Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Протективные эффекты сыворотки, содержащей цзянтангл тибетской медицины, на функцию митохондрий в β-клетках поджелудочной железы RIN-m5F

587 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68319

⸱

27 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tibetan Medicine, University of Xizang Medicine, 2School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4College of Life Sciences, Sichuan University, 5Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Это исследование показало, что сыворотка, содержащая Цзянтангл тибетской медицины, может улучшить митохондриальную дисфункцию за счет повышения уровня митохондриальной и гликолитической АТФ.

Аннотация

Недостаточность β-клеток, вызванная митохондриальной дисфункцией, является основным признаком сахарного диабета 2 типа (СД2). Тибетская медицина Jiangtangle, состоящая из Berberis kansuensis, Curcumaelongae Rhizoma, Malvae Fructus, Tribuli Fructus, Thlaspi arvense L. и Phyllanthus emblica L., может быть использована для лечения СД2. Тем не менее, его влияние на функцию митохондрий остается неясным. Данное исследование направлено на выяснение фармакологического воздействия тибетской медицины Цзянтлан на митохондрии. Через 7 суток после приема тибетского препарата Цзянтлан сыворотку крови крысы получали путем забора крови из брюшной аорты. Островковые β-клетки поджелудочной железы крысы (RIN-m5F) были разделены на контрольную, модельную и сывороточную группы, содержащие Jiangtangle. Модельную группу и группу сыворотки, содержащую Jiangtangle, индуцировали при повреждении средой DMEM, содержащей 50 мМ глюкозы, в течение 24 ч. Контрольную группу в течение 24 ч получали обработку средой DMEM, не содержащей глюкозы. Затем в контрольную и модельную группы добавляли среду, в то время как сыворотки, содержащие Jiangtangle, инкубировали в течение 24 ч со средой, содержащей 2,5%, 5% и 10% сыворотки, содержащей Jiangtangle. Результаты UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS показали 90 соединений в Jiangtangle, среди которых 6 прототипных соединений поступают в кровь. CCK 8 использовали для измерения жизнеспособности клеток, Seahorse XFe использовали для оценки митохондриального энергетического метаболизма, а также оценивали влияние сыворотки, содержащей Jiangtangle, на гипергликемическую модель клеток RIN-m5F. Сыворотка, содержащая цзянтангл, усиливает жизнеспособность клеток RIN-m5F, уровень митохондриальной АТФ, уровень гликолитической АТФ, базальный гликолиз, компенсаторный гликолиз, OCR, утечку протонов и максимальное дыхание.

Введение

Сахарный диабет – это хроническое метаболическое заболевание, широко распространенное в мире. Его сложный патогенез представляет серьезную угрозу для здоровья человека, являясь серьезной проблемой общественного здравоохранения, требующей безотлагательного решения1. Диабет в основном делится на сахарный диабет 1 типа, сахарный диабет 2 типа (СД2), гестационный диабет и определенные типы диабета2 типа. С изменением образа жизни и ускорением процессов старения распространенность диабета в последние несколько десятилетий демонстрирует резкую тенденцию к росту. Китай имеет самое большое население диабета в мире, более 118 миллионов человек страдают диабетом, что составляет примерно 22% от общего числа в мире, причем более 90% приходится на СД2 3,4,5. Во всех зарегистрированных патогенезах дисфункция островковых β-клеток была объявлена ключевым механизмом в процессе СД2 6,7.

Митохондрии, являясь центром клеточного энергетического обмена, являются суборганеллами, участвующими в основных функциях островковой β-клетки8. Современные исследования показали, что возникновение и развитие СД2 тесно связаны с митохондриальной активностью, функцией и окислительным стрессом. Недостаточность β-клеток, вызванная митохондриальной дисфункцией, является основным признаком СД29. β-клетки, расположенные в островках, отвечают за синтез и секрецию инсулина – гормона, необходимого для регулирования уровня сахара в крови. В ходе развития СД2 аномальная функция митохондрий, обогащенные активные формы кислорода и реакция окислительного стресса нарушают митохондриальный динамический баланс β клеток и влияют на секрецию и метаболизм инсулина10.

Тибетская медицина Jiangtangle состоит из Berberis kansuensis, Curcumaelongae Rhizoma, Malvae Fructus, Tribuli Fructus, Thlaspi arvense L. и Phyllanthus emblica L. (Рисунок 1). Представляет собой желтый порошок с ароматным запахом и горьковатым вкусом. Его можно использовать для лечения сухости во рту, полидипсии, истощения, полиурии, диабетической стопы, зуда кожи и других симптомов, вызванных диабетом. Существующие клинические данные показали, что алкалоиды коры барбариса могут эффективно облегчить СД2, снижая уровень сахара в крови, улучшая резистентность к инсулину и уменьшая воспаление11. Куркумин обладает потенциалом для улучшения СД2 за счет снижения уровня глюкозы в крови, повышения чувствительности к инсулину, модуляции липидного профиля и оказания противовоспалительного и антиоксидантного действия12. Кроме того, Malave Fructus, Tribulifructus, Thlaspi arvense L. и Phyllanthus emblica L. также обладают антидиабетической или антиоксидантной активностью 13,14,15. В настоящее время эффективность, материальная основа и механизм применения тибетской медицины Jiangtangle в терапии СД2 до сих пор не раскрыты. Состав китайской тибетской медицины сложен, а ее профилактика и терапия заболеваний базируются на теории применения лекарств в холистическом и систематическом взглядах. В настоящее время фармакохимия сыворотки китайской материи медика может частично объяснить компоненты абсорбции в крови и стала важным средством для изучения материальной основы тибетскоймедицины. Это исследование первоначально пролило свет на защитное действие тибетской медицины Jiangtangle на митохондрии in vitro, с акцентом на проверку новой гипотезы о том, что сыворотка, содержащая Jiangtangle, может смягчать митохондриальную дисфункцию в β-клетках островка поджелудочной железы крыс (RIN-m5F) при стрессе с высоким уровнем глюкозы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Административный комитет компании Sichuan Scientist Biological Testing Biotechnology Co., Ltd. утвердил протокол для животных (регистрационный номер: SYST-2024-019). Самцы крыс Sprague Dawley (SD) в возрасте 8-10 недель и массой 260-300 г содержались в независимых клетках с вентиляцией в контролируемой среде 23 ± 2 °C и относительной влажности 55%-60% для данного исследования. Эти специфические животные, свободные от патогенов, были получены от коммерческого поставщика (см. Таблицу материалов). Все крысы прошли 1-недельный период адаптивного кормления для акклиматизации к новой среде до начала эксперимента, с неограниченным доступом к воде и пище.

Подготовка к эксперименту

Необходимые препараты и реактивы были приготовлены в соответствии с технологической схемой эксперимента (см. таблицу материалов). В данном исследовании использовались крысы с SPF SD (8-10 недель, 260-300 г). Все животные были приобретены у коммерческого поставщика (см. Таблицу материалов). После карантина животных содержали при постоянной комнатной температуре с циклом свет-темнота 12:12 ч и кормили стандартной диетой грызунов и водой.

Лечение животных и сбор сывороток

Всем крысам, которые подвергались адаптивному кормлению, вводили тибетский препарат Jiangtangle через зонд в течение 7 дней. Клиническая доза составила 0,6 г/сут, которая была пересчитана в дозу для крыс 1,26 г/кг17. Через 1 ч после последнего введения крысам проводили анестезию изофлураном в концентрации 3-4% для индукции и 2% для поддерживающей терапии. Затем крыс под наркозом помещали на операционный стол, а место операции дезинфицировали йодофором. Разрез был сделан по средней линии живота, чтобы обнажить брюшную аорту. Кровь медленно отбирали с помощью гепаринизированного шприца из аорты (8 мл) и перекладывали в центрифужную пробирку для центрифугирования. Собранную кровь центрифугировали при 2360 х г в течение 10 мин при 4 °C для отделения сыворотки. Затем образцы сыворотки аликвотировали в криогенные пробирки по 5 мл на пробирку и хранили в медицинском холодильнике при температуре -80 °C (см. Таблицу материалов) для последующего анализа.

Анализ UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS

Приготовление образцов лекарственного материала: тибетский препарат Jiangtangle (140,0 мг) был тщательно взвешен и растворен в 25 мл метанола (см. Таблицу материалов) с последующим 30-минутным ультразвуковым обработкой при частоте 40 кГц, 300 Вт. Полученный раствор фильтровали через мембрану толщиной 0,22 мкм для получения исследуемого образца.

Подготовка образца сыворотки: 100 мкл сыворотки тщательно смешивали с 400 мкл холодного метанола и ацетонитрила (v/v, 1:1; см. таблицу материалов) методом вортексирования. Смесь обрабатывали ультразвуком (40 кГц, 300 Вт) в течение 1 ч в ледяной бане. Затем смесь инкубировали при -20°С в течение 1 ч и центрифугировали при 4°С в течение 20 мин при 14 000 х г. Затем надосадочную жидкость собирали и сушили в вакууме для анализа UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS.

Хроматографические условия: Надосадочную жидкость измеряли с помощью системы UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS (см. Таблицу материалов). Для разделения LC использовалась колонка ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 мм x 100 мм, 1,8 мкм). Подвижная фаза состояла из А (0,1% муравьиной кислоты в воде) и В (100% ацетонитрила). Скорость потока составила 0,3 мл/мин, с определенной программой градиента 5%-95% B (0-30 мин), 95% B (30-35 мин). Объем инжекции составил 5 мкл. Данные МС регистрировались в положительном и отрицательном режимах ESI отдельно. Источник HESI имел заданные условия по напряжению распыления, температуре капилляров, потокам газа и т.д. Прибор сканировал с температурой м/з 70-1050 Да, с различными разрешениями для полных МС и МС/МС. Необработанные данные МС обрабатывались с использованием MS-DIAL для выравнивания пиков. Состав тибетской медицины Jiangtangle был идентифицирован по точным данным о массе и MS/MS по общедоступным базам данных. Были сохранены только переменные с более чем 50% ненулевых значений хотя бы в одной группе.

Культивирование и лечение клеток

Клетки RIN-m5F (см. Таблицу материалов) культивировали с модифицированной средой Dulbecco Modified Eagle (DMEM), 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллином/стрептомицином в контролируемом инкубаторе с 5%CO2 (см. Таблицу материалов) при 37 °C. Клетки RIN-m5F на логарифмической стадии роста отбирали, подсчитывали после разложения и инокулировали в 96-луночные планшеты с 1 x 105 ячеек в лунку. С использованием 10-60 мМ глюкозы проводили индукцию клеток, чтобы имитировать среду с высоким содержанием глюкозы при СД2. Клетки RIN-m5F были разделены на контрольные, модельные и сывороточные группы 2,5%, 5% и 10% Jiangtangle. Клетки в контрольной группе обрабатывали DMEM, а другие группы индуцировали DMEM, содержащим глюкозу, в течение 24 ч. Контрольную и модельную группы добавляли со средой, в то время как к каждой группе сыворотки добавляли DMEM, содержащую 2,5%, 5% и 10% сыворотки, содержащей Jiangtangle, и инкубировали в течение 24 ч при 37 °C с 5%CO2.

Анализ CCK 8

Жизнеспособность клеток измеряли с помощью CCK 8 (см. Таблицу материалов). Клетки RIN-m5F инокулировали в 96-луночные планшеты и обрабатывали глюкозой (0, 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мМ). Затем в лунки добавляли 100 мкл DMEM с сывороткой, содержащей Jiangtangle, и инкубировали при 37 °C с 5%CO2 в течение 24 ч. В состав каждой группы входило по 6 повторяющихся скважин. После 24 ч инкубации с глюкозой и 24 ч инкубации с сывороткой, содержащей Jiangtangle, добавляли 10 мкл раствора CCK 8 и инкубировали при 37 °C в течение еще 1,5 ч. Полноволновый считыватель микропланшетов (см. Таблицу материалов) был использован для определения значений поглощения каждого отверстия на длине волны 450 нм16.

Анализ митохондриальной функции

Как мы сообщали ранее18, анализатор Seahorse XFe 24 (см. Таблицу материалов) использовался для оценки скорости производства АТФ и скорости гликолиза в реальном времени. Клетки RIN-m5F были инокулированы в микропланшеты Seahorse XFe24 V24. Клетки засеивали в планшеты для культивирования клеток XF24 с использованием двухэтапного протокола: 100 мкл клеточной суспензии дозировали в каждую лунку, и планшет оставляли нетронутым в течение 1 ч. Затем планшет был перенесен в инкубатор с температурой 37 °C, 5%CO2 на 4 ч для обеспечения первоначального прикрепления. Далее в каждую лунку добавляли по 150 мкл DMEM. После моделирования в течение 24 ч и введения препарата в течение 24 ч детектирующий раствор готовили путем добавления 1% глюкозы, 1% пирувата и 1% глутамина в среду Seahorse XF DMEM. Затем клетки дважды промывали раствором для детектирования по 1 мл. Для использования набора для измерения скорости АТФ в реальном времени и набора для анализа скорости гликолиза 56 мкл олигомицина и 62 мкл ротенона/антимицина А ресуспендировали и добавляли в лунки сенсорных картриджей А и В соответственно. Планшет для клеточной культуры помещали в инкубатор для клеточных культур безCO-2 на 60 минут. Наконец, скорость производства АТФ и скорость гликолиза контролировались в режиме реального времени с помощью автоматической системы впрыска. Все эксперименты проводились при температуре 37 °C, а данные анализировались с помощью программного обеспечения XF Wave19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS показал, что тибетская медицина Jiangtangle содержит такие соединения, как фенолы, алкалоиды, флавоноиды, нуклеозиды, органические кислоты, аминокислоты, терпеноиды, кумарины, гликозиды, дубильные вещества, лигнаны, стероиды и другие. (Рисунок 2, Таблица 1). Крысам SD перорально вводили 1,26 г/кг тибетского лекарства Цзянтлан один раз в день. Обзор стратегии гейтирования сыворотки представлен на рис...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

СД2 обычно рассматривается как хроническое метаболическое заболевание со скрытым началом и высокой распространенностью и сопровождается многими осложнениями, связанными с диабетом, такими как глазная, сердечно-сосудистая и почечная дисфункция 20,21,22,23. К его клиническим проявлениям относятся повышенный уровень сахара в крови, полиурия, полидипсия, потеря вес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана проектом «Коннотация» 14-го пятилетнего плана Университета тибетской медицины (2023ZYYGH05) и Департаментом науки и технологий провинции Сычуань (2024NSFSC1845). Между тем, авторы хотели бы поблагодарить доктора Лу Янга, старшего инженера по оборудованию в Инновационном институте китайской медицины и Phamacy/Academy for Interdiscipline, за предоставление технических услуг для методов Seahorse XF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
 -80° C медицинский холодильникMetherMDF-86H118
0.22 &; m водная мембранаJintengJTMF0445
0,22 &; m игольчатая микропористая фильтрующая мембранаJintengJTSFM013001
АцетонитрилАладдинA104440
программное обеспечение Agilent OpenLabAgilentVersion 2.X
Шкаф биобезопасностиAirtechBSC-1004 II A2
Набор для подсчета клеток-8BiogroundBG0025
CelMate CO2 ИнкубаторEsco Micro Pte Ltd.CLM-240B-8
Хроматографическая колонкаAgilentSB-C18
Decolorization шейкерKylin-BellTS-2
модифицированная орлиная среда DulbeccoGibco8121587
Буфер для электрофорезаNCM Biotech20230801
муравьиной кислотойАладдинF298778
ГлюкозаChengdu Herbpurify Co., Ltd.P012-180-180222
Программное обеспечение GraphPad Prismпрограммное обеспечение GraphPad, LLCВерсия 9.5.1
Высокоскоростная рефрижераторная центрифугаThermo Fisher ScientificLegend Micro 17R
Низкоскоростная центрифугаHallonNH5
МетанолАладдинM116118
пенициллин-стрептомицинNCM BiotechC125C5
Фосфатный буферный раствор (1&раз;)Gibco8120485
Островковые &бета;-клетки поджелудочной железы крысыATCCCRL-11605
ReadMax 1500 поглощение света полноволновым ферментом FlashReadMax 1500
Набор для анализа скорости гликолиза Seahorse XFAgilent103344-100
Набор для измерения скорости АТФ в реальном времени Seahorse XFAgilent103592-100
Анализатор Seahorse XFe 24AgilentXFe24
Трипсин (0,25%, 1&раз;)Анализатор HyCloneJ210045
UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MSThermo ScientificQE Q Exactive
Vortex смесительKylin-BellXW-80A

Ссылки

  1. Odutola, P. O., Olorunyomi, P. O., Olatawura, O. O., Olorunyomi, I. Effectiveness of remote glucose monitoring versus conventional care in diabetes management: a systematic review and meta-analysis. Med Adv. 3 (1), 28-36 (2025).
  2. Harreiter, J., Roden, M. Diabetes mellitus: definition, classification, diagnosis, screening and prevention (update 2023). Wien Klin Wochenschr. 135 (Suppl 1), 7-17 (2023).
  3. Xu, Z., et al. Diabetes in China part 1: epidemiology and risk factors. Lancet Public Health. 9 (12), 1089-1097 (2024).
  4. Reed, J., Bain, S., Kanamarlapudi, V. A review of current trends with type 2 diabetes epidemiology, aetiology, pathogenesis, treatments and future perspectives. Diabetes Metab Syndr Obes. 14, 3567-3602 (2021).
  5. Khan, M. A. B., et al. Epidemiology of type 2 diabetes-global burden of disease and forecasted trends. J Epidemiol Glob Health. 10 (1), 107-111 (2020).
  6. Cojocaru, K. A., et al. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and therapeutic strategies in diabetes, obesity, and cardiovascular disease. Antioxidants (Basel). 12 (3), 658(2023).
  7. Dludla, P. V., et al. Pancreatic β-cell dysfunction in type 2 diabetes: implications of inflammation and oxidative stress. World J Diabetes. 14 (3), 130-146 (2023).
  8. San-Millan, I. The key role of mitochondrial function in health and disease. Antioxidants (Basel). 12 (4), 782(2023).
  9. Liang, K. X. Interplay of mitochondria and diabetes: unveiling novel therapeutic strategies. Mitochondrion. 75, 101850(2024).
  10. Xiao, S. Y., et al. Aptamer functionalized liposomes co-loaded with exenatide-4 and coenzyme Q10 ameliorate type 2 diabetes mellitus by improving pancreatic β cell function. Int J Nanomedicine. 20, 3363-3378 (2025).
  11. Tao, Y. W., et al. The total alkaloids of Berberidis Cortex alleviate type 2 diabetes mellitus by regulating gut microbiota, inflammation, and liver gluconeogenesis. J Ethnopharmacol. 337 (3), 118957(2025).
  12. Zeng, Y., et al. Therapeutic effect of curcumin on metabolic diseases: evidence from clinical studies. Int J Mol Sci. 24 (4), 3323(2023).
  13. Li, X. Y., Wang, X., Zhao, M., Zhang, H., Liu, C. The chemical and pharmacological research progress on a kind of Chinese herbal medicine, Fructus Malvae. Molecules. 27 (17), 5678(2022).
  14. Xu, T. S., et al. Revealing the improvement of diabetes by Si Wei Jiang Huang Tang San through ERK/HIF1α signaling pathway via network pharmacology. J Ethnopharmacol. 319 (2), 117254(2024).
  15. Wu, N., et al. Protective benefits and mechanisms of Phyllanthus emblica Linn. on aging induced by oxidative stress: a system review. Food Med Homol. 2 (2), 9420029(2025).
  16. He, C. T., et al. Study on serum pharmacochemistry and mechanism of Zangjiangzhi capsule. Qinghai Sci Tech. 31 (02), 39-48 (2024).
  17. Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. J Ethnopharmacol. 241, 111801(2019).
  18. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  19. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  20. Iwasaki, H., Yagyu, H., Shimano, H. A comprehensive analysis of diabetic complications and advances in management strategies. J Atheroscler Thromb. 32 (5), 550-559 (2025).
  21. Yu, J. L., et al. Relationship between metabolomics of T2DM patients and the anti-diabetic effects of Phellodendri Chinensis Cortex-Anemarrhenae Rhizoma herb pair in mice. J Ethnopharmacol. 339, 119129(2025).
  22. Liu, S., et al. Diabetic microvascular complications are associated with left ventricular hypertrophy in patients with type 2 diabetes mellitus. J Diabetes Complications. 39 (2), 108947(2025).
  23. Goldney, J., et al. Age at onset of type 2 diabetes and prevalence of vascular disease and heart failure: systematic review and dose-response meta-analysis. J Diabetes Complications. 38 (10), 108849(2024).
  24. Jasem, D., et al. Incidence, prevalence and clinical manifestations at onset of juvenile diabetes in Tanzania. Diabetes Res Clin Pract. 156, 107817(2019).
  25. Wang, X. D., et al. Biomimetic nanoplatform with microbiome modulation and antioxidant functions ameliorating insulin resistance and pancreatic β-cell dysfunction for T2DM management. Biomaterials. 313, 122804(2025).
  26. Zhu, J., et al. Clinical expert consensus on the assessment and protection of pancreatic islet β-cell function in type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110568(2023).
  27. Dong, Z. H., et al. A novel antidiabetic peptide GPAGAP from Andrias davidianus collagen hydrolysates: screening, action mechanism prediction and improving insulin resistance in HepG2 cells. Food Med Homol. 1 (1), 9420010(2024).
  28. Rieusset, J. Contribution of mitochondria and endoplasmic reticulum dysfunction in insulin resistance: Distinct or interrelated roles. Diabetes Metab. 41 (5), 358-368 (2015).
  29. Baduini, I. R., et al. Type 2 diabetes mellitus and neurodegenerative disorders: The mitochondrial connection. Pharmacol Res. 209, 107439(2024).
  30. Du, H., et al. Effects of gut microbiota on five absorbed components of Berberis kansuensis in rat serum by HPLC-QqQ-MS. China J Chinese Materia Medica. 45 (2), 418-424 (2020).
  31. Su, M., et al. Exploring manzamine a: a promising anti-lung cancer agent from marine sponge Haliclona sp. Front Pharmacol. 16, 1525210(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

2RIN m5FSeahorse XFe
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.