мМ NaCl, 0,3 мМ Na2HPO4, 5,6 мМ D-глюкозу) для перфузии легких (5 мл на мышь). Стерилизуйте раствор с помощью фильтра 0,2 мкм и наполните раствором шприц.
    2. Под ламинарным колпаком приготовьте сбалансированный раствор соли Хэнкса с кальцием и магнием (HBSS с Ca2+/Mg2+, содержащий 1,3 мМ CaCl2, 0,5 MgCl2·6H2O, 0,4 мМ MgSO4·7H2O, 5,3 мМ KCl, 0,4 мМ KH2PO4, 4,2 мМ NaHCO3, 137,9 мМ NaCl, 0,3 мМ Na2HPO4, 5,6 мМ D-глюкоза), содержащие 0,3 мг/мл коллагеназы IV типа и 1 мг/мл диспазы для перфузии легких (10 мл на мышь). Стерилизуйте раствор с помощью фильтра 0,2 мкм и наполните раствором шприц.
    3. Под ламинарным колпаком приготовьте HBSS с Ca2+/Mg2+, содержащим 0,3 мг/мл коллагеназы IV типа, 1 мг/мл диспазы и 5 мг/мл ДНКазы I для переваривания легких (10 мл на мышь). Стерилизуйте раствор с помощью фильтра 0,2 мкм и наполните раствором шприц.
    4. Под ламинарным колпаком заполните чашку для клеточных культур (35 мм 10 мм, одна чашка на собранное легкое от одной мыши) 2 мл стерильного HBSS с Ca2+/Mg2+. Поставьте тарелку (тарелки), содержащую HBSS с Ca2+/Mg2+ , на лед.

2. Перфузия легких, сбраживание и сбор одноклеточной суспензии

  1. Обезболите мышь путем введения коктейля для анестезии, содержащего 10 мг/мл кетамина и 2 мг/мл ксилазина в дозе 0,01 мл/г массы тела, путем инъекции IP.
  2. Убедитесь, что мышь находится в глубоком бессознательном состоянии, оценив реакцию на щипот пальца ноги. Удалите выпавшие волосы и видимую грязь / мусор с места операции, подстригите и протрите место операции, используя 70% спирт для дезинфекции.
  3. С помощью стерильных хирургических инструментов вскрыть брюшную и грудную полости. Разрежьте ребра и диафрагму, чтобы обнажить легкие и сердце.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечит мгновенную смерть, так как торакотомия приведет к остановке дыхания во время анестезии мыши; При правильном выполнении эта часть процедуры займет до 3 минут от начала процедуры до грудной клетки, за которой последует смерть животного.
  4. Разрежьте нижнюю полую вену и приложите абсорбирующую прокладку для впитывания выделившейся крови.
  5. Перфузируйте легкие in situ через правый желудочек сердца с помощью шприца объемом 10 мл с иглой 25 г x 1 дюйм, заполненной 5 мл стерильного HBSS без Ca2+/Mg2+. Если перфузия прошла успешно, легочная ткань станет белой.
  6. Перфузируйте легкие in situ с помощью шприца объемом 10 мл с иглой 25 г X 1 дюйм, заполненной 10 мл стерильного HBSS с Ca2+/Mg2+, содержащего коллагеназу IV типа (0,3 мг/мл) и диспазу (1 мг/мл).
  7. Извлеките легкие и перенесите их в чашку для клеточных культур (35 мм X 10 мм) с 2 мл стерильного HBSS с Ca2+/Mg2+.
  8. Под ламинарным капюшоном промойте легкие и измельчите их на мелкие кусочки с помощью стерильного хирургического лезвия (#20, подходит для ручки #4). Перенесите измельченное легкое в пробирку объемом 15 мл, добавив первые 5 мл HBSS с Ca2+/Mg2+ , содержащим 0,3 мг/мл коллагеназы IV типа, 1 мг/мл диспазы и 5 мг/мл ДНКазы I, в фарш и перенесите его с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Соберите и перенесите оставшиеся остатки измельченной ткани, промыв чашку для клеточной культуры оставшимися 5 мл HBSS с Ca2+/Mg2+ , содержащими 0,3 мг/мл коллагеназы IV типа, 1 мг/мл диспазы и 5 мг/мл ДНКазы I.
  9. Инкубируйте измельченную легочную ткань в HBSS с Ca2+/Mg2+ , содержащим 0,3 мг/мл коллагеназы IV типа, 1 мг/мл диспазы и 5 мг/мл ДНКазы I, на вращающемся шейкере, поддерживаемом при температуре 37 °C в течение 45 минут. С каждым из трех 15-минутных интервалов под ламинарным капюшоном пропустите измельченную ткань 10 раз через серологическую пипетку объемом 10 мл для лучшей диссоциации клеток.
  10. Полученную клеточную суспензию пропустите через ситечко 100 мкм, чтобы собрать отдельные клетки в пробирку объемом 50 мл, содержащую 20 мл холодного раствора для визуализации живых клеток (физиологический раствор, содержащий 20 мМ HEPES, pH 7,4), содержащего менее 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Соберите клетки центрифугированием при 500 г в течение 10 мин при 4 °C.
  11. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл буфера для лизирования эритроцитов и оставьте пробирку на 5 минут при комнатной температуре (ОТ) для элиминации эритроцитов. Добавьте 20 мл холодного раствора для визуализации живых клеток, содержащего менее 5% FBS. Соберите клетки центрифугированием при 500 г в течение 10 мин при 4 °C.
  12. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 20 мл холодного раствора для визуализации живых клеток, содержащего менее 5% FBS. Полученную клеточную суспензию пропустите через ситечко 40 мкм, чтобы собрать отдельные клетки в пробирку объемом 50 мл, содержащую 20 мл холодного раствора для визуализации живых клеток, содержащего менее 5% FBS. Соберите клетки центрифугированием при 500 г в течение 10 мин при 4 °C.
  13. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 мл холодного раствора для визуализации живых клеток, содержащего менее 5% FBS. Подсчитайте клетки и отрегулируйте концентрацию клеток до ~5-10 x 106 клеток/мл.

3. Выделение ретиноидсодержащих клеток легких с помощью сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS)

  1. Возьмите аликвоту клеточной суспензии и отложите ее в сторону, чтобы использовать ее в качестве неокрашенного средства для контроля стробирования. Добавьте к оставшейся клеточной суспензии краситель для жизнеспособности SYTOX Green (разведение 1:1000, конечная концентрация 30 нМ).
  2. Пропустите клеточные суспензии через фильтр, прикрепленный к сборной трубке из полистирола объемом 5 мл (12 х 75 мм).
  3. Продолжайте выделение клеток FACS путем сортировки живых отдельных ретиноидсодержащих клеток на основе их излучения с длиной волны 455 нм. Выполните последовательную дискриминацию синглетов с помощью графика прямого рассеяния (высота прямого рассеяния/FSC-H в сравнении с прямой областью рассеяния/FSC-A). Исключение мертвых клеток по характеристикам разброса (боковой разброс) и окрашиванию с помощью SYTOX Green.
  4. Забирайте, сортируйте и собирайте одиночные, живые, содержащие ретиноиды клетки, используя излучение с длиной волны 455 нм при возбуждении на длине волны 350 нм.
    Примечание: Используя описанную процедуру, из одного легкого мыши можно собрать около 5,105 ретиноидсодержащих клеток легких.
  5. Выполняйте анализ данных FACS с помощью программного обеспечения для проточной цитометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Выделение ретиноидсодержащих клеток легких
Легкие мышей (от мышей Lrat+/+ и Lrat-/-) ферментативно расщепляли, а суспензии одиночных клеток готовили и подвергали FACS в соответствии с описанной выше процедурой. Сортировка клеток и сбор данных выполнялись на сортировочной системе Cytek Aurora™ Cell Sorter System под управлением программного обеспечения SpectroFlo CS версии 1.3.0 с использованием сопла 100 мкм и давления...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

О способности обнаруживать витамин А в тканях человека и животных и его гистологической визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии впервые сообщалось еще в 1940-х годах. Феномен ретиноидной аутофлуоресценции был затем успешно применен в исследованиях, направленных на обнаружение высоких концентраций витамина А в тканях in vitro61 и характеристику морфогенеза эмбриональных тканей животных

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была профинансирована грантом Национальных институтов здравоохранения/Национальным институтом сердца, легких и крови (NIH/NHLBI) R01 HL171112 (для I.S.), премией за развитие карьеры (для I.S.) от Центра Рутгерса по воздействию окружающей среды и болезням, финансируемым Национальными институтами здравоохранения/Национальным институтом наук об окружающей среде (NIH/NIEHS) P30 ES005022, и стартовые фонды от Ратгерса, Государственного университета Нью-Джерси (до I.S.). Авторы выражают признательность сотрудникам Общего ресурса иммунного мониторинга и проточной цитометрии в Институте рака Рутгерса (частично при финансовой поддержке NCI-CCSG P30CA072770-5920) за их вклад в работу, представленную в данной рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Серологическая пипетка 10 млAvantor/VWR76452-284
100 &микро; m ситечко Greiner Bio-One542000
15 мл соколиная трубкаCorning352099
40 &микро; m ситечко Greiner Bio-One542040
50 мл пробирка для соколаCorning352070
Чашка для клеточных культур, 35 мм и острая; 10 ммCorning430165
Среда для сортировки клетокGibcoA59688DJ
Коллагеназа типа IV Уортингтонская биохимическая корпорацияLS004188 
Система сортировщика клеток Cytek Aurora Cytek Biosciences
Dispase IISigma-AldrichD4693
DNase ISigma-AldrichDN25
Falcon марка 5 мл полипропиленовая трубка с круглым дном, 12 мм и 75 ммCorning352063
марка Falcon 5 мл полистирольная трубка с круглым дном и крышкой клеточного фильтра, 12 мм и острая 75 ммCorning 352235
Программное обеспечение FlowJo Программное обеспечение для проточной цитометрииBecton Dickinson
HBSS с Ca2+/Mg2+Gibco14925-092
HBSS без Ca2+/Mg2+Gibco14175-095
Nalgene Rapid-Flow Стерильные одноразовые фильтры для бутылочекThermoFisher595-3320
Лизис эритроцитов буферSigma-AldrichR7757
SpectroFlo CS программное обеспечение Cytek BiosciencesВерсия 1.3.0 
Хирургический дизайн Royaltek Нержавеющая сталь Хирургические лезвия скальпеляFisher Scientific22-079-683
SYTOX Зеленое окрашивание мертвых клетокInvitrogenS34860
ТамоксифенSigma-AldrichT2859

Ссылки

  1. Shmarakov, I. O., et al. Retinoids stored locally in the lung are required to attenuate the severity of acute lung injury in male mice. Nat Commun. 14 (1), 851(2023).
  2. Bogue, C. W., Jacobs, H. C., Dynia, D. W., Wilson, C. M., Gross, I. Retinoic acid increases surfactant protein mRNA in fetal rat lung in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 271 (5), L862-L868 (1996).
  3. Ng-Blichfeldt, J. -P., et al. Retinoic acid signaling balances adult distal lung epithelial progenitor cell growth and differentiation. EBioMedicine. 36, 461-474 (2018).
  4. Chen, F., et al. Prenatal retinoid deficiency leads to airway hyperresponsiveness in adult mice. J Clin Invest. 124 (2), 801-811 (2014).
  5. Esteban-Pretel, G., Marin, M. P., Renau-Piqueras, J., Barber, T., Timoneda, J. Vitamin A deficiency alters rat lung alveolar basement membrane: reversibility by retinoic acid. J Nutr Biochem. 21 (3), 227-236 (2010).
  6. Massaro, G. D., Massaro, D. Postnatal treatment with retinoic acid increases the number of pulmonary alveoli in rats. Am J Physiol. 270 (2 Pt 1), L305-L310 (1996).
  7. Hind, M., Maden, M. Retinoic acid induces alveolar regeneration in the adult mouse lung. Eur Respir J. 23 (1), 20-27 (2004).
  8. Belloni, P. N., Garvin, L., Mao, C. P., Bailey-Healy, I., Leaffer, D. Effects of all-trans-retinoic acid in promoting alveolar repair. Chest. 117 (5 Suppl 1), 235S-241S (2000).
  9. Veness-Meehan, K. A., Bottone, F. G. Jr, Stiles, A. D. Effects of retinoic acid on airspace development and lung collagen in hyperoxia-exposed newborn rats. Pediatr Res. 48 (4), 434-444 (2000).
  10. Cho, S. J., George, C. L., Snyder, J. M., Acarregui, M. J. Retinoic acid and erythropoietin maintain alveolar development in mice treated with an angiogenesis inhibitor. Am J Respir Cell Mol Biol. 33 (6), 622-628 (2005).
  11. Massaro, G. D., Massaro, D. Retinoic acid treatment abrogates elastase-induced pulmonary emphysema in rats. Nat Med. 3 (6), 675-677 (1997).
  12. Stinchcombe, S. V., Maden, M. Retinoic acid induced alveolar regeneration: critical differences in strain sensitivity. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (2), 185-191 (2008).
  13. Fraslon, C., Bourbon, J. R. Retinoids control surfactant phospholipid biosynthesis in fetal rat lung. Am J Physiol. 266 (6 Pt 1), L705-L712 (1994).
  14. Zachman, R. D. Role of vitamin A in lung development. J Nutr. 125 (6 Suppl), 1634s-1638s (1995).
  15. van Bennekum, A. M., et al. Lipoprotein lipase expression level influences tissue clearance of chylomicron retinyl ester. J Lipid Res. 40 (3), 565-574 (1999).
  16. Blaner, W. S., et al. Lipoprotein lipase hydrolysis of retinyl ester: possible implications for retinoid uptake by cells. J Biol Chem. 269 (24), 16559-16565 (1994).
  17. Trites, M. J., Febbraio, M., Clugston, R. D. Absence of CD36 alters systemic vitamin A homeostasis. Sci Rep. 10 (1), 20386(2020).
  18. Wassef, L., Quadro, L. Uptake of dietary retinoids at the maternal-fetal barrier: in vivo evidence for the role of lipoprotein lipase and alternative pathways. J Biol Chem. 286 (37), 32198-32207 (2011).
  19. Spiegler, E., Kim, Y. -K., Wassef, L., Shete, V., Quadro, L. Maternal-fetal transfer and metabolism of vitamin A and its precursor β-carotene in the developing tissues. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1821 (1), 88-98 (2012).
  20. Kedishvili, N. Y. Enzymology of retinoic acid biosynthesis and degradation. J Lipid Res. 54 (7), 1744-1760 (2013).
  21. Channabasappa, S., Caldwell, S., Kanthan, R., Singh, B. Retinoid receptors are expressed in mouse and human lungs. Anat Rec. 305 (9), 2281-2289 (2022).
  22. Kimura, Y., et al. Retinoid receptors in the developing human lung. Clin Sci (Lond). 103 (6), 613-621 (2002).
  23. Yang, L., Naltner, A., Yan, C. Overexpression of dominant negative retinoic acid receptor alpha causes alveolar abnormality in transgenic neonatal lungs. Endocrinology. 144 (7), 3004-3011 (2003).
  24. Snyder, J. M., et al. Alveolarization in retinoic acid receptor-beta-deficient mice. Pediatr Res. 57 (3), 384-391 (2005).
  25. Gao, R. -w, et al. Retinoic acid promotes primary fetal alveolar epithelial type II cell proliferation and differentiation to alveolar epithelial type I cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (5), 479-487 (2015).
  26. Dirami, G., et al. Lung retinol storing cells synthesize and secrete retinoic acid, an inducer of alveolus formation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (2), L249-L256 (2004).
  27. Massaro, G. D., Massaro, D., Chambon, P. Retinoic acid receptor-alpha regulates pulmonary alveolus formation in mice after, but not during, perinatal period. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 284 (2), L431-L433 (2003).
  28. Massaro, G. D., et al. Retinoic acid receptor-beta: an endogenous inhibitor of the perinatal formation of pulmonary alveoli. Physiol Genomics. 4 (1), 51-57 (2000).
  29. McGowan, S., et al. Mice bearing deletions of retinoic acid receptors demonstrate reduced lung elastin and alveolar numbers. Am J Respir Cell Mol Biol. 23 (2), 162-167 (2000).
  30. Yan, C., et al. Retinoic acid-receptor activation of SP-B gene transcription in respiratory epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 275 (2), L239-L246 (1998).
  31. Ghaffari, M., Whitsett, J. A., Yan, C. Inhibition of hSP-B promoter in respiratory epithelial cells by a dominant negative retinoic acid receptor. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 276 (3), L398-L404 (1999).
  32. Yang, L., et al. Synergy between signal transducer and activator of transcription 3 and retinoic acid receptor-α in regulation of the surfactant protein b gene in the lung. Mol Endocrinol. 18 (6), 1520-1532 (2004).
  33. Metzler, M. D., Snyder, J. M. Retinoic acid differentially regulates expression of surfactant-associated proteins in human fetal lung. Endocrinology. 133 (5), 1990-1998 (1993).
  34. George, T. N., Snyder, J. M. Regulation of surfactant protein gene expression by retinoic acid metabolites. Pediatr Res. 41 (5), 692-701 (1997).
  35. Naltner, A., Ghaffari, M., Whitsett, J. A., Yan, C. Retinoic acid stimulation of the human surfactant protein B promoter is thyroid transcription factor 1 site-dependent. J Biol Chem. 275 (1), 56-62 (2000).
  36. Ng-Blichfeldt, J. P., et al. Deficient retinoid-driven angiogenesis may contribute to failure of adult human lung regeneration in emphysema. Thorax. 72 (6), 510-521 (2017).
  37. Lochbaum, R., et al. Retinoic acid signalling adjusts tight junction permeability in response to air-liquid interface conditions. Cell Signal. 65, 109421(2020).
  38. Mamidi, S., Hofer, T. P., Hoffmann, R., Ziegler-Heitbrock, L., Frankenberger, M. All-trans retinoic acid up-regulates prostaglandin-e synthase expression in human macrophages. Immunobiology. 217 (6), 593-600 (2012).
  39. Hashimoto, S., et al. Retinoic acid differentially regulates interleukin-1beta and interleukin-1 receptor antagonist production by human alveolar macrophages. Leuk Res. 22 (11), 1057-1061 (1998).
  40. Li, S., Lei, Y., Lei, J., Li, H. Alltrans retinoic acid promotes macrophage phagocytosis and decreases inflammation via inhibiting CD14/TLR4 in acute lung injury. Mol Med Rep. 24 (6), (2021).
  41. Nagy, N. E., et al. Storage of vitamin A in extrahepatic stellate cells in normal rats. J Lipid Res. 38 (4), 645-658 (1997).
  42. Thompson, K. C., et al. Primary rat and mouse hepatic stellate cells express the macrophage inhibitor cytokine interleukin-10 during the course of activation in vitro. Hepatology. 28 (6), 1518-1524 (1998).
  43. Zhang, X. Y., Sun, C. K., Wheatley, A. M. A novel approach to the quantification of hepatic stellate cells in intravital fluorescence microscopy of the liver using a computerized image analysis system. Microvasc Res. 60 (3), 232-240 (2000).
  44. D'Ambrosio, D. N., et al. Distinct populations of hepatic stellate cells in the mouse liver have different capacities for retinoid and lipid storage. PLoS One. 6 (9), e24993(2011).
  45. Apte, M. V., et al. Periacinar stellate shaped cells in rat pancreas: identification, isolation, and culture. Gut. 43 (1), 128-133 (1998).
  46. Kim, N., et al. Formation of vitamin A lipid droplets in pancreatic stellate cells requires albumin. Gut. 58 (10), 1382-1390 (2009).
  47. Kida, Y., et al. Characterization of vitamin A-storing cells in mouse fibrous kidneys using Cygb/STAP as a marker of activated stellate cells. Arch Histol Cytol. 70 (2), 95-106 (2007).
  48. Ogawa, T., et al. Identification of vitamin A-free cells in a stellate cell-enriched fraction of normal rat liver as myofibroblasts. Histochem Cell Biol. 127 (2), 161-174 (2007).
  49. Tacke, F., Weiskirchen, R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).
  50. Bartneck, M., et al. Isolation and time lapse microscopy of highly pure hepatic stellate cells. Anal Cell Pathol (Amst). , (2015).
  51. Balaphas, A., et al. Optimized isolation and characterization of C57BL/6 mouse hepatic stellate cells. Cells. 11 (9), (2022).
  52. Kubota, H., Yao, H. L., Reid, L. M. Identification and characterization of vitamin A-storing cells in fetal liver: implications for functional importance of hepatic stellate cells in liver development and hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2339-2349 (2007).
  53. Larsen, A. K., et al. Autofluorescence in freshly isolated adult human liver sinusoidal cells. Eur J Histochem. 65 (4), (2021).
  54. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  55. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , The National Academies Press. Washington DC. (2011).
  56. O'Byrne, S. M., et al. Retinoid absorption and storage is impaired in mice lacking lecithin: retinol acyltransferase (LRAT). J Biol Chem. 280 (42), 35647-35657 (2005).
  57. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  58. McGowan, S. E. The lipofibroblast: more than a lipid-storage depot. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 316 (5), L869-L871 (2019).
  59. Meyer, K. A., Popper, H., Ragins, A. B. Histologic distribution of vitamin A in biopsy specimens of the liver. Arch Surg. 43 (3), 376-385 (1941).
  60. Popper, H. L. Histological demonstration of vitamin A in rats by means of fluorescence microscopy. Proc Soc Exp Biol Med. 43, 133-136 (1940).
  61. Van Exan, R. J., Hardy, M. H. Localization of vitamin A by autofluorescence during induced metaplastic changes in cultures of skin. In Vitro. 15 (8), 631-640 (1979).
  62. Schweigert, F. J., Siegling, C., Tzimas, G., Seeger, J., Nau, H. Distribution of endogenous retinoids, retinoid binding proteins (RBP, CRABPI) and nuclear retinoid X receptor beta (RXRbeta) in the porcine embryo. Reprod Nutr Dev. 42 (4), 285-294 (2002).
  63. Wake, K. Perisinusoidal stellate cells (fat-storing cells, interstitial cells, lipocytes), their related structure in and around the liver sinusoids, and vitamin A-storing cells in extrahepatic organs. Int Rev Cytol. 66, 303-353 (1980).
  64. Senoo, H., Kojima, N., Sato, M. Vitamin A-storing cells (stellate cells). Vitam Horm. 75, 131-159 (2007).
  65. Senoo, H., et al. Hepatic stellate cell (vitamin A-storing cell) and its relative--past, present and future. Cell Biol Int. 34 (12), 1247-1272 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение ретиноидсодержащих клеток легких методом сортировки клеток
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.