Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование цельноклеточных биосенсоров для измерения ионной ртути в пробах воды

647 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68257

⸱

3 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Moléculas Individuales, Laboratorios de Investigación y Desarrollo, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 2Kenniscentrum AI, Erasmushogeschool Brussel, 3Open BioLab Brussels, Erasmushogeschool Brussel

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье представлены протоколы использования двух цельноклеточных биосенсоров (Mer-Blue и Mer-RFP) для обнаружения ионной ртути. Предоставляя подробные процедуры для их эксплуатации и анализа выходных данных, исследование направлено на содействие более широкому внедрению и дальнейшему развитию этих технологий для мониторинга конкретных загрязнителей.

Аннотация

Цельноклеточные биосенсоры (ВКБ) являются инструментальными платформами для обнаружения и определения характеристик регуляторных элементов и развития биоинженерии. Они также имеют огромные перспективы для мониторинга окружающей среды и продуктов питания. Несмотря на то, что значительные усилия были вложены в повышение их чувствительности и портативности, стандартизация их обработки и анализа данных остается относительно неразвитой. В этой статье представлено подробное руководство по использованию двух недавно разработанных WCB, Mer-Blue и Mer-RFP, которые доказали свою способность обнаруживать ионную ртуть на уровнях ниже предельно допустимых значений для питьевой воды, установленных Всемирной организацией здравоохранения. Протоколы, подробно описанные в настоящем документе, охватывают подготовку микробных культур, калибровку датчиков, сбор и анализ данных. Для флуориметрического биосенсора Mer-RFP используется новая теорема о распределении биосинтеза для определения временного интервала для надежных и точных измерений зависимости «доза-реакция». Для колориметрического биосенсора Mer-Blue недорогая конфигурация камеры позволяет проводить точные измерения в условиях, где отсутствуют дорогие спектрофотометры и флуориметры, что способствует децентрализованному мониторингу загрязнения. Описаны процедуры, используемые для тестирования проб пресной воды, и обсуждены ограничения этих биосенсоров в отношении типов проб. Делясь этими методами обработки и анализа, мы поощряем более широкие исследовательские группы внедрять и совершенствовать эти биологические устройства для разработки эффективных решений по мониторингу окружающей среды. В конечном счете, это исследование направлено на содействие широкому внедрению биосенсорных технологий в экологическом сообществе, способствуя более эффективному и действенному мониторингу загрязнения микроэлементами в различных экосистемах.

Введение

В связи с растущей обеспокоенностью по поводу загрязнения окружающей среды и безопасности воды и продуктов питания, биосенсоры стали привлекательной и доступной альтернативой традиционным методам аналитической химии. Тяжелые металлы являются высокотоксичными загрязнителями, которые становятся все более распространенными в результате деятельности человека 1,2,3,4. Однако традиционные методыобнаружения5 часто являются дорогостоящими и недоступными.

Ртуть-чувствительные WCB используют замечательную специфичность и чувствительность транскрипционного фактора MerR 6,7,8. В своей естественной функции MerR регулирует экспрессию эффекторных белков, детоксикационная активность которых придает устойчивость к ртути9. Способность MerR регулировать экспрессию генов ртуть-зависимым образом была перепрофилирована для регуляции репортерных белков в системах обнаружения ртути 10,11,12,13,14,15,16. Несмотря на многообещающие исследования, эти РХБ до сих пор не приняты для мониторинга в реальном мире. Такие факторы, как биологическая хрупкость, специальные требования к обращению, а также отсутствие стандартизированных протоколов и сертифицированных эталонных материалов, препятствуют практическому применению 17,18,19,20.

Система WCB для обнаружения ионной ртути была разработана с использованием MerR, связанного с двумя различными репортерными белками. Mer-Blue экспрессирует хромогенный белок и служит колориметрическим биосенсором, обеспечивая визуальное обнаружение или обнаружение с помощью камеры. Флуоресцентный биосенсор Mer-RFP позволяет осуществлять непрерывный мониторинг накопления сигнала. Благодаря тщательному контролю времени воздействия образца на фазе роста была достигнута надежная воспроизводимость в обеих системах15.

В данной статье представлены подробные протоколы работы как Mer-Blue, так и Mer-RFP, а также всесторонний анализ их сигнальных выходов. Для Mer-RFP анализ основан на недавно введенной теореме о распределении биосинтеза белка21. Для Mer-Blue колориметрический анализ может быть оцифрован с помощью программного обеспечения для обработки изображений, такого как ImageJ. Чтобы обеспечить согласованные настройки получения изображений, представлена недорогая самодельная камера под названием PelletCam. В обоих случаях для облегчения работы предоставляется автоматизированное программное обеспечение. Обмен доступными и стандартизированными экспериментальными методологиями и методами анализа данных способствует более широкому внедрению РЦБ для разработки надежных и экономически эффективных решений для мониторинга на основе биосенсоров.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Приготовление растворов ионной ртути

  1. Взвесьте небольшую массу порошка HgBr2 (обычно от 0,1 до 0,2 г), используя соответствующие защитные перчатки и маску для предотвращения вдыхания и воздействия на кожу.
  2. Рассчитайте количество воды, необходимое для получения 4 мМ раствора, растворив измеренную массу твердого порошка в ddH2O по формуле:
    figure-protocol-1
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый объем близок к 100 мл; Может быть использована упрощенная формула:
    figure-protocol-2
    1. В качестве альтернативы, при использовании HgCl2, примените формулу:
      figure-protocol-3
  3. Храните исходный раствор в герметично закрытом контейнере в охлажденной среде (4 °C) для предотвращения испарения.
  4. Перед каждым анализом титрования готовьте серийные разведения, начиная с 1 мл 2 мМ Hg2+ и разбавляя до 40 нМ, как показано в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация ионной ртути может изменяться во время хранения, вероятно, из-за самопроизвольного восстановления и испарения элементарной ртути (Hg°). Несмотря на то, что охлаждение и использование высококачественных герметичных контейнеров могут уменьшить эти эффекты, избегайте использования растворов, хранящихся более 6 недель, особенно для концентраций 250 нМ Hg2+ или ниже.

2. Подготовка среды М9

  1. Порошки реагентов растворить в отдельных колбах с использованием сверхчистой воды для приготовления следующих исходных растворов: М9 5×, 1 М MgSO4, 1 М CaCl2, 20% (мас./об.) глюкозы и 20% (мас./об.) казаминокислот.
  2. В стеклянной бутылке объемом 500 мл или 1 л смешайте 50 мл M9 5×, 2,5 мл 20% (по объему) казаминокислот и добавьте сверхчистую воду до общего объема 246,475 мл.
  3. Автоклавируйте смесь и перечисленные выше исходные растворы при 121 °С в течение 20 мин.
  4. Дайте всем растворам полностью остыть, чтобы избежать выпадения осадков CaCl2.
  5. Добавить в охлажденную смесь: 25 мкл 1 М CaCl2, 500 мкл 1 М MgSO4 и 3 мл 20% (мас./об.) глюкозы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В результате получается богато обогащенная среда M9 со следующими конечными концентрациями: 0,24% (w/v) глюкозы, 0,2% (w/v) казаминокислот, 2 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 3 г/л KH2PO4, 0,5 г/л NaCl, 6,78 г/л Na2HPO4, 1 г/л NH4Cl.

3. Активация биосенсора Mer-Blue / Mer-RFP

  1. Используйте клетки Escherichia coli DH5α, трансформированные с помощью плазмиды pUC-Mer-RFP или pUC-Mer-Blue (см. Таблицу материалов).
  2. Приготовьте чашку Петри с LB-агаром, содержащую 100 мкг/мл ампициллина.
  3. Затравочные клетки из криоконсервированного глицеринового запаса наносятся на пластину LB-агара методом стрижирования.
  4. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 °C.
  5. На следующий день выберите одну колонию из планшета с LB-агаром, чтобы инокулировать культуру объемом 10 мл с использованием среды M9 (рис. 1A).
  6. Инкубируйте культуру при 37 °C с постоянным встряхиванием при 220 об/мин в течение ночи (~16 ч) (рис. 1B).

4. Эксперимент по титрованию с использованием Mer-RFP

  1. Измерьте оптическую плотность ночной бактериальной культуры при длине волны 600 нм (наружный диаметр600).
  2. Рассчитайте объем ночного посева, необходимый для достижения наружного диаметра0,05 в общем объеме 10 мл свежей среды М9, используя формулу:
    figure-protocol-4
    где C1 — наружный диаметр600 ночной культуры, а V1 — объем, который из нее нужно взять.
  3. Центрифуга V1 мл предварительного инокулята при 3500 × г в течение 5 мин. Выбросьте старую среду M9 и повторно суспендируйте бактериальную гранулу в 10 мл свежей среды M9 (рисунок 1C).
  4. Добавьте 195 мкл ресуспендированной культуры в каждую лунку 96-луночного микропланшета. Убедитесь, что каждая микрокультура подготовлена в трех экземплярах для точных измерений.
  5. Добавьте 5 мкл растворов ионной ртути от 40 нМ до 40 мкМ, как описано на этапе 1, в каждую лунку для достижения конечных концентраций в диапазоне от 1 нМ до 1 мкМ (рис. 1D).
  6. Поместите микропланшет в многорежимный считыватель микропланшетов с контролем температуры, установленный на следующие параметры (Рисунок 1E) - Температура: 37 °C, Тряска: Постоянное встряхивание при 60 об/мин, Временной интервал: Считывание каждые 15 мин в течение 16 часов, Измерение оптической плотности: Считывание при 600 нм, Измерение флуоресценции: возбуждение при 570 нм и излучение при 615 нм.
  7. После завершения 16-часового инкубационного периода соберите данные со считывателя микропланшетов (рис. 1F).

5. Анализ данных для получения результатов Mer-RFP

  1. Используйте предпочитаемое программное обеспечение для работы с электронными таблицами или инструменты управления данными для визуализации необработанных значений OD600 с течением времени для всех отдельных языков и региональных параметров (рис. 1G). Убедитесь, что окончание запаздывающей фазы и начало стационарной фазы происходят примерно в одно и то же время во всех репликациях при каждом условии концентрации ртути. Исключите любые культуры, которые отклоняются более чем на 1 ч от среднего времени.
  2. Рассчитайте среднее значение наружного диаметра600 для каждой временной точки по всем репликам в пределах каждого условия концентрации ртути. Для каждого утроенного условия культивирования будет доступна одна усредненная кривая роста OD600 и три выхода интенсивности флуоресценции в разные моменты времени.
  3. Построение графика усредненного наружного диаметра600 в зависимости от Время для культуры без ртути. Визуально определите и выберите временной интервал, в котором темп роста положительный (см. рисунок 2). Исключите оставшиеся точки данных из всех языков и региональных параметров.
  4. Для каждой культуры рассчитайте удельный темп роста в каждой временной точке, найдя изменение наружного диаметра600 по сравнению с предыдущим временным моментом и разделив это изменение на значение наружного диаметра600 в этот момент времени, используя следующую формулу:
    figure-protocol-5
  5. Аналогичным образом, рассчитайте удельную скорость производства флуоресценции для каждой культуры, найдя изменение интенсивности флуоресценции по сравнению с предыдущей временной точкой и разделив это изменение на значение наружного диаметра600 в этот момент времени по формуле:
    figure-protocol-6
  6. Для каждой культуры нанесите график зависимости конкретной скорости роста от скорости производства флуоресценции (см. рисунок 3). Определите линейный диапазон в поздних временных точках. Исключите ранние временные точки до тех пор, пока не будет достигнута линейная регрессия с наибольшим значением R2, основанная минимум на 12 точках (приблизительно 3 часа).
    Примечание: Наклон этой линейной регрессии представляет собой фракцию экспрессии, т.е. долю общего синтеза белка, относящуюся к репортерному белку21.
  7. Для всех культур извлеките линейные тренды примерно из одного и того же временного интервала и запишите значение наклона для каждого условия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Достижение максимально возможного значения R2 во всех языках и региональных параметрах с использованием одного и того же интервала времени может потребовать нескольких попыток. Для автоматизированного анализа доступен следующий Jupyter Notebook (фреймворк Google Colab) по адресу https://github.com/frank-britto/Mer_RFP. Этот блокнот служит шаблоном для оптимизации извлечения линейных трендов и дальнейшего профилирования «доза-реакция».
  8. Возьмите средний наклон поперек репликат для каждой концентрации ртути.
  9. Нанесите на график усредненные значения наклона в зависимости от концентрации ртути (см. рисунок 4A). Подгонка функции Hill к данным:
    figure-protocol-7
    Где: fRFP – фракция экспрессии для красного флуоресцентного белка, H – максимально возможная экспрессия для цепи, [Hg2+] – концентрация ионной ртути, kHg связана с аффинностью к ионной ртути, n – коэффициент Хилла, выражающий кооперативность реакции на Hg2+.

6. Эксперимент по титрованию с использованием биосенсора Mer-Blue

  1. Центрифугируйте в течение ночи плотную культуру, полученную, как описано на шаге 3, при концентрации 3500 × г в течение 10 минут.
  2. Выбросьте отработанную среду M9 и повторно суспендируйте бактериальную гранулу в свежей среде M9 до наружного диаметра600 или 1,0. Убедитесь, что при этой плотности получено не менее 5 мл культуры (Рисунок 1C).
    Примечание: Если спектрофотометр недоступен, приблизьтесь к начальным условиям, повторно суспендируя бактериальную гранулу в объеме свежей среды М9, равном в два раза большему первоначальному объему плотной культуры.
  3. Добавьте 9,5 мл среды М9 и 10 мкл стокового раствора ампициллина 100 мг/мл в стерилизованные пробирки для культуры стекла (рис. 1H).
  4. Инокулируют в добавленную среду М9 500 мкл биосенсорной культуры, приготовленной на стадии 6.2 (наружный диаметр600 = 1,0).
  5. Добавьте 10 мкл приготовленных растворов ионной ртути (см. шаг 1) для получения конечных концентраций 0 нМ, 1 нМ, 2 нМ, 5 нМ, 10 нМ, 25 нМ, 50 нМ, 100 нМ, 125 нМ и 250 нМ.
  6. Инкубировать культуры при 37 °C в течение 16 ч с энергичным встряхиванием при 220 об/мин (рис. 1I).

7. Сбор и анализ данных для результатов Mer-Blue

  1. Перенесите примерно 1,3 мл каждой культуры в микропробирку объемом 1,5 мл (рис. 1J).
  2. Центрифугируйте микропробирки на максимальной скорости в течение 3 минут, чтобы получить плотные гранулы. Выбросьте надосадочную жидкость.
  3. (Дополнительный) Для получения более крупных гранул повторите центрифугирование и удаление надосадочной жидкости до шести раз.
  4. Сфотографируйте дно каждой микротрубки, ориентируясь на гранулу (рисунок 1К). Используйте держатель микротрубки и штатив или камеру PelletCam (см. шаг 8), чтобы обеспечить согласованную и воспроизводимую ориентацию, освещение и цветовые настройки на всех изображениях (см. рисунок 5).
  5. Определите значения интенсивности цвета каждого изображения гранулы в красном, зеленом и синем каналах (RGB).
    1. Если вы используете ImageJ: Загрузите изображение и перейдите к Image > Type > RGB Stack , чтобы создать стек из трех срезов (красный, зеленый и синий каналы). С помощью инструмента выделения нарисуйте область интереса (ROI) вокруг области гранул. Перейдите к разделу Анализ > измерение , чтобы получить средние значения интенсивности для выбранной области в каждом канале.
    2. При использовании PelletCam: Откройте файл .csv, содержащий средние значения интенсивности цвета для репрезентативной области изображения гранулы размером девять пикселей.
  6. Вычислите отклик биосенсора для каждого образца, вычислив евклидово расстояние в пространстве RGB относительно белого эталонного изображения гранулы (непреобразованной кишечной палочки), как описано ранее22, используя уравнение:
    figure-protocol-8
    Здесьобразцы R, Gи Bпредставляют собой средние интенсивности цвета от каждого RGB-канала в выбранной области изображения гранулы из образца биосенсора, в то время как Rref, Gref и B ref обозначают соответствующие значения для эталонной гранулы нетрансформированной E. coli.
  7. Построение графика расчетных евклидовых расстояний в зависимости от соответствующих концентраций ионной ртути (см. рис. 6). Подгоним функцию Хилла к данным (см. рис. 4B) с помощью следующего уравнения:
    figure-protocol-9
    Здесь E — евклидово расстояние, H — максимально возможная окраска цепи, [Hg2+] — концентрация ионной ртути, kHg связана с сродством к ионной ртути, а n — коэффициент Хилла, выражающий кооперативность отклика на Hg2+.

8. Сборка камеры PelletCam

  1. Загрузите файлы для сборки закрытой микроконтроллерной системы для измерения цвета в бактериальных гранулах с веб-сайта (https://github.com/EhbAIGit/PelletCam-OPENBIOLAB-AI).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Базовые знания о лазерной резке, 3D-печати, ESP32 и Arduino полезны. Вводное руководство по ESP32-CAM доступно по адресу (https://lastminuteengineers.com/getting-started-with-esp32-cam/?utm_content=cmp-true). Рекомендуется приобретать ESP32-CAM вместе с адаптером MB для упрощения программирования. Пользователям, незнакомым с ESP32, рекомендуется сначала ознакомиться с https://lastminuteengineers.com/esp32-arduino-ide-tutorial/ инструкциями.
  2. Используйте файл LasercutterBox.ai для резки и гравировки мультиплекса диаметром 3 мм с помощью лазерного резака.
  3. Соберите детали из файла ESP32SET.stl с помощью 3D-принтера. Этот файл .stl может быть импортирован непосредственно практически всеми программами 3D-принтеров; Например, студия Bambu (https://bambulab.com/en/download/studio).
  4. Установите ESP32 (модуль Bluetooth-камеры ESP32-CAM-MB 2640 WiFi), поместив файлы .cpp и .h и .ino в одну папку. Затем откройте файл .ino с помощью программного обеспечения Arduino IDE и нажмите на >Загрузить. После загрузки ESP32 запустится автоматически.
  5. На этом этапе пользователь должен иметь возможность подключиться к точке доступа Wi-Fi с именем >PELLET и паролем >PELLETCAM, как указано в файле .ino ESP32. IP-адрес PelletCam будет отображаться на последовательном мониторе Arduino IDE. Откройте веб-браузер и перейдите по адресу: http://192.168.4.1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит просмотреть изображение или сделать новое изображение (>CAPTURE PHOTO), повернуть изображение (>ROTATE) или установить яркость светодиодной ленты (>LEDS).
  6. Подключите ESP32 Arduino к светодиодной ленте (NeoPixel Stick - светодиод 8 x 5050 RGB со встроенными драйверами) и USB-кабелю на 5 В по схеме в файле InstallationManual.pptx.
  7. Используйте клеевой пистолет, чтобы приклеить ESP32 и светодиодную ленту к опорам, напечатанным на 3D-принтере.
  8. Вставьте микротрубку с цветным дном (или бактериальную гранулу) в напечатанную на 3D-принтере переднюю часть камеры PelletCam. Расположите светодиодную опору ESP32 примерно на 5 см дальше и сделайте снимок на веб-странице. Если получается резкое и правильно освещенное изображение, то приклейте ESP32-LED-опору на дно деревянного ящика. Если нет, отрегулируйте расстояние между передней панелью и ESP32-LED-опорой и повторяйте процедуру до тех пор, пока не будет получено удовлетворительное расстояние.
  9. Соберите коробку, используя малярный скотч и склеив все детали между собой столярным клеем.
  10. Подключите камеру PelletCam с помощью USB-кабеля к USB-источнику питания, который может подавать не менее 1 А.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что установлен Python 3.9 или более поздняя версия.
  11. Откройте командную строку или окно терминала. Перейдите в каталог, содержащий файл pellet.py . Выполните скрипт с помощью команды >python pellet.py.
  12. Если скрипт pellet.py не может быть выполнен, это может быть связано с отсутствием библиотек Python. Установите необходимые библиотеки с помощью команды >pip install pillow tkinter pathlib statistics. Дополнительные рекомендации по настройке собственной системы см. в документе PelletCam Example.docx.

9. Измерение проб воды в окружающей среде

  1. Собирайте пробы из источников окружающей среды, таких как реки или пруды, и храните их в герметичных контейнерах при низких температурах, чтобы свести к минимуму испарение. Подробнее см. раздел Обсуждение.
  2. Центрифугируйте образцы при давлении 3 500 × г в течение 10 минут, чтобы осадить песок и органический мусор, изолируя водную фракцию.
  3. Осветленный образец простерилизовать с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте термической стерилизации, так как ртуть летуча и может испаряться во время процесса.
  4. (Дополнительный) Приготовьте отдельную подкисленную аликвоту, добавив 5% HCl для независимого измерения с использованием стандартных методов аналитической химии. Для биосенсорных анализов используйте только незакисленный образец.
  5. Смешайте 5 мл стерильно отфильтрованного образца окружающей среды с 4,5 мл среды 2× М9, в результате чего образец будет разбавлен в соотношении 1:2.
  6. Инокулируйте разведенную смесь образца и среды 0,5 мл культуры на ночь (приготовленной, как описано в шаге 5.4). Эта инокуляция соответствует 20-кратному разведению культуры, в результате чего OD600 составляет 0,05 для начала анализа.
    1. При использовании Mer-RFPTransfer 200 мкл смеси образец и среда в микропланшетную лунку и начните измерения с помощью считывателя микропланшетов, как описано в шаге 3.6.
    2. При использовании Mer-Blue: Инкубируйте смесь образца и среды объемом 10 мл при 37 °C в течение 16 ч с энергичным встряхиванием при 220 об/мин, как описано в шаге 5.6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оба биосенсора не демонстрируют обнаруживаемой базовой экспрессии соответствующих репортерных белков в условиях, свободных от ртути. Культуры Mer-Blue обычно начинают демонстрировать видимую для невооруженного глаза окраску через 6-8 ч после инокуляции при концентрацииHgBr2 25 нМ и выше. При правильном проведении эксперименты по титрованию с использованием Mer-RFP или Mer-Blue дают отклики, которые соответствуют функции Хилла с коэффициентом Хилла, близким к 1, что указывает на некооперативное поведение связыв...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Используемые здесь биосенсорные схемы идентичны, отличаются только репортерным белком. Оба они полностью закодированы на плазмидах с высоким уровнем копий, что позволяет использовать их в клетках кишечной палочки различных штаммов. В то время как он функционирует в клетках штамма E. coli B, более сильный цветной сигнал от Mer-Blue наблюдался в штаммах K-12, в частности DH5α и химически компетентных клетках E. coli15.

Мы заметили, что для дости...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

Данное исследование представлено благодаря поддержке Programa Nacional de Investigación Científica y Estudios Avanzados PROCIENCIA в рамках программы EF-041-2024-01 "Proyectos de Investigación aplicada", грантовый контракт PE501086520-2024-PROCIENCIA. Разработка ртутных биосенсоров финансировалась VLIR-UOS через код гранта Южной инициативы PE2020SIN292B122. M.D. благодарит VLIRUOS, DGD и Совет фламандских университетов прикладных наук и искусств за грант XREI в рамках проекта Global Minds BE2017GMHVLHC106.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Мультиплексная древесина толщиной 3 ммМногие распределители
USB-кабель 5 ВМногие распределители
96-луночный Прозрачный Плоский Дно Полистирол Обработанные TC МикропластиныCorning3599
Порошок агараHiMediaGRM026
АмпициллинГолд Биотехнология, Инк.A-301-100
CaCl2Millipore208290
Casamino AcidsCalbiochem2040OP
D-(+)-глюкозаCentral Drug House (P) Ltd.506250
ESP32-CAM-MB 2640 Bluetooth WiFi Модуль камеры USB к последовательному порту Плата разработки Автоматическая загрузка (тип C)Многие дистрибьюторы
Стеклянные трубки для культурыCorning9825
HgBr2, Бромид ртути(II)Merck200085
HgCl2, Хлорид ртути(II)Merck21465
Бульон Лурия (Миллер)Sigma-AldrichL3522
M9 минимум солейSigma-AldrichM6030
MgSO4HiMediaGRM684
NeoPixel Stick - 8 x 5050 RGB LED со встроенными драйверамиAdafruit1426
Плазмид: pUC-Mer-Blue Нашагруппа-Полнаяпоследовательность доступна в https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1
плазмиде: pUC-Mer-RFP Нашагруппа-Полнаяпоследовательность доступна в https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1
Шприцевые фильтры, гидрофильные, размер пор 0,22 мкмМиллипорыSLGV004SLДля стерилизации образцов окружающей среды.

Ссылки

  1. Cooke, C. A., Balcom, P. H., Biester, H., Wolfe, A. P. Over three millennia of mercury pollution in the Peruvian Andes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (22), 8830-8834 (2009).
  2. Gautam, R. K., Sharma, S. K., Mahiya, S., Chattopadhyaya, M. C. Contamination of heavy metals in aquatic media: transport, toxicity and technologies for remediation. Heavy Metals in Water: Presence, Removal and Safety. Sharma, S. K. , Royal Society of Chemistry. Cambridge. 1-24 (2014).
  3. Chen, C. Y., et al. A critical time for mercury science to inform global policy. Environ Sci Technol. 52 (17), 9556-9561 (2018).
  4. Ali, H., Khan, E., Ilahi, I. Environmental chemistry and ecotoxicology of hazardous heavy metals: environmental persistence, toxicity, and bioaccumulation. J Chem. 2019, 6730305(2019).
  5. Gao, Y., et al. Determination and speciation of mercury in environmental and biological samples by analytical atomic spectrometry. Microchem J. 103, 1-14 (2012).
  6. Ralston, D. M., O'Halloran, T. V. Ultrasensitivity and heavy-metal selectivity of the allosterically modulated MerR transcription complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3846-3850 (1990).
  7. Brown, N. L., Stoyanov, J. V., Kidd, S. P., Hobman, J. L. The MerR family of transcriptional regulators. FEMS Microbiol Rev. 27 (2-3), 145-163 (2003).
  8. Wang, D., et al. Structural analysis of the Hg(II)-regulatory protein Tn501 MerR from Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep. 6, 33391(2016).
  9. Nucifora, G., Chu, L., Silver, S., Misra, T. K. Mercury operon regulation by the merR gene of the organomercurial resistance system of plasmid pDU1358. J Bacteriol. 171 (8), 4241-4247 (1989).
  10. Cai, S., et al. Engineering highly sensitive whole-cell mercury biosensors based on positive feedback loops from quorum-sensing systems. Analyst. 143 (3), 630-634 (2018).
  11. Guo, M., et al. Using the promoters of MerR family proteins as "rheostats" to engineer whole-cell heavy metal biosensors with adjustable sensitivity. J Biol Eng. 13, 70(2019).
  12. Wang, D., et al. Engineered cells for selective detection and remediation of Hg2+ based on transcription factor MerR regulated cell surface displayed systems. Biochem Eng J. 150, 107289(2019).
  13. Wang, D., et al. Visual detection of Hg2+ by manipulation of pyocyanin biosynthesis through the Hg2+-dependent transcriptional activator MerR in microbial cells. J Biosci Bioeng. 129 (2), 223-228 (2020).
  14. Guo, Y., Hui, C., Liu, L., Chen, M., Huang, H. Development of a bioavailable Hg(II) sensing system based on MerR-regulated visual pigment biosynthesis. Sci Rep. 11, 13516(2021).
  15. Zevallos-Aliaga, D., et al. Highly sensitive whole-cell mercury biosensors for environmental monitoring. Biosensors. 14 (1), 246(2024).
  16. Zhang, N. -X., et al. Versatile artificial mer operons in Escherichia coli towards whole-cell biosensing and adsorption of mercury. PLoS One. 16 (5), e0252190(2021).
  17. Chen, Y., et al. Advances in bacterial whole-cell biosensors for the detection of bioavailable mercury: a review. Sci Total Environ. 868, 161709(2023).
  18. Chen, S., Chen, X., Su, H., Guo, M., Liu, H. Advances in synthetic-biology-based whole-cell biosensors: principles, genetic modules, and applications in food safety. Int J Mol Sci. 24 (7), 7989(2023).
  19. Yu, W., et al. Genetically encoded biosensors for microbial synthetic biology: From conceptual frameworks to practical applications. Biotechnol Adv. 62, 108077(2023).
  20. Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (6), 2000187(2020).
  21. Vaccari, N. A., Zevallos-Aliaga, D., Peeters, T., Guerra, D. G. Biosensors characterisation: Formal methods from the perspective of proteome fractions. Synth Biol. 10 (1), ysaf002(2025).
  22. Liljeruhm, J., et al. Engineering a palette of eukaryotic chromoproteins for bacterial synthetic biology. J Biol Eng. 12, 8(2018).
  23. Alon, U. An Introduction to Systems Biology. , Chapman and Hall/CRC. Boca Raton. (2019).
  24. Lineweaver, H., Burk, D. The determination of enzyme dissociation constants. J Am Chem Soc. 56 (3), 658-666 (1934).
  25. Wyatt, L., et al. Spatial, temporal, and dietary variables associated with elevated mercury exposure in Peruvian riverine communities upstream and downstream of artisanal and small-scale gold mining. Int J Environ Res Public Health. 14 (12), 1582(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.