Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генетическая трансформация, опосредованная Agrobacterium tumefaciens у Solanum nigrum

908 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68212

⸱

24 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Agriculture and Life Science, Liaocheng University

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье представлен подробный протокол метода генетической трансформации, опосредованного Agrobacterium tumefaciens, для получения трансгенного Solanum nigrum.

Аннотация

Пасленум черный –сиротский пасленовый родственник картофеля и томата, а его плоды в свежем виде – питательная и вкусная ягода. Все растение S. nigrum можно использовать в качестве лекарства. Тем не менее, дикий S. nigrum обладает некоторыми нежелательными чертами. К счастью, методы генной инженерии, особенно технологии редактирования генов, такие как CRISPR/Cas9, предлагают ценные возможности для быстрого улучшения S. nigrum путем устранения этих недостатков. У большинства растений улучшение растений с помощью технологии редактирования генов достигается за счет генетической трансформации, опосредованной Agrobacterium tumefaciens. В этой статье мы подробно описали протоколы генетической трансформации, опосредованные A. tumefaciens у S. nigrum. Семядоли и гипокотилы сеянцев S. nigrum использовались в качестве эксплантов для генетической трансформации. Поскольку S. nigrum устойчив к канамицину, ген DsRed был использован в качестве визуального маркера для идентификации трансгенных растений. Генетическая трансформация S. nigrum может быть эффективно завершена в соответствии с этими операционными протоколами. Обнаружение трансгенных растений Т1 может быть непосредственно идентифицировано по тому, излучают ли они красную флуоресценцию, без необходимости идентификации ПЦР.

Введение

Solanum nigrum (известный как черный паслен, 2n = 6x = 72) является пасленовым родственником картофеля и томата1. Плод представляет собой шаровидную ягоду, которая после созревания становится черной. Свежий плод – питательная и вкусная ягода. Все растение S. nigrum можно использовать в качестве лекарства, с эффектом рассеивания застоя крови, уменьшения отека, снятия жара и детоксикации. S. nigrum синтезирует два различных класса специализированных метаболитов из обычного предшественника холестерина: стероидные сапонины в листьях и стероидные гликоалкалоиды (SGA) в его ягодах. Уттрозид B, стероидный сапонин, полученный из S. nigrum, недавно был одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США в качестве орфанного препарата для лечения гепатоцеллюлярной карциномы2. Нокаут гена GAME15 у S. nigrum привел к тому, что растениям не хватало как сапонинов, так и стероидных алкалоидов, а также показал, что стероидные сапонины контролируют серьезных сельскохозяйственных насекомых-вредителей2. Полифенолы в S. nigrum снижают вес и жировые отложения в организме, влияя на метаболизм адипоцитов и липидов3. S. nigrum может обогащать кадмий и используется в качестве модельной установки для изучения обогащения кадмием 4,5. S. nigrum является неодомашненным растением, и его исследовательская база относительно слаба. Вдохновляет тот факт, что в последние годы исследования S. nigrum постепенно расширяются. Недавно был собран геном гексаплоида S. nigrum, и S. nigrum, возможно, эволюционировал из его диплоида Solanum americanum (2n = 2x = 24)6,7. Таким образом, S. nigrum является растением, которое обладает как лекарственной, так и съедобной ценностью. Исследования S. nigrum не только способствуют более глубокому пониманию его потенциального применения в лечении заболеваний человека, но и дают ценную информацию об увеличении сельскохозяйственного производства. Таким образом, создание системы генетической трансформации у S. nigrum является основой для генетического улучшения с помощью трансгенных технологий и технологий редактирования генов.

Существует несколько докладов, посвященных генетической трансформации S. nigrum, опосредованной Agrobacterium tumefaciens, 8,9,10,1 1. В нашей предыдущей работе мы создали LBA4404-опосредованную систему генетической трансформации A. tumefaciens для S. nigrum и трансформировали AcMYB110 в S. nigrum, получив новые зародышевые плазмы S. nigrum с повышенным содержанием антоцианов1. Трансгенные и генетически отредактированные растения S. nigrum были получены с помощью A. tumefaciens EHA105-опосредованной генетической трансформации10. Различные флуоресцентные белки имеют зеленое, красное, желтое, оранжевое и синее флуоресцентное излучение и широко используются для индикацииактивности клеточной жизни. В процессе генетической трансформации растений красные флуоресцентные гены часто используются в качестве репортерных генов для различения генетически модифицированных событий и негенетически модифицированных событий. Использование гена DsRed в качестве репортерного гена позволяет удобно различать трансгенные события, в то время как использование транскрипционного фактора R2R3-MYB в качестве репортерного гена может зависеть от генотипа растений14. В трансгенном потомстве трансгенные растения также могут быть легко отличимы от нетрансгенных растений с помощью оптических инструментов (например, флуоресцентных микроскопов или систем визуализации), что устраняет необходимость идентификации на основе ПЦР. Путем интеграции репортерного гена флуоресцентного белка с технологией редактирования генов CRISPR, гены фертильности у кукурузы были точно удалены, что привело к созданию ядерной стерильной линии и контролируемой стерильной линии15. Самоопыляемость и плодоношение растений-производителей приведет к получению потомства 1:1 от поддерживающих и стерильных линий. Основываясь на различных люминесцентных характеристиках, неразрушающая сортировка семян поддерживающих и стерильных линий может быть достигнута с помощью визуального или машинного распознавания15. Таким образом, использование гена флуоресцентного белка в качестве репортерного гена упрощает идентификацию трансгенных семян или растений без необходимости проведения ПЦР-анализа. Это представляет собой существенное преимущество в области генетической трансформации. Этот метод направлен на описание протокола генетической трансформации, опосредованной Agrobacterium tumefaciens, у S. nigrum, с использованием красного флуоресцентного гена DsRed в качестве репортерного гена.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Асептическое выращивание рассады

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются на сверхчистом скамейке.

  1. Соберите дикие семена S. nigrum в городе Ляочэн, Китай, и назовите их Snlc1. Возьмите 50 диких семян S. nigrum и поместите их в центрифужную пробирку объемом 2 мл. После замачивания в 1 мл 5% гиббереллина на 30 минут выбросьте раствор гиббереллина.
  2. Добавьте 1 мл 75% этанола, встряхните в течение 1 минуты, а затем выбросьте этанол.
  3. Добавьте 1 мл 2% раствора гипохлорита натрия и продезинфицируйте поверхность семян в течение 10 мин. Тщательно встряхните трубку центрифуги, чтобы простерилизовать поверхность семян. Через 10 минут выбросьте гипохлорит натрия.
  4. Промойте семена 5 раз стерилизованной водой, чтобы удалить остатки гипохлорита натрия. Поместите семена в чашки Петри диаметром 90 мм, содержащие 1/2 MS твердой среды. Культивируйте пластины в камере роста растений при фотопериоде 16 ч в свете/8 ч в темноте при 25 °C (рис. 1A).

2. Культура A. tumefaciens LBA4404

  1. Двоичный вектор pRed130516 , содержащий красный флуоресцентный ген DsRed2, в A. tumefaciens LBA4404 путем электропорации с помощью MicroPulser с параметрами: Напряжение 1800 В, Емкость 25 мкФ, Сопротивление 200 Ω, Кювета 1 мм. Культивируют бактерии на твердой среде LB с 50 мг/л канамицина и 50 мг/л рифампицина при 28 °C в течение 48 ч.
  2. Возьмите один клон LBA4404 содержащем pRed1305 и культивируйте его в 1 мл жидкой среды LB с 50 мг/л канамицина и 50 мг/л рифампицина в центрифужной пробирке объемом 15 мл в настольном концентраторе со скоростью вращения 180 об/мин при 28 °C в течение 12 ч.
  3. Добавьте 50 мл жидкого LB с тем же антибиотиком к 1 мл бактериального раствора и затем заселите в настольном концентраторе со скоростью 200 об/мин при 28 °C в течение 6 ч.
  4. Прекратите культивирование, когда наружный диаметр600 бактериальной питательной среды составит 0,4, а затем центрифугируйте бактериальный раствор при 2200 x g в течение 10 мин при 25 °C.
  5. Ресуспендируют центрифугированные бактерии раствором инфекции (IS: M519 4,43 г/л, сахароза 30 г/л, 6-БА 2 мг/л, AS, 100 моль/л, pH 5,8) и отрегулируют концентрацию бактериального раствора до OD600= 0,6 с помощью спектрофотометра.

3. Эксплантная инфекция A. tumefaciens

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются на сверхчистом скамейке.

  1. Выращивайте семена в течение 7 дней, пока семядоли не раскроются (рисунок 1B). Стерилизованным острым скальпелем в посуде для культуры срежьте две семядоли и гипокотиль длиной примерно 1 см и выбросьте первичные корни. Будьте осторожны при использовании скальпеля.
  2. Настаивать экспланты в растворе инфекции в течение 30 минут. Поместите экспланты на сухую фильтровальную бумагу, чтобы бактериальный раствор на поверхности экспланта впитался.
  3. Поместите экспланты в твердую среду IS (0,7% агара; Рисунок 1С). Поместите экспланты в камеру для роста растений без освещения при температуре 19 °C и выращивайте в течение 3 дней.

4. Дифференциация эксплантов

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются на сверхчистом скамейке.

  1. Поднимите экспланты из камеры роста растений при температуре 19 °C. Промойте экспланты стерилизованной водой 5 раз и поместите экспланты на сухую стерилизованную фильтровальную бумагу.
  2. Поместите экспланты в среду для дифференцировки побегов (SD: M519 4,43 г/л, сахароза 30 г/л, 6-BA 2 мг/л, ZT 0,5 мг/л, Cef 100 мг/л, Carb 100 мг/л, 0,7 г/л агара, pH 5,8) и культивируйте при температуре 25 °C в течение 4 недель (рис. 1D, E).
  3. Срежьте каллус/бутоны эксплантов с красной флуоресценцией под зеленым возбуждающим светом ручной люминесцентной лампы с помощью скальпеля, а затем перенесите их в новую среду SD и продолжайте культивировать в течение 4 недель при 25 °C (рис. 1F, G).

5. Укоренение и пересадка

  1. Срежьте бутоны с красной флуоресценцией с помощью ручной люминесцентной лампы, перенесите их в среду для укоренения (RM: M519 4,43 г/л, сахароза 30 г/л, 6-BA 2 мг/л, ZT 0,5 мг/л, Cef 100 мг/л, Carb 100 мг/л, 0,7 г/л агара, pH 5,8) и культивируйте их в течение 2-4 недель при 25 °C для стимулирования образования корней.
  2. Пересадите в почву рассаду с красной флуоресценцией и длиной корня более 2 см (рисунок 1H-K). Перед пересадкой удалите агар с корней вручную, чтобы избежать чрезмерного роста бактерий в корнях.

6. Тестирование генетически модифицированных растений Т0 с ПЦР-амплификацией

  1. Экстрагировать геномную ДНК независимой трансгенной линии методом бромида цетилтриметиламмония (CTAB)17.
  2. Амплифицируйте ген DsRed с помощью набора праймеров, RedF (5'-TGGCCTCCTCCGAGAAC-3') и RedR (5'-CGGAGGGGAAGTTCACG-3') с использованием 10 нг геномной ДНК в качестве матрицы в реакционном объеме 15 μл, содержащем 7,5 μл 2x PCR Master Mix и 0,3 μл каждого праймера (10 μмоль/л). Ожидаемый фрагмент ДНК составил 393.н. Подвергнуть продукты ПЦР электрофорезу в 1% агарозном геле, чтобы определить, являются ли они трансгенными растениями.

7. Идентификация трансгенных растений поколения Т1 с помощью люминесцентной лампы

  1. Соберите плоды Т0 трансгенных растений S. nigrum , которые полностью приобрели черно-фиолетовый цвет, а затем выдавите семена внутри плода вручную. Естественно просушите семена на воздухе при комнатной температуре около 1 недели.
  2. Высушенные семена культивируют в среде 1/2 MS в соответствии с шагами с 1.1 по 1.4 настоящего протокола и помещают в камеру для роста растений на 1 неделю. Различайте трансгенную рассаду и нетрансгенную рассаду с помощью ручной люминесцентной лампы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Генетическая трансформация, опосредованная Agrobacterium tumefaciens с получением трансгенного S. nigrum.
После заражения семядолей и гипокотиль сеянцев S. nigrum A. tumefaciens мы смогли определить, была ли инфекция Agrobacterium успешной, поскольку DsRed использовался в качестве репортерного гена. Красная флуоресценция появлялась на месте раны пос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

К настоящему времени методы генетической трансформации S. nigrum, опосредованные A. tumefaciens, были установлены в различных лабораториях 8,9,10,11. В большинстве этих методов трансформации в качестве селекционного вещества используется канамицин 8,9,10,11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Исследовательским фондом Ляочэнского университета (318012028) и Фондом естественных наук провинции Шаньдун (ZR2020MC034).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2X SanTaq PCR Master Mix (с синим красителем)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B532061ПЦР-смесь 2X SanTaq включает MgCl?, dNTP, Taq DNA Polymerase, буфер для ПЦР, загрузочный краситель и усилитель ПЦР.
6-BASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.C14819266Искусственные цитокинины
AgarTianjin Damao Chemical Reagent Partnership Enterprise (Limited Partnership)CAS NO:9002-18-0Solids
ASSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.K914BA0002Индуцирование эффективной экспрессии углеводов агробактерий
Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Антибиотик
CefSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.I526BA0010Антибиотик
гиббереллинSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.K514BA0009Способствует прорастанию семян
канамициномSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.I614BA0013Антибиотик
LB средаSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113Выращивание бактерий
MicroPulser ( Gene Pulser Xcell)Bio-Rad, US617BR1 06783Gene Pulser
Xcell MS solid mediumphytotech Co., Ltd., USHCA0519228A  Мурасигэ и Skoog Basal Medium with Vitamins, M519
пластиковая коробкаLiaoSu, ChinaT909HПосадочная коробка
растений рифампицинSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.S180305Антибиотик
сахарозаSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.CAS NO:57-50-1     В качестве источника углерода
Tanon-5200Multi машинаTanon Co., Ltd., Китай5200MultiУскоренное сепарация
дикого Solanum nigrumсобранного в городе Ляочэн
ZTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.J921BA0014Регуляторы роста растений
,

Ссылки

  1. Wang, X., et al. Ectopic overexpression of AcMYB110 causes significantly increased content of anthocyanins in Solanum nigrum. Biologia plant. 67, 200-203 (2023).
  2. Boccia, M., et al. A scaffold protein manages the biosynthesis of steroidal defense metabolites in plants. Science. 386 (6728), 1366-1372 (2024).
  3. Peng, C. H., et al. Solanum nigrum polyphenols reduce body weight and body fat by affecting adipocyte and lipid metabolism. Food Funct. 11 (1), 483-492 (2020).
  4. Wang, J., et al. Influence of Cd toxicity on subcellular distribution, chemical forms, and physiological responses of cell wall components towards short-term Cd stress in Solanum nigrum. Environ Sci Pollution Res. 28 (11), 13955-13969 (2021).
  5. Wang, J., et al. Comparative cytology combined with transcriptomic and metabolomic analyses of Solanum nigrum L. in response to Cd toxicity. J Hazardous Mater. 423, 127168(2022).
  6. Lee, E. S., et al. Engineering homoeologs provide a fine scale for quantitative traits in polyploid. Plant Biotech J. 21 (12), 2458-2472 (2023).
  7. Lin, X., et al. Solanum americanum genome-assisted discovery of immune receptors that detect potato late blight pathogen effectors. Nat Genetics. 55 (9), 1579-1588 (2023).
  8. Bhattacharya, A., et al. Engineering gibberellin metabolism in Solanum nigrum L. by ectopic expression of gibberellin oxidase genes. Plant Cell Rep. 31 (5), 945-953 (2012).
  9. Chhon, S., Jeon, J., Kim, J., Park, S. U. Accumulation of Anthocyanins through Overexpression of AtPAP1 in Solanum nigrum Lin (Black Nightshade). Biomolecules. 10 (2), 277(2020).
  10. Park, S., et al. Rapid generation of transgenic and gene-edited Solanum nigrum plants using Agrobacterium-mediated transformation. Plant Biotech Rep. 14 (4), 497-504 (2020).
  11. Peng, W., et al. A convenient, reliable and directly visual selection marker for identifying transgenic lines of Solanum nigrum. Plant Cell Tiss Organ Cult. 152 (2), 369-375 (2023).
  12. Schlechter, R. O., et al. Chromatic Bacteria - A Broad Host-Range Plasmid and Chromosomal Insertion Toolbox for Fluorescent Protein Expression in Bacteria. Front Microbio. 9, 3052(2018).
  13. Hao, H., et al. High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation of Lotus corniculatus using DsRed2 positive selection and vermiculite-based rooting method. Plant Cell Tiss Organ Cult. 156 (2), 58(2024).
  14. Fan, Y., et al. a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Meth. 16 (1), 94(2020).
  15. Qi, X., et al. Genome Editing Enables Next-Generation Hybrid Seed Production Technology. Mol Plant. 13 (9), 1262-1269 (2020).
  16. Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell Tiss Organ Cult. 141 (1), 207-216 (2020).
  17. Schenk, J. J., Becklund, L. E., Carey, S. J., Fabre, P. P. What is the "modified" CTAB protocol? Characterizing modifications to the CTAB DNA extraction protocol. Appl Plant Sci. 11 (3), e11517(2023).
  18. Li, Q., et al. An Improved and Simplified Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation Protocol for Solanum nigrum with a Shorter Growth Time. Plants. 13 (15), 2015(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CRISPR Cas9DsRed

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.