Методическая статья

Мышиная модель стеатозного заболевания печени, ассоциированного с метаболической дисфункцией, с фиброзом

DOI:

10.3791/68294

⸱

18 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Brooklyn College, City University of New York

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышиная модель стеатотического заболевания печени, ассоциированного с метаболической дисфункцией (MASLD) с метаболической дисфункцией, изменениями экспрессии генов печени и гистопатологическими изменениями печени, которые напоминают MASLD человека, включая фиброз, прогрессирующий до прогрессирующей стадии фиброза 3. Эта модель может быть использована в исследованиях патофизиологии MASLD и в доклинических исследованиях новых методов лечения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фиброз печени является наиболее важным предиктором неблагоприятных исходов при стеатозной болезни печени, связанной с метаболической дисфункцией (MASLD). В доклинических исследованиях MASLD мыши являются наиболее часто используемой моделью заболевания. Однако в этих моделях фиброз печени трудно вызвать. Этот протокол описывает мышиную модель MASLD, в которой гиперфагических мышей Ay кормят диетой с высоким содержанием жира и фруктозы, что напоминает среднюю диету в США. У мышей развивается стеатоз печени, травмы, воспаление и фиброз. Фиброз прогрессирует от периклеточного, фиброз 1 стадии через 16 недель, до мостовидного, фиброз 3 стадии через 12 месяцев. У этих мышей также развиваются ожирение, гипертриглицеридемия, непереносимость глюкозы и гиперинсулинемия. Эта модель заболевания воспроизводит гистопатологию печени, изменения экспрессии генов печени и метаболическую дисфункцию заболевания человека. Этот протокол включает в себя два метода количественной оценки фиброза: гистологическое окрашивание коллагена пикро-сириусом красным и количественная оценка содержания гидроксипролина в печени. Эти методы могут быть использованы для изучения патофизиологии MASLD и для доклинических исследований потенциальных методов лечения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стеатотическое заболевание печени, связанное с метаболической дисфункцией (MASLD), является наиболее распространенным заболеванием печени, с распространенностью от 31% до 40% в США и 42% во всем мире 1,2,3,4. У пациентов с MASLD может развиться стеатогепатит, ассоциированный с метаболической дисфункцией (MASH), ранее называвшийся неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ), цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома 5,6. MASLD увеличивает риск развития гепатоцеллюлярной карциномы, и после недавнего увеличения распространенности MASLD она стала наиболее распространенным заболеванием печени у пациентов, у которых развивается гепатоцеллюлярная карцинома 7,8. При MASLD фиброз является основным предиктором прогрессирования до цирроза и неблагоприятных клинических исходов, включая заболеваемость со стороны печени (печеночная декомпенсация, печеночная недостаточность или рак печени) и смертность, связанную с печенью 6,9,10,11. Соответственно, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) поощряет разработку терапевтических средств, ориентированных на MASH/NASH при фиброзе, а также использование соответствующих моделей на животных12.

В доклинических исследованиях лекарственных препаратов и в механистических исследованиях MASLD чаще всего используются мышиные модели13. Были описаны тысячи мышиных моделей MASLD, что свидетельствует об отсутствии консенсуса по поводу оптимальной модели13,14. Создание оптимальных моделей сталкивается с рядом проблем. Несмотря на то, что у мышей относительно легко вызвать ожирение и стеатоз, кормя их пищей с высоким содержанием жиров, фиброз печени сложнее вызвать 13,14,15,16. В моделях MASLD, основанных на диетах с ожирением, фиброз развивается медленно17 Хотя это медленное прогрессирование может лучше имитировать болезнь человека18, оно увеличивает продолжительность и стоимость исследований на животных. Диеты с высоким содержанием холестерина (например, 2%) способствуют развитию фиброза; Однако они также снижают эндогенный синтез холестерина, что противоположно увеличению, описанному при заболевании человека15,16. В некоторых моделях MASLD используются мутантные или генетически модифицированные мыши; Тем не менее, у них могут быть предостережения: у мышей с акушерством и акушерством развиваются ожирение, стеатоз и резистентность к инсулину, но им не хватает лептина, который является медиатором фиброза; У мышей с нулевым содержанием PTEN развивается стеатоз, но не развивается резистентность к инсулину15,17. Таким образом, мышиные модели MASLD часто требуют длительных исследований, диет с высоким содержанием холестерина или генетических манипуляций для развития значительного фиброза. Чтобы решить некоторые из этих проблем, мы разработали мышиную модель, в которой у животных развивается MASLD с фиброзом, который прогрессирует от периклеточного/перисинусоидального (стадия 1) до мостовидного фиброза (стадия 3)19.

Целью данной статьи является описание данной модели MASLD с фиброзом печени и двумя методами количественной оценки фиброза: гистологическое окрашивание коллагена по пикро-сириусу красным цветом и количественное определение содержания гидроксипролина в печени.

Обоснованием для разработки этой модели было то, что наиболее полезными животными моделями являются те, которые наилучшим образом воспроизводят болезнь человека, как в отношении факторов заболевания, так и в изменениях в гистопатологии и экспрессии генов. Поэтому мы использовали диету, которая похожа на среднюю диету в США, включающую умеренно высокое количество жиров и фруктозы19,20. Мы кормили этой диетой мышей, несущих мутацию желтого Агути (Ay), которые широко использовались в качестве моделей ожирения21. Эти мыши повсеместно экспрессируют белок агути, антагонист рецепторов меланокортина, включая MC4R, вызывая гиперфагию и воспроизводя повышенное потребление пищи, которое часто встречается при ожирении человека 21,22,23. Эта модель обобщает изменения, определяющие MASH, включая стеатоз, гепатоцеллюлярное повреждение, воспаление, фиброз и метаболическую дисфункцию.

Основными преимуществами данной модели являются характеристики, которые делают ее схожей с болезнью человека. В модели используется диета западного типа, которая была разработана так, чтобы напоминать типичную диету США, и была показана как наиболее эффективная диета для репликации фенотипа человека MASLD 14,20. У мышей развиваются гистопатологические изменения печени, аналогичные тем, которые описаны в печени человека с MASH19,24. У мышей развивается метаболическая дисфункция, которая является важным критерием для диагностики MASLD5. Печень мышей с MASH демонстрирует изменения в экспрессии генов, которые повторяют таковые у людей с MASH/NASH19. В недавнем исследовании сравнивались 39 мышиных моделей MASLD на предмет их сходства с болезнью человека. В него были включены мыши с нокаутом MC4R, которые имеют тот же механизм гиперфагии и получали ту же диету, что и описанная нами модель14. Эта модель заняла пятое место (из 39) по сходству с MASLD человека по фенотипу, гистопатологии печени и транскриптомике14.

Дополнительными преимуществами данной модели являются: мыши Ay коммерчески доступны в лаборатории Джексона, и доступны в штамме C57BL/6J, который обычно используется в метаболических исследованиях21,25; Мутантных мышей легко идентифицировать по цвету шерсти; модель может быть объединена с моделями прироста или потери функции для изучения роли конкретных генов в развитии MASLD; И, наконец, в модели не используются дефициты питательных веществ (дефицит холина или метионина), необычные компоненты пищи (холевая кислота, этионин), необычно высокое содержание специфических питательных веществ (трансжиров) или гепатотоксинов (четыреххлористого углерода), которые не являются распространенными причинами MASLD и могут не воспроизводить болезнь человека 13,14,17.

Этот метод подходит для исследования механизмов, способствующих развитию и прогрессированию MASLD, а также для оценки вмешательств по его лечению или профилактике. Эта модель особенно полезна, потому что у животных не только развивается стеатогепатит и метаболическая дисфункция, но и развивается фиброз, который прогрессирует до 3 стадии. Модель может не подходить для изучения механизмов, влияющих на пищевое поведение (например, агонисты GLP1R), поскольку у этих мышей наблюдается гиперфагия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол соответствует рекомендациям по уходу за животными Бруклинского колледжа; Протокол IACUC No 318.

1. Мышиная модель MASLD с фиброзом

  1. Разводите мышей для получения потомства Ay. Установите племенные пары с мышами Ay (B6. cg-ay/j). Запишите дату рождения щенков.
  2. Убедитесь, что в пометах одинаковое количество щенков, чтобы обеспечить адекватное и равномерное кормление и рост. Стремитесь иметь от пяти до шести щенков в помете, так как это средний размер помета для мышей C57BL/6J. Дополнительные щенки, предпочтительно того пола, который не нужен, могут быть усыплены или взяты на воспитание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование самцов Ay и самок дикого типа (C57BL/6J Jax 0000664) может повысить эффективность разведения, поскольку самок мышей дикого типа C57BL/6J легко получить и они могут быть лучшими производителями, чем самки мышей Ay.
  3. Настройте клетки для экспериментов, как описано ниже.
    1. Определите мышей Ay по желтому цвету шерсти. Назначьте уникальную идентификацию каждой мыши и пометьте или пометьте мышей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аллель желтого (Ay) агаути гена агути придает желтый цвет шерсти. Аллель является полудоминантным у гетерозигот. Гомозиготность приводит к эмбриональной летальности. Поэтому мыши с желтой окраской шерсти гетерозиготны по гену Ay.
    2. Отлучайте мышей от груди, когда им исполнится 21 день. Сгруппируйте мышей, которые будут содержаться в одной клетке во время исследования. Содержать трех или четырех мышей Ay в клетке, в соответствии с ожидаемой массой тела и институциональными рекомендациями.
    3. Кормят стандартным кормом и водой. Домашние мыши при стандартной температуре (20-23 °C) и относительной влажности (от 40% до 60%) с 12-часовым световым циклом, 12-часовым темным циклом.
  4. Кормите мышей Ay диетой с высоким содержанием жира и фруктозы (High Fat and Fructose Diet, HFFD), начиная с 8-недельного возраста, как описано ниже.
    1. Обеспечьте мышей Ay западной диетой с высоким содержанием жира и сахарозы (Adjusted caloris Western Diet Inotiv TD.88137) ad libitum.
    2. Приготовьте раствор, содержащий фруктозу (23 г/л) и глюкозу (19 г/л) в питьевой воде. Стерилизуйте раствор путем фильтрации через фильтр 0,2 мкм и храните его в стерильных флаконах. После открытия храните раствор в холодильнике.
    3. Предоставьте мышам раствор, содержащий фруктозу и глюкозу, для питья, в стерильных питьевых бутылках. Заменяйте раствор и флаконы не реже одного раза в неделю, проверяя на рост микроорганизмов.
    4. Используйте клеточную подстилку, не имеющую питательной ценности (например, древесную щепу).
  5. Кормите контрольных мышей рационом с низким содержанием жира и фруктозы, как описано ниже.
    Примечание: Тип контрольных мышей зависит от дизайна исследования: если для оценки эффекта лекарств используются мыши Ay-HFFD, то контрольными мышами могут быть мыши Ay-HFFD, получавшие плацебо. Если модель используется для изучения влияния генетической модификации на развитие фиброза, то в качестве контрольной группы могут быть использованы мыши с Ay-HFFD без генетической модификации. Если требуется управление без MASH, выполните описанные здесь действия.
    1. Используйте мышей дикого типа, которые являются однопометниками мышей Ay. Их можно узнать по черному окрасу шерсти.
    2. Кормите мышей контрольной диетой (Low Fat Control Diet Inotiv TD.08485; называемой Low Fat and Fructose Diet, LFFD), начиная с того же возраста. Обеспечьте мышей регулярной питьевой водой.
  6. Отслеживайте развитие ожирения, еженедельно взвешивая мышей, помещая бодрствующих животных в тарелированный контейнер на лабораторные весы и записывая их вес.
  7. Следите за тем, чтобы мыши всегда получали достаточное количество пищи и раствора для питья. При необходимости контролируйте и записывайте потребление продуктов питания и растворов для питья, чтобы оценить потребление калорий.
  8. Соберите салфетки, как описано ниже.
    1. Выполняйте забор тканей после 16 недель на диете HFFD. Усыпьте мышь путем вдыхания углекислого газа (или других методов, одобренных IACUC учреждения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Через 16 недель у мышей Ay, которых кормили диетой HFFD, обычно наблюдается фиброз 1 стадии; Увеличение времени приведет к большему фиброзу, прогрессирующему до 3 стадии через 9-12 месяцев.
    2. Взвесьте мышь и запишите вес19.
    3. При необходимости соберите кровь. Для этого берут кровь из нижней полой вены с помощью шприца объемом 1 мл и иглы 27G после вскрытия брюшной полости и перед вскрытием печени (или используют любой другой метод, одобренный IACUC).
    4. Вскрывайте печень, вскрывая брюшную полость с помощью разреза по средней линии, удерживая печень за ворота щипцами и разрезая ножницами связки, связывающие печень с диафрагмой и забрюшинным пространством. Взвесьте печень и запишите вес.
    5. Промойте печень ледяным фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Сфотографируйте печень и включите в изображение линейку или другой объект в качестве эталонного размера. Поместите печень в чашку Петри, которая кладется на лед.
    6. Препарируйте образцы (примерно от 100 до 150 мг на образец) нескольких долей, включая срединную долю, левую долю и правую долю. Убедитесь, что образцы имеют толщину не более 4 мм, чтобы облегчить фиксацию. Поместите их в фиксирующий раствор (формалин 10% или формальдегид 4%) на 24 ч и обработайте для гистопатологического анализа (см. ниже).
    7. Препарируйте дополнительные образцы нескольких лепестков. Поместите их в пробирки (1,5 или 2 мл), заморозьте, погрузив в жидкий азот, и храните при температуре -80 °C. Эти образцы будут использоваться для измерения содержания гидроксипролина.
    8. При желании соберите образцы других органов (жировой ткани, мышц и т.д.)

2. Гистохимическое окрашивание коллагена и морфометрическое количественное определение

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, требующие использования опасных и/или летучих химических веществ, должны выполняться в вытяжном шкафу. Все слайды следует обрабатывать параллельно с помощью окрашивающей посуды и держателей для слайдов.

  1. Подготовьте срезы печени, как описано ниже.
    1. Закрепите ткань печени, выдержав ее в формалине (или формальдегиде) в течение 24 часов при комнатной температуре. Используйте объем фиксатора в 20 раз больше объема ткани. Далее переведите салфетки на 70% этанол. На этом протокол можно приостановить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани могут быть помещены в гистологические кассеты, которые затем помещаются в контейнер с фиксатором или, в качестве альтернативы, в отдельные контейнеры или пробирки.
    2. Заделайте салфетки в парафин. Обычно это делается основным учреждением или службой гистопатологии.
    3. Получить сечения толщиной 0,5 мкм, установленные на предметных стеклах (достаточно незаряженных предметных стекол). Дайте секциям высохнуть, выставив их на воздух комнатной температуры. Обычно это делает основное учреждение или служба гистопатологии. На этом протокол можно приостановить.
  2. Депарафинизируйте и регидратируйте срезы, как описано ниже.
    1. Депарафинизируйте секции, погрузив их в две смены депарафинизирующего/очищающего раствора (ксилол или цитрисольв) на 5-15 минут каждая.
    2. Восстановите водный баланс, последовательно погружая предметные стекла в 100% этанол, 95% этанол, 70% этанол и воду на 5 минут в каждую.
  3. Окрасьте срезы в красный цвет, как описано ниже.
    1. Погрузить секции в раствор Сириус красный (прямой красный 80) 1 г/л в пикриновую кислоту 1,3% на 1 ч. Не окрашивайте дольше, так как прямой красный цвет может окрашивать структуры, отличные от коллагена (например, ядра). Добавьте быстрый зеленый (1 г/л) в раствор для окрашивания, если требуется противодействие окрашиванию26. В качестве альтернативы можно окрашивать ядра гематоксилиномВейгерта 27.
    2. Верните раствор пикро-сириуса в закрытую емкость из темного стекла или пластика для хранения. Раствор может быть повторно использован многократно (не менее 20 лет27).
  4. Погрузите образцы в этанол (100%) на 5 минут для обезвоживания. Повторите то же самое со второй сменой этанола.
  5. Погрузите в очищающий раствор (ксилол или цитрисольв) до тех пор, пока они не будут по отдельности сняты для монтажа.
  6. Вынимайте по одному предметному стеклу из очищающего раствора и удаляйте лишнюю жидкость, промокнув на бумажных полотенцах. Добавьте монтажный материал (примерно от 50 до 100 мкл). Накройте секцию покровным стеклом и аккуратно нажмите на него, чтобы удалить пузырьки воздуха. Дайте высохнуть на воздухе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол может быть приостановлен.
  7. Наблюдайте за срезами с помощью светового микроскопа со светлым полем и объективами от 4x до 20x - коллаген выделяется красным цветом на светлом желто-оранжевом фоне. Визуализируйте интересующие области с помощью цветной камеры в соответствии с инструкциями на камере.
  8. Выполните визуализацию с помощью поляризационной световой микроскопии, как описано ниже.
    1. Включите и отрегулируйте поляризатор и фильтры анализатора ортогонально, чтобы убедиться, что коллаген виден, а фоновый сигнал минимален. Коллаген виден в виде белого, желтого или оранжевого цвета на темном фоне. На участках с небольшим фиброзом или без него будет виден коллаген в стенках кровеносных сосудов. Сохраняйте настройки, включая интенсивность освещения, одинаковыми для всех сравниваемых образцов.
    2. Изображение с помощью монохромной камеры или монохромного режима в цветной камере. Используйте объектив с 4-кратным увеличением. Делайте несколько изображений на секцию. Избегайте участков возле ворот, если они имеют крупные кровеносные сосуды. Используйте одни и те же настройки для всех сравниваемых изображений.
  9. Выполните морфометрическую количественную оценку с помощью Photoshop (альтернатива а), как описано ниже.
    1. Количественно определите белую область на изображениях, которая соответствует коллагену. В Photoshop нажмите кнопку Выбрать > Цветовой диапазон, затем выберите Светлые участки и отрегулируйте параметры Нечеткость и Диапазон, чтобы выбрать белые пиксели, соответствующие коллагену. Далее выберите Окно > Гистограмма > Развернутый вид и запишите количество выбранных пикселей, указанное рядом с параметром Пиксели. Используйте одни и те же параметры для всех сравниваемых изображений.
    2. Количественно определите общую площадь изображения. В Photoshop нажмите « Выделить > всех», затем запишите общее количество пикселей, как было сделано ранее.
    3. Рассчитайте процент площади изображения, соответствующий коллагену, разделив количество белых пикселей на общее количество пикселей. Значения обычно выражаются в процентах от площади.
  10. Выполните морфометрическую количественную оценку с использованием ImageJ (альтернатива b), как описано ниже.
    1. Выделите на снимках белые участки, которые соответствуют коллагену. Откройте инструмент «Порог», нажав «Изображение» > «Настроить порог> (или нажав Shift + T). Установите пороговый диапазон, чтобы только области, окрашенные коллагеном (белые области), были выделены красным цветом (например, минимальный порог 64; максимальный порог: 255), и нажмите «Применить». Это позволит бинаризировать изображение, преобразуя коллагеновую область в черную, а фон в белый.
    2. Измерьте общую площадь изображения, нажав кнопку «Анализ» > «Задать измерения». Проверьте область и отобразите метку. Нажмите OK. Нажмите «Анализировать> измерить (или нажмите клавишу M на клавиатуре). В окне «Результаты» отобразится общая площадь изображения.
    3. Чтобы измерить площадь коллагена и процентное соотношение, сначала включите параметр «Предел порогового значения», нажав «Анализ» > «Установить измерения». Отметьте площадь, Долю площади (ImageJ автоматически рассчитает % коллагена), Предел порога и Отображаемую метку. Нажмите OK. Затем нажмите кнопку «Анализ > измерение » (или нажмите клавишу M). В окне результатов будут отображены: Collagen Area (абсолютное количество пикселей) и Area Fraction (% коллагена от общего изображения).
    4. Сохраните результаты, выбрав «Сохранить как», или скопируйте их в буфер обмена и вставьте в таблицу.

3. Количественное определение гидроксипролина печени

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, требующие использования сильных оснований и кислот, должны проводиться с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты.

  1. Взвесьте образцы печени, приготовленные на шаге 1.8.7, и запишите вес. Поместите тканевые аликвоты в трубку, подходящую для гомогенизации. Добавьте деионизированную воду в соотношении воды и тканей 900 мкл воды на 100 мг ткани.
  2. Гомогенизируйте с помощью бисера или другим методом в соответствии с инструкциями производителя до тех пор, пока ткань не будет полностью гомогенизирована, что оценивается визуальным наблюдением. На этом протокол можно приостановить, а гомогенаты можно хранить при температуре -20 °C.
  3. Проводите осаждение белка так, как описано ниже. Следующие действия выполняются при комнатной температуре, за исключением случаев, когда указана другая температура.
    1. Переведите приблизительно 500 мкл на 1000 мкл гомогената в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Переносите один и тот же объем для всех образцов.
    2. Добавьте трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 12% (например, добавьте 120 мкл трихлоруксусной кислоты к 880 мкл гомогената)28. Вихрь коротко перемешать.
    3. Инкубируйте образцы на водяной бане в течение 30 минут. Центрифуга при 6 000 x g при 4 °C в течение 10 минут. Образуется осадок, содержащий белок. Выводить надосадочную жидкость методом аспирации. Держите трубки на льду.
    4. Добавьте 1 мл ледяного этанола (100%), чтобы промыть гранулы. Повторно суспензируйте гранулу с помощью ультразвука (или другим методом) и визуально убедитесь, что материал снова суспендирован. Центрифугируйте при 6 000 x g при 4 °C в течение 10 мин и удалите надосадочную жидкость путем аспирации. Используйте настройки ультразвука в соответствии с инструкцией к оборудованию (например, при использовании соникатора Branson SFX 150 с микронаконечником диаметром 3,2 мм для большинства образцов эффективна амплитуда 70% в течение 10 с). Повторите стирку 2 раза.
    5. Дайте гранулам высохнуть на воздухе в течение 10 минут или дольше, если это необходимо.
  4. Проведите гидролиз белка, как описано ниже.
    1. Добавьте 800 мкл 6 Н соляной кислоты в пробирки, содержащие белковый осадок. Повторно суспендируйте гранулу ультразвуком (или другим методом), используя те же настройки, что и в шаге 3.3.4.
    2. Переложите белковую суспензию в стеклянные пробирки или флаконы с завинчивающимися крышками; плотно закройте. Инкубировать пробирки в духовке при температуре 110 °C в течение 22 ± 2 ч29.
    3. Центрифужные пробирки при давлении 16 000 х г в течение 10 мин; Твердые частицы образуют гранулы. Обычно для этого требуется перенос гидролизата из стеклянных флаконов в центрифужные пробирки перед центрифугированием.
    4. Перенесите надосадочную жидкость, которая содержит гидроксипролин, в трубки объемом 1,5 мл. На этом протокол можно приостановить. Гидролизаты могут храниться при температуре 4 °C.
  5. Подготовьте стандартную кривую для концентрации гидроксипролина. Для образцов печени со стадией фиброза с 1 по 3 стадию с использованием количества ткани, указанного в данном протоколе, достаточно стандартных концентраций до 125 мкг/мл (например, при серийных разведениях 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,81, 3,91, 1,95 и 0 мкг/мл). Готовят нормы, разводя гидроксипролин в 6 Н соляной кислоты.
  6. Перелейте 40 μл каждого образца и стандарта в пробирки с маркировкой 1,5 мл. Добавьте 10 мкл 10 Н гидроксида натрия в каждый и быстро перемешайте.
  7. Выполните окисление гидроксипролина, как описано ниже.
    1. В деионизированной воде приготовьте ацетатно-цитратный буфер, содержащий уксусную кислоту 1,2% v/v, лимонную кислоту 46 г/л, тригидрат ацетата натрия 120 г/л и гидроксид натрия 34 г/л, и отрегулируйте pH буфера до 6,5.
    2. Приготовьте раствор 12,7 г/л хлорамина Т в буфере вода:n-пропанол:ацетат-цитрат (1:1:8 v:v:v). Сначала растворите хлорамин Т в воде путем перемешивания, затем добавьте n-пропанол, перемешайте, а затем добавьте буфер ацетат-цитрат и перемешайте.
    3. Добавьте 450 мкл раствора хлорамина в пробирки с образцами и эталонами. Перемешайте путем вортексинга. Выдерживать при комнатной температуре 25 мин30.
  8. Приготовьте реагент Эрлиха с 1 М 4-(диметиламино) бензальдегидом в соотношении хлорная кислота:пропанол 1:2 (v/v). Добавьте 500 мкл реагента Эрлиха в образцы и стандарты. Перемешайте путем вортексинга.
  9. Инкубировать при температуре 65 °C в течение 20 минут в нагревательном блоке, водяной бане или инкубаторе. Когда инкубация закончится, дайте образцам и стандартам остыть до комнатной температуры.
  10. Измерьте поглощение образцов и эталонов на длине волны 550 нм с помощью спектрофотометра.
  11. Построите график зависимости поглощения от стандартных величин и используйте линейную регрессию для построения стандартной кривой. Используйте параметры из стандартной кривой для расчета концентрации гидроксипролина в образцах.
  12. Рассчитать количество гидроксипролина в образцах печени исходя из общего объема гидролизата (шаг 3.4) и нормализовать по массе ткани, соответствующей объему гомогената, используемого для осаждения белка (шаг 3.3.1). Выражайте результаты в виде нг гидроксипролина на мг ткани. В качестве альтернативы можно измерить концентрацию белка в гомогенатах и выразить результаты в виде массы гидроксипролина на массу белка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У мышей, которых кормили HFFD, прибавлялось больше веса, чем у мышей дикого типа, которых кормили LFFD, развивалось ожирение (рис. 1A). Они набирают вес быстрее в течение первых 4 недель кормления HFFD, набирая примерно 3-4 г в неделю. Через 8 недель они набирают вес со скоростью, аналогичной контрольной мышке (примерно 0,6 г/неделю)19. Через 16 недель мыши Ay, получавшие HFFD, весили примерно от 45 г до 50 г (в среднем по трем отдель...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает мышиную модель MASLD с фиброзом печени, которая воспроизводит заболевание у людей 5,6. У мышей развивается стеатоз печени, о чем свидетельствует смешанный микро- и макровезикулярный стеатоз в гистологии и повышенное содержание триацилглицерина в печени19. У мышей также развиваются ожирение, гипертриглицеридемия, непереносимость глюкозы и, как сообщается, гипертензия, которая в сочет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения K22CA178098, R03DK101863, а также R15DK131627 и стартовыми фондами от Бруклинского колледжа (до JMC).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4-(диметиламино)бензальдегидСигма-ОлдричD2004
Уксусная кислотаРазличныеNA
Корректированная калорийная диета Западная диетаInotivTD.88137Рацион содержит жир (42 %ккал) и сахарозу (34 %Вт/Вт). Другие поставщики предлагают диеты с таким же составом
B6. Cg-Ay/JЛаборатория Джексона000021Стрейн имеет мутацию смертельного жёлтого цвета Агути и фон C57BL6/J. В настоящее время лаборатория Джексона сохраняет этот штамм cryproserved.
C57BL/6JЛаборатория Джексона000664
ЦентрифугаРазличныеNAС ротором для трубок объёмом 1,5 мл, охлаждённых, способных достигать 16 000 xg.
ЦентрифугаРазличныеNA
Хлорамин-Т-гидратСигма-Олдрич857319
Лимонная кислотаРазличныеNA
Direct Red 80Sigma365548-5G
ЭтанолЛаборатории Decon2701
Раствор формалина, нейтральный буферSigmaHT501128
ФруктозаСигма-ОлдричF0127
ГлюкозаСигма-ОлдричG8270
Оборудование для обработки гистологииNANAВстраивание и секционирование можно проводить в лаборатории исследователя или внешнем помещении
ГомогенизаторРазличныеNAБитеры эффективны для обработки нескольких образцов. Могут использоваться и другие методы гомогенизации
Соляная кислотаРазличныеNA
ГидроксипролинSigmaH5534
Диета с низким содержанием жировInotivTD.08485Контрольная диета, с низким содержанием жира (13 %ккал) и сахарозой (12 %w/w)
Микроскоп, оснащённый для поляризованной световой микроскопииРазличныеNA
N-пропанолРазличныеNA
Перхлорная кислотаРазличныеNA
Монтажная среда PermountFisher ScientificSP15-100
Пикриновая кислота, насыщенный водный раствор, спектрФишер18612375
Тригидат натрия ацетатаРазличныеNA
Гидроксид натрияРазличныеNA
СоникаторРазличныеNASonicator полезен для повторного подвески гранул на шаге 2.5, но не абсолютно необходим
Трихлоруксусная кислотаРазличныеNA
Очки VWR Micro Cover, прямоугольныеVWR 48393-081
Микроскопические слайды VWR Premium Superfrost Plus | VWRVWR 48311-703
Вода, деионизированнаяРазличныеNAДеионизированная вода из системы очистки воды или закуплена у поставщика.
КсиленыFisher ScientificX3FКлиринговый агент Citrisolv  (Fisher 22-143-975) продаётся как экологически чистая альтернатива

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ciardullo, S., Carbone, M., Invernizzi, P., Perseghin, G. Exploring the landscape of steatotic liver disease in the general US population. Liver Int. 43 (11), 2425-2433 (2023).
  2. Lee, B. P., Dodge, J. L., Terrault, N. A. National prevalence estimates for steatotic liver disease and subclassifications using consensus nomenclature. Hepatology. 79 (3), 666-673 (2024).
  3. Kalligeros, M., et al. Prevalence of Steatotic Liver Disease (MASLD, MetALD, and ALD) in the United States: NHANES 2017-2020. Clin Gastroenterol Hepatol. 22 (6), 1330-1332.e4 (2024).
  4. Younossi, Z. M., Kalligeros, M., Henry, L. Epidemiology of Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease. Clin Mol Hepatol. 31 ((Suppl)), S32-S50 (2024).
  5. Rinella, M. E., et al. A multisociety Delphi consensus statement on new fatty liver disease nomenclature. Hepatology. 78 (6), 1966-1986 (2023).
  6. Rinella, M. E., et al. AASLD Practice Guidance on the clinical assessment and management of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 77 (5), 1797-1835 (2023).
  7. Friedman, S. L. Hepatic Fibrosis and Cancer: The Silent Threats of Metabolic Syndrome. Diabetes Metab J. 48 (2), 161-169 (2024).
  8. Phoolchund, A. G. S., Khakoo, S. I. MASLD and the Development of HCC: Pathogenesis and Therapeutic Challenges. Cancers. 16 (2), 259(2024).
  9. Taylor, R. S., et al. Association Between Fibrosis Stage and Outcomes of Patients With Nonalcoholic Fatty Liver Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Gastroenterology. 158 (6), 1611-1625.e12 (2020).
  10. Younossi, Z. M., et al. Liver histology is associated with long-term clinical outcomes in patients with metabolic dysfunction-associated steatohepatitis. Hepatol Commun. 8 (6), e0423(2024).
  11. Dulai, P. S., et al. Increased risk of mortality by fibrosis stage in nonalcoholic fatty liver disease: Systematic review and meta-analysis. Hepatology. 65 (5), 1557-1565 (2017).
  12. Noncirrhotic Nonalcoholic Steatohepatitis With Liver Fibrosis: Developing Drugs for Treatment; Draft Guidance for Industry. The Federal Register / FIND. , Food and Drug Administration. (2018).
  13. Im, Y. R., et al. A Systematic Review of Animal Models of NAFLD Finds High-Fat, High-Fructose Diets Most Closely Resemble Human NAFLD. Hepatology. 74 (4), 1884-1901 (2021).
  14. Vacca, M., et al. An unbiased ranking of murine dietary models based on their proximity to human metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD). Nat Metab. 6 (6), 1178-1196 (2024).
  15. Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. Animal Models of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis: Do They Reflect Human Disease. Adv Nutr. 11 (6), 1696-1711 (2020).
  16. Wang, S., Friedman, S. L. Found in translation-Fibrosis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Sci Transl Med. 15 (716), eadi0759(2023).
  17. Farrell, G., et al. Mouse Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Toward Optimization of Their Relevance to Human Nonalcoholic Steatohepatitis. Hepatology. 69 (5), 2241-2257 (2019).
  18. Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease. J. Hepatol. 68 (2), 230-237 (2018).
  19. St Rose, K., et al. Mouse model of NASH that replicates key features of the human disease and progresses to fibrosis stage 3. Hepatol Commun. 6 (10), 2676-2688 (2022).
  20. Hintze, K. J., Benninghoff, A. D., Cho, C. E., Ward, R. E. Modeling the Western Diet for Preclinical Investigations. Adv Nutr. 9 (3), 263-271 (2018).
  21. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L. J., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Dis Model Mech. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  22. Okumura, K., et al. Exacerbation of dietary steatohepatitis and fibrosis in obese, diabetic KK-A(y) mice. Hepatol Res. 36 (3), 217-228 (2006).
  23. Lin, X., Li, H. Obesity: Epidemiology, Pathophysiology, and Therapeutics. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 706978(2021).
  24. Brunt, E. M. Pathology of fatty liver disease. Mod Pathol. 20 Suppl 1, 40(2007).
  25. Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Dig Dis Sci. 61 (5), 1325-1336 (2016).
  26. Caviglia, J. M., et al. MicroRNA-21 and Dicer are dispensable for hepatic stellate cell activation and the development of liver fibrosis. Hepatology. 67 (6), 2414-2429 (2018).
  27. Kiernan, J. Histological and histochemical methods. , Scion Publishing Ltd. (2015).
  28. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. S. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Sci. 18 (5), 980-993 (2009).
  29. Davidson, I. Hydrolysis of samples for amino acid analysis. Methods Mol Biol. 211, 111-122 (2003).
  30. Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clin Biochem. 29 (3), 225-229 (1996).
  31. Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).
  32. Mark, A. L., et al. Contrasting blood pressure effects of obesity in leptin-deficient ob/ob mice and agouti yellow obese mice. J Hypertens. 17 (12 Pt 2), 1949-1953 (1999).
  33. Luo, Y., et al. Metabolic phenotype and adipose and liver features in a high-fat Western diet-induced mouse model of obesity-linked NAFLD. Am J Physiol Endocrinol Metab. 310 (6), 418(2016).
  34. Lonardo, A., Suzuki, A. Sexual Dimorphism of NAFLD in Adults. Focus on Clinical Aspects and Implications for Practice and Translational Research. J Clin Med. 9 (5), 1278(2020).
  35. Lonardo, A., Ballestri, S., Mantovani, A., Targher, G., Bril, F. Endpoints in NASH Clinical Trials: Are We Blind in One Eye. Metabolites. 14 (1), 40(2024).
  36. Giles, D. A., et al. Thermoneutral housing exacerbates nonalcoholic fatty liver disease in mice and allows for sex-independent disease modeling. Nat Med. 23 (7), 829-838 (2017).
  37. Hao, L., Khan, M. S. H., Zu, Y., Liu, J., Wang, S. Thermoneutrality Inhibits Thermogenic Markers and Exacerbates Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Mice. Int J Mol Sci. 25 (15), 8482(2024).
  38. Horakova, O., et al. Thermoneutral housing promotes hepatic steatosis in standard diet-fed C57BL/6N mice, with a less pronounced effect on NAFLD progression upon high-fat feeding. Front Endocrinol. 14, 1205703(2023).
  39. Suzuki, A., Diehl, A. M. Nonalcoholic Steatohepatitis. Annu Rev Med. 68, 85-98 (2017).
  40. Arrese, M., et al. Insights into Nonalcoholic Fatty-Liver Disease Heterogeneity. Semin Liver Dis. 41 (4), 421-434 (2021).
  41. Wentworth, B. J., Caldwell, S. H. Pearls and pitfalls in nonalcoholic fatty liver disease: tricky results are common. Metab Target Organ Damage. 1 (1), 2(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи