Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В естественных условиях Кальциевая визуализация нейронных ансамблей в сетях первичных сенсорных нейронов в интактных ганглиях тройничного нерва

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68284

⸱

1 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Department of Endodontics, School of Dentistry, University of Alabama at Birmingham, 3Division of Life Sciences, College of Life Sciences and Bioengineering, Incheon National University, 4Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences, University of Texas Health Science Center at San Antonio

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает визуализацию кальция in vivo GCaMP интактных нейронов тройничного ганглия (ТГ). Это описание включает в себя экспозиционную хирургию ТГ, конфокальную микроскопию нейронов ТГ in vivo , применение соматических стимулов во время микроскопической визуализации нейронов ТГ, а также анализ данных визуализации кальция in vivo .

Аннотация

Визуализация кальция является важным инструментом для мониторинга сигнальных механизмов, которые либо вливают Ca2+ в цитозоль, либо высвобождают Ca2+ из внутриклеточных запасов Ca2+ . Использование мышей Pirt-GCaMP3, у которых Ca2+ сенсор GCaMP3 вставлен ниже промоторной области Pirt и экспрессируется почти во всех (>95%) первичных сенсорных нейронах, позволяет одновременно контролировать активность >3000 нейронов с помощью Ca2+ визуализации первичных сенсорных нейронов тройничного ганглия (ТГ). Это позволяет исследователям изучать реакцию нейронной сети на вредные стимулы, а также соматосенсорные и гормональные реакции in vivo, которые в противном случае было бы очень трудно обнаружить с помощью других методов.

В частности, возможность мониторинга области ТГ, иннервирующей лицо и другие области головы по отдельности, позволяет контролировать первичные сенсорные нейроны, активируемые стимулами области лица, до последующих слоев нейронной обработки. Также можно наблюдать количество нейронов, генерирующих транзиенты Ca2+ , и амплитуду транзиентов Ca2+ , которые указывают на их чувствительность к различным сенсорным модальностям. Кроме того, исследователи могут измерить диаметр нейронов, который является индикатором типа активированных волокон (безвредные механические волокна в сравнении с вредными ноцицептивными волокнами, волокнами Aβ, Aδ и C). Таким образом, визуализация ТГ с помощью Pirt-GCaMP3 с помощью анализа кальция может стать мощным инструментом для анализа специфических сенсорных модальностей и типов нейрональных клеток для изучения боли тройничного происхождения (орофациальная и краниофациальная, зубная боль, головная боль, мигрень, боль в височно-нижнечелюстном суставе, невралгия тройничного нерва), зуд и прикосновение и любые другие соматоощущения, а также гормональные реакции.

Введение

Первичные сенсорные нейроны непосредственно иннервируют ткани, включая кожу, и ретранслируют сенсорные сигналы в центральную нервную систему (спинной мозг или ствол головного мозга). Нейроны тройничного нерва (ТГ) иннервируют голову и реагируют на сенсорные раздражители, включая боль в зубах, периорбитальной области, орофациальной и черепно-лицевой областях, височно-нижнечелюстном суставе 1,2 и мозговых оболочек 3,4,5. Нейроны ТГ различаются по размеру, уровню миелинизации и профилям экспрессии генов 6,7,8,9. Более мелкие нейроны являются ноцицептивными, в то время как более крупные нейроны обычно реагируют на безболезненные механические раздражители10,11. Дисфункция нейронов тройничного нерва может сенсибилизировать как сами нейроны, так и сенсорные нейроны центральной нервной системы (ЦНС)11,12.

В нормальном физиологическом контексте при непатологических состояниях возбуждение нейронов in vivo необходимо для снятия боли, но до последних двух десятилетий инструменты для изучения интактных сенсорных ганглиев in vivo были ограничены мониторингом относительно небольшого числа нейроноводновременно. Из-за обычно низких концентраций кальция в цитоплазме, притока кальция во время потенциалов действия и использования кальция в качестве цитоплазматического сигнала, динамика кальция является мощным суррогатом для мониторинга потенциалов действия или клеточной активности in vivo с использованием чувствительных к кальцию флуоресцентных индикаторов. Обоснование данного метода заключается в том, что флуоресцентная микроскопия может одновременно контролировать эти показатели в сотнях и тысячах нейронов одновременно в периферических сенсорных ганглиях мышей 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 и крысы 25,26. Это мощное преимущество перед методами, которые могут контролировать более ограниченное количество нейронов in vivo.

Целью данного метода является непосредственное наблюдение за динамикой цитоплазматическогоCa2+ in vivo в ТГ в ответ на механические, температурные, химические и гормональные стимулы в моделях головной боли 19,23,24. Этот метод может быть использован в качестве дополнения к болевым или другим соматосенсорным тестам в орофациальной области. Визуализация тройничного нерваCa2+ in vivo использовалась для характеристики теплового и сенсорного кодирования19,22, изучения классов механорецепторов27, открытия нового класса механочувствительных нейронов28, мониторинга реакций тройничного нерва на нормальные механические нагрузки на мозговые оболочки29, изучения влияния гормонов на болевую чувствительность24, характеристики моделей орофациальной боли30, и участники исследования с болью, вызванной алкогольной абстиненцией23.

Мыши Pirt-GCaMP3 позволяют осуществлять мониторинг нейронной активности in vivo, поскольку у них датчик Ca2+ GCaMP3 вставлен в промоторную область гена Part, который высоко экспрессируется во всех (>95%) первичных сенсорных нейронах12,18. В данной работе продемонстрирована методика проведения хирургического облучения ТГ in vivo, а также сбор и анализ данных микроскопии индикатора кальция для правой стороны ТГ мышей Pirt-GCaMP3 с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные здесь процедуры выполняются в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию в учреждениях. Операция не является выживаемой. Разделы 1 и 2 этой процедуры должны быть выполнены сразу после начала. Раздел 3 может быть выполнен позже.

1. Фиксация и хирургическое вмешательство мыши для визуализации ТГ с правой стороны

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши Pirt-GCaMP3 C57BL/6J18 должны иметь взрослый размер тела (обычно 8 недель или старше), независимо от пола. Возможна двусторонняя визуализация ТГ. Время, указанное здесь, является оценкой опытного технического специалиста. Если кровотечение больше нормы, это может занять на несколько минут больше времени в течение каждого времени.

  1. Приготовьте стерильный солевой раствор с 40 мг/мл кетамина и 6 мг/мл ксилазина. Подготовьте достаточный объем для операции и эвтаназии после визуализации (минимум 9 мкл на грамм массы тела мыши).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многие виды анестезии использовались во время визуализации in vivo . Внимание: Кетамин вреден при инъекции, проглатывании или попадании в глаза. Обращайтесь с осторожностью.
  2. Стерилизуйте все хирургические инструменты в стерилизаторе с шариками. Вымойте инструменты с 70% этанолом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно предварительно настроить приборы в автоклаве.
  3. За 15-25 минут до операции мышам Pirt-GCaMP3 вводите 2,25 мкл кетамина/ксилазина на грамм массы тела (90 мг/кг и 13,5 мг/кг кетамина и ксилазина, соответственно) внутримышечно. Не превышайте 120 мг/кг кетамина.
  4. После 15-25 мин инъекции анестетика (шаг 1.3) защемите заднюю лапу щипцами, чтобы убедиться, что мышь находится в плоскости хирургической анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Укол должен быть достаточно интенсивным, чтобы вызвать вокализацию у мыши, находящейся в сознании, но не настолько интенсивным, чтобы вызвать травму. Важно не оставлять мышь на этом этапе дольше, чем это необходимо, чтобы избежать падения температуры тела. По возможности полезно держать клетку в тепле.
  5. Поместите мышь на грелку, чтобы температура тела поддерживалась на уровне 37 °C, и поместите голову мыши в стереотаксическую маску (рис. 1A,B), наклонив голову примерно на 15° влево (рис. 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стереотаксическая маска, которая стабилизирует голову и обеспечивает путь введения изофлурана, описана здесь. Если в процедуре не используется изофлуран или не используется стереотаксическая маска, следует использовать другой метод стабилизации головы для предотвращения движения.
  6. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость и раздражение, так как раздражение индуцирует активность тройничного нерва.
  7. Побрейте правую сторону головы мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает 90 секунд. Следователь может ненадолго снять животное с грелки для бритья.
  8. Сделайте прямоугольный разрез размером 9 мм x 5 мм между правым ухом и правым глазом (рисунок 2A). Остановите кровотечение с помощью гемостатического тампона или лабораторной салфетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает 2 минуты. Исследователь может использовать гемостатические щипцы или ретрактор, чтобы держать разрез открытым. Это процедура, не требующая выживания, то есть дополнительная чистка не требуется. Тем не менее, исследователь может взять мазок с места операции с помощью повидон-йода. Указан максимально допустимый размер разреза. Если хирург достаточно квалифицирован, меньший разрез предпочтительнее большего, чтобы свести к минимуму повреждение тканей. ТГ иннервирует эту ткань и может быть повреждена.
  9. Разрежьте ткань (надкостницу) на поверхности черепа вентрально к глазу (рисунок 2В).
  10. С помощью бормашины и конусной фиссуры TNT bur 31p просверлите отверстие размером примерно 9 мм x 5 мм в дорсальном черепе с центром в месте разреза (рис. 2C). Приложите бор как можно легче к поверхности черепа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает примерно 2 минуты. Если хирург достаточно квалифицирован, отверстие меньшего размера предпочтительнее отверстия большего размера.
  11. Наклоняйте голову до тех пор, пока ТГ не станет хорошо видна (рисунок 2C). Если есть кровотечение в ТГ, аспирируйте кровь или удалите кровь с помощью гемостатического тампона или лабораторной салфетки. Убедитесь, что ТГ хорошо виден, не удаляя кортикальную ткань (Рисунок 2C).
    Примечание: Мы обычно визуализируем ТГ в течение 3-6 часов или более без признаков дистресса в нейронах, но исследователь может выбрать покровное стекло или другое покрытие, чтобы предотвратить высыхание ТГ.
  12. Переместите животное и грелку на предметный столик для микроскопа и поместите нос мыши в стереотаксический носовой конус. Подключите линии кислорода/изофлурана так, чтобы мышь получала непрерывную изофлурановую анестезию (рисунок 3A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает 3 минуты. Для непрерывного изофлурана требуются кислородные баллоны, газодаточные трубки и испаритель для анестезии. Также возможно поддержание анестезии на протяжении всей процедуры путем периодических инъекций анестетика.
  13. Расположите стереотаксическую рамку так, чтобы объектив микроскопа находился на расстоянии 9 мм непосредственно над отверстием черепа (рис. 3B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точное расстояние зависит от объектива, микроскопа и мыши.
  14. Вставьте ректальный термометр. Подключите шнур питания к ректальному термометру и грелке. Соедините маску для анестезии с изофлураном в кислородной магистрали с 1% изофлураном.

2. Визуализация ТГ

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте зеленую настройку (FITC) 495 нм, излучение 519 нм, длину волны обнаружения 500-580 нм, устройство визуализации GaAsP-Pmt1, детектор GaAsP-PMT или используйте рекомендуемые настройки для микроскопа. В таблице 1 приведена сводка настроек программного обеспечения.

  1. Используйте объектив M27 5x/0,25, программное обеспечение производителя микроскопа и вертикальный конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Определите местоположение поверхности TG с помощью микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объективный выбор зависит от микроскопа и предпочтений исследователя.
  2. Отрегулируйте объектив и носовой конус так, чтобы поверхность TG была как можно более плоской и имела максимально возможную площадь поверхности в фокальной плоскости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более плоский TG обеспечивает более четкое изображение, заставляет программное обеспечение компоновать более четкие фильмы, отображает больше нейронов, а также упрощает и повышает точность анализа по сравнению с более наклонным TG.
  3. Поддерживайте мышь под наркозом, применяя 1-1,5% изофлуран к потоку кислорода через маску для анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животное должно находиться под пристальным наблюдением на протяжении всей процедуры, зажимая заднюю лапу каждые 20-30 минут, чтобы убедиться, что животное остается под анестезией. Процентное содержание изофлурана, необходимое для поддержания анестезии, будет зависеть от конкретной мыши. Если животное двигается во время пробного щипка, изофлуран необходимо увеличить. Если дыхание становится поверхностным, изофлуран необходимо уменьшить. ВНИМАНИЕ: Изофлуран вреден при вдыхании и может вызвать головокружение или сонливость. Избегайте вдыхания и убедитесь, что рабочая зона имеет достаточную вентиляцию.
  4. Загрузка микроскопа по протоколу высокоскоростного сканирования: размер вокселя 4,160 мкм x 4,160 мкм x 14 мкм, 512 x 512 пикселей, 10 оптических срезов Z-стека, 1,02 единицы эйри (AU)/33 мкм, 15% мощность лазера 488 нм/75 мВт, время пикселя 1,52 мкс, время линии 0,91 мс, время кадра 465 мс, скорость сканирования LSM 8, двунаправленное сканирование, коэффициент усиления детектора GaAsP-PMT 550 В, Цифровое усиление 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные настройки могут варьироваться в зависимости от микроскопа и животных.
  5. Сканируйте ТГ короткими порциями по 6-8 циклов. Создание ортогональных проекций сканов (за один скан получается один кадр фильма) для создания фильма и проверки четкости изображения и согласованности между кадрами. При необходимости отрегулируйте положение стереоскопического кадра и толщину оптического сечения и повторяйте этот шаг до тех пор, пока не будет создан четкий и равномерный фильм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходимо повторить, если голова мыши движется, или исследователь меняет положение мыши или корректирует фокальную плоскость.
  6. Загрузите протокол сканирования микроскопа с высоким разрешением: размер вокселя 0,520 мкм x 0,520 мкм x 14 мкм, 4096 x 4096 пикселей, 6 оптических срезов Z-stack, 1,02 единицы измерения воздуха (AU)/33 мкм, 20% мощность лазера 488 нм/100 мВт, время пикселя 0,52 мкс, время линии 4,95 мс, время кадра 20,26 с, скорость сканирования LSM 6, двунаправленное сканирование, Коэффициент усиления детектора GaAsP-PMT 550 В, цифровой коэффициент усиления 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные настройки зависят от микроскопа и животного. Если клетки помечены td-Tomato, установите микроскоп на сканирование красного канала с длиной волны 592 нм/излучением 614 нм, длиной волны обнаружения 600-700 нм в дополнение к зеленому каналу.
  7. Создайте изображение TG в высоком разрешении.
    Примечание: Это изображение может быть полезно для подсчета нейронов, измерения диаметра тусклых нейронов или получения подробного изображения, позволяющего определить, реагировал ли один и тот же нейрон на два разных стимула или два разных нейрона.
  8. Загрузите в микроскоп протокол высокоскоростного сканирования (см. шаг 2.4).
  9. Запишите спонтанную активность в течение 80 циклов (примерно 10 минут). Создайте ортогональный проекционный фильм и убедитесь, что изображения достаточно четкие и согласованные для анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет получить достаточно кадров для анализа спонтанной активности. Это число может быть уменьшено или увеличено в зависимости от того, насколько важна спонтанная активность для конкретного эксперимента.
  10. Чтобы применить стимуляцию, установите микроскоп на сканирование 15-20 циклов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при применении стимулов, чтобы не двигать головой мыши. Смещение ТГ даже на микроны во время раздражителя может нарушить визуализацию. Сканирование позволяет циклам установить базовую линию, стимул и наблюдать за нейронами после удаления стимула.
  11. Подождите, пока циклы 1-5 не будут завершены, чтобы создать базовый план. Применяйте стимуляцию во время сканирования 6-10. Подождите не менее 5 минут после каждого стимула, чтобы избежать десенсибилизации нейронов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый стимул требует отдельного сканирования в 15-20 циклов. Сначала примените механическую стимуляцию, а затем холодную, тепловую и химическую стимуляцию. Применяйте низкочастотную стимуляцию (например, низкая механическая сила, температура, близкая к комнатной) перед высокочастотной стимуляцией (высокая механическая сила, температура, далекая от комнатной). Будьте осторожны, чтобы не сдвинуть ТГ при применении стимуляции. Если сканирование отчетливо слышно, стимуляция может быть применена сразу после сканирования 5. Тем не менее, любой метод, который обеспечивает постоянное время стимуляции, будет работать. Смотрите обсуждение порядка стимулирования.
  12. Для фон Фрея в области, иннервируемой V2 частью ТГ, удерживайте нить и многократно прикладывайте ее к ипсилатеральной области ниже глаза и над ртом сразу после сканирования 5 до сразу после сканирования 10.
  13. Для фон Фрея в области, иннервируемой V3 частью ТГ, удерживайте нить и многократно прикладывайте к ипсилатеральной области чуть ниже уха сразу после окончания сканирования 5 до сразу после окончания сканирования 10.
  14. Для холодных и тепловых стимулов охладите или нагрейте стакан для воды до температуры немного ниже (для холода) или выше (для нагрева) желаемой температуры, а затем начните сканирование с помощью пластиковой пипетки. Сразу после сканирования 5 приложите стимул с помощью пипетки для переноса к ипсилатеральной области чуть ниже глаза, над ртом (для V2) или чуть ниже уха (для V3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что температура находится в пределах 1 °C от желаемой температуры для сканирования 5. Чтобы избежать десенсибилизации нейронов, не применяйте стимул, если температура стакана неправильная. Вместо этого снова охладите или нагрейте воду и повторите попытку.
  15. В конце экспериментов введите 50 мМ хлорида калия подкожно в области V2 или V3, начиная с цикла 6, чтобы активировать и идентифицировать все реагирующие нейроны.
  16. После того как все стимулы были введены и зарегистрированы, усыпить животное путем передозировки кетамина/ксилазина (200 мг на кг кетамина, 30 мг на кг ксилазина или 5 мкл на г раствора, приготовленного на шаге 1.1), а затем обезглавить.

3. Протокол для анализа

  1. Откройте файл ортогональной проекции с помощью функции перетаскивания . Выберите тип изображения в меню Изображение | Тип | Цвет RGB. Дополнительно: Используйте плагин StackReg31 в разделе Плагины | jars | StackReg для коррекции артефактов движения и выравнивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователь может выбрать тип изображения в зависимости от предпочтений. RGB упрощает создание цветных изображений для публикации.
  2. Откройте Менеджер ROI с помощью команды Анализ | Инструменты | Менеджер по окупаемости инвестиций.
  3. Выберите активные нейроны, нарисовав ROI с помощью инструмента « Эллипс» или «Прямоугольник » на панели инструментов, а затем поместите его в файл ROI, нажав кнопку « Добавить » в окне «Менеджер ROI» или нажав клавишу «t».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Часто сохраняйте файлы ROI. ROI можно восстановить, перетащив файл ROI в ImageJ и нажав на поле «Показать все » в нижней части окна «Менеджер ROI». Сохранение файла ROI .zip упрощает анализ по сравнению с сохранением ROI в виде наложения. Нейрон, который колеблется в течение исходного периода, должен быть исключен как спонтанно активный, а не как реагирующий на стимул.
  4. В разделе Анализ | Настройки измерений, установите флажок Среднее значение серого (необязательно, но рекомендуется: снимите все остальные флажки в разделе Настройки измерения).
  5. Использование окна ROI в меню «Еще» | Multi-Measure для измерения интенсивности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда соседние нейроны находятся слишком близко, чтобы получить отдельный ROI. Эти нейроны могут быть включены в подсчет активных нейронов, но не могут быть включены в измерения интенсивности переходных процессов.
  6. Функция Multimeasure создает файл CSV в новом окне с меткой «Результаты». Сохраните файл CSV, нажав на Файл | Сохранить как. Откройте файл .csv с помощью программного обеспечения для работы с электронными таблицами и сохраните файл как таблицу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблон анализа см. в Дополнительном файле 1 .
  7. Рассчитайте интенсивность переходных процессов Ca2+ как ΔF/F0 = (Ft-F 0)/F0, где Ft — интенсивность пикселей в ROI в интересующую момент времени, а F0 — базовая интенсивность, определенная средней интенсивностью 2–4 кадров, предшествующих переходному процессу Ca2+ для спонтанной активности или первых 1–5 кадров для вызванных стимулом переходных процессов Ca2+ . Исключите все нейроны, которые генерируют пикиCa2+ до стимуляции и не анализируют активность после стимуляции.
  8. Для анализа интенсивности переходных процессов Ca2+ случайным образом отбирайте примерно одинаковое количество нейронов из каждого ганглия, чтобы предотвратить доминирование в анализе ганглий, генерирующих наибольшее количество реагирующих нейронов. Исключите пики с ΔF/F0 < 0,15.
    Примечание: Существуют альтернативные опубликованные методы анализа и включения и исключения нейронов 15,16,19,22,32,33,34,35.
  9. Измерьте диаметр нейрона, вычислив среднюю длину линии, нарисованной в ImageJ вдоль самого длинного и самого короткого диаметров, с помощью инструмента «Линия» на панели инструментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователь также может измерить площадь и эллиптические параметры ROI для оценки диаметра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Визуализация большого количества нейронов и специфических ветвей тройничного нерва с помощью конфокального сканирования тройничного ганглия Pirt-GCaMP
После хирургического воздействия ТГ на мышей Pirt-GCaMP3 конфокальная микроскопия позволяет визуализировать более >3000 нейронов одновременно (рис. 4). Это дает мощное преимущество одновременного наблюдения за тысячами ТГ-нейронов в их нормальном физиологическом контексте. Спонтанные переходные процессы Ca2+ м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Болевые расстройства височно-нижнечелюстного сустава и апикальный периодонтит затрагивают примерно 5%36 и 30-70%37,38 общей популяции соответственно. Первичные сенсорные нейроны обнаруживают вредные раздражители в коже, слизистой оболочке полости рта, зубах и периорбитальных областях, и их пластичность способствует постоянной боли. Клеточные культуры и экспланты могут быть использованы для изучения нейроно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами Национальных институтов здравоохранения R01NS0128574 и R01DE031477 (для Y.S.K.), а также премией Rising STAR от системы Университета Техаса (Y.S.K.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аназная инъекция (ксилазин)Covetrus, Akorn33197
Флурар 5х/0.25 M27 оберегКэл Цейсс420130-9900-000
Аппликаторы с хлопковыми наконечникамиМаккессон24-106-1С
Изогнутый гемостатИнструменты для точной науки13007-12
Регулятор температуры постоянного токаFHC40-90-8Д
Грелка с регулятором температуры постоянного токаFHC40-90-2-05
Щипцы Dumont с керамическим покрытиемИнструменты для точной науки11252-50
Регулятор температуры постоянного тока FHCFHC40-90-8Д
Флуризо (Изофлуран)MWI Animal Health, Piramal Group501017
Фридман-Пирсон РонгерИнструменты для точной науки16221-14
ГельпенкаКомпания Pfizer09-0353-01
ИзображениеJНациональные институты здравоохраненияИИ153
Кетазет (Кетамин)ЗоетисКЕТ-00002Р2
Модель 923-B Держатель головки для газовой анестезии мыши (взрослая мышь)Инструменты Kopf923-Б
Люминесцентная зеленая сценическая лентаJSITON/ АмазонкаB803YW8ZWL
M35 Компактная электрическая лабораторная система наконечниковБуффало Дентал Мануфэкчуринг Ко., Инк.М35
Matrx VIP 3000 Изофлуран ВапорайзерМидмарк91305430
Микроножницы для препарированияРобозРС-5882
Пружинные ножницы для микрорассеченияИнструменты для точной науки15023-10
Пружинные ножницы для микрорассеченияРобозРС-5677
Мини ректальный термисторный зондFHC40-90-5D-02
Операционные ножницыРобозРС-6812
Мыши Pirt-GCaMP3 C57/BL/6JУниверситет Джонса ХопкинсаН/ДЛюбой пол может быть изображен одинаково хорошо. Мышам должно быть не менее 8 недель из-за слабой или прерывистой экспрессии промотора PIRT у более молодых мышей.
Хлористый калийНаучный центр ФишераБП366-500
Стереотаксическая рамаKopf Модель 923-B923-Б
Стеротаксическая маска (активная) для мышей < 30г с трубочкамиRWD Медико-биологические науки68663
Бор для тротила с конической трещиной (31P)Буффало Дентал Мануфэкчуринг Ко., Инк.31P-ЗОЛОТО
td-Tomato C57BL/6J мышиЛаборатория Джексона7909
Верхняя пластина, 6 x 10 дюймовНьюпорт290-ТП
Трансферная пипетка, 3 млКоул ПармерУКС-06226-23
Мыши TrpV1-Cre C57BL/6JЛаборатория Джексона17769
Конфокальный микроскоп Zeiss LSM 800Кэл ЦейссЛСМ800
Программное обеспечение Zeiss Zen 2.6 Blue EditionКэл ЦейссДзен (Синее издание) 2.6

Ссылки

  1. Kuramoto, E., et al. Three-dimensional topography of rat trigeminal ganglion neurons using a combination of retrograde labeling and tissue-clearing techniques. J Comp Neurol. 532 (2), e25584(2024).
  2. Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. Int J Mol Sci. 22 (11), 5810(2021).
  3. Levy, D., Burstein, R., Kainz, V., Jakubowski, M., Strassman, A. M. Mast cell degranulation activates a pain pathway underlying migraine headache. Pain. 130 (1-2), 166-176 (2007).
  4. Moskowitz, M. A., Macfarlane, R. Neurovascular and molecular mechanisms in migraine headaches. Cerebrovasc Brain Metab Rev. 5 (3), 159-177 (1993).
  5. Strassman, A. M., Raymond, S. A., Burstein, R. Sensitization of meningeal sensory neurons and the origin of headaches. Nature. 384 (6609), 560-564 (1996).
  6. Avraham, O., et al. Profiling sensory neuron microenvironment after peripheral and central axon injury reveals key pathways for neural repair. Elife. 10, e68457(2021).
  7. Bhuiyan, S. A., et al. Harmonized cross-species cell atlases of trigeminal and dorsal root ganglia. Sci Adv. 10 (25), eadj9173(2024).
  8. Chu, Y., et al. Single-cell transcriptomic profile of satellite glial cells in trigeminal ganglion. Front Mol Neurosci. 16, 1117065(2023).
  9. Mapps, A. A., et al. Diversity of satellite glia in sympathetic and sensory ganglia. Cell Rep. 38 (5), 110328(2022).
  10. Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Curr Biol. 9 (12), R429-R431 (1999).
  11. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
  12. Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of trpv1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
  13. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).
  14. Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Sci Rep. 9 (1), 7651(2019).
  15. Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., Mcmahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
  16. Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Sci Adv. 2 (11), e1600990(2016).
  17. Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. J Neurosci. 41 (41), 8494-8507 (2021).
  18. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  19. Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: Modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. J Physiol. 597 (7), 2045-2061 (2019).
  20. Macdonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  23. Son, H., et al. Mast-cell-specific receptor mediates alcohol-withdrawal-associated headache in male mice. Neuron. 112 (1), 113-123.e4 (2024).
  24. Son, H., Zhang, Y., Shannonhouse, J., Gomez, R., Kim, Y. S. PACAP38/mast-cell-specific receptor axis mediates repetitive stress-induced headache in mice. J Headache Pain. 25 (1), 87(2024).
  25. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225(2020).
  26. Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
  27. Moayedi, Y., et al. The cellular basis of mechanosensation in mammalian tongue. Cell Rep. 42 (2), 112087(2023).
  28. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954.e4 (2017).
  29. Blaeser, A. S., et al. Trigeminal afferents sense locomotion-related meningeal deformations. Cell Rep. 41 (7), 111648(2022).
  30. Son, H., et al. Elucidation of neuronal activity in mouse models of temporomandibular joint injury and inflammation by in vivo GCaMP Ca2+ imaging of intact trigeminal ganglion neurons. Pain. 165 (12), 2794-2803 (2024).
  31. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  32. Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  33. Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nat Commun. 7, 11450(2016).
  34. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nat Commun. 6, 8171(2015).
  35. Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nat Neurosci. 19 (9), 1201-1209 (2016).
  36. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine 2020. Temporomandibular disorders: Priorities for research and care. Yost, O., Liverman, C. T., English, R., Mackey, S., Bond, E. C. , The National Academic Press. Washington, DC. (2020).
  37. Eriksen, H. M. Endodontology--epidemiologic considerations. Endod Dent Traumatol. 7 (5), 189-195 (1991).
  38. Sidaravicius, B., Aleksejuniene, J., Eriksen, H. M. Endodontic treatment and prevalence of apical periodontitis in an adult population of vilnius, lithuania. Endod Dent Traumatol. 15 (5), 210-215 (1999).
  39. Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Nav1.8-positive and Nav1.8-negative sensory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (9), 3811-3816 (2019).
  40. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. (192), e64826(2023).
  41. Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca2+ activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. J Neurosci. 42 (31), 6020-6037 (2022).
  42. Zheng, Q., et al. Synchronized cluster firing, a distinct form of sensory neuron activation, drives spontaneous pain. Neuron. 110 (2), 209-220.e6 (2022).
  43. Mahadevan, A. S., et al. Cytonet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Comput Biol. 18 (6), e1009846(2022).
  44. Chen, C., et al. Long-term imaging of dorsal root ganglia in awake behaving mice. Nat Commun. 10 (1), 3087(2019).
  45. Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca2+ responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. J Pharmacol Sci. 137 (1), 101-104 (2018).
  46. Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
  47. Li, J., et al. Engineering of nemo as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).
  48. Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nat Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
  49. Tan, C. H., Mcnaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
  50. Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nat Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
  51. Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
  52. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  53. Zhang, Y., et al. Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with genetically-encoded voltage indicator, ASAP4.4-kv. bioRxiv. , (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Тройничный ганглийвизуализация in vivoмыши GCaMP3конфокальная микроскопиясенсорные модальностистимуляция волокнами фон Фреякальциевые транзиенты
В естественных условиях Кальциевая визуализация нейронных ансамблей в сетях первичных сенсорных нейронов в интактных ганглиях тройничного нерва
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.