Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

РНК-секвенирование раскрывает путь дифференцировки клеток Th17 как механизм радиационно-индуцированного повреждения головного мозга

561 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68322

⸱

20 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Institute of Radiation Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Данное исследование направлено на изучение активации пути дифференцировки клеток Th17 у мышей с радиационно-индуцированным повреждением головного мозга.

Аннотация

Лучевая терапия является распространенным терапевтическим методом при злокачественных новообразованиях головы и шеи; тем не менее, это неизменно приводит к радиационно-индуцированному повреждению нормальной мозговой ткани, кульминацией которого является радиационно-индуцированное повреждение головного мозга (RBI). Несмотря на обширные исследования радиационно-индуцированного нейровоспаления, связь между RBI и путем дифференцировки клеток Th17 остается недостаточно изученной. Мышам C57BL/6 было проведено однократное введение облучения черепа с индукцией 30 Гр для разработки модели RBI. Когнитивные функции оценивались с помощью водного лабиринта Морриса (MWM), теста на открытом поле, теста на распознавание новых объектов и теста Ротарода. Гистопатологические изменения в тканях головного мозга анализировали с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (H&E). Иммунофлуоресцентное окрашивание использовали для оценки активации микроглии (IBA-1) и астроцитов (GFAP). Секвенирование РНК было проведено для идентификации дифференциально экспрессируемых генов, в то время как Simple Western и qPCR были использованы для изучения ключевых сигнальных молекул, участвующих в дифференцировке клеток Th17. Мыши RBI продемонстрировали выраженный когнитивный дефицит, особенно в пространственном обучении и удержании памяти. Гистологическое исследование показало активацию микроглии и астроцитов в коре и гиппокампе облученных мышей. Анализ секвенирования РНК выявил значительное обогащение пути дифференцировки клеток Th17 в коре головного мозга группы RBI. Дальнейшая валидация с помощью анализа Simple Western и количественной ПЦР подтвердила повышение регуляции TGF-β, IL-6, RORγt, IL-17 и P-STAT3 в коре головного мозга мышей RBI. Эти результаты свидетельствуют о том, что путь дифференцировки клеток Th17 играет ключевую роль в патогенезе радиационно-индуцированного повреждения головного мозга. Нейровоспаление, опосредованное клетками Th17, может быть критическим механизмом, лежащим в основе радиационно-индуцированной когнитивной дисфункции.

Введение

Лучевая терапия является важным методом лечения как первичных, так и метастатических опухолей головы и шеи, но радиационно-индуцированное повреждение головного мозга (РБИ) может стать тяжелым осложнением, характеризующимся поражением центральной нервной системы. Частота РБИ варьируется в зависимости от типа опухоли и метода лечения, при этом частота колеблется от 28% до 50% после стереотаксической лучевой терапии при менингиомах1, 1,9%-5% при карциноме носоглотки 2,3, 1%-24% при глиомах низкой степенизлокачественности 4,5 и 8%-20% при метастазах в головной мозг 6,7. RBI классифицируется на острый, раннеотсроченный и поздно отсроченный типы, при этом когнитивная дисфункция, особенно ухудшение памяти, и дефицит обучения заметны в поздней задержке. Радиационно-индуцированная когнитивная дисфункция (RICD), которая затрагивает 50-90% выживших после рака головы и шеи в течение длительного времени, значительно влияет накачество жизни8, однако ее патогенез остается плохо изученным, а эффективные профилактические и терапевтические стратегии отсутствуют.

Нейровоспаление является ключевым патологическим признаком RBI, усугубляя нарушение гематоэнцефалического барьера и препятствуя нейрогенезу в гиппокампе. Клетки Th17, подмножество CD4+ Т-клеток, известных своей продукцией провоспалительного цитокина IL-179, были связаны с различными нейродегенеративными заболеваниями, включая рассеянный склероз и болезнь Паркинсона. Эти клетки при определенных воспалительных состояниях могут пересекать гематоэнцефалический барьер и способствовать нейровоспалению. С момента своего открытия в 2005 году клетки Th17 привлекли внимание своей ролью как в иммунных реакциях против патогенов, так и в их участии в воспалительных заболеваниях, что делает их потенциальной мишенью для изучения механизмов RBI и связанной с ним когнитивной дисфункции.

В этом исследовании использовались только самцы мышей. Исключение женщин было направлено на то, чтобы избежать потенциальных искажающих эффектов, возникающих из-за нейровоспалительных колебаний, связанных с эстральным циклом, поскольку уровни прогестерона могут варьироваться до десяти раз в зависимости от фазыцикла. Кроме того, наша экспериментальная модель была разработана таким образом, чтобы отразить клинический контекст лучевой терапии рака головы и шеи, в которой примерно 72% пациентов составляют мужчины15 лет. В соответствии с этим, в большинстве опубликованных исследований, изучающих механизмы радиационно-индуцированного повреждения головного мозга (RBI), использовались самцы грызунов для установления исходных патологическихпризнаков.

В то время как для изучения RBI использовались различные модели, традиционные методологии, такие как гистопатологическое окрашивание и простой вестерн-блоттинг, сталкиваются с ограничениями с точки зрения чувствительности, пропускной способностии точности. Последние достижения, такие как секвенирование РНК (RNA-Seq) и высокопроизводительная протеомика, позволили получить более надежное представление о молекулярных механизмах, лежащих в основе RBI18. Эти технологии позволяют всесторонне понять изменения экспрессии генов и белковые изменения, предоставляя более точные данные по сравнению спредыдущими методами. Simple Western, в частности, является новым и автоматизированным методом, который сочетает в себе преимущества капиллярного электрофореза с детектированием белка с помощью хемилюминесценции, облегчая высокопроизводительный анализ с минимальным объемом образца и повышенной воспроизводимостью. По сравнению с традиционным вестерн-блоттингом, Simple Western устраняет необходимость в мембранном переносе и предоставляет количественные данные об экспрессии белка, предлагая ряд преимуществ с точки зрения чувствительности и воспроизводимости, особенно при обнаружении белка с низким содержанием21,22.

Практические рекомендации по экстракции и получению РНК имеют решающее значение для успеха высококачественного секвенирования и количественной оценки. Для оптимальной экстракции РНК мы рекомендуем использовать высококачественные наборы для выделения РНК и следить за тем, чтобы концентрация находилась в диапазоне 100-1000 нг/мкл с числом целостности РНК (RIN) выше 7,0, чтобы избежать деградации. При проведении анализа белка с помощью Simple Western важно убедиться, что образцы белка правильно денатурированы и загружены в концентрации примерно 1-5 мкг на капилляр. Для валидации кПЦР используйте высококачественную кДНК, синтезированную не менее чем из 1 мкг РНК, что обеспечивает стабильные условия обратной транскрипции. Распространенных ошибок при получении РНК, таких как загрязнение геномной ДНК или деградация РНК, следует избегать, используя оборудование, не содержащее РНКазы, и своевременно выполняя фазовое разделение для предотвращения деградации РНК.

Используя эти методы, данное исследование направлено на изучение того, активируется ли путь дифференцировки клеток Th17 в мышиных моделях RBI и как он способствует патогенезу радиационно-индуцированной когнитивной дисфункции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Проводимые здесь экспериментальные процедуры проводятся в строгом соответствии с руководящими принципами ARRIVE. Одобрение получено от Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию Пекинского института радиационной медицины (Approval No. AF/SC-08/02; Дата: 25 февраля 2024 г.).

1. Облучение черепа мышей

  1. В исследовании приняли участие в общей сложности 10 мышей-самцов C57BL/6 в возрасте 6-8 недель, распределив пять животных в группу RBI и пять в контрольную группу, где контрольная группа состоит из холостых контрольных мышей, не получавших RBI. Поддерживайте мышей в контролируемых условиях окружающей среды, включая регулируемую температуру, влажность и 12-часовой цикл света/темноты. Акклиматизируйте мышей за 1 неделю до начала эксперимента.
  2. Обезболивание животных с помощью внутрибрюшинной инъекции 1% пентобарбитала натрия в дозе 50 мг/кг массы тела. Подтвердите правильность обезболивания, проверив отсутствие рефлекторной реакции на крепкое ущипывание лапой. Нанесите ветеринарную офтальмологическую мазь на оба глаза сразу после начала анестезии, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
  3. Расположите животных в положении лежа с помощью специального деревянного удерживающего устройства и накройте нецелевые участки тела защитной пластиной из свинца (Pb) толщиной 3 мм (чистота 99,9%) для обеспечения локального облучения.
  4. Коллимировать поле облучения размером 2 x 2см2 с собственной фильтрацией (1,5 мм Al + 0,25 мм Cu). Выровняйте поле по средней линии черепа с помощью встроенного лазерного перекрестия (λ = 635 нм ± точностью 0,5 мм) и проверяйте позиционирование в режиме реального времени с помощью встроенной системы CMOS-камер и ИК-подсветки. Облучают область черепа однократной дозой рентгеновского излучения 30 Гр со скоростью 1,325 Гр/мин с помощью системы X-RAD 320 при следующих параметрах: 320 кВпик/12,5 мА, SSD = 50 см.
  5. Выполняйте еженедельную калибровку дозы с помощью отслеживаемой ионизационной камеры, расположенной в изоцентре. Поддерживайте параметры пучка на уровне 320 кВ (размах)/12,5 мА с помощью фильтрации 3,2 мм Cu HVL для достижения мощности дозы 1,325 Гр/мин (вариация ± 3%). Ежедневно проверяйте однородность луча (> 95% в полевых условиях) с помощью пленки Gafchromic EBT3.
  6. Применяйте мелоксикам (1-2 мг/кг, подкожно) один раз в сутки в течение 3 дней для купирования послеоперационной боли. Поместите животных в предварительно прогретую камеру восстановления и непрерывно наблюдайте до тех пор, пока они не придут в полное сознание и не смогут сохранять лежачее положение на грудине. Не оставляйте животных без присмотра в период восстановления.
  7. Записывайте массу тела всех мышей еженедельно на протяжении всего исследования. Наблюдайте за мышами в общей сложности 4 недели, включая 1 неделю акклиматизации и 3 недели после облучения.

2. Анализ поведения животных

  1. Проводите поведенческие эксперименты через 3 недели после RBI.
  2. Водный лабиринт Морриса
    1. Наполните круглый бассейн (диаметр: 120 см, высота: 50 см) непрозрачной водой (20-22 °C) с помощью сухого молока, чтобы скрыть затопленную платформу. Разместите скрытую платформу (диаметр: 10 см) на 1 см ниже поверхности воды в фиксированном квадранте.
    2. Приучить мышей к испытательному залу не менее чем за 30 минут до начала испытаний. Начните этап обучения, поместив каждую мышь в воду из одной из четырех псевдослучайно выбранных начальных точек (N, S, E, W).
    3. Позвольте мыши плавать в течение 60 секунд, чтобы найти скрытую платформу. Если мышь не может найти платформу в течение 60 секунд, направьте ее к платформе и дайте ей оставаться там в течение 15 секунд.
    4. Проводите четыре испытания в день на каждой мыши с интервалом между испытаниями 15 минут. Тщательно вытирайте каждую мышь теплым полотенцем между попытками, чтобы предотвратить переохлаждение. Продолжайте обучение в течение 5 дней подряд для оценки усвоения знаний.
    5. В день испытания зонда снимите платформу и дайте мыши свободно плавать в течение 60 с. Записывайте такие параметры, как время, проведенное в целевом квадранте, пересечения платформ и траектории плавания.
    6. Отслеживайте и анализируйте все испытания с помощью автоматизированной системы видеослежения, в которой экспериментаторы не могут быть распределены по группам.
  3. Испытание в открытом поле
    1. Акклиматизируйте мышей в испытательном помещении не менее чем за 30 минут до начала эксперимента. Используйте аппарат для открытого поля (50 см x 50 см x 40 см) из непрозрачного пластика. Равномерно освещайте арену (обычно 25-30 люкс), чтобы избежать сильных теней и свести к минимуму стресс.
    2. Очистите арену 70% этанолом перед тестированием каждого животного, чтобы устранить признаки запаха. Аккуратно поместите мышь в центр открытого поля, чтобы начать тест. Позвольте мыши свободно исследовать арену в течение 10 минут.
    3. Записывайте локомоторную активность и положение с помощью автоматизированной системы слежения. Определите центральную зону как внутренние 20%-25% от общей площади. Измерьте время, проведенное в центральной зоне, и общее пройденное расстояние.
    4. После сеанса верните мышь в домашнюю клетку и тщательно очистите аппарат.
  4. Тест на распознавание новых объектов
    1. Акклиматизируйте мышей в испытательном помещении не менее чем за 30 минут до начала эксперимента. Используйте арену для открытого поля (50 см х 50 см х 40 см) с равномерным освещением (20-30 люкс). Тщательно очистите арену с 70% этанолом между животными, чтобы устранить обонятельные сигналы.
    2. Поместите каждую мышь на пустую арену и позвольте ей свободно исследовать ее в течение 10 минут. Не размещайте никаких предметов во время этой фазы.
    3. Через 24 часа поместите два одинаковых объекта (А и А') в противоположных углах арены (не менее 8 см от стен). Аккуратно поместите мышь в центр арены и дайте ей исследовать ее в течение 10 минут.
    4. Записывайте взаимодействие объектов с помощью автоматизированной видеосистемы. Определите исследование объекта как нахождение морды мыши в пределах 2 см от объекта при ориентации на него.
    5. После испытания верните мышь в домашнюю клетку и очистите арену и предметы.
    6. После интервала удержания в 1 час поместите один знакомый предмет (А) и один новый объект (В) в те же места. Верните мышь на арену и дайте ей исследовать ее в течение 5 минут.
    7. Фиксируйте время, затраченное на изучение каждого объекта, используя те же критерии, что и раньше. Рассчитаем индекс распознавания следующим образом:
      Индекс распознавания (%) = [Время на новом объекте / (Время на новом + знакомом объекте)] x 100
  5. Тест Ротарод
    1. Акклиматизируйте мышей в тестовом помещении не менее чем за 30 минут до тестирования. Используйте моторизованный ротародный аппарат с диаметром стержня ~3 см и высотой ~30 см над основанием.
    2. Установите режим вращения на ускоренную скорость (от 4 об/мин до 40 об/мин в течение 5 мин). Очистите поверхность стержня 70% этанолом перед размещением каждой мыши.
    3. Аккуратно поместите мышь в центр вращающегося стержня лицевой стороной вперед. Начните вращение и немедленно начните измерять время.
    4. Записывайте задержку, которая автоматически падает системой. Безопасно поймайте мышь при падении, чтобы избежать травм. Дайте перерыв в отдыхе не менее 15 минут между попытками, чтобы предотвратить усталость.
    5. Проводите 3 последовательных испытания на каждой мыши в день и усредняйте задержку в качестве конечного результата. Убедитесь, что все испытания проводятся слепыми экспериментаторами в стабильных условиях. После тестирования верните мышь в домашнюю клетку и тщательно продезинфицируйте аппарат.

3. Эвтаназия животных и подготовка образцов

  1. Соберите образцы тканей через 5 недель после RBI.
  2. Приготовьте пентобарбитал натрия (100 мг/кг) и стерильный шприц. Введите пентобарбитал натрия внутрибрюшинно. Подождите, когда мышь перестанет дышать и сердцебиение прекратится, подтвердив смерть.
  3. Быстро обезглавьте в затылочном соединении и сагиттально надрежьте черепные швы с помощью тонких ножниц, затем осторожно приподнимайте двусторонние черепные лоскуты с помощью изогнутых щипцов, сохраняя при этом целостность менингеальных оболочек, прежде чем разрывать нейронные связи.
  4. Перенесите интактный мозг в предварительно охлажденную матрицу в течение 60 с для бисекции в середине сагиттала с помощью стерильных бритвенных лезвий. Немедленно зарегистрируйте переднезадние размеры (8,2 ± 0,3 мм), медиолатеральную ширину (4,5 ± 0,2 мм) и массу ткани (112 ± 8 мг) с помощью прецизионного инструментария.
  5. Рассеките корковые ткани и ткани гиппокампа на льду. Мгновенно заморозьте левое полушарие в жидком азоте для секвенирования РНК, количественной ПЦР и Simple Western.
  6. Фиксация правого полушария в 4% параформальдегиде (PFA) для гистологии. Обезвоживайте неподвижный мозг в сортированном этаноле от 70% до 100%, каждый этап длится 30 минут.
  7. Очистить мозги в ксилоле в течение 2 ч. Инфильтрируйте ткани расплавленным парафином при температуре 60°C в течение 4 ч. Поместите очищенные мозги в парафиновые блоки и дайте им застыть при комнатной температуре. Вырезать коронковые срезы толщиной 5 мкм с помощью микротома.

4. Окрашивание гематоксилином и эозином

  1. Депарафинизировать срезы ткани путем погружения предметных стекол в ксилол на 5 мин, 3х. Регидратируйте срезы с помощью сортированного этанола: 100%, 95%, 70% и дистиллированной воды в течение 5 минут каждая.
  2. Окрашивайте срезы гематоксилином в течение 5 минут, в зависимости от желаемой интенсивности окрашивания. Промойте секции в проточной воде из-под крана в течение 5 минут, чтобы удалить излишки гематоксилина.
  3. Дифференцируйте участки в 1% соляной кислоте в этаноле в течение нескольких секунд, чтобы добиться желаемого контраста. Снова промойте в проточной воде из-под крана в течение 5 минут. Окрашивайте срезы Эозином в течение 1 минуты.
  4. Коротко промойте срезы в дистиллированной воде. Обезвоживайте срезы с помощью сортированного этанола: 70%, 95% и 100%, в течение 5 минут каждая.
  5. Очистите срезы в ксилоле в течение 5 минут, 3 раза. Закрепите секции с помощью покровного стекла с помощью монтажного носителя. Получение изображений с помощью никель-низкоуглеродного микроскопа Nikon Eclipse с 20-кратным объективом.

5. Иммунофлюоресценция

  1. Зафиксируйте ткань, погрузив предметные стекла в 4% PFA на 15 минут при комнатной температуре. Промойте предметные стекла в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 5 минут, 3 раза, чтобы удалить излишки PFA.
  2. Проникнуть в ткань путем инкубации предметных стекол с 0,3% Triton X-100 в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре. Блокируйте неспецифическое связывание путем инкубации предметных стекол с 5% нормальной сывороткой в течение 1 ч при комнатной температуре.
  3. Инкубируют с первичными антителами IBA-1 и GFAP, разведенными в блокирующем буфере в соотношении 1:2000, в течение ночи при 4 °С, в зависимости от характеристик антител. Промойте предметные стекла в PBS в течение 5 минут, 3 раза, чтобы удалить несвязанные первичные антитела.
  4. Инкубировать с вторичным антителом Goat Anti-Rabbit IgG, конъюгированным с Alexa Fluor 488, разведенным в соотношении 1:1000 в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. Промойте предметные стекла в PBS в течение 5 минут, 3 раза, чтобы удалить избыток вторичных антител.
  5. Установите слайды с помощью монтажной среды, препятствующей выцветанию, содержащей DAPI. Заклейте покровное стекло прозрачным лаком для ногтей.
  6. Получение флуоресцентных изображений с помощью конфокального микроскопа с 20-кратным объективом.
  7. Количественно оцените интенсивность флуоресценции с помощью ImageJ. Выполните количественный анализ с помощью инструмента ImageJ «Анализ частиц» с пороговыми значениями размера 50-200мкм2 (микроглия) и 100-500мкм2 (астроциты). Вычтите фон с помощью алгоритма Rolling Ball (радиус = 50 пикселей).

6. Анализ количественной ПЦР

  1. Извлеките общую РНК из ткани с помощью набора для экстракции РНК. Следуйте протоколу производителя по гомогенизации, лизису и очистке РНК.
  2. Количественно оцените выделенную РНК с помощью спектрофотометра для измерения концентрации и оценки чистоты (соотношение A260/A280). Убедитесь, что концентрация РНК достаточна для синтеза кДНК (100-500 нг/мкл).
  3. Оцените качество РНК с помощью биоанализатора. Убедитесь, что РНК не демонстрирует деградации (резкие полосы для 18S и 28S рРНК) и имеет число целостности РНК (RIN) выше 7.
  4. Приготовьте реакционную смесь объемом 20 мкл с 1 мкг РНК, буфером для обратной транскрипции, олиго-dT, dNTP, ингибитором РНКазы и обратной транскриптазой.
  5. Инкубировать при 42 °C в течение 60 мин для синтеза кДНК. Нагреть до 85 °C в течение 5 минут для инактивации обратной транскриптазы.
  6. Объедините кДНК, мастер-смесь, прямой праймер, обратный праймер (Таблица 1) и воду, не содержащую нуклеаз, в 96-луночном ПЦР-планшете. Используйте 2 мкл кДНК на 20 мкл реакции и обеспечьте конечную концентрацию праймера 200 нМ. Заклейте пластину оптической клеевой пленкой, чтобы предотвратить испарение.
ГенПоследовательность праймеров (5'-3', вперед/назад)
ТГФ-β1CCACCTGCAAGACCATCGAC
CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC
ТГФ-β3GGACTTCGGCCACATCAAGAA
TAGGGGACGTGGGTCATCAC
Ил-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
RORγtTCCACTACGGGGTTATCACCT
AGTAGGCCACATTACACTGCT
Ил-17АTCAGCGTGTCCAAACACTGAG
CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT
Ил-17ФTGCTACTGTTGATGTTGGGAC
CAGAAATGCCCTGGTTTTGGT
ГАПДХAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GGGGTCGTTGATGGCAACA

Таблица 1: праймеры для кПЦР секвенирования.

  1. Поместите реакционную пластину в прибор для ПЦР в реальном времени и запрограммируйте термоамплификатор. Используйте следующие условия цикла: начальная денатурация при 95 °C в течение 3 минут, затем 40 циклов при 95 °C в течение 15 с и 60 °C в течение 30 с.
  2. Нормализовать экспрессию генов-мишеней к GAPDH. Вычислите уровни относительной экспрессии с помощью метода ΔΔCt и представьте данные в виде кратных изменений по сравнению с контрольной группой.

7. Анализ секвенирования РНК

  1. Обезболите и усыпьте мышь в соответствии с протоколами ухода за животными в учреждении. Немедленно провести перфузию холодным ПБС для удаления циркулирующей крови.
  2. Препарируйте мозг на льду. Изолируйте кору головного мозга с помощью стерильных инструментов для вскрытия. Сведите к минимуму время диссекции, чтобы сохранить целостность РНК.
  3. Мгновенно заморозьте корковую ткань в жидком азоте. Хранить при температуре -80 °C, если экстракция РНК не проводится немедленно.
  4. Гомогенизируйте замороженную кору головного мозга (30-50 мг) в 1 мл реагента для экстракции РНК с помощью моторизованного гомогенизатора до тех пор, пока не останутся видимые фрагменты.
  5. Выполнить разделение хлороформных фаз. Добавьте 200 μL хлороформа, энергично встряхните в течение 15 секунд, инкубируйте в течение 2-3 минут при комнатной температуре, затем центрифугируйте при 12 000 x g в течение 15 минут при 4 °C.
  6. Перенесите верхний слой в новую пробирку, добавьте равный объем 70% этанола и приступайте к очистке РНК с помощью набора на основе кремнеземных колонок.
  7. Используйте расщепление ДНКазы на колонке для удаления геномной ДНК во время очистки РНК. Соберите общую РНК в 30-50 мкл и держите на льду для немедленного использования.
  8. Используйте спектрофотометр для количественной оценки концентрации и чистоты РНК. Подтвердите соотношение A260/A280 ~2.0. Проанализируйте 1 мкл РНК на биоанализаторе. Убедитесь, что RIN больше 8,0 для секвенирования.
  9. Используйте протокол выбора poly(A) и набор для подготовки многозадачной библиотеки. Следуйте протоколу производителя для генерации библиотек 300-400 bp. Очистите библиотеки с помощью коммерческого набора.
  10. Используйте биоанализатор для подтверждения размера фрагмента и количественной оценки с помощью пула библиотек в равновесном отношении. Выполните парное секвенирование (2x, 150.о.) с помощью платформы Illumina.
  11. Обрезайте адаптеры с помощью Trim Galore, оценивайте качество с помощью FastQC, выравнивайте чтения с геномом мыши (GRCm39) с помощью STAR и количественно оценивайте экспрессию генов с помощью featureCounts. Идентификация дифференциально экспрессируемых генов с помощью DESeq2.
  12. Используйте выходные данные DESeq2 и отфильтруйте значительно дифференциально экспрессируемые гены DEG (скорректированное p-значение < 0,05 и |log2FC| > 1). Выполните анализ обогащения путей GO и KEGG с помощью Phyper на основе гипергеометрического теста. Определите пути с скорректированным значением P ≤ 0,05 как статистически значимые.

8. Простой западный анализ

  1. Гомогенизируйте кору головного мозга мыши в буфере RIPA с ингибиторами протеазы и фосфатазы, затем центрифугируйте при 12 000 x g в течение 10 минут при 4 °C для удаления мусора. Определите концентрацию белка с помощью анализа BCA.
  2. Денатурируйте образцы белка, смешав их с буфером для образца и инкубируя при температуре 95°C в течение 5 минут для обеспечения полной денатурации.
  3. Загрузите 3 мкл образцов денатурированного белка в капилляры Simple Western. Убедитесь, что образцы загружены правильно, чтобы предотвратить переполнение. Поместите капилляры в инструмент Simple Western.
  4. Инкубируйте разделенные белки с разведенными первичными антителами в соотношении 1:50, включая p-STAT3, STAT3, RORγt, TGF-β, IL-6 и IL-17, в течение 30 минут.
  5. Промойте капиллярную систему промывочным буфером в течение трех промывок по 5 мин каждое, чтобы удалить несвязанные первичные антитела. Добавьте конъюгированное с HRP вторичное антитело, разведенное в блокирующем буфере, и инкубируйте в течение 30 минут.
  6. Выполните 3 промывки по 5 минут каждая с промывочным буфером для удаления избытка вторичных антител. Запустите программу детектирования в системе Simple Western для автоматического обнаружения белков с помощью хемилюминесценции.
  7. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения Compass for Simple Western. Количественно оцените экспрессию белка путем сравнения относительных пиковых площадей на электроферограмме. Нормализуйте данные по белку GAPDH.

9. Статистический анализ

  1. Откройте GraphPad Prism 9.0.0. программное обеспечение. Нажмите « Файл» > «Импортировать данные » для загрузки данных. Представьте данные в виде средних ± SD. Используйте непарный t-критерий для сравнения между двумя группами.
  2. Оцените норму с помощью теста Шапиро-Уилка. Если норма нарушена (p < 0,05), примените U-критерий Манна-Уитни для межгрупповых сравнений. Если норма удовлетворительна (p ≥ 0,05), проведите независимый выборочный t-критерий для оценки различий в группах.
  3. Отчет о результатах с p-значениями. Рассмотрим p < 0,05 как статистически значимый. Используйте следующие обозначения: n.s. для незначимых, * для p < 0,05, ** для p < 0,005, *** для p < 0,0005 и **** для p < 0,0001.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Когнитивные нарушения у мышей с RBI
После облучения всего мозга мощностью 30 Гр масса тела мышей контролировалась на еженедельной основе. Когнитивные функции оценивали в течение4-й недели (рис. 1А). Первоначальные измерения показали, что масса тела контрольной группы и группы RBI была схожей. Тем не менее, между 1 и 3 неделями после облучения группа RBI продемонстрировала значительное снижение массы тела (ри...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критические шаги в рамках протокола
Этот протокол включает в себя индукцию RBI у мышей с последующей всесторонней оценкой нейровоспаления и пути дифференцировки клеток Th17 (рис. 6). Критическим этапом является облучение черепа мышей C57BL/6 дозой 30 Гр, что является хорошо зарекомендовавшей себя моделью для RBI1. Точная калибровка дозы с использованием ионизационных камер обеспечивает воспроизводимость

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Поддержку этой работе оказал Пекинский институт радиационной медицины

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Модуль разделения 12-230 кДа, 8 x 25 капиллярных картриджейProteinSimpleSM-W004для антитела SimpleWestern
против GAPDHProteintechHRP-600041:500 разведения/антитела для SimpleWestern
антитела против GFAPAbcamab72601:2000 разведения/антитела для иммунофлуоресценции
анти-IBA-1 антителаAbcamab1788461:2000 разведение/антитело для иммунофлуоресцентного
анти-IL-17 A/F антителоThermoMA5-237481:10 разведение/антитело для SimpleWestern
анти-IL-1&бета; антителоCST122421:50 разведение/антитело для SimpleWestern
анти-IL-6 антителоThermoMA5-238001:5 разведение/антитело для модуля
обнаружения SimpleWestern против мышейProteinSimpleDM-002вторичное антитело для SimpleWestern
anti-P-STAT3(Try705) антителоThermoMA5-151931:2 разведение/антитело для SimpleWestern
Anti-rabbit Модуль обнаружениябелкаSimpleDM-001вторичное антитело для SimpleWestern
anti-RORγ t антителоThermo14-6988-821:5 разведение/антитело для SimpleWestern
анти-STAT3 антителоThermo7100771:20 разведение/антитело для SimpleWestern
anti-TGF β-1,2,3 антителоThermoMA5-237951:10 разведение/антитело для SimpleWestern
анализ BACThermoA55860анализ белка
EZ Standard Pack 1 12-230 кДаProteinSimplePS-ST01EZ-8для SimpleWestern
Goat Anti-rabbit IgG H& LAbcamab1500771:1000 разведение/антитело для иммунофлуоресценции
RNeasy KitQiagen74134Экстракция РНК
SuperScript IV Система синтеза первой нитиThermo Fisher Scientific18091050обратной транскрипции
SYBR Green Master MixTakara Bio RR820AРеагент тризола Q-PCR
Инвитроген15596026РНК экстракция

Ссылки

  1. Milano, M. T., et al. Radiation-induced edema after single-fraction or multifraction stereotactic radiosurgery formeningioma: a critical review. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 101 (2), 344-357 (2018).
  2. Tian, Y., et al. Radiation encephalopathy in nasopharyngeal carcinoma patients in mainland China: a systematic evaluation. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 24 (5), 471-473 (2002).
  3. Na, A., et al. Cerebral radiation necrosis. Asia Pac J Clin Oncol. 10 (1), 11-21 (2014).
  4. Deangelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344 (2), 114-123 (2001).
  5. Kumar, A. J., et al. Malignant gliomas: MR imaging spectrum of radiation therapy-and chemotherapy-induced necrosis of the brain after treatment. Radiology. 217 (2), 377-384 (2000).
  6. Minniti, G., et al. Single-fraction versus multifraction (3 x 9 Gy) stereotactic radiosurgery for large (>2 cm) brain metastases: acomparative analysis of local control and risk of radiation-induced brain necrosis. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 95 (4), 1142-1148 (2016).
  7. Minniti, G., et al. Repeated stereotactic radiosurgery for patients with progressive brain metastases. J Neurooncol. 126 (1), 91-97 (2016).
  8. Turnquist, C., Harris, B. T., Harris, C. C. Radiation-induced brain injury: current concepts and therapeutic strategies targeting neuroinflammation. Neurooncol Adv. 2 (1), vdaa057(2020).
  9. Raphael, I., et al. T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases. Cytokine. 74 (1), 5-17 (2015).
  10. Moser, T., et al. The role of TH17 cells in multiple sclerosis: Therapeutic implications. Autoimmun Rev. 19 (10), 102647(2020).
  11. MacMahon, C. A., et al. The Pathogenesis of Parkinson's Disease: A Complex Interplay Between Astrocytes, Microglia, and T Lymphocytes. Front Neurol. 12, 666737(2021).
  12. Kebir, H., et al. Human TH17 lymphocytes promote blood-brain barrier disruption and central nervous system inflammation. Nat Med. 13 (10), 1173-1175 (2007).
  13. Omenetti, S., et al. The Intestine Harbors Functionally Distinct Homeostatic Tissue-Resident and Inflammatory Th17 Cells. Immunity. 51 (1), 77-89.e6 (2019).
  14. Mangold, C. A., et al. Sexually divergent induction of microglial-associated neuroinflammation with hippocampal aging. J Neuroinflammation. 14 (1), 141(2017).
  15. SEER Cancer Stat Facts: Head and Neck Cancer. , National Cancer Institute. https://seer.cancer.gov/statfacts/html/headneck.html (2025).
  16. Holmes-Hampton, G. P., et al. Time- and sex-dependent delayed effects of acute radiation exposure manifest via miRNA dysregulation. iScience. 27 (2), 108867(2024).
  17. Kempf, S. J., et al. The cognitive defects of neonatally irradiated mice are accompanied by changed synaptic plasticity, adult neurogenesis and neuroinflammation. Mol Neurodegener. 9, 57(2014).
  18. Zhao, J., et al. RNA-seq reveals Nup62 as a potential regulator for cell division after traumatic brain injury in mice hippocampus. PeerJ. 11, e14913(2023).
  19. Zhang, P., et al. Quantitative proteomics analysis to identify diffuse axonal injury biomarkers in rats using iTRAQ coupled LC-MS/MS. J Proteomics. 133, 93-99 (2016).
  20. Sormunen, A., et al. Comparison of Automated and Traditional Western Blotting Methods. Methods Protoc. 6 (2), 43(2023).
  21. Mishra, M., et al. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Rev Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  22. Edouard, S., et al. Automated Western immunoblotting detection of anti-SARS-CoV-2 serum antibodies. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 40 (6), 1309-1317 (2021).
  23. Galland, F., et al. Astrocyte culture models: Molecular and function characterization of primary culture, immortalized astrocytes and C6 glioma cells. Neurochem Int. 131, 104538(2019).
  24. Wu, B., et al. The TGF-β superfamily cytokine Activin-A is induced during autoimmune neuroinflammation and drives pathogenic Th17 cell differentiation. Immunity. 54 (2), 308-323.e6 (2021).
  25. Korn, T., et al. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  26. Kumar, R., et al. RORγt protein modifications and IL-17-mediated inflammation. Trends Immunol. 42 (11), 1037-1050 (2021).
  27. Qin, Z., et al. TCR signaling induces STAT3 phosphorylation to promote TH17 cell differentiation. J Exp Med. 221 (3), e20230683(2024).
  28. Lampert, P. W., et al. Delayed effect of radiation on the human central nervous system, 'early' and 'late' delayed reactions. Neurology. 14, 912-917 (1964).
  29. Martin, A., et al. Neurological imaging of brain damages after radiotherapy and/or chemotherapy. J Neuroradiol. 41 (1), 52-70 (2014).
  30. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology. 17, 13(2016).
  31. Allen, B. D., et al. Mitigation of helium irradiation-induced brain injury by microglia depletion. J Neuroinflammation. 17 (1), 159(2020).
  32. Singh, R. P., et al. Th17 cells in inflammation and autoimmunity. Autoimmun Rev. 13 (12), 1174-1181 (2014).
  33. Monje, M. L., Toda, H., Palmer, T. D. Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis. Science. 302 (5651), 1760-1765 (2003).
  34. Pazzaglia, S., et al. Neurocognitive Decline Following Radiotherapy: Mechanisms and Therapeutic Implications. Cancers. 12 (1), 146(2020).
  35. Zhang, X., et al. DNA methylation changes and their role in radiation-induced brain injury,". Neurobiol Dis. 129, 96-104 (2019).
  36. Lee, H. J., et al. Profiling of gene expression in the brain associated with anxiety-related behaviors in the chronic phase following cranial irradiation. Sci Rep. 12 (1), 13162(2022).
  37. Cañada-García, D., Arévalo, J. C. A Simple, Reproducible Procedure for Chemiluminescent Western Blot Quantification. Bio Protoc. 13 (9), e4667(2023).
  38. Raber, J., et al. Radiation-induced cognitive impairments are associated with changes in indicators of hippocampal neurogenesis. Radiat Res. 162 (1), 39-47 (2004).
  39. Zhang, J., et al. Th17 cell-mediated neuroinflammation is involved in neurodegeneration of aβ1-42-induced Alzheimer's disease model rats. PLoS One. 8 (10), e75786(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Simple Western
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.