Методическая статья

Изучение последовательных клеточных событий фагоцитоза, вызванного Godanti Bhasma в клетках млекопитающих

DOI:

10.3791/68321

⸱

11 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shobhit Institute of Engineering & Technology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование выясняет фагоцитарный процессинг частиц Godanti Bhasma (GB) в клетках млекопитающих, характеризуя их клеточное поглощение, динамику вакуоли, закисление и деградацию. Эти результаты не только углубляют наше понимание фундаментальных механизмов фагоцитоза, но и делают ГБ перспективной модельной системой для разработки новых терапевтических стратегий.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фагоцитоз является жизненно важным клеточным механизмом, с помощью которого клетки поглощают и разрушают чужеродные частицы, патогены или мусор, играя ключевую роль в иммунной защите и поддержании гомеостаза тканей. Сбои в этом процессе связаны с различными заболеваниями. Для изучения сложных событий, связанных с фагоцитозом, необходимы передовые «умные» частицы и эффективные методы мониторинга. Godanti Bhasma (GB), традиционная индийская медицина, состоящая из биоактивных частиц сульфата кальция, быстро интернализуется путем фагоцитоза в клетках млекопитающих, вызывая значительную цитоплазматическую вакуолацию. Здесь оценивали ключевые стадии ГБ-индуцированного фагоцитоза с помощью проточной цитометрии (ФК), визуализации живых клеток и специфических методов окрашивания. Проточный цитометрический анализ продемонстрировал формирование фагоцитарных чашеобразных структур, связанных с интернализацией частиц. Визуализация живых клеток позволила в режиме реального времени наблюдать за фагоцитарными процессами, включая поглощение частиц, образование вакуолей, деградацию поглощенных материалов и вакуолярный оборот. Для оценки вакуолярного подкисления использовали окрашивание нейтральным красным и акридиновым оранжевым. Интересно, что лечение лизосомальным ингибитором BFA1 в клетках, обработанных GB, не приводило к вакуолизации, о чем свидетельствует отсутствие нейтрального поглощения красного, что подчеркивает необходимость наличия кислой среды для возникновения вакуоляции. Эти результаты подчеркивают потенциал ГБ-индуцированного фагоцитоза в качестве модели для выяснения последовательных клеточных событий, участвующих в этом процессе, что имеет решающее значение для понимания взаимодействий хозяина и патогена, внутриклеточного транспорта и разработки инновационных терапевтических стратегий для расстройств, связанных с фагоцитозом.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фагоцитоз является важным клеточным процессом, осуществляемым тканевыми резидентными профессиональными фагоцитами, такими как макрофаги и дендритные клетки, а также непрофессиональными фагоцитами, такими как эпителиальные клетки и фибробласты, которые поглощают и разрушают чужеродные частицы. Эти клетки интернализуют и выводят чужеродные частицы, патогены или клеточный мусор, внося значительный вклад в иммунную защиту и тканевый гомеостаз1. Этот процесс начинается с распознавания патогенов, мусора или частиц с помощью рецепторов распознавания образов (PRR), таких как Toll-подобные рецепторы (TLR), которые связываются с патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (PAMP)2. Это распознавание запускает образование фагоцитарной чашки, в которой выступы плазматической мембраны распространяются вокруг частицы-мишени3. Актиновые филаменты играют решающую роль на этом этапе, стимулируя ремоделирование мембраны, необходимое для поглощения частиц4. Как только частица заключена в фагосому, образуется связанная с мембраной везикула. Фагосома подвергается созреванию, характеризующемуся слиянием с ранними, затем поздними эндосомами с последующим включением лизосом, содержащих гидролитические ферменты5. Эти ферменты, такие как катепсины, лизоцимы и нуклеазы, активируются путем подкисления внутри фагосомы, достигаемого вакуолярной АТФазой (V-АТФаза), снижая рН до 4,5-5,5. Деградационный процесс завершается экзоцитозом остатков из клетки. Дисфункции в этом динамичном и сложном процессе могут привести к значительным проблемам с иммунитетом 6,7,8.

Для точной оценки сложного клеточного процесса фагоцитоза существует потребность в усовершенствованных и простых методах мониторинга основных клеточных событий фагоцитоза. Традиционно, метод мониторинга для количественного определения фагоцитоза включает в себя такие методы, как фиксация фагоцитов через заранее определенные интервалы времени для микроскопической визуализации, измерение интернализации меченных красителем мишеней с помощью визуализации или проточной цитометрии или подсчет количества клеток-мишеней, оставшихся после определенной продолжительности фагоцитоза.. Более того, методы, основанные на косвенных показателях, таких как поглощение красителя, могут неточно отражать фактические фагоцитарные события из-за потенциального пассивногопереноса красителя.

Последние достижения в области визуализации живых клеток, проточной цитометрии и методов окрашивания произвели революцию в наших возможностях мониторинга фагоцитоза с высокой пространственно-временной точностью. Визуализация живых клеток, например, позволяет непрерывно наблюдать за динамическими процессами с отслеживанием последовательных событий11. Проточная цитометрия широко используется для анализа клеток млекопитающих и обнаружения биомаркеров в клинических исследованиях12. Однако традиционные методы ФК не позволяют оценить морфологические и пространственные характеристики отдельных клеток12. Проточная цитометрия с визуализацией (IFC) служит надежной альтернативой, позволяющей собирать подробную информацию об отдельных клетках. IFC сочетает аналитические возможности проточной цитометрии с визуализацией с высоким разрешением, позволяя проводить анализ отдельных клеток с морфологической и пространственной детализацией. Различные частицы, в том числе флуоресцентные латексные шарики, зимозан-APC и синтетические наночастицы, обычно используются для изучения фагоцитоза, обеспечивая понимание взаимодействия рецепторов, формирования фагосом и иммунныхреакций.

В отличие от традиционных биохимических методов, которые обычно основаны на анализе конечных точек, визуализация живых клеток обеспечивает непрерывный, динамический мониторинг клеточных процессов. Этот метод обеспечивает высокое пространственно-временное разрешение и возможность наблюдать последовательные события в фагоцитозе. В результате, это мощный инструмент для изучения сложного процесса фагоцитоза, позволяющий получить более точное и подробное представление о клеточном поведениии механизмах.

В дополнение к достижениям в системах визуализации, существует потребность в умных фагоцитарных частицах, которые могут отчетливо выделять фагоцитарные события, в частности, этапы деградации, происходящие внутри фагосомы. В исследованиях фагоцитоза часто используются такие частицы, как латексные шарики, зимозан, бактерии, апоптотические клетки и синтетические наночастицы для изучения таких механизмов, как взаимодействие рецепторов, образование фагосом и иммунные реакции. Несмотря на то, что эти частицы дают ценную информацию, они имеют ограничения в отслеживании всего процесса деградации или прямой оценке созревания фагосом. Например, гранулы латекса не поддаются биологическому разложению и не могут демонстрировать деградацию, в то время как зимозан и бактерии часто требуют сложной маркировки и могут не давать последовательных профилей деградации14,15.

Наше предыдущее исследование продемонстрировало полезность GB, традиционной аюрведической формулы, состоящей в основном из сульфата кальция, в качестве идеальной частицы для изучения созревания и деградации фагосом. GB со временем растворяется в кислой среде фагосомы, что позволяет четко визуализировать деградацию частиц. Кроме того, способность ГБ индуцировать устойчивое образование вакуоли облегчает исследование различных стадий созревания фагосом, от раннего образования до подкисления и окончательного разрешения. В отличие от других частиц, GB устраняет необходимость во внешней маркировке, обеспечивая самоподдерживающуюся систему для изучения полного жизненного цикла фагосом, что делает ее идеальной моделью для понимания динамики фагоцитоза и связанных с нимрасстройств.

В данном исследовании представлен стандартизированный и воспроизводимый протокол, предназначенный для оценки индуцированного частицами фагоцитоза и образования вакуоли с использованием Godanti Bhasma (GB) как в профессиональных (RAW 264.7), так и в непрофессиональных (HeLa и 3T3-L1) фагоцитарных клеточных линиях. Общая цель этого метода — обеспечить надежную платформу для изучения механизмов клеточного поглощения, вакуолярного биогенеза и внутриклеточной обработки частиц в различных типах клеток. GB суспендировали в DMEM в концентрации 10 мг/мл, и для обеспечения однородности более крупным частицам давали осесть, пока собирали верхнюю фракцию для экспериментального использования. Для анализов проточной цитометрии клетки засевали с плотностью 2 х 105 клеток на лунку в 12-луночные планшеты и добавляли 300 мкл рабочей суспензии GB в каждую лунку. Для анализа на основе визуализации 5000-10000 клеток засевали в лунку в 96-луночных планшетах или на предметных стеклах камеры. Этот метод делает GB надежной моделью для исследования образования вакуоли и интернализации частиц в различных типах клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культивирование клеток и посев

  1. Готовят полнорационную среду DMEM с добавлением 10% инактивированного при нагревании FBS и антибиотиков (100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина). Перед использованием стерилизуйте все реактивы и оборудование.
  2. Культивируют клетки 3T3-L1, HeLa и RAW 264,7 в колбах2 диаметром 25 см и чашках для культивирования 35 мм с использованием DMEM. Поддерживайте культуру при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%CO2 и заменяйте среду каждые 48 часов.
  3. Для субкультивирования промойте клетки 2 раза PBS, затем отделите адгезивные клетки с помощью 500 μл Trypsin-EDTA и инкубируйте в течение 5 минут. Добавьте 1 мл DMEM для нейтрализации раствора Trypsin-EDTA, пипеткой для создания одноклеточной суспензии и отрегулируйте объем до 10 мл с помощью свежего DMEM. Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин, ресуспендируйте гранулу в 1 мл свежей среды.
  4. Смешайте 10 μл клеточной суспензии с 0,4% трипановым синим (1:1), подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра, рассчитайте плотность как Клетки/мл = Среднее количество x 104 x 2.
  5. Для 96-луночных планшетов: Дозируйте 100 мкл клеточной суспензии (содержащей 10 000 клеток) в каждую лунку. Для полостных стекол засейте 50 мкл клеточной суспензии (содержащей 5000 клеток) в две полости, оставив среднюю полость пустой. Добавьте по 50 мкл DMEM в каждую из засеянных полостей.
  6. Инкубируйте планшеты и предметные стекла при 37 °C при 5%CO2 в течение 24 ч для обеспечения адгезии и стабилизации клеток. Осмотрите клетки под инвертированным микроскопом при 20-кратном увеличении, чтобы оценить морфологию, слияние и загрязнение, прежде чем приступать к экспериментам.

2. Приготовление ГБ стокового раствора/коктейля для культивирования клеток

  1. Приобретите GB и точно взвесьте 100 мг порошка. Суспензию порошка в 10 мл ДМЭМ, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином.
  2. Сделайте вихревой нагрузку на суспензию и дайте ей постоять 1 минуту, чтобы более крупные частицы осели. Затем перелейте верхние 5 мл суспензии в стерильную центрифужную пробирку.
  3. Обозначьте эту приготовленную суспензию GB объемом 5 мл в качестве исходного раствора для последующих экспериментов на клеточных культурах. Тщательно окуните суспензию в вихрь, чтобы обеспечить равномерное диспергирование частиц перед добавлением ее в ячейки.

3. Анализ проточной цитометрии

  1. Соберите RAW 264.7, HeLa или 3T3-L1 клетки методом трипсинизации, нейтрализуйте с помощью полного DMEM, центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут, повторно суспендируйте в 1 мл свежей среды, смешайте 10 μL с 0,4% трипанового синего (1:1), подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра, рассчитайте плотность и доведите до 2 x 105 клеток/мл.
  2. Высевают 2 х 10по 5 клеток в лунку в 12-луночный планшет и культивируют в течение 24 ч. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2.
  3. Обрабатывайте клетки суспензией GB (300 μл на лунку) в течение различной продолжительности: 30 мин, 1 ч и 12 ч. После обработки промойте клетки 5 раз PBS для удаления лишних частиц.
  4. Трипсинизируйте клетки, как описано в шаге 1.3, и тщательно промойте их PBS. Загрузите приготовленную суспензию в отверстие для образца проточного цитометра. Запустите программное обеспечение и выберите подходящие настройки для сбора данных. Выберите режим «Яркое поле » для визуализации.
  5. Начните сбор данных, нажав кнопку «Запустить » в программном обеспечении. Собирайте данные не менее чем для 10 000 событий, когда система захватывает изображения отдельных ячеек, проходящих через ячейку потока.
  6. Используйте диаграммы рассеяния с соотношением площади и сторон для гейта отдельных неповрежденных ячеек. Это помогает исключить дублеты и кластеры. Просмотрите соответствующие изображения в библиотеке изображений. Соберите изображения отдельных клеток из библиотеки изображений программного обеспечения для изучения морфологических изменений, вызванных лечением.
  7. Для анализа частиц затравливают 2 х 105 клеток в лунку в 12-луночные планшеты и культивируют в течение 24 ч. Обрабатывайте клетки суспензией GB (300 μл на лунку) в течение разной продолжительности: 1 ч, 7 ч, 14 ч и 24 ч.
  8. После обработки осторожно встряхните культуральный планшет в течение 1 минуты и соберите питательную среду в пробирки объемом 1,5 мл. Промойте клетки 5 раз PBS, чтобы удалить любые внеклеточные частицы.
  9. Добавьте 500 мкл буфера RIPA (20 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 150 мМ NaCl; 0,1% Triton X-100; 1% дезоксихолата натрия) для полного лизирования клеток.
  10. Проведите культуральную среду и лизированные образцы клеток, содержащие частицы, отдельно через проточный цитометр. Загрузите образцы в порт образца системы. Запустите программное обеспечение и выберите подходящие настройки для сбора данных. Выберите режим яркого поля для анализа частиц.
  11. Начните сбор данных, нажав кнопку «Запустить » в программном обеспечении. Получение данных не менее чем за 20 000 событий по мере того, как система получает изображения отдельных частиц, проходящих через проточную ячейку.
  12. Используйте диаграммы рассеяния с соотношением площадей и сторон, чтобы затворить все частицы. Используйте инструменты точечной диаграммы для анализа количества частиц.

4. Покадровая микроскопия

  1. Культивировать клетки 3T3-L1 (3,0 x 104) в чашке диаметром 35 мм с 2 мл DMEM при 37 °C и 5%CO2 до тех пор, пока они не достигнут 70% конфлюенции.
  2. Тщательно перемешайте 300 мкл суспензии GB в предварительно подогретой свежей культуральной среде объемом 2 мл, а затем поместите чашку с культуральными пленками вместе с клетками и GB, на предметный столик для микроскопа.
  3. Выберите цель 10x. Включите подсветку светлого поля с помощью кнопки Яркость. Нажмите кнопку «Видео», чтобы перейти в режим интервальной съемки. Установите время интервала 5 минут. Начните запись, нажав кнопку Rec.
  4. Делайте снимки каждые 5 минут в течение от 16 до 24 часов, обеспечивая непрерывную визуализацию в стандартных условиях в инкубаторе сCO2 .
  5. Используйте программное обеспечение ImageJ для компиляции отснятых изображений в покадровое видео. Этот метод позволяет дифференцировать различные стадии фагоцитоза, от интернализации до полной деградации частиц.

5. Нейтральное красное окрашивание

  1. После 24 ч роста клеток в 96-луночных планшетах и полостных стеклах тщательно перемешайте суспензию GB-частиц и добавьте 30 мкл суспензии в каждую лунку или полость.
  2. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 в течение 24 ч, чтобы вызвать образование вакуоли. Используйте необработанные лунки или полости в качестве негативного контроля.
  3. Для окрашивания нейтральным красным (NR) приготовьте раствор NR 0,5 мг/мл в бессывороточном DMEM и отфильтруйте его через фильтр 0,2 мкм.
  4. Для визуализации вакуолей в 96-луночных планшетах и предметном стекле: удалите среду, добавьте 60 мкл красителя NR и инкубируйте при 37 °C в течение 15 минут. Промойте 3 раза PBS, чтобы удалить излишки красителя, а затем приступайте к микроскопической визуализации.
  5. Исследуйте вакуоли под микроскопом с помощью объектива 20x, чтобы оценить размер, морфологию и количество вакуолей.

6. Обработка бафиломицином А1 для ингибирования вакуоли и подкисления

  1. Готовят исходный раствор бафиломицина А1 (BFA1) в концентрации 100 мкг/мл (160,5 нМ) путем растворения 100 мкг БЖК в 50 мкл ДМСО с последующим разведением в 950 мкл ДМЗ. Разведите 1 мкл этого запаса в 1,6 мл DMEM до получения рабочего раствора 0,1 нМ.
  2. Тщательно перемешайте и добавьте 100 мкл рабочего раствора БФА в лунки, содержащие ячейки в 96-луночных планшетах. Кроме того, добавьте 30 мкл суспензии частиц GB для оценки ингибирования образования вакуоли и фагосом.
  3. Для ингибирования закисления фагосом следует добавить 100 мкл рабочего раствора БФА в лунки с предварительно сформированными вакуолями (предварительно обработанными частицами GB). Инкубируйте все лунки при 37 °C с 5%CO2 в течение 24 часов.
  4. Добавьте 60 μL нейтрального красного (NR) красителя в каждую лунку, инкубируйте еще 15 минут и проанализируйте образование вакуоли и подкисление.

7. Окрашивание акридином в оранжевый цвет (AO)

  1. Обрабатывают клетки, культивируемые в полостных предметных стеклах, 50 мкл ГБ и инкубируют в течение ночи в стандартных экспериментальных условиях.
  2. После обработки клетки инкубируют с раствором акридина апельсина (1 мг/мл) в течение 15 минут при 37 °C для обеспечения селективного окрашивания вакуолей и кислых везикулярных органелл.
  3. Промойте клетки 3 раза стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS), чтобы удалить несвязанный краситель и свести к минимуму фоновую флуоресценцию.
  4. Быстро проанализируйте предметные стекла с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного 20-кратным объективом и синим фильтром возбуждения с диапазоном 450-492 нм, чтобы оценить клеточную морфологию и поглощение акридинового апельсина, что позволит получить представление о вакуолярной динамике.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В исследовании выделены ключевые клеточные реакции на GB-частицы в клетках млекопитающих. Мы использовали проточный цитометр для исследования интернализации частиц GB в клетках 3T3-L1 (рис. 1). Клетки подвергались воздействию частиц в течение от 30 минут до 12 часов. Через 30 минут мы наблюдали частицы на поверхности клетки (рисунок 1B), и клеточная мембрана начала сворачиваться внутрь в местах прикрепления, что указывает на начало интернализации (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фагоцитоз служит важнейшим механизмом иммунной защиты, обеспечивающим поглощение и последующую элиминацию частиц, патогенов и апоптотических клеток. Чтобы понять процессы образования и созревания фагосом, «умные» биосовместимые частицы в сочетании с передовыми методами визуализации необходимы для изучения динамических событий, таких как вакуолярная прогрессия, закисление и деградация поглощенных материалов18,19. Мы использовали G...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантом Совета по научным и инженерным исследованиям (SERB) (CRG/2022/009045) Департамента науки и технологий правительства Индии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
25 см<суп>2 колбы для культурNEST, Индия707001
96- и 6-луночные планшетыTarsons India Pvt. Ltd., Калькутта, Индия; Thermo Scientific, Индия980040; 140675
Акридин апельсиновыйSRL, Индия82407
Антибиотики и раствор Трипсин-ЭДТАHigh Media, Индия628242; 655111
Клеточные линии - HeLa, 3T3-L1 и RAW-264.7Национальный центр клеточных наук (NCCS), Пуна, Махараштра
Посуда для культуры (35мм) SPL Lifesciences, Индия101350
Дульбекко s модифицированный средний Eagle (DMEM)MP Biomedicles, Индия1033126
Фетальная бычья сыворотка (FBS)High Media, Индия651257
Проточный цитометрМиллипор, СШААмниспроточные цитометры с амнисом,
Флуоресцентный микроскопЛаборатория DiGi, ИндияМодель: DiGi 110 Infinity
Годанти БхасмаПатанджали Аюрведа240002
Нейтральный красный красительCDH, Индия593630
Покадровая съемка микроскопаНаноЭнТек Инк.  Сеул, Корея.ДжулиИнтеллектуальный анализатор флуоресцентных клеток JuLi,
Покадровая съемка микроскопаLEEDZ MICRO IMA. ВЕЛИКОБРИТАНИЯS.No. LIM225552358A58EA PRIME Инвертированный микроскоп

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. B. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8 (2), 131-141 (2008).
  2. Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12 (7), 492-502 (2012).
  3. Gordon, S. Phagocytosis: An immunobiologic process. Immunity. 44 (3), 463-475 (2016).
  4. Flannagan, R. S., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol Mech Dis. 7, 61-98 (2012).
  5. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: Going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (10), 781-795 (2008).
  6. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).
  7. Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
  8. Méresse, S., Gorvel, J. P., Chavrier, P. The rab7 GTPase resides on a vesicular compartment connected to lysosomes. J Cell Sci. 112 (21), 3195-3204 (1999).
  9. Caponegro, M. D., Thompson, K. K., Tayyab, M., Tsirka, S. E. A Rigorous Quantitative Approach to Analyzing Phagocytosis Assays. Bio Protoc. 10 (15), e3698(2020).
  10. de Neergaard, T., Sundwall, M., Wrighton, S., Nordenfelt, P. High-Sensitivity Assessment of Phagocytosis by Persistent Association-Based Normalization. J Immunol. 206 (1), 214-224 (2021).
  11. Chu, C. C., et al. High-resolution quantification of discrete phagocytic events by live cell time-lapse high-content microscopy imaging. J Cell Sci. 133 (5), jcs237883(2020).
  12. Park, Y., et al. Imaging Flow Cytometry Protocols for Examining Phagocytosis of Microplastics and Bioparticles by Immune Cells of Aquatic Animals. Front Immunol. 11, 203(2020).
  13. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochem Pharmacol. 116, 107-119 (2016).
  14. Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
  15. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annu Rev Immunol. 31, 443-473 (2013).
  16. Das, S. K., et al. Godanti bhasma (anhydrous CaSO4) induces massive cytoplasmic vacuolation in mammalian cells: A model for phagocytosis assay. Methods. 230, 158-168 (2024).
  17. Huss, M., et al. Proton translocation by V-ATPase: molecular mechanism and target for inhibition by Bafilomycin A1. J Bioenerg Biomembr. 34, 243-250 (2002).
  18. Méndez-Alejandre, A., Raymond, B. B. A., Trost, M., Marín-Rubio, J. L. Bi-functional particles for real-time phagosome acidification and proteolysis multiplex assay in macrophages. Front Immunol. 14, 1204223(2023).
  19. Lancaster, C. E., et al. Phagosome resolution regenerates lysosomes and maintains the degradative capacity in phagocytes. J Cell Biol. 220 (9), e202005072(2021).
  20. Krendel, M., Gauthier, N. C. Building the phagocytic cup on an actin scaffold. Curr Opin Cell Biol. 77, 102112(2022).
  21. Barger, S. R., et al. Membrane-cytoskeletal crosstalk mediated by myosin-I regulates adhesion turnover during phagocytosis. Nat Commun. 10 (1), 1249(2019).
  22. Ghosh, M., et al. Quantitative determination of phagocytosis using pH-sensitive fluorescent bioparticles. J Vis Exp. (125), e56093(2017).
  23. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. J Vis Exp. (120), e54646(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи