Методика биопсии конъюнктивы и прямой иммунофлюоресценции для диагностики пемфигоида слизистой оболочки

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол забора и обработки биопсии конъюнктивы для выявления пемфигоида слизистой оболочки.

Аннотация

Пемфигоид слизистой оболочки глаза (ММП) проявляется в виде хронического рубцового конъюнктивита, который при отсутствии лечения может привести к слепоте. Своевременная диагностика и иммуносупрессивная терапия предотвращают прогрессирование заболевания. Прямое иммунофлюоресцентное окрашивание (ФВС) биопсии конъюнктивы для депонирования иммунного комплекса в базальной мембране является диагностическим для ММП. Процент положительных результатов биопсии зависит от характеристик биопсии, латеральности, пожилого возраста и активности заболевания. В данной методике описана методика забора биопсии конъюнктивы и использование оптимальной температуры среза средненаполненных картриджей для переноса образца и блокоподготовки. Биопсия проводится из нерубцовой, невовлеченной или относительно менее вовлеченной области конъюнктивы в обоих глазах. Обычный размер биопсии составляет 4-5 мм в длину, 2-3 мм в ширину, и должен иметь крошечную подлежащую субконъюнктивальную ткань, чтобы не пропустить базальную мембрану. Мы рекомендуем проводить периодическое окрашивание кислотой по Шиффу для подтверждения наличия базальной мембраны. Используя определенный протокол, криосрезы из биопсии окрашивают флуоресцентно-конъюгированными антителами IgG, IgM, IgA и факторами комплемента C3c и C4c. Положительная биопсия показывает зеленую положительную флуоресценцию в базальной мембране, и даже если одно из антител положительное, оно является положительным для MMP. Отрицательный результат биопсии не исключает пемфигоид; тем не менее, положительный результат подтверждает ММП и дифференцирует его от лекарственно-индуцированного рубцового конъюнктивита или псевдопемфигоида.

Введение

Пемфигоид слизистой оболочки (ММП) является хроническим рубцовым заболеванием конъюнктивы аутоиммунной этиологии и поражает слизистые оболочки в организме ^1,2. Хронический рубцовый конъюнктивит имеет различную этиологию, поэтому дифференциация ММП от ССД, саркоидоза, плоскоклеточной неоплазии глаза и псевдопемфигоида необходима, так как первый требует системной иммуносупрессии ^3,4. Кроме того, ММП является потенциально слепящим заболеванием, при котором пациенты часто обращаются поздно и им изначально ставят ошибочный диагноз ^1,2,5. Только поражение глаз без системного поражения может наблюдаться у 27,4% пациентов с ММП глаза⁶. Для постановки диагноза ММП требуется биопсия конъюнктивы, чтобы показать наличие аутоантител в базальной мембране ^2,5. Прямая иммунофлюоресценция (DIF) является ключевым диагностическим инструментом для выявления аутоиммунных заболеваний, поражающих конъюнктиву, таких как MMP. DIF помогает обнаружить отложение иммуноглобулинов и компонентов комплемента in situ в зоне базальной мембраны (БМЗ), характерное для ММП. Показатели положительности DIF варьируются от 30% до 80%^1,5. Тем не менее, у некоторых пациентов биопсия может быть отрицательной, особенно у пациентов с ММП только для глаз, но клиническая документация прогрессирования заболевания рассматривается так же, как и случаи ММП с положительной биопсией глаза ^7,8. Следовательно, Dart et al. подчеркнули необходимость отдельных диагностических критериев для ММП⁸, предназначенной только для глаз.

Предполагаемыми причинами низкого уровня положительных результатов в исследованиях являются прогрессирующее заболевание с обширным рубцеванием глазной поверхности, неадекватными методами обработки тканей или окрашивания, а также биопсийно-отрицательным вариантом заболевания 8,9,10,11. Ретроспективный анализ биопсий 27 пациентов с подозрением на глазную ММП показал только 30% положительных результатов, а 63,7% имели только глазное^{поражение.} DIF требует определенного протокола; Не каждая диагностическая лаборатория настроена на это. Существуют различия относительно места проведения биопсии, проведения биопсии из одного или обоих глаз, а также растворов для переноса образцов 13,14,15. В ретроспективном анализе биопсии конъюнктивы в нашем центре уровень положительности DIF составил 54,1%, с большим количеством положительных результатов при двусторонней биопсии (59% против 45%)⁸. Несмотря на то, что биопсия имеет решающее значение, клинические признаки и прогрессирующая рубцевание глазной поверхности помогают поставить диагноз MMP. Его легче диагностировать, когда вовлечен экстраокулярный участок, такой как ротовая полость или кожа, о чем сообщалось у 40% и 18% пациентов^{соответственно5.}

В существующей литературе существуют вариации, и представленный здесь протокол может служить справочным руководством с изменениями, внесенными для снижения потребности в уникальной передаточной среде¹⁴. Биопсия переносится в среду с оптимальной температурой резки (ОКТ) и замораживается с защелкой в том же картридже для переноса в патологической лаборатории, что устраняет необходимость в дополнительной среде для переноса. В настоящей статье изложена методология окрашивания конъюнктивы DIF, забора тканей и протокола переноса образцов.

Протокол

Протокол соответствует руководящим принципам комитета по этике исследований человека Института глаза им. Л. В. Прасада.

1. Техника биопсии конъюнктивы

1. Плановая биопсия обоих глаз пациента с подозрением на пемфигоид под местной или местной анестезией и операционным микроскопом.
2. Получите информированное согласие пациента и перечислите возможные побочные эффекты кровотечения, рубцевания и необходимость начала приема местных стероидов после операции.
3. Закапайте по 1-2 капли 0,5% пропаракаина в оба глаза и подождите 5 минут перед началом процедуры.
4. Следите за тем, чтобы пациент не чувствовал боли при прикосновении к конъюнктиве тонкими щипцами. Если пациент все еще чувствует боль после местного применения пропаракаина, введите 0,2 мл субконъюнктивального 2% лидокаина с помощью туберкулинового шприца объемом 1 мл.
5. Поместите зеркало в правый или левый глаз, в зависимости от того, что будет выбрано первым.
6. Осмотрите поверхность глаза на предмет рубцов и кератинизации. Выберите область биопсии, которая не вовлечена и не покрыта рубцами или ороговевшими.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании в качестве места биопсии предпочтительна верхняя бульбарная конъюнктива вдали от лимбуса, за которой следует нижняя бульбарная конъюнктива.
7. С помощью щипцов Лима приподнять склеру от конъюнктивы и линейно исчерпать ножницами Уэсткотта длиной 4-5 мм и шириной 2-3 мм.
8. Немедленно перенесите всю биопсию в оптимальную режущую среду (ОКТ).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия может быть перенесена в обычный физиологический раствор или транспортную среду Мишеля.
9. Возьмите картридж и форму для пластиковой ткани с углублением в центре, очистите ее физиологическим раствором и высушите на воздухе.
10. Наполните картридж средой ОКТ отдельно для правого и левого глаза. Погрузите иссеченную ткань конъюнктивы в среду ОКТ и отправьте ее в патологию.
11. Повторите аналогичные шаги и для контралатеральной стороны.

2. Перенос ткани

1. Встраивайте биопсийные образцы конъюнктивы в среду ОКТ для сохранения архитектуры ткани и антигенности, если они получены в транспортной среде Мишеля или в обычном физиологическом растворе.
2. Заморозьте внедренные образцы с помощью жидкого азота или сухого льда и храните при температуре -80 °C в течение ночи.

3. Подготовка и разрезание тканей

1. Разрежьте замороженную ткань на ломтики размером 4-6 мкм (всего 7) с помощью криостата при температуре от -20 °C до -25 °C.
2. Установите срезы на положительно заряженные предметные стекла микроскопа с полилизиновым покрытием для обеспечения адгезии и храните при температуре -80 °C до окрашивания в алюминиевую фольгу.

4. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Разморозьте предметные стекла при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут и зафиксируйте в холодном ацетоне (100%) на 10 минут для сохранения антигенов и предотвращения повреждения тканей.
2. Промойте 1x PBS трижды, каждый раз в течение 5 минут, чтобы удалить избыток среды OCT и ацетона.
3. Применяйте конъюгированные антитела анти-IgG, анти-IgA, анти-IgM и анти-C3 в разведении (фибриноген-1:10 [положительный контроль], IgG-1:10, IgA-1:10, IgM-1:10, C3-1:5, C4-1:10) на предметные стекла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела разводятся в 1x PBS.
4. Для отрицательного контроля не применяйте конъюгированные антитела и следуйте остальным шагам, упомянутым ниже.
5. Следуйте рекомендациям производителя по разбавлению антител и стандартизируйте с известными положительными и отрицательными контрольными показателями.
6. Высиживайте предметные стекла во влажной камере при температуре 37 °C в течение 45-60 минут.
7. Промойте предметные стекла PBS (3× в течение 5 минут каждое), чтобы удалить несвязанные антитела.
8. Противоморочное вещество с DAPI (4',6-диамидино-2-фенилидол)-содержащей монтажной средой для визуализации ядра.
9. Накройте предметные стекла защитным стеклом и дайте им застыть в течение 20 минут.
10. Изучите предметные стекла с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного соответствующими фильтрами для используемых флуорофоров (зеленый фильтр возбуждения для 488 нм).
11. Задокументируйте полученные результаты с помощью цифровых микрофотографий.

5. Быстрая периодическая кислота - окрашивание по Шиффу

1. Приготовление периодической кислоты Шиффа (PAS)
   1. Растворите 1 г основного фушина в 100 мл горячей дистиллированной воды.
   2. Добавьте 10 мл соляной кислоты и 2 г дисульфита калия, чтобы обесцветить краситель.
   3. После остывания добавьте 0,5 г активированного угля, размешайте и отфильтруйте раствор до получения прозрачной периодической кислоты реагента Шиффа. Хранить в темной бутылке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить наличие реагента Шиффа, налейте 10 мл 37% формалина в стекло часов и добавьте несколько капель тестируемого препарата Шиффа. Хороший реактив Шиффа быстро приобретет красно-фиолетовый цвет. Ухудшение качества реагента Шиффа вызовет замедленную реакцию, и продукт будет темно-сине-фиолетового цвета.
2. Техника окрашивания PAS
   1. Выпейте воду из горок.
   2. Окислить в 0,5% периодическом растворе кислоты в течение 5 мин.
   3. Промойте в дистиллированной воде.
   4. Поместите в реагент Шиффа на 15 минут (на этом этапе срезы выглядят светло-розовыми)
   5. Постирайте в теплой воде из-под крана в течение 5 минут (срезы становятся темно-розовыми).
   6. Противокрасить гематоксилином Майера в течение 1 мин.
   7. Промыть в водопроводной воде в течение 5 минут.
   8. Обезвоживайте предметные стекла в следующих растворах: один раз в 80% этиловом спирте в течение 1 мин, два раза в 90% этиловом спирте в течение 1 мин, два раза в 100% этиловом спирте в течение 1 мин.
   9. Трижды обезвожьте предметные стекла в ксилоле по 1 минуте каждая.
   10. Наденьте покровное стекло на слайды с помощью синтетического монтажного носителя (например, монтажника DPX)
   11. Наблюдайте за результатами PAS под светлопольным микроскопом.

Результаты

Интерпретация DIF требует подтверждения наличия базальной мембраны в срезах тканей (рис. 1). На предметных стеклах, окрашенных PAS, базальная мембрана будет выглядеть как ярко-розовая мембрана, расположенная в базальной области эпителия конъюнктивы (рис. 1C). Также следует отметить непрерывность и архитектуру фундаментальной мембраны. Положительный результат DIF будет виден как ярко-зеленый BM (рисунок 1B), указывающий на отложение ...

Обсуждение

Описанная здесь методика биопсии конъюнктивы использует ОКТ-среду в качестве среды для переноса, что устраняет необходимость в дополнительной среде для переноса и позволяет избежать необходимости переноса биопсии в среду ОКТ для криосекции. Пластиковая форма для картриджа, заполненная средой и биопсией, напрямую замораживается для создания тканевых блоков, а затем разрезается. Преимущества ОКТ заключаются в том, что он быстро замерзает с минимальными повреждениями от образования кристалл...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 Н соляной кислоты	Финар  Chemical Limited	7647-01-0
Ацетон	Квалигены	Вопрос 33517
Альбумин	ДАКО	Ф0117
Основной фуксин	Квалигены	Вопрос 39402
С3с	Диагностические биосистемы	Ф003
С4с	Диагностические биосистемы	Ф005
Патрон	Полинауки	25376-500
Активированный уголь	Сигма	С-5260
Криостат	Leica	CM1860UV
Криотомного лезвия	Leica	818
DAPI	Абкам	АБ104139
Фибриноген	Диагностические биосистемы	Ф006
Флуоресцентный микроскоп	Олимп	СХ43
Щипцы	Джоджа хирургический	JS1528A
Камера влажности	Диагностические биосистемы	СМ365
IgA	Диагностические биосистемы	Ф007
IgG	Диагностические биосистемы	Ф008
IgM	Диагностические биосистемы	Ф009
IHC Адгезивные стеклянные горки	Томо	33140455
Щипцы Лима	Спидвей	С-7223
Танспорт Мишеля средний	Фишер Сцинитикс	NC0253304
Микроскопическое покровное стекло	Голубая звезда	https://www.bluestarslides.com
OCT Medium	Криоматрица	6769006
ПБС	ДАКО	ДМ831
Периодическая кислотность	Сигма	375810-25Г
Дисульфит калия	Сигма	П2522-500Г
Пропаракаин 0,5%	Sunway Private	Г/1118А
Ножницы Уэсткотта	Pillig Gurgical Intruments	423480