Здесь мы представляем протокол использования поверхностных субстратов дрожжей для анализов ферментативной модификации. Платформа была продемонстрирована с использованием анализа активности дефосфорилирования тирозинфосфатазы SHP-2 в отношении одного из ее субстратов в качестве репрезентативного анализа ферментативной модификации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ферментативная модификация и проточная цитометрия оценки белков, отображаемых на поверхности дрожжей
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Поверхностный дисплей дрожжей — это стратегия связывания генотипа и фенотипа, которая обеспечивает высокопроизводительный скрининг функции белка. Традиционно, отображение поверхности дрожжей применялось для эволюции новых связывающих белков, а проточная цитометрия использовалась для оценки и сортировки по уровням прочности связывания. В последнее время наблюдается растущий интерес к применению дрожжевого поверхностного дисплея для скрининга ферментативной модификации вариантов субстрата с аддитивными (например, фосфорилированием) или субтрактивными (например, протеолиз) модификациями, обеспечивающими фенотип, читаемый с помощью проточной цитометрии. Такие модификации регулярно применяются с использованием внутриклеточной колокализации, но возможность достижения внеклеточной ферментативной модификации отображаемых субстратов может открыть гораздо больше реакций для исследования. В данной статье мы описываем методы разработки и применения скрининговых анализов для внеклеточной ферментативной модификации субстратов-кандидатов, отображаемых на поверхности дрожжей, и последующей оценки с помощью анализа проточной цитометрии. Мы приводим эти протоколы в контексте фосфатаз, дефосфорилирующих дрожжевые субстраты, содержащие фосфорилированные остатки тирозина, и комментируем, как эта прикладная структура может быть адаптирована для разработки скрининговых анализов для других пар фермент-субстрат.
Введение
Понимание взаимодействий между ферментами и их мишенями становится все более интересной областью исследований из-за его необходимости в биологической характеристике путей, контролирующих клеточный гомеостази развитие заболеваний. Ферменты отвечают за катализ многих реакций, поддерживающих биологическую жизнь, контролируя необходимые пути, такие как клеточный метаболизм 3,4, передача сигналов5 и даже фундаментальные процессы, такие как восстановление генома 6,7.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Рост клеток дрожжей, содержащих плазмиду и индукция экспрессии белка
- Следуя рецептуре, описанному в таблице 1, приготовьте среды, необходимые для роста неплазмидных дрожжей (YPD), роста плазмидсодержащих дрожжевых клеток (SD-CAA) и индукции экспрессии белка (SRG-CAA), а также планшетов SD-CAA.
- Трансформируйте ДНК дрожжевой дисплейной плазмиды, содержащей пару киназа-субстрат, в дрожжевые клетки EBY-100 с помощью метода30,31 на основе катионов лития, обычно используемого для использования в наборах для трансформации дрожжей от различных производителей.<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Анализ проточной цитометрии из отдельной реплики нашей модельной системы, инкубированной в течение 2 ч без (рис. 1A) и с (рис. 1B) 1000 нМ SHP-2, показал медианную разницу в фосфорилировании в размере 63,6%, которая определяется как отношение медианы по оси Y (фосфорилирования) от всех отображаемых на поверхности событий минус исходный сигнал фосфорилирования, определенный как медиана по оси Y неотображаемых событий между обработанным образцом и необработанным к.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Представленный протокол позволяет проводить анализ ферментативных взаимодействий с использованием внеклеточного отображения белков на поверхности дрожжей. Включение секвестрации эндоплазматического ретикулума в используемую плазмиду с поверхностным дисплеем открывает возможности для анализа специфических взаимодействий между ферментами и посттрансляционно модифицированными субстратами внеклеточно, благодаря внутриклеточным взаимодействиям, которые могут быть спроектированы таким образом,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конфликта интересов, связанного с данной работой, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Эта работа была поддержана премией NSF CAREER L.A.S. (CBET - 2339172) и стартап-фондами из Университета Южной Флориды.
На рисунке 2A значок microtube-open-translucent от Servier https://smart.servier.com/ лицензирован под лицензией CC-BY 3.0 Unported https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/. Модификации включают добавление буфера и дрожжевой клетки (слева) и добавление антитела (в центре справа).
Пробирка, инкубатор и проточный цитометр на рисунке 2А были предоставлены через www.bioicons.com в открытом доступе.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 л Бутылки для мультимедиа | Corning | 06-414-1D | |
| 1,7/2,0 мл микропробирки | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 &микро; L SureOne Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| 1000 &микро; L SureOne Наконечники для пипеток | Fisher Scientific | 02-707-408 | |
| 12 мл Полистирольные трубки с круглым дном | Greiner | 07-000-212 | |
| 3 мл Пластиковые кюветы | МАРКА | 759076D | |
| 300 &микро; L SureOne Наконечники для пипеток | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 5 мл серологических пипеток | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Кислотный казеин (казаминокислоты) | Аналитические | Fisher Scientific BP-1424-500 | |
| Mettler Toledo | 30243397 | ||
| Бактериологическая чашка Петри | Corning | Falcon 351008 | |
| Шкафы биобезопасности | Labconco | Logic Class II, тип A2 302310102 | |
| Биоспектрометр | Eppendorf | Kinetic 6136000010 | |
| Бычья сыворотка Альбумин | Биореагенты | Фишера BP1600-100 | |
| Лимонная кислота | Fisher Scientific | A940-500 | |
| CytoFLEX Проточная цитометрия Анализатор | Beckam Coulter | Cytoflex C09745 | CytExpert программное обеспечение |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Дитиотрейтол | Фишер биореагенты | BP172-5 | |
| Donkey Anti-goat FITC | Invitrogen | A16000 | |
| EDTA | Alfa Aesar | H56165.30 | |
| Ez-Link PEG4-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39259 | |
| Набор для трансформации дрожжей Frozen-EZ II | Zymo Research | T2001 | |
| Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | |
| Холодильник общего назначения | Marvel Scientific | MS24RAS4RW | |
| Goat анти-myc tag антитела | Bethyl | A190-104A | |
| Mictrotube Центрифуга | Eppendorf | 5425 R 5406000313 | |
| Mini Низкотемпературный охлаждаемый инкубатор | Fisher Scientific | 15-015-2632 | |
| Антитела к фосфотирозину у мышей 4G10 | BioXcell | BE0194 | |
| Парапленка M | Bemis | M PM999 | |
| Фосфат буферизованный физиологический раствор | Контроллер пипеток биореагентов | Fisher BP399-500 | |
| Eppendorf | easypet 3 4430000018 | ||
| Raffinose | Thermo Scientific | J21060-36 | |
| Рекомбинантный человеческий активный белок SHP-2 R | & D Systems | 1894-SH | |
| Центрифуга холодильная | Eppendorf | 5910 R | |
| Saccharomyces cerevisiae дрожжевый поверхностный дисплей штамм EBY 100 | ATCC | MYA-4941 | |
| Shaker Incubator | Eppendorf | M1335-0002 Нью-Брансуик Innova 42 | |
| Набор одноканальных пипеток | Eppendorf | 05-403-151 | |
| Хлорид натрия | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Дигидрат цитрата натрия | Fisher | Scientific S279-500 | |
| Диосновной гептагидрат фосфата натрия | Fisher Scientific | S373-500 | |
| Моноосновной моногидрат натрия | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Стрептавидин Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S32357 | |
| Весы с верхней загрузкой | Mettler Toledo | ||
| Tris гидрохлорид | EMD Millipore | 648317-100GM | |
| Трубчатый револьверный ротатор | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| Бумага для взвешивания | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| Дрожжевое азотное основание | BD Difco | 291940 | |
| Zeba Spin Колонны для обессоливания | Термо Сайентиал | 89883 |
Ссылки
- Lea, M. A., Weber, G. Role of enzymes in homeostasis: VIII. Inhibition of the activity of glycolytic enzymes by free fatty acids. J Biol Chem. 243 (6), 1096-1102 (1968).
- Mahé, M., Rios-Fuller, T. J., Karolin, A., Schneider, R. J. Genetics of e....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
