Методическая статья

Выделение и проточная цитометрическая оценка нейроиммунных взаимодействий на мышиной модели с мини-инсультом

DOI:

10.3791/68308

⸱

20 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Translational Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье мы представляем протокол оценки функции иммунных клеток после ишемического инсульта с использованием проточного цитометрического анализа в модели мини-инсульта. Этот метод позволяет детально изучить нейроиммунные взаимодействия и может быть адаптирован для изучения других нейродегенеративных заболеваний, улучшая наше понимание иммунных реакций при патологии инсульта.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инсульт является одной из основных причин смерти и длительной инвалидности во всем мире, причем в большинстве случаев приходится на ишемический инсульт. После ишемического инсульта резидентные и инфильтрирующие иммунные клетки активируются, что способствует дальнейшему повреждению нейронов. Тем не менее, роль иммунной системы в патологии ишемического инсульта до конца не изучена, во многом из-за сложной и динамической регуляции иммунных реакций в ответ на изменения микроокружения во время нейровоспаления. Поэтому важно контролировать и анализировать активацию резидентных и инфильтрирующих иммунных клеток с течением времени после ишемического инсульта. В данном исследовании мы представляем протокол оценки функции этих иммунных клеток после ишемического инсульта с использованием проточного цитометрического анализа в модели мини-инсульта. Мы препарируем инфарктированную ткань мозга в определенные моменты времени, а затем диссоциируем ее на одноклеточную суспензию с помощью как механических, так и ферментативных методов. Клетки пропускают через клеточный фильтр размером 70 мкм и мечают коктейлями антител с флуоресцентными метками, а затем количественно оценивают с помощью проточного цитометрического анализа. Хотя этот анализ был специально разработан для изучения нейроиммунных взаимодействий после ишемического инсульта, он также может быть легко адаптирован для изучения нейроиммунных механизмов при других нейродегенеративных заболеваниях, таких как рассеянный склероз, болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инсульт является преобладающей причиной смертности и долгосрочной инвалидности во всем мире, при этом подавляющее большинство случаев приходится на ишемический инсульт 1,2,3. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы улучшить наше понимание нейроиммунных взаимодействий, которые происходят после ишемического инсульта, путем предоставления усовершенствованного подхода к оценке активации как резидентных, так и инфильтрирующих иммунных клеток в модели мини-инсульта у мышей 4,5. Сложное взаимодействие между этими иммунными клетками и микроокружением нейронов имеет решающее значение для понимания патофизиологии ишемического инсульта. Тем не менее, точные механизмы, лежащие в основе этих нейроиммунных взаимодействий, остаются плохо выясненными, в первую очередь из-за динамической и многогранной природы иммунных реакций, вызванных нейровоспалением. Этот метод направлен на выяснение сложной динамики иммунных реакций в контексте нейровоспаления и их последующего влияния на повреждение нейронов и результаты восстановления.

Обоснование разработки этого метода проистекает из той важной роли, которую иммунные клетки играют в усугублении повреждения нейронов и влиянии на восстановление после ишемического события. Традиционным методам изучения этих взаимодействий часто не хватает разрешения, необходимого для того, чтобы уловить временные и пространственные нюансы активации иммунных клеток. Используя проточный цитометрический анализ суспензий одиночных клеток, полученных из микродиссектированной инфарктной ткани мозга, этот протокол предлагает более подробную и динамическую оценку профилей иммунных клеток с течением времени. Этот подход позволяет идентифицировать специфические популяции иммунных клеток и их функциональные состояния, которые имеют решающее значение для понимания патофизиологии ишемического инсульта.

По сравнению с альтернативными методами, такими как гистологическое окрашивание или объемное секвенирование РНК, которые могут дать ограниченное представление об индивидуальном вкладе типов иммунных клеток, этот метод проточной цитометрии имеет ряд преимуществ. Например, предыдущие исследования показали, что проточная цитометрия позволяет проводить высокопроизводительный анализ нескольких маркеров одновременно, способствуя более полной характеристике фенотипов и функций иммунных клеток 9,10,11,12,13. Кроме того, способность этого метода адаптироваться к различным нейродегенеративным состояниям, таким как рассеянный склероз, болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера, демонстрирует его универсальность и актуальность в более широкой литературе, посвященной нейроиммунным взаимодействиям.

Для исследователей, рассматривающих возможность применения этого метода, важно оценить конкретные цели своего исследования. Этот метод особенно подходит для исследований, требующих детального временного анализа иммунных реакций в контексте ишемического инсульта или связанных с ним нейродегенеративных заболеваний. Рекомендуется, чтобы пользователи обладали базовым пониманием проточной цитометрии и опытом работы с мышиными моделями для эффективной реализации этого протокола и интерпретации полученных данных. Обеспечивая надежную основу для изучения нейроиммунных взаимодействий, этот метод вносит значительный вклад в текущие усилия по разграничению сложностей иммунного участия в патологии инсульта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Пекинской больницы дружбы Столичного медицинского университета. Мы рекомендуем подвергать все растворы стерильной фильтрации и стерильно использовать все пробирки.

1. Подготовка реагентов и буфера

  1. Смесь ферментов для пищеварения: растворить коллагеназу IV до получения концентрации 0,25% и разбавить ДНКазу I до конечной концентрации 2 ЕД/мл.
  2. Буфер для сортировки магнитно-активированных клеток (MACS): растворите бычий сывороточный альбумин (BSA) и этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) до концентрации 0,5% и 2 мМ в 1x PBS соответственно.

2. Модель фокального ишемического инсульта

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши C57BL/6 J (в возрасте 8-10 недель) были использованы для создания модели фокального ишемического инсульта, как описано ранее14. В качестве альтернативы мышей можно обезболить с помощью раствора 1,25% авертина в дозировке 0,2 мл на 10 г массы тела.

  1. Обезболивают мышей с помощью 3% изофлурана, поддерживая дозировку 1,5% с помощью аппарата для газовой анестезии. Поддерживайте температуру тела на уровне 37 °C на протяжении всей процедуры с помощью грелки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании подчеркивается важность проверки достижения операционной плоскости до начала процедуры. Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения оптимального доступа к целевой области и минимизации потенциальных осложнений во время операции.
  2. Подстригите шерсть в области между правым глазом и правым ухом с помощью электрической бритвы. Создайте вертикальный разрез в обозначенной области, прилегающей к глазам, под микроскопом для вскрытия.
  3. Аккуратно отделите все ткани, чтобы обнажить череп и определить дистальную ветвь правой средней мозговой артерии (МКА), характеризующуюся вертикальной Y-образной сосудистой структурой. Используйте электрическую дрель для проникновения в череп, осторожно удаляя ее.
  4. Аккуратно иссекаем мозговые оболочки микрощипцами.
  5. Обнажите дистальную ветвь правой средней мозговой артерии (МКА), а затем выполните постоянное лигирование дистальной ветви правой МКА с помощью шва 10-0.
  6. Установите ткань в исходное положение и закройте разрез кожи лица тканевым клеем.
  7. Расположите мышь в положении лежа на спине и подстригите шерсть в области шеи электрической бритвой.
  8. Сделайте горизонтальный разрез в области шеи и аккуратно раздвиньте подчелюстные железы.
  9. Аккуратно рассеките сонную артерию микрощипцами, определив общую сонную артерию и отделив ее от блуждающего нерва.
  10. Проденьте шов 4-0 через общую сонную артерию и закрепите его скользящим узлом.
  11. Повторите шаг 10 на контралатеральной общей сонной артерии. Временно окклюзируйте двусторонние общие сонные артерии (ОСА) на 7 минут.
  12. Верните ткань подчелюстной железы в исходное положение и закройте разрез на шее тканевым клеем.
    Примечание: В группе фиктивных операций были выполнены процедуры, идентичные процедурам в группе инсульта, за единственным исключением, что дистальные МКА и ОСА оставались нелигированными.
  13. Следите за мышью во время и после хирургической процедуры, включая ее дыхание и температуру тела. Держите мышь на грелке до тех пор, пока она полностью не придет в себя.

3. Перфузия и диссекция головного мозга

  1. Приготовьте шприц объемом 50 мл и прикрепите к его концу иглу 26 G. Наполните шприц физиологическим раствором.
  2. Введите двойную дозу 1,25% авертина для достижения глубокой анестезии у мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед переходом к следующему шагу мышь должна быть тщательно подтверждена на предмет полного обезболивания.
  3. Расположите мышь в положении лежа на пенопласте, вытянув ее передние и задние конечности, зафиксировав их на месте иглами 26 G.
  4. После того, как мышь полностью обезболится, захватите кожу живота офтальмологическими щипцами и сделайте боковой разрез, чтобы показать печень. Приступайте к разрезу по обеим сторонам ребер, чтобы обнажить сердце.
  5. Введите иглу 26 G в левый желудочек и разрежьте ушную раковину, затем нажмите на шприц, чтобы кровь вытекла.
  6. Продолжайте процесс перфузии до тех пор, пока кровь, стекающая из ушной раковины, не станет прозрачной.
  7. Обезглавите мышь чуть выше спинного мозга с помощью прямых хирургических ножниц.
  8. Сделайте задне-передний разрез на коже головы, чтобы обнажить череп. Сделайте два боковых разреза на стыке боковых стенок и основания черепа.
  9. Разрежьте череп по сагиттальному шву и сделайте надрез между орбитами.
  10. С помощью щипцов удалите череп, покрывающий каждое полушарие, тем самым обнажив мозг, и перенесите его на стальную матрицу мозга мыши. Затем разрежьте мозг на последовательные корональные срезы толщиной 2 мм.

4. Расщепление корковой ткани в одноклеточную суспензию и окрашивание антителами для проточной цитометрии

  1. Введите 500 мкл смеси ферментов для сбраживания в каждую лунку 12-луночного планшета.
  2. Деликатно отделите ткань инфаркта и перенесите ее в смесь ферментов пищеварения с помощью микрощипцов (Рисунок 1).
  3. Мелко разрежьте ткань на мельчайшие кусочки офтальмологическими ножницами и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 20 минут.
  4. С помощью пипетки P1000 осторожно отасуньте и дозируйте раствор 10 раз, чтобы диссоциировать ткань на отдельные клетки, затем пропустите раствор через клеточное сетчатое фильтр размером 70 мкм. Непрерывно промывайте 12-луночный планшет и сетчатое фильтр ледяным HBSS, содержащим кальций и магний.
  5. Центрифугируйте при 500 × г при 4 °C в течение 5 мин, затем осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что образующиеся гранулы довольно рыхлые и легко смещаются, пожалуйста, воздержитесь от их беспокойства, чтобы предотвратить потерю клеток.
  6. Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл 1x PBS и повторите шаг 5. Затем повторно суспендируйте гранулу в 150 мкл 1x PBS и перенесите суспензию в 96-луночный планшет с круглым дном. Затем снова центрифугируйте при 500 × г при 4 °C в течение 5 минут.
  7. Крепко возьмитесь за 96-луночный планшет и быстро переверните его, чтобы удалить надосадочную жидкость.
  8. Разбавьте флуоресцентный краситель для жизнеспособности клеток в соотношении 1:100 в 1x PBS, затем повторно суспендируйте гранулу в аликвоте объемом 150 мкл. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре (RT), защищенной от света.
  9. Центрифугируйте при 500 × г при 4 °C в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Развести коктейль антител клеточной поверхности в буфере MACS. Не промывая клетки, добавьте коктейль антител на клеточной поверхности и инкубируйте еще 15-20 минут при 4 °C.
  10. Центрифугируйте при 500 × г при 4 °C в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулу в 150 мкл буфера MACS.
  11. Повторите шаг 4.10 и переложите суспензию в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл или пробирки из полистирола объемом 5 мл с круглым дном.

5. Анализ и сортировка проточной цитометрии

  1. Спроектируйте многоцветную панель проточной цитометрии в соответствии с конфигурацией прибора, используя либо ручные методы, либо онлайн-инструмент проектирования, чтобы оптимизировать выбор флуорофоров, конъюгированных с антителами, и свести к минимуму спектральное перекрытие.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При проектировании многоцветной панели проточной цитометрии необходимо принять во внимание несколько ключевых моментов. Во-первых, важно ознакомиться с конфигурацией используемого инструмента, включая лазеры и фильтры, до начала работы. Во-вторых, используйте яркие флуорофорные метки на антителах для антигенов с низкой распространенностью, при этом выбирайте тусклые флуорофорные метки для антител, нацеленных на высокоэкспрессированные антигены. Наконец, крайне важно включить в панель краситель для жизнеспособности клеток, чтобы эффективно исключить нежизнеспособные клетки и мусор из данных. В частности, для обеспечения надлежащего гейтирования антигенов с низкой распространенностью или плохо охарактеризованными антигенами следует использовать контроль флуоресценции минус один (FMO)15. Контроль FMO охватывает все маркеры линии, за исключением интересующего, способствуя точному разграничению между положительно и отрицательно окрашенными клетками16.
  2. Отрегулируйте настройки детекторов прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC), чтобы убедиться, что интересующие ячейки правильно отображаются на весах и могут быть стробированы по мере необходимости.
  3. Тщательная настройка FSC и SSC для устранения мусора или посторонних шумов. Дифференцируйте дублеты от одиночных клеток с помощью точечной диаграммы, которая иллюстрирует площадь и высоту FSC. Выделяют жизнеспособные клетки на основе жизнеспособности клеток флуоресцентного красителя-отрицательного сигнала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки различных инструментов могут незначительно отличаться. Например, некоторые сортировщики ячеек используют ширину и высоту FSC, чтобы отличить дублеты от одиночных ячеек, в то время как другие используют площадь и высоту FSC для той же цели.
  4. Настройте компенсацию для каждого канала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как образцы ячеек, так и коммерчески доступные компенсационные шарики могут быть использованы с целью компенсации флуоресцентного перелива.
    1. Сравните контроль автофлуоресценции (неокрашенные клетки) с положительным контролем окрашенных клеток, чтобы убедиться, что окрашенные клетки правильно масштабируются для каждого параметра. Кроме того, можно точно настроить компенсацию, анализируя многоцветные образцы клеток, отслеживая 2-цветные точечные графики и регулируя настройки компенсации в сторону увеличения или уменьшения, чтобы убедиться, что популяции клеток выровнены друг относительно друга по вертикали или горизонтали.
    2. Используйте сигналы CD45 и CD11b для различения лимфоцитов (высокий уровень CD11b-CD45), микроглии (CD11b+CD45int), миелоидных клеток (высокий уровень CD11b+CD45) и астроцитов (CD11b-CD45-GLAST+)17,18.
    3. Используйте фиктивную ткань мозга в качестве аутофлуоресцентного контроля и эталона для распознавания лимфоцитов. Если исследуется конкретная мишень, используйте контроль FMO с постинсультной тканью мозга.
  5. Начните сбор контрольных данных и данных образцов и убедитесь, что они сохранены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что описанная здесь модель мини-инсульта приводит к небольшому инфаркту, обычно собирается меньше клеток, чем при модели окклюзии средней мозговой артерии (MCAO). Как правило, сбор 5 × 105 клеток дает примерно 5 × 103 микроглии и 1 × 105 астроцитов соответственно.
  6. Выберите и отсортируйте желаемые популяции клеток в полистирольные пробирки объемом 5 мл с круглым дном или конические центрифужные пробирки объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 500 μL PBS и тщательно промойте пробирку, чтобы убедиться в жизнеспособности клеток и помочь в образовании клеточной гранулы.

6. Анализ экспрессии генов в выбранных клеточных популяциях

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы экстракцию общей РНК можно проводить с использованием коммерческих наборов в соответствии с рекомендациями производителя.

  1. Центрифугируйте клетки на шаге 5.6 при 500 × г при 4 °C в течение 3 мин, затем выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 1 мл реагента TRIzol.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество отсортированных клеток значительно меньше по сравнению с культивируемыми клетками или тканями. Следовательно, более высокая скорость центрифугирования может помочь в формировании более компактной клеточной гранулы. Клетки, полученные на этом этапе, могут быть использованы для последующих применений, таких как культивирование клеток или конвейеры секвенирования РНК одиночных клеток.
  2. Дайте образцу постоять при температуре RT в течение 5 минут, чтобы облегчить диссоциацию нуклеопротеиновых комплексов.
  3. Добавьте в образец 0,2 мл хлороформа и зафиксируйте пробирку. Энергично встряхивайте пробирки в течение 15 с, затем инкубируйте в течение 2 мин при RT.
  4. Центрифугируйте образцы при 10 000 г в течение 15 минут при 4 °C. РНК останется только в верхней водной фазе.
  5. Осторожно перенесите верхнюю водную фазу в чистую трубку, стараясь не повредить границу раздела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем водной фазы должен составлять примерно 500 мкл.
  6. Осадите РНК из водной фазы, введя 0,5 мл изопропанола и аккуратно перемешав, несколько раз перевернув пробирку. Инкубируйте образцы при RT в течение 10 минут.
  7. Центрифугируйте образцы при 10 000 г в течение 10 минут при 4 °C для сбора РНК.
  8. Сцедите надосадочную жидкость и тщательно удалите остатки жидкости с помощью аспирации.
  9. Промойте гранулу РНК один раз 75% этанолом, добавив минимум 1 мл 75% этанола. Тщательно перемешайте образец, затем центрифугируйте при 7500 × г в течение 5 мин при 4 °C.
  10. Устраните все следы этанола. Высушите гранулу РНК на воздухе в течение 5 минут.
  11. Растворите РНК в 10 мкл воды, не содержащей РНКазы, путем пипетирования вверх и вниз.
  12. Приступайте к проведению ПЦР в реальном времени в соответствии с инструкциями производителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы представляем усовершенствованный протокол оценки функциональности иммунных клеток после ишемического инсульта с использованием проточного цитометрического анализа в рамках модели мини-инсульта. Мини-инсульт был вызван постоянным лигированием дистальной ветви правой средней мозговой артерии (МКА), за которым последовала 7-минутная окклюзия двусторонних общих сонных артерий (ОЦА). Эта методология приводит к легкому инсульту, характеризующемуся небольшими, постоянными объемами поражения и удивительно ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы представляем подробный протокол оценки функции иммунных клеток после ишемического инсульта с использованием проточного цитометрического анализа в модели мини-инсульта. Важнейшие этапы этого протокола включают установление фокального ишемического инсульта путем постоянного лигирования дистальной ветви правой средней мозговой артерии (МКА) наряду с семиминутной окклюзией двусторонних общих сонных артерий (ОСА). Этот хирургический подход приводит к легкому инсульту, к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (No 82201622) и Фонда естественных наук Внутренней Монголии (No 2020MS03017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроцентрифужная пробирка 1,5 млНЕСТ 615601Лабораторные материалы
1&раз; ПБСКорнинг21-040-СМРеагент
96-луночный микропланшет с прозрачным круглым дном и обработанным TCКорнинг3799Лабораторные материалы
Антимышь APC CD19Биолегенда152410Антитело
APC/Cyanine7 антимышь CD45Биолегенда103116Антитело
Авертин (1.25%)Нанкин Айбэй Биотехнология М2920Реагент
BD FACSAria IIБД642510Оборудование
Антимышь Brilliant Violet 421 CD4Биолегенда100437Антитело
Brilliant Violet 605 антимышиный/человеческий CD11bБиолегенда101237Антитело
БСАСигма-ОлдричА1933-1ГХимический
Коллагеназа IVСигма-ОлдричС4-28-100МГФермент
ДНКаза IБиолаборатории Новой АнглииМ0303ЛФермент
ЭДТАСигма-ОлдричЭДС-100ГХимический
Falcon 5 мл Пробирки из полистирола с круглым дномКорнинг352052Лабораторные материалы
Фалькон  Конические центрифужные пробирки 15 млКорнинг352095Лабораторные материалы
ФлоуДжо V10БДПрограммное обеспечение
Антитела к GLAST (ACSA-1), ПЭМилтеньи Биотек130-118-344Антитело
ИзофлуранRWD Медико-биологические наукиР510-22-10Реагент
PE/Cyanine7 антимышиный CD3Биолегенда100220Антитело
PE/Dazzle 594 антимышь НК-1.1Биолегенда156518Антитело
Реагент ТРИЗОЛThermo Fisher Scientific Inc.15596026Реагент
Ультрачистая дистиллированная вода, не содержащая ДНКазы/РНКазыThermo Fisher Scientific Inc.10977015Реагент
Тканевые клеи Vetbond3 МИН.1469СБЛабораторные материалы
Зомби Аква Корректируемый Набор ЖизнеспособностиБиолегенда423102Аминоактивный флуоресцентный краситель

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kleindorfer, D. O., et al. 2021 Guideline for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: A guideline from the American heart association/American Stroke Association. Stroke. 52 (7), e364-e467 (2021).
  2. Pu, L., et al. Projected global trends in ischemic stroke incidence, deaths and disability-adjusted life years from 2020 to 2030. Stroke. 54 (5), 1330-1339 (2023).
  3. Cheng, Y., et al. Projections of the stroke burden at the global, regional, and national levels up to 2050 based on the global burden of disease study 2021. J Am Heart Assoc. 13 (23), e036142(2024).
  4. Ma, Y., Yang, S., He, Q., Zhang, D., Chang, J. The role of immune cells in post-stroke angiogenesis and neuronal remodeling: The known and the unknown. Front Immunol. 12, 784098(2021).
  5. Duan, M., Xu, Y., Li, Y., Feng, H., Chen, Y. Targeting brain-peripheral immune responses for secondary brain injury after ischemic and hemorrhagic stroke. J Neuroinflammation. 21 (1), 102(2024).
  6. Chen, B. R., Wu, T., Chen, T. H., Wang, Y. Neuroimmune interactions and their roles in neurodegenerative diseases. Fundam Res. 4 (2), 251-261 (2024).
  7. Zhang, Z., Lv, M., Zhou, X., Cui, Y. Roles of peripheral immune cells in the recovery of neurological function after ischemic stroke. Front Cell Neurosci. 16, 1013905(2022).
  8. Garcia-Bonilla, L., et al. Analysis of brain and blood single-cell transcriptomics in acute and subacute phases after experimental stroke. Nat Immunol. 25 (2), 357-370 (2024).
  9. Stevens, S. L., et al. The use of flow cytometry to evaluate temporal changes in inflammatory cells following focal cerebral ischemia in mice. Brain Res. 932 (1-2), 110-119 (2002).
  10. Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells. Glia. 22 (1), 72-85 (1998).
  11. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
  12. De Haas, A. H., Boddeke, H. W., Biber, K. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
  13. Mcdonough, A., Weinstein, J. R. Neuroimmune response in ischemic preconditioning. Neurotherapeutics. 13 (4), 748-761 (2016).
  14. Wang, S., et al. Transcriptome analysis reveals dynamic microglial-induced a1 astrocyte reactivity via c3/c3ar/NF-kappab signaling after ischemic stroke. Mol Neurobiol. 61 (12), 10246-10270 (2024).
  15. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. 69A, 1037-1042 (2006).
  16. Siddiqui, S., Livak, F. Principles of advanced flow cytometry: A practical guide. Methods Mol Biol. 2580, 89-114 (2023).
  17. Sousa, C., et al. Single-cell transcriptomics reveals distinct inflammation-induced microglia signatures. EMBO Rep. 19 (11), e46171(2018).
  18. Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry. J Vis Exp. 124, e55781(2017).
  19. Zhang, W., et al. Microglia-associated neuroinflammation is a potential therapeutic target for ischemic stroke. Neural Regen Res. 16 (1), 6-11 (2021).
  20. Mao, J. H., et al. Microglia polarization in ischemic stroke: Complex mechanisms and therapeutic interventions. Chin Med J (Engl). 134 (20), 2415-2417 (2021).
  21. Shui, X., et al. Microglia in ischemic stroke: Pathogenesis insights and therapeutic challenges. J Inflamm Res. 17, 3335-3352 (2024).
  22. Feng, Y., et al. Infiltration and persistence of lymphocytes during late-stage cerebral ischemia in middle cerebral artery occlusion and photothrombotic stroke models. J Neuroinflammation. 14 (1), 248(2017).
  23. Schulze, J., Gellrich, J., Kirsch, M., Dressel, A., Vogelgesang, A. Central nervous system-infiltrating t lymphocytes in stroke are activated via their TCR (T-cell receptor) but lack CD25 expression. Stroke. 52 (9), 2939-2947 (2021).
  24. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  25. Leelatian, N., et al. Single-cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry B Clin Cytom. 92 (1), 68-78 (2017).
  26. Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. J Allergy Clin Immunol. 143 (2), 528-537 (2019).
  27. Schmit, T., Klomp, M., Khan, M. N. The application of flow cytometry for simultaneous and multi-parametric analysis of heterogenous cell populations in basic and clinical research. Methods Mol Biol. 2223, 183-200 (2021).
  28. Dukhinova, M., Kopeikina, E., Ponomarev, E. D. Usage of multiparameter flow cytometry to study microglia and macrophage heterogeneity in the central nervous system during neuroinflammation and neurodegeneration. Methods Mol Biol. 1745, 167-177 (2018).
  29. Rui, W., et al. Myeloid gasdermin d drives early-stage T-cell immunity and peripheral inflammation in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 21 (1), 266(2024).
  30. Rauber, S., et al. Flow cytometry identifies changes in peripheral and intrathecal lymphocyte patterns in CNS autoimmune disorders and primary CNS malignancies. J Neuroinflammation. 21 (1), 286(2024).
  31. Rayaprolu, S., et al. Flow-cytometric microglial sorting coupled with quantitative proteomics identifies moesin as a highly-abundant microglial protein with relevance to Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 15 (1), 28(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи