Проектирование твердофазных ферментационных систем для получения полимерных гидролитических внеклеточных ферментов нитчатыми грибами

Summary

В соответствии с этим протоколом пшеничные отруби используются во вращающейся твердофазной ферментационной системе для увеличения производства ферментов. Субстрат, дополненный индукторами, такими как хитин, поддерживает рост грибков в контролируемых условиях. Результаты демонстрируют выход фермента в 4-6 раз выше по сравнению с ферментацией в погружении, что демонстрирует адаптивность и эффективность метода для различных биотехнологических применений.

Abstract

Твердофазная ферментация (SSF) — это процесс биоконверсии, в котором используется твердый субстрат, который не растворяется в водной среде. Микроорганизмы растут на поверхности субстрата и проникают в его твердую матрицу для извлечения необходимых питательных веществ для своего развития. SSF характеризуется минимальным количеством свободной воды, содержание влаги в субстрате поддерживается выше 70% и включает в себя три взаимосвязанные фазы - газообразную, жидкую и твердую. В этом протоколе описывается использование пшеничных отрубей, побочного продукта агропромышленности, в качестве базового субстрата для производства ферментов в ротационной системе. Субстрат дополняется индуктором, таким как хитин, хитозан, крахмал или целлюлоза, чтобы способствовать синтезу гидролитических белков. Система обладает высокой адаптивностью, что позволяет использовать различные формы грибов, включая мицелий, споры или гранулы. В описанной методике индуктор и субстрат смешивают в соотношении 1:100 (масса/масса), стерилизуют с помощью автоклавирования и доводят до нужного уровня влажности стерильной водой. Затем добавляется грибковый инокулюм, и роторная система работает со скоростью 10 об/мин, обеспечивая адекватное перемешивание и насыщение кислородом. Система инкубируется в течение 6-8 дней при оптимальных условиях роста мезофильных или термофильных/термотолерантных грибов, что повышает ее универсальность. После инкубации фермент легко экстрагируется с использованием соответствующего холодного буфера (например, ацетата, цитрата или фосфата), в зависимости от типа фермента. Экстракт осветляют с помощью центрифугирования и фильтрации с получением бесклеточного надосадочной жидкости. Затем фермент может быть дополнительно концентрирован или очищен по мере необходимости. Результаты продемонстрировали увеличение активности фермента в 4-6 раз по сравнению с ферментацией под водой (SmF), что подчеркивает эффективность системы. Его приспособляемость к различным субстратам, индукторам и видам грибов делает его ценным инструментом для различных биотехнологических применений.

Introduction

Твердофазная ферментация (SSF) стала перспективной и устойчивой технологией биоконверсии для производства высокоценных ферментов, биологически активных соединений и вторичных метаболитов. Этот метод включает в себя выращивание микроорганизмов на твердых субстратах с минимальным количеством свободной воды, имитируя их естественную среду и обеспечивая эффективную метаболическую активность¹. Основной целью этого протокола является оптимизация производства ферментов с помощью вращающейся системы SSF, которая обеспечивает улучшенное использование субстрата, диффузию кислорода и масштабируемость процесса. Использование пшеничных отрубей, обильного побочного продукта агропромышленности, в качестве базового субстрата способствует повышению ценности сельскохозяйственных отходов и способствует внедрению методов биоэкономики замкнутого цикла².

SSF имеет значительные преимущества по сравнению с ферментацией под водой (SmF), включая более низкое потребление энергии и воды, более высокую концентрацию продукта и совместимость с широким спектром недорогих сельскохозяйственных отходов, таких как пшеничные отруби, рисовая шелуха и жмых сахарного тростника3^. В отличие от SmF, для которого требуются большие объемы воды и дорогостоящие питательные среды, в системах SSF используются твердые матрицы, которые не только служат поверхностями для роста микроорганизмов, но и обеспечивают питательные вещества, необходимые для микробной активности. Кроме того, ограниченное количество свободной воды в SSF сводит к минимуму риск загрязнения, что делает его более надежным вариантом для производства ферментов в промышленных условиях⁴. В дополнение к своим эксплуатационным преимуществам, SSF имеет значительные экологические и экономические преимущества по сравнению с ферментацией под водой (SmF). Исследования показали, что SSF снижает потребление воды на 50-70% и снижает затраты на электроэнергию более чем на 30% благодаря отсутствию больших объемов воды, требующих постоянного перемешивания и аэрации. Кроме того, использование отходов агропромышленного производства в качестве субстрата сводит к минимуму затраты на сырье и способствует внедрению методов экономики замкнутого цикла за счет повторного использования побочных продуктов сельского хозяйства ^2,4.

SSF прошел тщательную проверку на эффективность и масштабируемость. Например, в исследованиях сообщалось о 4-6-кратном увеличении активности фермента при использовании SSF по сравнению с SmF, что подчеркивает экономические и экологические преимущества этой методики^{в 2,5} раза. Кроме того, упрощается процесс на последующих этапах, так как экстракция ферментов обычно требует меньше воды и меньше этапов очистки. Это делает SSF особенно привлекательным для отраслей, стремящихся снизить эксплуатационные расходы и воздействие на окружающую среду⁶.

Роторная система SSF, описанная в этом протоколе, предлагает несколько улучшений по сравнению с традиционными статическими методами SSF. В то время как статические системы часто сталкиваются с такими проблемами, как неравномерная колонизация субстрата и ограничение кислорода, вращающаяся конфигурация обеспечивает тщательное перемешивание и аэрацию, способствуя равномерному росту микроорганизмов ^7,8,9. Например, эта система была успешно использована для производства гидролитических ферментов, таких как хитиназы, амилазы и протеазы, с использованием таких видов грибов, как Aspergillus и Trichoderma².

Ключевой особенностью этой системы SSF является ее адаптивность. Использование пшеничных отрубей в качестве базового субстрата демонстрирует потенциал агропромышленных отходов для экономически эффективной биоконверсии³. Кроме того, добавление в субстрат индукторов, таких как хитин, хитозан и крахмал, еще больше усиливает синтез ферментов, стимулируя специфические метаболические пути ^2,10. Система также совместима с различными формами грибов, включая споры, мицелий и гранулы, что позволяет пользователям адаптировать процесс к своим конкретным требованиям².

SSF предлагает широкий потенциал для применения в различных областях, таких как пищевая биотехнология, производство биотоплива и восстановление окружающей среды. Интеграция экономичных субстратов, исключительный выход ферментов и высокая гибкость процесса делают SSF важным подходом к биотехнологическим инновациям в промышленных масштабах.

Protocol

Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка основания

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте коммерческую марку пшеничных отрубей, чтобы свести к минимуму значительные изменения в характеристиках субстрата. Каждая партия пшеничных отрубей варьируется из-за множества факторов, что делает их неоднородным материалом, который трудно стандартизировать, что приводит к колебаниям его состава. Если требуется стандартизированный материал, выберите альтернативную матрицу или проведите предварительный химический анализ каждой партии пшеничных отрубей, чтобы скорректировать ее в соответствии с потребностями.

1. Трижды промойте пшеничные отруби стерильной дистиллированной водой, чтобы удалить остатки органических веществ, мусор и пыль. При этом также удаляются простые сахара, которые могут помешать брожению.
2. Выложите промытые отруби на алюминиевый противень и высушите в духовке при температуре 60 °C в течение 24 часов.
3. После высыхания поместите пшеничные отруби в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл.

2. Приготовление посевного материала

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает три метода получения инокулята: споровая суспензия, прямой посев мицелиевыми дисками и клеточная суспензия. Установите начальную концентрацию инокулята и количественно оцените уровень белка для точного расчета урожайности.

1. Приготовление споровой суспензии
   1. Перенесите агаровый диск диаметром 5 мм, насыщенный мицелием, на тарелку агара декстрозы для свежего картофеля. Инкубируйте тарелку при температуре 28 °C в течение 5-7 дней, или пока мицелий не насытит среду. Некоторым грибам может потребоваться более длительное время инкубации.
   2. Добавьте в тарелку 5 мл стерильной дистиллированной воды и механически отделите споры с помощью стерильной петли.
   3. Приготовьте разведение споровой суспензии в соотношении 1:100. Поместите 10 μL в центр камеры Нейбауэра и подсчитайте споры под микроскопом. Рассчитайте концентрацию спор (спор/мл) на основе коэффициента камеры и разведения.
2. Выращивание мицелия в жидкой среде
   1. Перенесите 5 мм агаровый диск, насыщенный мицелием, на свежую картофельно-декстрозно-агаровую пластину и инкубируйте при 28 °C до насыщения.
   2. Приготовьте 25 мл картофельно-декстрозного отвара в стерильной колбе объемом 125 мл и автоклаве.
   3. Переложите 5 мм мицелиевый диск из насыщенной пластины в стерильный бульон.
   4. Инкубируйте колбу в шейкере при 125 об/мин в течение 24-48 ч, в зависимости от штамма гриба. Продлите время инкубации для медленно растущих грибов.
   5. Соберите 2 мл для посевного материала и 2 мл для определения сухой массы.
3. Прямой посев дисков мицелия
   1. Поместите 5 мм агаровый диск, насыщенный мицелием, на свежую картофельно-декстрозно-агаровую пластину. Инкубировать при 28 °C до насыщения.
   2. Используйте один диск мицелия в качестве инокулята, а другой — для определения сухого веса.

3. Подготовка системы SSF

ПРИМЕЧАНИЕ: Индукторы могут быть натуральными или коммерческими. Очищенные коммерческие индукторы предпочтительны для минимизации примесей, которые могут повлиять на эффективность ферментации. Отрегулируйте добавление воды, чтобы поддерживать относительную влажность не менее 90%.

1. Соедините в стерильной конической пробирке объемом 50 мл следующие компоненты: 5 г сухих пшеничных отрубей; 0,2 г индуктора (например, коммерческого хитина); 5,5 мл воды (регулируется в зависимости от водопоглощающей способности индуктора); 5 мл стерильного раствора соли, содержащего 16 г/л одноосновного фосфата калия, 4 г/л сульфата натрия, 2 г/л хлорида калия, 1 г/л хлорида кальция, 400 мг/л хлорида цинка, 60 мг/л борной кислоты, 40 мг/л молибдата натрия, 150 мг/л хлорида магния, 100 мг/л хлорида железа и 400 мг/л сульфата меди.
2. Измерьте относительную влажность с помощью гигрометра на основе электрода, обеспечив минимум 90% влажности. Вставьте электродный зонд непосредственно в реактор на различную глубину, чтобы получить репрезентативное измерение распределения влаги.
   1. Следуйте инструкциям, чтобы отрегулировать влажность, если она ниже 90%:
      1. Постепенно добавляйте стерильную дистиллированную воду с шагом 1 мл на 10 г субстрата. После каждого добавления тщательно перемешивайте, чтобы обеспечить равномерное распределение влаги.
      2. Дайте субстрату сбалансироваться в течение 10-15 минут. Повторно измерьте уровень влажности.
      3. Повторяйте вышеуказанные действия до тех пор, пока не будет достигнута целевая влажность 90%. Избегайте чрезмерного увлажнения субстрата на протяжении всего процесса.
   2. Следуйте инструкциям, чтобы отрегулировать влажность, если она выше 90%:
      1. Разложите субстрат тонким слоем в стерильной среде. Удалите лишнюю влагу, (1) подвергнув основание воздействию ламинарного потока воздуха или (2) поместив его в сушильную камеру при температуре 30 °C на 10-15 минут.
      2. В качестве альтернативы аккуратно перемешайте основание, чтобы обеспечить равномерное перераспределение влаги. После обработки повторно оцените уровень влажности.
      3. При необходимости повторяйте этап сушки или смешивания, пока влажность не достигнет 90%. Приступайте к ферментации только после достижения целевой влажности.
3. Автоклавируйте трубку при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 минут.
4. После охлаждения инокулируйте субстрат одним из следующих веществ: 1 мл споровой суспензии (1 x 10^6-1 x 10⁷ спор/мл), 2 мл клеточной суспензии или одним 5 мм мицелиевым диском.

4. Процедура твердофазного брожения (SSF)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для кинетических исследований или оценки параметров в разное время подготовьте отдельные пробирки для каждой временной точки, чтобы обеспечить репрезентативность.

1. Избегайте образования комков субстрата, переворачивая пробирки с максимальной скоростью в течение 5 минут циклами по 1 минуте.
2. Поместите трубки во вращающийся миксер с горизонтальной осью. Убедитесь, что субстрат свободно перемещается внутри трубок. Установите смеситель на 10 об/мин.
3. Инкубируйте смеситель в инкубаторе при оптимальной для микроорганизма температуре роста. Поддерживайте указанную температуру для оптимальной ферментативной активности при использовании термочувствительных индукторов.

5. Экстракция ферментов

ПРИМЕЧАНИЕ: Основы экстракции основаны на растворимости и максимальной активности внеклеточного фермента. Поскольку SSF избегает водной среды, внеклеточный фермент участвует в воде, окружающей твердый матрикс, что означает, что его концентрация выше, чем в SmF. В этом контексте выбор наилучшего буфера для добычи зависит от знания желаемой деятельности. Оптимизация экстракции зависит от конечной концентрации фермента и типа используемого буфера для экстракции.

1. После желаемого периода брожения повторно суспендируйте субстрат в 20 мл предварительно охлажденного буфера. Примеры включают: 0,1 М ацетатный буфер, pH 5,6, для экстракции хитиназы; 0,02 М фосфатный буфер, pH 6,9, для экстракции амилазы.
2. Вихревые трубки циклы: 1 мин на максимальной скорости, затем 1 мин на льду. Повторите 10 раз.
3. Отфильтруйте суспензию с помощью бумажных фильтров и механически извлеките надосадочную жидкость путем прессования.
4. Осветите надосадочную жидкость центрифугированием при 3000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
5. Используйте сырой экстракт непосредственно или дополнительно очистите фермент с помощью колоночной хроматографии или центробежных фильтров. Также рекомендуются кинетические исследования для определения постоянной Михаэлиса (Км) и максимальной скорости ферментативного превращения (Vmax)¹².

6. Процесс оптимизации

ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте этот протокол, оценив и отрегулировав качество и концентрацию индукторов, а также тип и концентрацию инокулята.

1. Определите идеальное время ферментации и уточните этапы экстракции для повышения эффективности.
2. Контролируйте и точно настраивайте условия окружающей среды, включая температуру, pH и аэрацию.
3. Тестируйте различные буферы и условия экстракции для повышения выхода ферментов и стабильности.
4. Выполняйте статистический анализ, такой как методология поверхности отклика, чтобы определить наиболее влиятельные переменные и достичь оптимальной выработки ферментов.

Results

На рисунке 1А представлено схематическое изображение вращающегося смесителя, используемого в данной системе, который имеет емкость для шести конических пробирок объемом 50 мл. На рисунке 2В показаны изменения, происходящие в пшеничных отрубях во время кондиционирования перед началом процесса твердофазной ферментации. Как видно, существенных структурных изменений не наблюдалось.

На рисунке 2 показано насыщ...

Discussion

В этом исследовании изложен соответствующий протокол для оптимизации производства ферментов с помощью систем твердофазной ферментации (SSF), специально разработанных для нитчатых грибов. Ниже обсуждаются важнейшие аспекты методологии, а также ее значение, ограничения и потенциальное применение.

Успех протокола в значительной степени зависит от ключевых этапов, таких как подготовка субстрата и инокулята. Правильная промывка и сушка пшеничных отрубей необходимы ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Колба Эрленмейера 125 мл	Сигма-Олдрич	CLS431684	Для культивирования мицелия в жидкой среде.
Коническая трубка 50 мл	Сигма-Олдрич	CLS430921	Для хранения и приготовления субстратов и инокулюма.
Ацетатный буфер, pH 5,6	Сигма-Олдрич	320866	Для экстракции хитиназы.
Фильтры Centricon	Многородность	UFC905024	Для дальнейшей очистки ферментов.
Камера счетных ячеек	Сигма-Олдрич	Z359629	Используется для подсчета спор под микроскопом.
Фильтровальная бумага	Ватман	1001-110	Для фильтрации используется фермент экстракт.
Гигрометр	Тодомикро	-	Для измерения относительной влажности субстрата.
Индуктор (например, коммерческий хитин)	Сигма-Олдрич	С9752	Используется для усиления выработки ферментов во время брожения.
Фосфатный буфер, pH 6,9	Сигма-Олдрич	П5379	Для экстракции амилазы.
Картофельно-декстрозный агар	Сигма-Олдрич	П2182	Питательная среда для выращивания грибного мицелия.
Картофельно-декстрозный бульон	Сигма-Олдрич	П6685	Жидкая питательная среда для выращивания грибного мицелия.
Роторный смеситель	Термо-Фишер Сайентиал	88-861-051	Чтобы субстрат двигался во время брожения.
Компоненты солевого раствора (например, KH2PO4, Na2SO4, KCl и т.д.)	Сигма-Олдрич	Многократный	О приготовлении стерильного солевого раствора смотрите подробный рецепт в протоколе.
Пшеничные отруби	Коммерческий рынок	-	Субстрат для твердофазного брожения.