Рабочий процесс с использованием криогенного совпадающего флуоресцентного, электронного и ионного микроскопа для прицельного фрезерования ячеек

Краткое содержание

Этот рабочий процесс позволяет производить ламели для нацеливания на флуоресцентно меченые биологические структуры, которые являются небольшими (<1 мкм в осевом масштабе) и редкими (1 копия на клетку) с использованием платформы криогенной трикослучайной визуализации. Эта платформа объединяет флуоресцентную микроскопию, фрезерование сфокусированным ионным пучком и сканирующую электронную микроскопию в одном фокальном положении и позволяет проводить одновременную флуоресцентную микроскопию во время фрезерования.

Аннотация

Криогенное сфокусированное ионно-лучевое фрезерование с помощью сканирующей электронной микроскопии (CryoFIB-SEM) стало доминирующим подходом к получению ламелей клеток толщиной менее 200 нм для криогенной электронной томографии (CryoET). В последнее время флуоресцентная микроскопия была включена в системы CryoFIB-SEM для направления производства ламелей к флуоресцентно меченным мишеням. Тем не менее, в большинстве реализаций оптические и ионные системы визуализации имеют различные фокальные плоскости в разных областях вакуумной камеры, эффективно функционируя как два отдельных микроскопа. Такая конфигурация требует регистрации изображений между модальностями, которой часто не хватает точности, необходимой для надежного нацеливания на небольшие редкие структуры in situ. Мы представляем рабочий процесс на основе специализированной платформы трикосовочной визуализации, которая обеспечивает одновременную флуоресцентную визуализацию и фрезерование сфокусированного ионного пучка. Это позволяет получить флуоресцентную обратную связь в режиме реального времени, которую можно использовать для определения того, когда следует завершить фрезерование, чтобы сохранить флуоресцентно помеченные структуры, представляющие интерес, в конечной ламели. Используя этот подход, мы нацелились на центр организации микротрубочек (MTOC) в витрифицированных макрофагах и достигли показателя успеха >60%, что было подтверждено последующей криогенной электронной томографией и корреляционной световой и электронной микроскопией.

Введение

Криогенная электронная томография (CryoET) позволяет визуализировать биологические образцы в близком к нативному состоянии с высокомолекулярным разрешением 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Однако толщина эукариотических клеток — часто несколько микрон — превышает средний свободный пробег (~300 нм) электронов 300 кВ, ограничивая глубину проникновения нерассеянных электронов и тем самым ограничивая полезную толщину образца. Чтобы решить эту проблему, сфокусированный ионный пучок (FIB) может быть использован для абляции большей части криогенно сохраненной клетки в процессе, известном как фрезерование CryoFIB, в результате чего ламели становятся достаточно тонкими для визуализации CryoET 12,13,14,15,16.

В ранее описанных рабочих процессах образцы сначала консервируются в остеклованном льду с помощью погружной заморозки 17,18,19, а затем загружаются в двухлучевой прибор, оснащенный как CryoFIB, так и сканирующим электронным микроскопом (SEM). Визуализация СЭМ может быть использована для идентификации представляющих интерес субклеточных особенностей, таких как органеллы и даже некоторые белковые структуры^20,21. Эта информация может быть использована для управления процессом фрезерования CryoFIB, в ходе которого образец поэтапно удаляется с целью получения ламели толщиной менее 200 нм, подходящей для CryoET 13,14,22. Тем не менее, этот подход ставит две ключевые проблемы, которые решает настоящий протокол. Во-первых, часто необходимо получить криоэт специфических белковых структур, но SEM может быть вредным, и большинство белковых структур не различимы SEM при визуализации неокрашенного биологического материала. Как можно точно направить измельчение на определенные субклеточные области или области, содержащие определенные биомолекулы, без повреждений? Во-вторых, даже после получения тонких ламелей и последующей CryoET может быть сложно идентифицировать конкретные биомолекулы в окончательных реконструкциях из-за недостаточного разрешения, отношения сигнал/шум и/или контраста, необходимых для однозначной идентификации. Как можно определить пространственное положение этих биомолекул с помощью крио-ЭТ-реконструкций?

Чтобы решить обе проблемы, в этой области все чаще обращаются к флуоресцентной микроскопии. Генетически кодируемые флуоресцентные белки или экзогенные красители, которые связываются с белками-мишенями, обычно используются для мечения конкретных биомолекул, представляющих интерес ^5,23,24. Криогенная флуоресцентная микроскопия витрифицированных клеток, взятых после фрезерования, может быть соотнесена с полученными томограммами. Этот подход, известный как криогенная коррелятивная световая и электронная микроскопия (CryoCLEM), хорошо зарекомендовал себя и широко используется для локализации специфических белков в реконструкциях CryoET 5,12,23,24. Последние достижения включают использование флуоресцентных биосенсоров и методов сверхвысокого разрешения для повышения дополнительной информации и пространственной точности 25,26,27,28,29.

CryoCLEM является одним из способов преодоления второй проблемы, описанной выше, позволяющим определить расположение конкретных белков внутри ламели. Тем не менее, CryoCLEM ничего не делает для пользователя, если конечная пластинка не содержит интересующих белков. К счастью, флуоресцентная микроскопия также может быть использована для прямого фрезерования в помеченных областях интереса. Несмотря на то, что фрезерование FIB с флуоресцентным наведением является более новой разработкой, чем CryoCLEM, первые рабочие процессы, появившиеся около^десяти лет назад, нашли быстрое и широкое распространение. Ранние протоколы полагались на внешние световые микроскопы для получения 2D или 3D наборов данных флуоресценции, которые затем регистрировались на изображениях SEM и ионных пучков после переноса образца в CryoFIB-SEM. В последнее время флуоресцентные микроскопы стали встраиваться непосредственно в вакуумные камеры CryoFIB-SEM. Эта интеграция снижает загрязнение льдом во время переноса и упрощает визуализацию конечной ламели. В настоящее время разработано несколько платформ для объединения флуоресцентной микроскопии с CryoFIB-SEM для фрезерования под контролем флуоресценции. Они успешно нацелены на органеллы и крупные белковые комплексы ^5,23,24. Однако, за редким исключением³⁰, оптический тракт создает отдельную фокальную плоскость в физической области вакуумной камеры, отличной от ФИБ-СЭМ. В результате, при прямом фрезеровании по-прежнему требуется точная регистрация между флуоресцентными и ионными изображениями, как и при использовании автономных оптических микроскопов.

Этот процесс регистрации подвержен погрешностям из-за трех ключевых факторов: несоответствий показателя преломления (которое приводит к кажущимся сдвигам фокуса)^31,32, движения образца во время фрезерования и ошибки локализации. Кроме того, регистрации обычно способствуют флуоресцентные реперные точки микронного размера, которые видны как в ионной, так и в оптической модальностях и используются в качестве пар точек выравнивания для вычисления преобразований между ионным и оптическим изображениями. Тем не менее, эти шарики могут затемнять или конкурировать с сигналом флуоресценции от образца, а их локализация и выравнивание по оптическим и ионным изображениям происходит медленно и требует большого количества усилий. В совокупности эти ограничения затрудняют регулярное нацеливание на небольшие и редкие функции. Несмотря на то, что трудно определить точный предел для структур, которые в настоящее время могут быть сохранены в тонких ламелях, подходы, основанные на регистрации, обычно считаются неэффективными для захвата целей с осевыми размерами менее одного микрона³³.

В данной работе мы сообщаем об использовании системы трикопараллельной визуализации, которая объединяет FIB, SEM и флуоресцентную микроскопию в одном фокальном положении^34,35. Такая конфигурация обеспечивает более простое и точное фрезерование с флуоресцентным контролем по сравнению с несовпадающими интегрированиями, устраняя необходимость регистрации оптических и ионных изображений. В идеальных условиях низкого фона и высокого сигнала точность наведения порядка 10 нм может быть достигнута³⁶. Он также позволяет получать данные многоцветной криогенной флуоресцентной микроскопии на протяжении всего процесса фрезерования, в том числе из конечной тонкой ламели, что позволяет проводить корреляционный анализ и локализовать мишени, ограниченные субдифракцией³⁵. Для этого мы используем специализированный набор инструментов для преобразования изображений, чтобы точно совмещать эти флуоресцентные изображения с помощью просвечивающей электронной микроскопии с низким увеличением, чтобы определить, где собирать CryoET, оптимизируя сбор данных и обеспечивая захват цели при окончательных томографических реконструкциях.

Для управления измельчением мы используем способность системы отслеживать изменения интенсивности флуоресценции в режиме реального времени. Вместо того, чтобы пытаться совместить оптические и ионные изображения, чтобы найти нашу цель, пользователь просто наблюдает за флуоресцентным сигналом от образца. По мере фрезерования флуоресценция ведет себя очень характерным образом: сначала она становится ярче по мере удаления углеродной пленки-носителя между объективом микроскопа и флуоресцентно меченым образцом, затем постепенно уменьшается по мере удаления расфокусированного автофлуоресцентного материала и, наконец, резко уменьшается по мере частичного удаления самой меченой структуры. Этот сигнал в режиме реального времени точно определяет, на каком этапе процесса фрезерования находится объект и когда его следует остановить, гарантируя, что интересующая цель останется в пределах конечной ламели³⁷. В подробном протоколе мы также обсудим более продвинутый подход, который использует колебания яркости флуоресценции из-за интерферометрических эффектов для направления фрезерования к объектам с осевой протяженностью <300 нм.

Мы демонстрируем полезность платформы, ориентируясь на центр организации микротрубочек (MTOC)³⁸. MTOC является важнейшей органеллой, участвующей в делении и дифференцировке клеток. В клетках млекопитающих флуоресцентная микроскопия меченого тубулина выявляет MTOC как одну флуоресцентную точку диаметром около 1 мкм в живых клетках. Этот подход был использован для успешной локализации MTOC с высокой точностью до тонких ламелей витрифицированных клеток. Детальная организация микротрубочек в MTOC и их взаимодействие с другими органеллами раскрываются в последующих томографических реконструкциях. Этот рабочий процесс позволяет проводить высокоточную корреляционную флуоресцентную микроскопию и CryoFIB-SEM без регистрации, сокращая ввод данных пользователем и расширяя доступ к клеточным структурам, которые ранее были непомерно малы для надежного захвата с помощью несовпадающих подходов.

Определения и описание прибора
Интегрированный оптический микроскоп подробно описан в Boltje et ^al.35, а более подробную информацию об использовании интегрированного микроскопа можно найти в недавно опубликованном протоколе³⁴. Объектив интегрирован снизу и оснащен возможностями позиционирования по осям x, y и z для обеспечения выравнивания по совпадающей точке FIB-SEM. В настоящее время он работает с объективом 100x, 0,85 NA с корректором покровного стекла. Оптическая визуализация осуществляется через покровное стекло, которое защищает объектив от напыления материала и облучения как FIB, так и SEM. Широкопольное освещение обеспечивается набором светодиодов, охватывающих несколько видимых длин волн. Детектирование флуоресценции осуществляется с помощью детектора sCMOS. Существует три определенных положения ступени: загрузка: позиция ступени, в которую загружается образец; покрытие: положение столика для нанесения покрытия с помощью системы впрыска газа; 3-Beam: положение предметного столика, для которого все три микроскопа (FIB, SEM и оптический) могут быть совмещены.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая здесь система с тремя совпадениями представляет собой специализированный компонент криогенной флуоресцентной визуализации, интегрированный в коммерчески доступную двухлучевую систему FIB-SEM. Принцип и порядок операций могут быть в целом адаптированы к будущим реализациям с тремя совпадениями.

1. Настройка

1. Охладите систему до криогенной температуры. Контролируйте температуру с помощью двух датчиков: один расположен на предметном столике, а другой внутри камеры. Поддерживайте температуру на стадии образца примерно на 20 °C теплее, чем в камере (например, на стадии ~-170 °C, в камере ~-190 °C), чтобы свести к минимуму образование льда на образце. Процесс охлаждения обычно занимает около 1,5 часов.

2. Загрузка образцов

1. Используйте жидкий азот для ручного охлаждения передаточной станции, когда температура системы приближается к криогенной температуре (примерно -167,5 °C). Температура системы отображается в верхнем левом углу программного обеспечения для световой микроскопии.
2. Загрузите одну отрезанную авторешетку в кассету с образцами, предназначенную для системы криогенной световой микроскопии. Кассета состоит из клеевого покровного стекла и распорки, между которыми расположена авторешетка. Закройте кассету, затянув кольцевой винт, затем вставьте ее в паз на передаточной станции³⁴.
3. Подсоедините передаточную станцию к системе и с помощью камеры внутренней камеры направьте кассету с образцом на предметный столик.

3. Система впрыска газа (ГИС) для нанесения покрытий на образцы

1. Откройте управляющее программное обеспечение для световой микроскопии и переместите предметный столик из положения «Загрузка » в положение «Покрытие ».
2. Вставьте иглу ГИС с помощью управляющего программного обеспечения FIB-SEM, щелкнув значок снежинки. В разделе Управление ГИС выберите опцию Вставить иглу ГИС.
3. Разрешите осаждение КРУЭ в течение 30 с, открыв поток газа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это время варьируется от 20 с до 1 минуты в зависимости от типа образца. Целью этого этапа является достаточная защита образца во время последующей процедуры измельчения FIB.
4. Втянув стрелку ГИС, переместите предметный столик образца обратно в заданное положение загрузки .

4. Юстировка трехлучевой системы

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел адаптирован из Ван³⁹.

1. В программном обеспечении для световой микроскопии переместите предметный столик образца из положения загрузки в предопределенное положение 3-пучка .
2. В программном обеспечении FIB-SEM нажмите на верхнее левое окно и установите SEM на увеличение 100x.
3. На вкладке «Выравнивание» программного обеспечения для световой микроскопии нажмите на функцию «Просмотр», чтобы получить атлас сетки в формате SEM. На этом изображении атласа используются ранее заданные параметры.
4. Определите квадратную область с разбитой углеродной пленкой и дважды щелкните по ней, чтобы переместить предметный столик для образца в это место.
5. Вернитесь к управляющему программному обеспечению FIB-SEM и настройте SEM на большее увеличение , чтобы сфокусироваться на выбранной квадратной области, центрированной в поле зрения.
6. При необходимости повторяйте шаги 4.4 и 4.5 до тех пор, пока СЭМ не сфокусируется на различимом узоре, например, на остром крае разорванной углеродной пленки.
7. Включите флуоресцентный микроскоп и отрегулируйте координаты x, y, z в соответствии с видом SEM.
8. Фрезеруйте с помощью FIB небольшой узор, например, небольшой прямоугольник или круг.
9. Убедитесь, что шаблон виден как на FIB, так и на флуоресцентном микроскопе. При необходимости отрегулируйте центровку, выполнив при необходимости шаги 4.3-4.7.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Юстировка и регистрация оптического и ионного микроскопов завершены.

5. Локализация и фрезерование целей

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел адаптирован из Ван³⁹.

1. Перейдите на вкладку «Локализация » в программном обеспечении для световой микроскопии и настройте флуоресцентные каналы, активировав соответствующие условия возбуждения и фильтрации. Назначьте каждый флуорофор отдельным каналом и включите дополнительный канал для проходящего света (или светлого поля).
2. Определите интересующую цель, настроив мощность светодиода и время экспозиции для каждого флуоресцентного канала. В качестве ориентира при визуализации SiR-тубулина используйте экспозицию 1,2 с с постоянной мощностью светодиода 30 мВт.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры могут варьироваться в зависимости от флуорофора. Оптическая интенсивность должна оставаться ниже ~25-50 Вт/^см2 на образце. Более высокая интенсивность может привести к значительному нагреву и девитрификации образца ^37,40.
3. После того, как вы будете удовлетворены параметрами, приобретите предварительно фрезерованный флуоресцентный z-образный стек с шагом в осевом направлении. Затем отметьте цель как ROI.
4. Переключитесь на программное обеспечение FIB-SEM, чтобы нарисовать ламель по ROI.
5. Выполняйте черновое фрезерование для удаления основной массы материала примерно на 3 мкм выше и ниже ROI. Между тем, держите флуоресцентный микроскоп включенным во время фрезерования, чтобы отслеживать любое снижение флуоресцентного сигнала.
6. Уменьшите ROI до ~2 мкм с помощью режима очистки поперечного сечения.
7. Откройте интерферометрический инструментарий на основе Python из терминала, чтобы отслеживать флуоресцентный сигнал во время истончения ламели (https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite)³⁶.
8. Для последующего фрезерования и полировки следуйте одному из двух подходов, описанных ниже в шагах 5.9 или 5.10, чтобы выполнить прямое фрезерование в зависимости от размеров выбранных целей.
   1. Осевая протяженность мишени > 300 нм
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы будем использовать полуразрушающий подход к прямому фрезерованию.
      1. В графическом интерфейсе Python выберите интересующую цель на флуоресцентной микрофотографии. Программное обеспечение автоматически начнет построение графика яркости в зависимости от времени с каждым новым кадром.
      2. Отслеживайте интенсивность флуоресценции с помощью инструментария Python. Измельчите образец в режиме очистки поперечного сечения снизу, чтобы удалить остатки поддерживающей пленки, если это применимо.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При удалении поддерживающей пленки следует наблюдать усиление флуоресценции.
      3. Используйте быстрые падения интенсивности флуоресценции, указывающие на потерю флуоресцентного материала, в качестве сигнала о том, когда следует переключать направление фрезерования. Например, если фрезерование снизу вверх и наблюдается резкое снижение флуоресценции, прекратите фрезерование и переключитесь на фрезерование сверху вниз.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если конструкция удаляется слишком быстро, уменьшите ток фрезерования в программном обеспечении FIB-SEM, чтобы замедлить удаление цели.
   2. Осевая протяженность мишени ≤ 300 нм
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы будем использовать интерферометрический эффект для прямого фрезерования³⁶.
      1. В графическом интерфейсе Python выберите интересующую цель на флуоресцентной микрофотографии. Программное обеспечение автоматически начнет построение графика яркости в зависимости от времени с каждым новым кадром.
      2. Начните с фрезерования сверху вниз через тестовую мишень. Контролируйте контраст бахромы непосредственно перед фрезерованием мишени с помощью интенсивности флуоресценции. Флуоресцентная мишень постоянно подгоняется к 2D-гауссову, при этом подгонка используется для получения интегрированной интенсивности, которая затем строится на графике.
      3. После того как цель будет профрезерована, подгоните колебания в трассировке интенсивности к следующей функции модели с помощью графического интерфейса Python:
         
         Где A — амплитуда колебаний, λ — длина волны возбуждения, k — гасящий член, представляющий длину когерентности источника света, фазовый фактор Φ, а d — расстояние до объекта захвата. Исходя из тестовой мишени, все члены могут быть предсказаны в разумных пределах, так что расстояние d является единственной свободной переменной, используемой для указания пользователю, где находится флуоресцентный объект относительно его фрезерования. См. Sica et al. для получения более подробной информации³⁶.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующих целей инструментарий будет подгонять трассировку интенсивности с той же модельной функцией и оценивать, где следует остановить фрезерование сверху вниз. Все фитинги производятся одновременно с фрезерованием. Цель состоит в том, чтобы остановить фрезерование, когда мишень залегает на глубине, равной половине желаемой толщины ламели ниже верхней поверхности.
      4. После завершения фрезерования сверху вниз завершите изготовление ламели путем фрезерования снизу вверх в режиме очистки поперечного сечения до тех пор, пока не будет достигнута желаемая толщина.
9. Сделайте флуоресцентное изображение после фрезерования.

6. Корреляционная световая микроскопия и коллекция наклонных серий

1. После переноса образца в CryoTEM соберите обзор атласа сетки с кратностью 182x, чтобы обеспечить достаточный охват всей сетки.
2. При соответствующем промежуточном увеличении в диапазоне от 6 500x до 11 000x соберите серию монтажных изображений окончательной ламели под углом 0°.
3. Считайте многоканальные флуоресцентные изображения после фрезерования и проекционное изображение из шага 6.2 в пользовательское программное обеспечение для проективного преобразования для регистрации ROI (https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git).
4. Выберите в общей сложности 8-10 пар опорных точек для точного вычисления проективного преобразования изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти точки могут быть очевидными особенностями (например, краями ламелей, видимым загрязнением льда или открытыми отверстиями в сетке), которые присутствуют как в светлопольной, так и в электронной микроскопии.

7. Коллекция наклонных серий с большим увеличением

1. Используйте это наложенное изображение флуоресценции и просвечивающей электронной микроскопии в качестве эталона, чтобы пользователи могли выбрать область изображения в пределах размера кадра камеры для сбора данных с наклонной серией с большим увеличением.
2. Подбирайте увеличение и параметры наклонного ряда исходя из биологического вопроса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для демонстрации мы собрали данные с 54° с шагом 2° при размере пикселя 3,5 Å 41,42,43.

Результаты

Мы мечли дифференцированные макрофагальные клетки маркером тубулина SiR-тубулином перед замораживанием. Следуя протоколу, мы идентифицировали MTOC как одну флуоресцентную точку диаметром ~ 1 мкм под флуоресцентным микроскопом (рис. 1A). Кроме того, мы наблюдали фибриллоподобные флуоресцентные структуры, расходящиеся от MTOC к периферии клетки, что согласуется с сетью микротрубочек (рис. 1A). Моментальные снимки ступенчатого фрезерования при разной толщине образца показаны на Иллюстрации 1B. Примечательно, что по мере того, как ламель достигала толщины примерно 800 нм, одна точка MTOC распадалась на два смежных крана, каждый около 700 нм в диаметре. Последующий анализ подтвердил, что каждое пятнышко соответствует отдельному центриоле.

Одновременная визуализация и фрезерование позволили нам отслеживать изменения интенсивности флуоресценции в режиме реального времени. Примечательно, что мы наблюдали увеличение флуоресценции после удаления объемного нефлуоресцентного материала и абсорбирующей поддерживающей пленки (рис. 1B-D). По мере утончения ламелли с 2 мкм до 800 нм интенсивность флуоресценции резко снижалась, что отражало прогрессирующее удаление меченых структур. Это снижение продолжалось по мере того, как ламель становилась тоньше ниже 200 нм (Рисунок 1B-D). Коррелированное флуоресцентное изображение и атлас электронной микроскопии демонстрируют, что наш рабочий процесс обеспечивает точное нацеливание для фрезерования (рис. 2A). Реконструированные томограммы и сегментированные модели показывают, что центриоли состоят из триплетов микротрубочек, что согласуется с предыдущими отчетами 42,43,44,45 (рис. 2A,B). В тех случаях, когда в конечной пластинке сохранилось только одно флуоресцентное пятнышко, мы наблюдаем одну центриоль в соответствующей томограмме (рис. 2В).

Рисунок 1: Рабочий процесс трисовпадающего CryoFM-FIB-SEM для точной локализации центра-организации микротрубочек. (A) (слева) Живая клеточная микроскопия и (справа) CryoFM MTOC. Масштабная линейка = 10 мкм. (B) Пошаговые снимки CryoFM и CryoFIB для прицельного фрезерования. FM-вид крупным планом обозначен желтыми пунктирными рамками. Центриоли отмечены желтыми стрелками. Масштабная линейка = 5 мкм. (C) Интенсивность флуоресценции MTOC при фрезеровании CryoFIB. (D) Профиль флуоресцентной линии на MTOC, полученный на разных этапах фрезерования CryoFIB. Сокращения: CryoFM-FIB-SEM = Криогенная флуоресцентная микроскопия с фокусированным ионным пучком фрезерования и сканирующей электронной микроскопией; MTOC = центр, организующий микротрубочки; ROI = область интереса. Эта цифра адаптирована из Ван³⁹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Молекулярные детали MTOC, выявленные с помощью трисовпадающего рабочего процесса CryoFM-FIB-SEM. (A) Коррелированная FM, EM и модель сегментации MTOC. (a) Изображение FM после фрезерования. Это то же самое изображение с последней панели рисунка 1B, отмеченное как 180 нм, но повернутое в соответствии с реконструкцией и сегментацией CryoET. Масштабная линейка = 5 мкм; (b) Увеличенный вид пунктирной области, выделенной желтым цветом, начиная с пункта (a). (c) Коррелированная проекция ЧМ и ПЭМ пунктирной области голубым цветом, указанная в пункте (2). Масштабная линейка = 1 мкм. (d) Сегментированная модель томографической реконструкции в области интереса (желтый – центриол; зеленый – микротрубочка). Масштабная линейка = 100 нм. (B) Репрезентативные FM-изображения и томографические срезы двух разных ламели, представляющих различную ориентацию центриоле. FM: Масштабная линейка = 5 мкм. Томографический срез: масштабная линейка = 200 нм. Сокращения: CryoFM-FIB-SEM = Криогенное сфокусированное ионное пучковое фрезерование с помощью сканирующей электронной микроскопии; MTOC = центр, организующий микротрубочки; FM = флуоресцентная микроскопия; ET = пропускание электронов; ПЭМ = просвечивающая электронная микроскопия. Эта цифра адаптирована из Ван³⁹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Наши результаты подчеркивают полезность платформы трикосовочной визуализации, которая обеспечивает одновременную флуоресцентную визуализацию и фрезерование. Используя эту обратную связь, мы демонстрируем две стратегии фрезерования с флуоресцентным контролем — полуразрушающую и интерферометрическую — которые позволяют избежать необходимости в громоздких и основанных на приводке подходах, которые сталкиваются с фундаментальными ограничениями точности, связанными с несоответствием показателей преломления и движением во время фрезерования 12,33,46. Кроме того, поскольку точное руководство основано на флуоресцентной микроскопии, а не на СЭМ, оптическое излучение не приводит к обнаруживаемым повреждениям до тех пор, пока интенсивность остается ниже порога, который приводит к девитрификации^37,47. Продемонстрированные здесь возможности расширяют доступные биологические образцы, включая редкие и небольшие (<300 нм в осевом протяжении) мишени, представляющие интерес, при этом оптимизируя рабочий процесс.

Ключевым шагом в этом протоколе является определение времени остановки фрезерования на основе изменений яркости флуоресцентной поверхности интересующей цели. В настоящее время это включает в себя быстрое ручное вмешательство для остановки фрезерования в нужное время. Этот метод оказался достаточным для достижения текущих целей, которые были исследованы, но будущие модификации могут привести к дальнейшей интеграции инструментария Python в систему FIB, чтобы напрямую остановить фрезерование. Эта модификация может быть необходима, если требуется более высокая скорость фрезерования, так как это даст меньше времени на ручное вмешательство. В качестве альтернативы, если можно допустить более медленную скорость фрезерования, это даст больше времени для ручного вмешательства в случае необходимости.

После создания интересующих нас биологических структур, содержащих ламели, наше специализированное программное обеспечение для преобразования изображений обеспечивает корреляцию на уровне CryoTEM, используя атласные обзоры ламелей для сбора данных CryoET. В целом, представленный здесь протокол имеет важное значение для визуализации флуоресцентно меченных, небольших и редких биологических мишеней с помощью криогенной электронной томографии в толстых образцах клеток эукариот. По сравнению с существующими несовпадающими системами Cryo-FIB, такими как Aquilos 2 с iFLM, наш рабочий процесс обеспечивает более высокий уровень успеха в нацеливании на эти функции.

Такая высокая точность прицеливания достигается за счет эффективности. Поскольку фрезерование происходит вручную, а не автоматизировано, производительность производства ламелей ограничена. За 8 часов фрезерования мы обычно производим 6-8 ламелей, из которых примерно пять содержат интересующую мишень. Тем не менее, мы считаем, что в будущем этот рабочий процесс может быть автоматизирован для повышения производительности. Для автоматизации потребуются пользовательские скрипты для непрерывного мониторинга активных областей фрезерования на FIB-изображении и отслеживания интенсивности флуоресценции в режиме реального времени, чтобы обеспечить удержание цели. Ключевые проблемы остаются, в том числе установление эффективной связи между всеми пользовательскими сценариями и управляющим программным обеспечением как для CryoFIB-SEM, так и для флуоресцентного микроскопа.

Заглядывая в будущее, можно сказать, что предстоит проделать большую работу по внедрению других передовых методов флуоресцентной микроскопии, о которых говорилось ранее, включая флуоресцентные биосенсоры, визуализацию со сверхвысоким разрешением и конфокальную микроскопию. Тем не менее, мы ожидаем, что трехсовпадающая геометрия станет стандартом в будущих приборах, а одновременная флуоресцентная визуализация во время фрезерования станет обычным делом. Если это так, то этот протокол может послужить ценным руководством для исследователей, стремящихся зафиксировать детали молекулярного масштаба небольших и редких биологических структур, которые, несмотря на свой размер и распространение, занимают центральное место в клеточной биологии.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Aquilos 2 Cryo-FIB	ThermoFisher Scientific		https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/dualbeam-fib-sem-microscopes/aquilos-cryo-fib.html?cid=msd_ls_xseg_xmkt_sdb-aquilos_285811_na_pso_gaw_pei90m & gad_source=1& gad_campaignid=12 764255901& gbraid=0AAAAADxi_GS s7OvZmg4cgCUm0PjSiq9X9& gclid= Cj0KCQjwh5vFBhCyARIsAHBx2w xlIfYHMvqY3sSWu6oEAdUynCSf9 KRg9Jhjp7l0Dot9qTl6GyQaEo8aAiy 2EALw_wcB
Крио-сетка, совместимая с Autogrid	Науки об электронной микроскопии		https://www.emsdiasum.com/autogrid -compatible-cryo-grid-box?srsltid= AfmBOorQAd3esD8fLmnDDO2TvrNk cj4UINXFnPSMgrpEmkWd0H7ImUq7
Кольца автосетки и C-образные клипсы	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/100-pack-autogrid-rings-c-clips
Программный комплекс CLEM	Исследовательская группа Далберга в Стэнфорде/SLAC		https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git
Стрекоза 2022.1	Системы исследования объектов		https://dragonfly.comet.tech/
ENZEL	Делмик Б. В.		Система ENZEL — это индивидуальный инструмент, который в настоящее время не доступен в коммерческих продажах
IMOD 4.12	Университет Колорадо		https://bio3d.colorado.edu/imod/
LD4 жидкий азот Дьюар	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/ld4-liquid-dewar-4-liters
MATLAB 2023	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Инструмент для манипуляции крышками штифтов	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/pin-lid-manipulator-tool
Python toolkit	Исследовательская группа Далберга в Стэнфорде/SLAC		https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite
Quantifoil R2/2, LF, 200 mesh, Au EM сетка	Науки об электронной микроскопии		https://www.emsdiasum.com/quantifoil-r-22-lf-200-mesh-gold
Serial EM	Университет Колорадо в Боулдере		https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Стандартный судно Spearlab (трансферный дьюар)	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/spearlab-standard-vessel
Пинцет	Науки об электронной микроскопии		https://www.emsdiasum.com/style-3sa