Методическая статья

Ферментативная модификация и проточная цитометрия оценки белков, отображаемых на поверхности дрожжей

DOI:

10.3791/68208

⸱

30 мая 2025 г.

 ,  , 
1Department of Chemical, Biological, and Materials Engineering, University of South Florida

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол использования поверхностных субстратов дрожжей для анализов ферментативной модификации. Платформа была продемонстрирована с использованием анализа активности дефосфорилирования тирозинфосфатазы SHP-2 в отношении одного из ее субстратов в качестве репрезентативного анализа ферментативной модификации.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поверхностный дисплей дрожжей — это стратегия связывания генотипа и фенотипа, которая обеспечивает высокопроизводительный скрининг функции белка. Традиционно, отображение поверхности дрожжей применялось для эволюции новых связывающих белков, а проточная цитометрия использовалась для оценки и сортировки по уровням прочности связывания. В последнее время наблюдается растущий интерес к применению дрожжевого поверхностного дисплея для скрининга ферментативной модификации вариантов субстрата с аддитивными (например, фосфорилированием) или субтрактивными (например, протеолиз) модификациями, обеспечивающими фенотип, читаемый с помощью проточной цитометрии. Такие модификации регулярно применяются с использованием внутриклеточной колокализации, но возможность достижения внеклеточной ферментативной модификации отображаемых субстратов может открыть гораздо больше реакций для исследования. В данной статье мы описываем методы разработки и применения скрининговых анализов для внеклеточной ферментативной модификации субстратов-кандидатов, отображаемых на поверхности дрожжей, и последующей оценки с помощью анализа проточной цитометрии. Мы приводим эти протоколы в контексте фосфатаз, дефосфорилирующих дрожжевые субстраты, содержащие фосфорилированные остатки тирозина, и комментируем, как эта прикладная структура может быть адаптирована для разработки скрининговых анализов для других пар фермент-субстрат.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание взаимодействий между ферментами и их мишенями становится все более интересной областью исследований из-за его необходимости в биологической характеристике путей, контролирующих клеточный гомеостази развитие заболеваний. Ферменты отвечают за катализ многих реакций, поддерживающих биологическую жизнь, контролируя необходимые пути, такие как клеточный метаболизм 3,4, передача сигналов5 и даже фундаментальные процессы, такие как восстановление генома 6,7. В связи с их ролью в этих процессах, их взаимодействие также играет роль в развитии многих заболеваний, так как отклонения в их активности могут вызвать серьезную дисрегуляцию активности клеток, вызывая апоптоз или пролиферацию вредных раковых клеток2. Изучение ферментативной активности имеет важное применение при разработке новых терапевтических средств 8,9, требующих анализов, адаптированных к каждому конкретному взаимодействию фермента и субстрата10. Множественные ферментативные анализы были установлены в качестве стандартных протоколов для оценки и характеризации этих взаимодействий. Анализы, разработанные для анализа ферментативных взаимодействий, классифицируются на детекционные анализы, которые отслеживают связывание для активации/ингибирования11, или анализы, которые контролируют модификацию субстрата ферментами12.

Одной из основных ролей ферментов является регулирование поведения клеток. Сигнальная трансдукция, внутриклеточный ответ клетки на внеклеточный триггер13, отвечает за выживание и функциональность клетки. Пролиферация клеток, дифференцировка и многие другие функциональные процессы включают в себя сигнальные пути с ферментативными взаимодействиями, регулирующими их14,15. Ферменты катализируют посттрансляционные модификации, которые часто модулируют массивные сигнальные сети, ответственные за правильную передачу внеклеточных сообщений16. Фосфорилирование белков является наиболее распространенной посттрансляционной модификацией, повсеместно присутствующей в клеточной сигнализации и многих других клеточных путях. Следовательно, протеинкиназы стали значительной частью потенциальных терапевтических мишеней из-за их критической регуляторнойроли. Фосфатазы являются естественными модулирующими молекулами для клеточных сигнальных комплексов18,19 на основе фосфатов, обладающих способностью удалять остатки фосфатов из белков-мишеней20. В последнее десятилетие фосфатазы стали основной терапевтической мишенью для лечениярака21 и воспалительныхзаболеваний22 на основе их участия в регуляции нисходящих сигнальных путей в нескольких типах клеток. Вместе протеинкиназы и фосфатазы обеспечивают широкий спектр взаимодействий, которые могут быть изучены путем разработки специальных протоколов ферментативного анализа.

Отображение поверхности дрожжей было использовано в качестве инструмента для определения характеристик и оценки ферментативной активности 23,24. Он обеспечивает высокопроизводительную платформу для скрининга процессов посттрансляционной модификации в сочетании со стратегиями секвестрации эндоплазматического ретикулума25,26. Это позволяет парам киназа-субстрат быть колокализованными и удерживаться в эндоплазматическом ретикулуме путем связывания с рецепторами27 KDEL, где фосфорилирование субстрата может происходить с повышенной скоростью из-за близости между киназами и их мишенями. Связывание рецептора KDEL опосредовано С-концевой эндоплазматическим ретикулумом FEHDEL, которая, как было показано, обладает более сильной удерживающей способностью, чем другие последовательности HDEL25,28. Затем фосфорилированный субстрат закрепляют на поверхности дрожжей для его последующей оценки с помощью проточной цитометрии29. В настоящее время не существует обобщенных протоколов для ферментативной модификации субстратов, отображаемых на поверхности дрожжей. Мы расширяем возможности отображения поверхности дрожжей, используя преимущества внеклеточно экспрессируемых фосфорилированных вариантов субстрата и модифицируя их путем дефосфорилирования известной фосфатазой. Анализ проточной цитометрии затем обеспечивает платформу для фенотипической оценки вышеупомянутых субстратов путем измерения изменений в медиане фосфорилирования в результате инкубации с известной фосфатазой. Это обеспечивает адаптируемый метод посттрансляционной модификации поверхностно-отображаемых белков, а также метод ферментативного модифицированного анализа взаимодействий при использовании платформы поверхностного отображения дрожжей.

Мы представляем методы разработки и применения анализа ферментативной модификации, который описывает введение взаимодействия киназы-субстрата в платформу отображения поверхности дрожжей, совместную инкубацию экспрессированного фосфорилированного субстрата с рекомбинантной фосфатазой и последующий анализ активности дефосфорилирования с помощью проточной цитометрии. В данном отчете это достигается за счет совместной локализации цитоплазматического домена CD28 с лимфоцитарной киназой (LCK) в эндоплазматическом ретикулуме дрожжей с последующим отображением фосфорилированного CD28 на поверхности дрожжей и последующим дефосфорилированием с помощью домена, содержащего фосфатазу-2 (SHP-2) области гомологии Src 2. Пан-антифосфотирозиновое антитело (в данном исследовании 4G10), которое обнаруживает фосфорилированные остатки тирозина в широком спектре пептидных последовательностей, используется для количественной оценки уровня фосфорилирования в зависимости от обработки фосфатазой. Детально описанный процесс обеспечивает обобщенный подход к исследованию фермент-субстратных взаимодействий; Перспективный способ изучения ферментов и субстратов в очищенном виде.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Рост клеток дрожжей, содержащих плазмиду и индукция экспрессии белка

  1. Следуя рецептуре, описанному в таблице 1, приготовьте среды, необходимые для роста неплазмидных дрожжей (YPD), роста плазмидсодержащих дрожжевых клеток (SD-CAA) и индукции экспрессии белка (SRG-CAA), а также планшетов SD-CAA.
  2. Трансформируйте ДНК дрожжевой дисплейной плазмиды, содержащей пару киназа-субстрат, в дрожжевые клетки EBY-100 с помощью метода30,31 на основе катионов лития, обычно используемого для использования в наборах для трансформации дрожжей от различных производителей.
    Примечание: Электропорация32 или другие предпочтительные методы трансформации дрожжевой плазмиды могут быть использованы в зависимости от трансформируемой плазмидной конструкции.
  3. Приготовьте культуральную пробирку объемом 14 мл с 10 мл среды YPD. Инокулируют клетки EBY-100 и выращивают в встряхивающем инкубаторе при 30 °С, 300 об/мин до тех пор, пока культура не достигнет оптической плотности (наружный диаметр600 нм) 0,8-1,0 (8 x 106- 1 x 107 клеток/мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наружный диаметр600 нм измеряют путем приготовления 3 мл образцов кювет, содержащих 1:10 разведения дрожжевых культур в соответствующих средах, и 3 мл чистых кювет, содержащих среды, используемые для разведения образца. Программа наружного диаметра600 нм на спектрофотометре используется для измерения сначала заготовки кюветы, затем каждой кюветы образца путем установки соответствующего разведения, подготовленного для каждого образца. 1 наружный диаметр600 нм соответствует 1 ×10 7 дрожжей/мл.
  4. Соберите клетки путем центрифугирования культуры при 1000 x g в течение 3 мин и промойте1-м моющим раствором, входящим в комплект для трансформации дрожжей, или TE (10 мМ Tris-HCl и 1,0 мМ ЭДТА)31.
  5. Снова гранулируйте клетки в дозе 1000 x g в течение 3 минут и повторно суспендируйте в 1 мл буфера для трансформации, предоставленного в наборе для трансформации дрожжей, или в стерильной воде. Элементы должны быть аликвотированы в 50 мкл аликвот и могут храниться при температуре -80 °C до 6 месяцев.
  6. Для трансформации плазмиды готовят одну аликвоту на плазмиду и размораживают на льду, затем непосредственно в клетки добавляют 0,5-1,5 мкг плазмидной ДНК, содержащей конструкцию дисплея дрожжей. Добавляют 0,5 мл раствора для трансформации, предусмотренного в наборе для трансформации дрожжей, или 0,5 мл стерильного 50% полиэтиленгликоля и 0,1 М раствора LiOAc31. Тщательно соедините смесь клеток, плазмидной ДНК и раствора трансформации с помощью пипетирования.
  7. Смесь для трансформации инкубировать статически в течение 30-60 мин при 30 °C, вихревую смесь с интервалом 15 мин. Соберите клетки центрифугированием при 1 000 × г в течение 3 минут.
  8. Приготовьте культуральную пробирку объемом 14 мл с 4,5 мл среды SD-CAA. Ресуспендируйте клетки, содержащие нужную плазмиду, в 500 мкл SD-CAA и инокулируйте приготовленные 4,5 мл.
  9. Стараясь не проколоть агар, распределите 50 мкл из 5 мл инокулированной культуры на планшет SD-CAA и статически инкубируйте при 30 °C в течение 48 ч, чтобы определить эффективность трансформации.
  10. Инкубируйте 5 мл клеточной культуры SD-CAA в встряхивающем инкубаторе при 30 °C, 300 об/мин в течение не менее 18 ч. Контролируйте оптическую плотность (наружный диаметр600 нм) через 16 ч и 20 ч. После того как образец вырос до достаточной оптической плотности, не превышающей 6, центрифугируйте культуру в течение 3 мин при концентрации 2500 × г. Выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив дрожжевые гранулы.
  11. Ресуспендируйте дрожжевую гранулу в SRG-CAA до конечного наружного диаметра600 нм менее 1 (<1 × 107 дрожжей/мл).
  12. Культуру дрожжей инкубировать в встряхивающем инкубаторе при температуре 30 °С, 300 об/мин не менее 8 ч, но не дольше 24 ч.
    Примечание: Индукция экспрессии белка в дрожжевых клетках может варьироваться в диапазоне от 20 до 37 °C. 30 °C подходит для синтеза пар киназа/субстрат 29,33, но может быть скорректирована, если сочтет необходимым для конкретных изучаемых белков.
  13. Измерьте наружный диаметр600 нм для определения плотности ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол можно остановить, храня дрожжевые культуры при температуре 4 °C.

2. Биотинилирование антифосфотирозиновых антител 4G10

  1. Ресуспендируйте флакон 2 мг PEG4-NHS-биотина до конечной концентрации 5 мМ, добавив 680 мкл стерильного PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ресуспендирование PEG4-NHS-биотина следует проводить непосредственно перед проведением реакции биотинилирования. NHS гидролизуется в водном растворе. Использование стерильных PBS и флаконов важно для подготовки реагентов к длительному хранению и для использования в клеточных анализах для смягчения любого потенциального воздействия загрязняющих веществ на жизнеспособность реагентов или выполняемые чувствительные анализы.
  2. Исходя из концентрации антитела 4G10, добавьте 100 мкг антитела в стерильный флакон объемом 1,7 мл.
  3. Добавьте 1 мкл приготовленного 5 мМ PEG4-NHS-биотина с этапа 2,1 во флакон, содержащий 100 мкг антитела 4G10, для достижения молярного соотношения биотина к антителам 7,5:1. Аккуратно пипетируйте смесь, чтобы гомогенизировать реакцию.
  4. Инкубируйте реакцию при комнатной температуре при постоянном вращении не менее 2 ч.
  5. Следуйте протоколу производителя для спиновых обессоливающих колонн объемом 0,5 мл для замены буфера из биотинилированного 4G10 (B-4G10) в PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обессоливающие колонки с молекулярной массой (MWCO) 7 кДа обычно используются для биотинилирования антител, что позволяет удалить непрореагировавший биотин и другие малые молекулы, сохраняя при этом более крупные антитела.
  6. Разбавьте антитело B-4G10 до конечной концентрации 1 мкМ в PBSA (PBS с 1 г/л бычьего сывороточного альбумина). Аликвотируйте антитела B-4G10 в меньшие объемы, чтобы предотвратить повторные циклы замораживания/размораживания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биотинилированные антитела могут храниться при температуре 4 °C для ежедневного использования до 3 месяцев без существенной потери эффективности. Остальные неиспользованные аликвоты храните при температуре -20 °C не более 2 лет.

3. Дефосфорилирование субстратов, экспрессируемых на поверхности дрожжевых клеток

  1. Приготовьте рабочий буферный раствор 2x, как описано ранее в литературе34.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется 2x для облегчения измерения необходимых ингредиентов.
  2. Приготовьте рабочий буфер для образцов во флаконе объемом 1,7 мл, разбавив 2x буферный раствор, приготовленный на шаге 3.1 1:2 в деионизированной воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий реакционный объем для каждого образца составит 20 мкл, и для каждого образца потребуется от 10 до 18 мкл рабочего буфера. Подготовьте достаточное количество рабочего буфера для всех образцов или контрольных элементов.
  3. После рекомендованной пробоподготовки, описанной в таблице 2, пометьте флаконы объемом 1,7 мл соответствующим контрольным или наименованием образца.
  4. На основе наружного диаметра600 нм, измеренного на шаге 1.9, рассчитайте объем культуры, необходимый для извлечения двух миллионов (2 × 106) дрожжевых клеток из соответствующей культуры дрожжей для каждого образца.
  5. В флакон объемом 1,7 мл для каждого образца добавьте рассчитанный на предыдущем шаге объем культуры дрожжей.
  6. Центрифугируйте флакон в течение 1 минуты при концентрации 4 500 × г. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки и выбросьте как биологически опасные отходы.
  7. Повторно суспендируйте гранулированные клетки в 1 мл PBSA и повторите шаг 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить как можно больше надосадочной жидкости, не нарушая гранулированные клетки.
  8. Исходя из исходной концентрации, рассчитайте объем рекомбинантного человеческого SHP-2, необходимый для получения конечной концентрации 1000 нМ в общем объеме реакции 20 мкл.
    Примечание: Рекомбинантный SHP-2 следует аликвотировать в небольших объемах, чтобы любой белок, используемый в каждом анализе, не прошел более двух циклов замораживания-размораживания. Любой SHP-2, оставшийся от аликвоты после того, как все образцы были подготовлены для анализа, должен быть отбракован.
    Исходные концентрации рекомбинантных ферментов могут варьироваться в зависимости от номера партии. Рекомбинантный SHP-2 обычно изготавливается в исходной концентрации 0,2-0,4 мг/мл. Для исходной концентрации 0,324 мг/мл SHP-2 это соответствует исходной концентрации 4,696 мкМ (SHP-2 имеет молекулярную массу 69 кДа). 4,26 мкл запаса SHP-2 в реакции объемом 20 мкл приводит к конечной концентрации SHP-2 в 1000 нМ SHP-2.
  9. Добавьте 7,7 мг DTT в 10 мл деионизированной воды, приготовленной в конической форме объемом 15 мл, чтобы получить раствор DTT массой 5 мМ. Если ограничения оборудования затрудняют взвешивание миллиграммов, добавьте 0,77 г DTT к 10 мл деионизированной воды, затем выполните 100-кратное разбавление, чтобы получить 5 мМ раствор DTT, используемый для анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор DTT может быть приготовлен в исходных растворах с более высокой концентрацией, которые должны быть разбавлены до 5 мМ, если невозможно измерить количество в миллиграммах с помощью имеющегося оборудования. Раствор DTT необходимо готовить свежей предшествующей ресуспензией клеток в рабочем буфере из-за его склонности к гидролизу, что делает его нестабильным в течение длительного времени при разбавлении в воде.
  10. Повторно суспендируйте гранулированные элементы в рабочем буфере, подготовленном на стадии 3.2, таким образом, чтобы конечный объем реакции в каждом образце или контроле составлял 20 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество добавленного рабочего буфера должно быть рассчитано на основе количества DTT (2 μL) и SHP-2 (рассчитанного на шаге 3.8), которое будет в каждом образце.
  11. Добавьте 2 мкл 5 мМ раствора DTT, приготовленного на стадии 3.9, в каждый образец или контрольную часть до конечной реакционной концентрации 0,5 мМ DTT.
  12. Добавьте объем SHP-2, рассчитанный на шаге 3.8, в каждый образец до конечного объема 20 мкл и аккуратно перемешайте с помощью микропипетки.
  13. Оберните крышки флаконов с образцами парапленкой, чтобы предотвратить утечку или перекрестное загрязнение.
  14. Инкубируйте образцы при температуре 37 °C в течение 2 ч на роторе с постоянной частотой вращения.
  15. Извлеките образцы из ротора и остановите реакцию, добавив 1 мл PBSA в каждую пробу.
  16. Повторите шаг 3.6.

4. Мечение клеток и анализ проточной цитометрии дефосфорилированных субстратов

  1. Ресуспендируйте образцы с этапа 3.16 в смесь соответствующих первичных реагентов объемом 20 мкл, как описано в таблице 2. Инкубируйте образцы в течение 20 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все используемые концентрации реагентов были рассчитаны как превышающие количество белков, экспрессируемых на поверхности дрожжевых клеток. Расчет предполагает экспрессию 10 000 белков на клетку от всех 2 x 106 дрожжей в образце35, в то время как обычно это делают только ~50% из них. В таблице 3 показано избыточное соотношение реагентов для мечения для каждого из реагентов, выраженное в таблице 2, рассчитанное следующим образом:
    figure-protocol-1
  2. Центрифугируйте образцы при концентрации 4 500 × г в течение 1 минуты и выбросьте надосадочную жидкость как биологически опасные отходы.
  3. Промойте клетки один раз, повторно суспендируя в 1 мл PBSA. Повторите шаг 4.2.
  4. Ресуспендируйте образцы в смесь соответствующих вторичных реагентов объемом 20 мкл, как описано в таблице 2. Инкубируйте образцы в течение 15 минут при отсутствии света.
  5. Повторите шаг 4.2.
  6. Повторите шаг 4.3.
  7. Повторно суспендируйте промытые образцы в 300-500 мкл PBSA и переложите в полистирольные пробирки объемом 5 мл для немедленного анализа с помощью соответствующего проточного цитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо транспортировать образцы, держите их на мокром льду. Это не рекомендуется, но образцы можно хранить при температуре 4 °C не более 2 часов в виде влажных гранул.
  8. После выполнения необходимого запуска и подготовки цитометра к новому эксперименту нажмите кнопку «Новый эксперимент » в меню «Файл », назовите эксперимент и нажмите «Сохранить », чтобы убедиться, что полученные данные сохраняются в нужном пути к файлу.
  9. Выберите значок точечной диаграммы на верхней панели инструментов, чтобы создать две или более точечных диаграмм для каждого запускаемого образца. Для одной из точечных диаграмм выберите имя по оси X, чтобы отобразить канал FSC-A, и имя по оси Y, чтобы отобразить канал SSC-A. Этот график показывает боковое рассеивание - площадь в сравнении с прямым рассеиванием - площадь и используется для шлюзования дрожжевых клеток для дальнейшего анализа.
  10. На другой точечной диаграмме выберите имя по оси X, чтобы отобразить канал, в котором флуоресцирует вторичный реагент, нацеленный на первичное антитело антиэпитопной метки. Выберите имя по оси Y, чтобы отобразить канал, в котором флуоресцирует вторичный реагент стрептавидина. На этом графике будут показаны только события, забитые с боковой стороны по сравнению с прямой диаграммой рассеяния в виде дрожжевых клеток, и он используется для отображения фосфорилирования тирозина по оси Y и экспрессии поверхности субстрата по оси X.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном примере вторичный реагент, нацеленный на первичное антитело против эпитопной метки, флуоресцирует в канале FITC (AF-488), а вторичный реагент стрептавидина флуоресцирует в канале AF-647. Используемые каналы могут различаться в зависимости от первичных и вторичных реагентов, используемых при мечении.
  11. Поместите каждую пробирку с образцом в держатель пробирки цитометра и выберите «Запустить», чтобы цитометр начал загрузку образца и сбор данных. При необходимости настройте события для отображения, события для записи, время для записи и скорость потока выборки.
  12. Определите ворота, окружающие здоровые дрожжевые клетки, на графике SSC-A и FSC-A, созданном на шаге 4.9. На рисунке 1 показано описательное представление применяемой стратегии стробирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На графике SSC-A в сравнении с FSC-A 100 000 событий для отображения и 50 000 событий для записи в пределах определенного дрожжевого затвора является хорошим ориентиром для визуализации и сбора достаточного количества данных для дальнейшего анализа. Более строгие стратегии стробирования для отбора синглетных дрожжей могут быть применены на основе графика зависимости прямой высоты рассеяния от прямой площади рассеяния, о чем недавно сообщалось36. Стратегия стробирования, показанная на рисунке 1 , соответствует менее строгому подходу, включающему синглетные и некоторые дублетные дрожжи с помощью дистракционного стробирования.
  13. Запись флуоресценции всех контрольных образцов с помощью анализатора проточной цитометрии. Сначала обычно собираются контрольные выборки, чтобы помочь определить стратегию стробирования, как описано ниже на шаге 4.14.
  14. Определите стратегию литникования для графика, созданного на шаге 4.10, перед анализом обработанных образцов. На рисунке 1 показано описательное представление применяемой стратегии стробирования.
  15. Зарегистрируйте флуоресценцию дефосфорилированных образцов с помощью проточного цитометра и стратегии стробирования, определенной в шагах 4.12 и 4.14.
  16. Анализируйте данные проточной цитометрии, полученные с помощью программного обеспечения для анализа проточной цитометрии.
  17. Оцените дефосфорилирование путем измерения и сравнения медианы по оси Y клеток, экспрессирующих белок на своей поверхности, и исходного фосфорилирования, обеспечиваемого непроявляющими клетки между образцами и контролем. Рассчитайте разницу в процентах медианного фосфорилирования следующим образом:
    figure-protocol-2

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ проточной цитометрии из отдельной реплики нашей модельной системы, инкубированной в течение 2 ч без (рис. 1A) и с (рис. 1B) 1000 нМ SHP-2, показал медианную разницу в фосфорилировании в размере 63,6%, которая определяется как отношение медианы по оси Y (фосфорилирования) от всех отображаемых на поверхности событий минус исходный сигнал фосфорилирования, определенный как медиана по оси Y неотображаемых событий между обработанным образцом и необработанным к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный протокол позволяет проводить анализ ферментативных взаимодействий с использованием внеклеточного отображения белков на поверхности дрожжей. Включение секвестрации эндоплазматического ретикулума в используемую плазмиду с поверхностным дисплеем открывает возможности для анализа специфических взаимодействий между ферментами и посттрансляционно модифицированными субстратами внеклеточно, благодаря внутриклеточным взаимодействиям, которые могут быть спроектированы таким образом,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конфликта интересов, связанного с данной работой, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана премией NSF CAREER L.A.S. (CBET - 2339172) и стартап-фондами из Университета Южной Флориды.

На рисунке 2A значок microtube-open-translucent от Servier https://smart.servier.com/ лицензирован под лицензией CC-BY 3.0 Unported https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/. Модификации включают добавление буфера и дрожжевой клетки (слева) и добавление антитела (в центре справа).

Пробирка, инкубатор и проточный цитометр на рисунке 2А были предоставлены через www.bioicons.com в открытом доступе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 л Бутылки для мультимедиа Corning06-414-1D
1,7/2,0 мл микропробиркиAxygenMCT-175-C
10 &микро; L SureOne Pipet TipsFisher Scientific02-707-438
1000 &микро; L SureOne Наконечники для пипетокFisher Scientific02-707-408
12 мл Полистирольные трубки с круглым дномGreiner07-000-212
3 мл Пластиковые кюветыМАРКА759076D
300 &микро; L SureOne Наконечники для пипетокFisher Scientific02-707-411
5 мл серологических пипетокFisher Scientific13-678-11D
Кислотный казеин (казаминокислоты)АналитическиеFisher Scientific BP-1424-500
 Mettler Toledo30243397
Бактериологическая чашка Петри CorningFalcon 351008
Шкафы биобезопасностиLabconcoLogic Class II, тип A2  302310102
БиоспектрометрEppendorfKinetic 6136000010
Бычья сыворотка АльбуминБиореагентыФишера BP1600-100
Лимонная кислотаFisher ScientificA940-500
CytoFLEX Проточная цитометрия Анализатор Beckam CoulterCytoflex C09745CytExpert программное обеспечение
DextroseFisher ScientificD16-1
ДитиотрейтолФишер биореагентыBP172-5
Donkey Anti-goat FITCInvitrogenA16000
EDTAAlfa AesarH56165.30
Ez-Link PEG4-NHS-BiotinThermo ScientificA39259
Набор для трансформации дрожжей Frozen-EZ II Zymo ResearchT2001
GalactoseFisher ScientificBP656-500
Холодильник общего назначенияMarvel ScientificMS24RAS4RW
Goat анти-myc tag антитела BethylA190-104A
Mictrotube Центрифуга Eppendorf5425 R 5406000313
Mini Низкотемпературный охлаждаемый инкубаторFisher Scientific15-015-2632
Антитела к фосфотирозину у мышей 4G10BioXcellBE0194
Парапленка MBemisM PM999
Фосфат буферизованный физиологический раствор Контроллер пипеток биореагентовFisher BP399-500
 Eppendorfeasypet 3 4430000018
RaffinoseThermo ScientificJ21060-36
Рекомбинантный человеческий активный белок SHP-2 R& D Systems1894-SH
Центрифуга холодильная Eppendorf5910 R
Saccharomyces cerevisiae дрожжевый поверхностный дисплей штамм EBY 100ATCCMYA-4941
Shaker IncubatorEppendorfM1335-0002 Нью-Брансуик Innova 42 
Набор одноканальных пипеток Eppendorf05-403-151
Хлорид натрияFisher ScientificS671-500
Дигидрат цитрата натрияFisherScientific S279-500
Диосновной гептагидрат фосфата натрияFisher ScientificS373-500
Моноосновной моногидрат натрияFisher ScientificS468-500
Стрептавидин Alexa Fluor 647InvitrogenS32357
Весы с верхней загрузкойMettler Toledo
Tris гидрохлоридEMD Millipore648317-100GM
Трубчатый револьверный ротаторFisher Scientific11-676-341
Бумага для взвешивания Fisher Scientific09-898-12B
Дрожжевое азотное основаниеBD Difco291940
Zeba Spin Колонны для обессоливания  Термо Сайентиал89883
весы

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lea, M. A., Weber, G. Role of enzymes in homeostasis: VIII. Inhibition of the activity of glycolytic enzymes by free fatty acids. J Biol Chem. 243 (6), 1096-1102 (1968).
  2. Mahé, M., Rios-Fuller, T. J., Karolin, A., Schneider, R. J. Genetics of enzymatic dysfunctions in metabolic disorders and cancer. Front Oncol. 13, 1230934(2023).
  3. Fernandez-de-Cossio-Diaz, J., Vazquez, A. A physical model of cell metabolism. Sci Rep. 8 (1), 8349(2018).
  4. Metallo, C. M., Vander Heiden, M. G. Understanding metabolic regulation and its influence on cell physiology. Mol Cell. 49 (3), 388-398 (2013).
  5. Mildvan, A. S. Mechanisms of signaling and related enzymes. Proteins. 29 (4), 401-416 (1997).
  6. Frosina, G. Overexpression of enzymes that repair endogenous damage to DNA. Eur J Biochem. 267 (8), 2135-2149 (2000).
  7. Schärer, O. D. Chemistry and biology of DNA repair. Angew Chem Int Ed. 42 (26), 2946-2974 (2003).
  8. de la Fuente, M., et al. Enzyme therapy: Current challenges and future perspectives. Int J Mol Sci. 22 (17), 9181(2021).
  9. Robertson, J. G. Enzymes as a special class of therapeutic target: clinical drugs and modes of action. Curr Opin Struct Biol. 17 (6), 674-679 (2007).
  10. Goddard, J. -P., Reymond, J. -L. Enzyme assays for high-throughput screening. Curr Opin Biotechnol. 15 (4), 314-322 (2004).
  11. Helm, J. S., Hu, Y., Chen, L., Gross, B., Walker, S. Identification of active-site inhibitors of MurG using a generalizable, high-throughput glycosyltransferase screen. J Am Chem Soc. 125 (37), 11168-11169 (2003).
  12. Veldhuyzen, W. F., Nguyen, Q., McMaster, G., Lawrence, D. S. A light-activated probe of intracellular protein kinase activity. J Am Chem Soc. 125 (44), 13358-13359 (2003).
  13. Torres, M., Forman, H. J. Encyclopedia of Respiratory. Laurent, G. J., Shapiro, S. D. , Academic Press. 10-18 (2006).
  14. Blume-Jensen, P., Hunter, T. Oncogenic kinase signalling. Nature. 411 (6835), 355-365 (2001).
  15. Martin, G. S. Cell signaling and cancer. Cancer Cell. 4 (3), 167-174 (2003).
  16. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  17. Graves, J. D., Krebs, E. G. Protein phosphorylation and signal transduction. Pharmacol Ther. 82 (2), 111-121 (1999).
  18. Hafen, E. Kinases and phosphatases--A marriage is consummated. Science. 280 (5367), 1212-1213 (1998).
  19. Westphal, R. S., Anderson, K. A., Means, A. R., Wadzinski, B. E. A signaling complex of Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase IV and protein phosphatase 2A. Science. 280 (5367), 1258-1261 (1998).
  20. Barford, D., Das, A. K., Egloff, M. -P. The structure and mechanism of protein phosphatases: Insights into catalysis and regulation. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 27, 133-164 (1998).
  21. Liu, Q., Qu, J., Zhao, M., Xu, Q., Sun, Y. Targeting SHP2 as a promising strategy for cancer immunotherapy. Pharmacol Res. 152, 104595(2020).
  22. Pan, J., Zhou, L., Zhang, C., Xu, Q., Sun, Y. Targeting protein phosphatases for the treatment of inflammation-related diseases: From signaling to therapy. Signal Transduct Targeted Ther. 7 (1), 177(2022).
  23. Denard, C. A., et al. YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants. ACS Synth Biol. 10 (1), 63-71 (2021).
  24. Lim, S., Glasgow, J. E., Filsinger Interrante, M., Storm, E. M., Cochran, J. R. Dual display of proteins on the yeast cell surface simplifies quantification of binding interactions and enzymatic bioconjugation reactions. Biotechnol J. 12 (5), (2017).
  25. Yi, L., et al. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (18), 7229-7234 (2013).
  26. Yi, L., et al. Yeast endoplasmic reticulum sequestration screening for the engineering of proteases from libraries expressed in yeast. Methods Mol Biol. 1319, 81-93 (2015).
  27. Semenza, J. C., Hardwick, K. G., Dean, N., Pelham, H. R. ERD2, a yeast gene required for the receptor-mediated retrieval of luminal ER proteins from the secretory pathway. Cell. 61 (7), 1349-1357 (1990).
  28. Mei, M., et al. Characterization of aromatic residue-controlled protein retention in the endoplasmic reticulum of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 292 (50), 20707-20719 (2017).
  29. Ezagui, J., Russell, B., Mairena, Y., Stern, L. A. Endoplasmic reticulum sequestration empowers phosphorylation profiling on the yeast surface. AIChE J. 68 (12), e17931(2022).
  30. Kawai, S., Murata, K. Genetic Transformation Systems in Fungi. van den Berg, M. A., Maruthachalam, K. 1, Springer International Publishing. 187-192 (2015).
  31. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  32. Loock, M., et al. High-efficiency transformation and expression of genomic libraries in yeast. Methods Protoc. 6 (5), 89(2023).
  33. Huang, D., Gore, P. R., Shusta, E. V. Increasing yeast secretion of heterologous proteins by regulating expression rates and post-secretory loss. Biotechnol Bioeng. 101 (6), 1264-1275 (2008).
  34. Yu, B., et al. Targeting protein tyrosine phosphatase SHP2 for the treatment of PTPN11-associated malignancies. Mol Cancer Ther. 12 (9), 1738-1748 (2013).
  35. Stern, L. A., et al. Geometry and expression enhance enrichment of functional yeast-displayed ligands via cell panning. Biotechnol Bioeng. 113 (11), 2328-2341 (2016).
  36. Pan, X., et al. Optimized single-cell gates for yeast display screening. Protein Eng Design Sel. 38, gzae018(2025).
  37. Margittai, É, et al. Production of H2O2 in the endoplasmic reticulum promotes in vivo disulfide bond formation. Antioxid Redox Signal. 16 (10), 1088-1099 (2012).
  38. Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Rev. 57 (2), 383-401 (1993).
  39. Ezagui, J., Stern, L. A. Tyrosine phosphorylation screening on the yeast surface by magnetic bead selection and FACS. Methods Mol Biol. 2681, 275-290 (2023).
  40. Yarnall, M. T. N., Kim, S. H., Korntner, S., Bishop, A. C. Destabilization of the SHP2 and SHP1 protein tyrosine phosphatase domains by a non-conserved “backdoor” cysteine. Biochem Biophys Rep. 32, 101370(2022).
  41. Dustin, C. M., Heppner, D. E., Lin, M. J., van der Vliet, A. Redox regulation of tyrosine kinase signalling: more than meets the eye. J Biochem. 167 (2), 151-163 (2020).
  42. Stern, L. A., Csizmar, C. M., Woldring, D. R., Wagner, C. R., Hackel, B. J. Titratable avidity reduction enhances affinity discrimination in mammalian cellular selections of yeast-displayed ligands. ACS Comb Sci. 19 (5), 315-323 (2017).
  43. Waldman, A. C., Rao, B. M., Keung, A. J. Mapping the residue specificities of epigenome enzymes by yeast surface display. Cell Chem Biol. 28 (12), 1772-1779.e4 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Yeast Surface DisplayProtein DephosphorylationSubstrate ScreeningPhosphorylation AnalysisSHP 2 PhosphataseExtracellular Enzyme AssayHigh Throughput ScreeningGating Strategy

Похожие статьи