В этом протоколе изложены оптимизированные методы анализа дегенерации и сохранения фоторецепторов в мышиной модели пигментного ретинита, включая интравитреальное введение лекарств, криостатное секционирование и иммунофлуоресценцию. Метод обеспечивает целостность сетчатки и дает количественные данные об эффективности терапевтических вмешательств.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ дегенерации и сохранения фоторецепторов на мышиной модели пигментного ретинита
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ретинопатии поражают сотни миллионов людей во всем мире и являются существенной причиной ухудшения зрения и слепоты. Среди этих заболеваний пигментный ретинит (РП) является наследственным заболеванием глаз, характеризующимся прогрессирующей дегенерацией сетчатки, поражающим примерно от 1,5 до 2 миллионов человек во всем мире. Исследования на животных моделях наследственных дистрофий сетчатки составляют важную основу для исследований патофизиологических механизмов заболевания, эффективности и безопасности лечения. Интравитреальные инъекции мышам и криостатные секции широко используются для изучения эффектов лекарств в моделях РП, поскольку они позволяют точно доставлять вещества в стекловидное тело и получать высококачественные гистологические образцы для детального анализа изменений сетчатки. Кроме того, подсчет клеток с помощью иммунофлуоресценции с использованием антител против реверина, кальций-зависимого белка, экспрессируемого в фоторецепторах сетчатки, недавно был использован для изучения клеточных изменений, связанных с дегенерацией сетчатки в моделях RP, поскольку этот подход облегчает оценку потери фоторецепторов и потенциальную клеточную сохранность после терапевтических вмешательств. Интравитреальная инъекция была оптимизирована для обеспечения целостности глаза и надежных результатов с использованием тонкой иглы для введения раствора в камеру стекловидного тела. По прошествии заданного периода для оценки эффектов препарата выполняется гистологическая обработка, при которой образцы срезаются на толщину 10 мкм с помощью криостата, после чего проводится иммунофлуоресцентное мечение антителами к реверину. Наконец, проводится подсчет клеток, чтобы оценить, оказало ли лечение лекарственными препаратами защитный эффект, о чем свидетельствует сохранность фоторецепторов. Несмотря на то, что эти методы широко применяются для получения согласованных данных в исследованиях ретинопатии, проблемы с достижением точной обработки тканей и качества обработки сохраняются. Этот протокол обеспечивает стандартизированный подход к оптимизации каждого этапа, от интравитреального введения до подготовки гистологических срезов, обеспечивая воспроизводимые и высококачественные результаты.
Введение
Зрение является одним из самых сложных чувств сенсорной системы, необходимым для улавливания визуальных стимулов окружающей среды и преобразования их в электрохимические сигналы, которые обрабатываются в мозге для формирования изображений. Различные биологические факторы, такие как старение, генетические дефекты и болезни, могут ухудшить зрение, значительно влияя на качество жизни и повседневную деятельность.
Человеческий глаз состоит из трех основных камер. Внешний слой, образованный роговицей и склерой, обеспечивает структурную поддержку глазного яблока. Промежуточный слой включает в себя радужную оболочку, цилиарное тело и сосудистую оболочку, причем последняя отвечает за снабжение кровью фоторецепторов. Наконец, внутренний слой содержит сетчатку, структуру, отвечающую за обработку световых стимулов и преобразование света в электрические сигналы, посылаемые в мозгдля формирования изображения.
Нервная сетчатка состоит из нескольких клеточных слоев, включая специализированные клетки, такие как фоторецепторы, биполярные клетки, горизонтальные клетки, амакриновые клетки и ганглиозные клетки. Кроме того, сетчатка содержит глиальные клетки, такие как микроглия, астроциты и клетки Мюллера, а также пигментные эпителиальные клетки. Последний, расположенный в ненервной части сетчатки, играет решающую роль в поддержании структурной целостности, защите и поддержке фоторецепторов 3,4. В нервной части находятся сенсорные и нейронные клетки, непосредственно участвующие в улавливании и обработке света 5,6,7.
Будучи важной для зрения, сетчатка часто страдает от патологий, которые могут привести к слепоте. Среди этих состояний пигментный ретинит (РП) выделяется как одна из основных наследственных ретинопатий, с более чем 80 генами, ассоциированными с его этиологией 8,9. РП является гетерогенным заболеванием, преимущественно наследуемым аутосомно-доминантным или рецессивным образом, но оно также может протекать как сцепленное с Х-хромосомой или обусловленное спонтаннымимутациями.
При глобальной распространенности, оцениваемой от 1 на 3000 до 1 на 7000 человек, в зависимости от популяции и географического региона11,12, РП обычно проявляется в подростковом или раннем взрослом возрасте, с начальными симптомами, такими как снижение ночного зрения и потеря периферического поля зрения. По мере прогрессирования заболевания центральное зрение нарушается, что потенциально может привести к полной слепоте 9,13.
Несмотря на то, что лекарства от РП пока не существует, различные методы лечения, находящиеся в разработке, показали потенциал для замедления или обращения вспять прогрессирования заболевания. Среди этих подходов — генетическая, клеточная и фармакологическая терапия, а также электронные устройства. Для углубления понимания РП и оценки новых вмешательств широко используются мышиные модели дегенерации сетчатки. Эти модели, часто называемые rd (дегенерация сетчатки), являются ценными инструментами для изучения молекулярной основы и терапии РП. Среди различных моделей, использованных при изучении пигментного ретинита, у мышиной линии Pde6βrd10/rd10 (rd10) наблюдается миссенс-мутация в гене, кодирующем палочкоспецифичную β субъединицу фосфодиэстеразы14, демонстрируя медленную дегенерацию фоторецепторов, аналогичную той, которая происходит у человека15.
Интравитреальное введение лекарств широко использовалось в различных исследованиях 16,17,18. Этот протокол подходит для исследователей, изучающих влияние лекарств на сетчатку, особенно в отношении выживаемости фоторецепторных клеток. Таким образом, основной целью данного протокола является оптимизация доставки лекарственного препарата путем интравитреального введения в мышиной модели пигментного ретинита (РП) и оценка выживаемости фоторецепторов с использованием иммунофлуоресценции для восстановления, фоторецепторного клеточного маркера. Интравитреальная инъекция позволяет локализовать введение лекарственных средств, сводя к минимуму системные побочные эффекты, повышая биодоступность сетчатки и уменьшая побочные эффекты в других органах. С другой стороны, иммунофлюоресценция для рекаверина позволяет проводить специфический анализ выживаемости фоторецепторов, обеспечивая эффективный инструмент для оценки эффективности этой терапевтической стратегии. Однако их применимость зависит от таких факторов, как выбор модели на животных, точность инъекции и продолжительность лечения, которые следует учитывать при адаптации этого метода к другим экспериментальным условиям.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Проект и все протоколы, проводимые в его рамках, соответствуют руководящим принципам по уходу за животными Национального совета по контролю за экспериментами на животных и были одобрены Комитетом по этике использования животных (CEUA - UFF) под номером 1464280219.
1. Животные
- Используйте мышиный штамм rd10, который подвергается дегенерации фоторецепторов, и штамм C57 Black/6 (фон rd10). Поддерживайте эти штаммы в течение 12 ч/12 ч цикла свет-темнота, с ограниченным доступом к воде и пище.
2. Анестезия
- Выполняют внутрибрюшинную инъекцию с анестетиком, приготовленным в дозе 80 мг/кг кетамина и 8 мг/кг ксилазина, разведенного в дистиллированной воде. Кетамин действует как ингибитор рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA), обеспечивая обезболивающий эффект, в то время как ксилазин функционирует как обезболивающее седативное средство.
- Для внутрибрюшинной инъекции рассчитайте объем для инъекции как 10 мкл х вес (г).
- Ограничьте мышь, чтобы обеспечить свободный доступ к животу. Очистите 70% спиртом нижний правый квадрант брюшной полости, куда следует ввести иглу скосом вверх.
- Чтобы подтвердить отсутствие болевого рефлекса, аккуратно ущипните животное за хвост или лапу. Если реакции нет, это говорит о том, что животное должным образом обезболито.
3. Интравитреальное введение
- Под наркозом животным обнажить глаза и с помощью бинокулярного стереоскопического микроскопа с увеличением 10x определить область лимба, серую полосу между роговицей и склерой, где будет производиться инъекция.
- Для выполнения инъекции необходима помощь другого человека. Под бинокулярным стереоскопическим микроскопом один человек должен держать животное и вводить иглу, в то время как помощник нажимает на поршень шприца, чтобы ввести вещество в глаз.
- Во-первых, с помощью ультратонкого шприца с неподвижной иглой (31 г х 6 мм) сделайте прокол в области лимба, стараясь не вводить иглу слишком глубоко; Достаточно вставить только половину фаски.
- Затем вставьте портативный предварительно стерилизованный микрошприц (манометр 26 S без скоса), содержащий 1 мкл интересующей жидкости/лекарственного средства, в прокол, сделанный инсулиновым шприцем.
- Попросите помощника медленно нажимать на поршень шприца, следя за тем, чтобы весь объем был введен в течение примерно 30 с.
- Повторите процесс для другого глаза того же животного и запишите время.
- Если экспериментальной группы несколько, отметьте ухо животного, чтобы обеспечить надлежащую идентификацию каждой группы.
- Используйте по 1 капле 0,01 М раствора PBS в каждый глаз животного для предотвращения высыхания.
- После этих процедур уложите животных на грелку, с температурой, установленной на 37 °С, до тех пор, пока они не проснутся. Это может занять 1-2 часа. Постоянно наблюдайте за животными под наркозом, а когда проснутся, верните их в клетки до момента анализа.
- Проведите начальное обучение с использованием видимого красителя, такого как трипановый синий, чтобы помочь операторам отточить технику интравитреальной инъекции мышам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Краситель облегчает визуализацию траектории иглы, позволяя точно регулировать глубину и угол инъекции, снижая риск повреждения структуры глаза и повышая безопасность процедуры.
4. Эвтаназия и подготовка глаз
- После определенной продолжительности лечения после инъекции усыпьте животных путем ингаляции 5% передозировки изофлурана. Продолжайте воздействие в течение как минимум 1 минуты после прекращения дыхания. Чтобы обеспечить смертельный исход, удерживайте животное за заднюю часть шеи и применяйте сильное сцепление с хвостом до тех пор, пока не будет достигнут вывих шейного отдела.
- Перед удалением глаз отметьте височный полюс. Осторожно нанесите маркер или горячую иглу/булавку на височную область склеры, убедившись, что маркировка видна и точна. Этот шаг послужит ориентиром для ориентации в процессе секционирования.
- Затем обнажите глаза и с помощью стерильного скальпеля и ножниц для иридэктомии разрежьте окружающие ткани, чтобы отделить соединительную и мышечную ткани и обнажить глазное яблоко. У мышей тщательно рассекайте глазные мышцы, так как это может быть непросто. Чтобы облегчить процедуру, сделайте боковой разрез стерильным скальпелем в обоих уголках кожи глаза.
- С помощью изогнутых щипцов со средним кончиком аккуратно извлеките глаза из глазницы, удерживая их за зрительный нерв, и немедленно зафиксируйте ткань на 5 минут в 4% растворе параформальдегида (PFA) при комнатной температуре (RT).
- После фиксации в растворе PFA перенесите глаза на стеклянную пластину, используя изогнутые щипцы со средним наконечником. Эта пластина функционирует как платформа для препарирования и гарантирует, что она содержит фосфатный буфер в концентрации 0,1 М pH 7,4.
- Далее поместите пластину под бинокулярный стереоскопический микроскоп с увеличением 10x, и сделайте небольшой разрез чуть выше лимба (границы роговицы) с помощью скальпеля. Затем выполните круговой разрез вслед за лимбом ножницами для микроиридэктомии, чтобы отделить роговицу.
- Удалите роговицу вместе с радужной оболочкой и хрусталиком с помощью щипцов Dumont #5. Наконец, снова зафиксируйте глаза в растворе 4% PFA на 55 минут. После этого трижды промыть глаза фосфатным буфером 0,1 М, pH 7,4.
5. Криоконсервация и заморозка
ПРИМЕЧАНИЕ: Криостатное сечение ткани сетчатки проводили, как описано ранее, с некоторыми корректировками19.
- Криоконсервируйте глаза градиентом сахарозы 10%, 20% и 30%, разведенными в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,4. Погружайте глаза последовательно в растворы сахарозы, начиная с самой низкой концентрации (10%) и постепенно увеличивая до самой высокой (30%). Каждый этап длится в течение необходимого времени, пока глаза не осядут на дне контейнера, указывая на то, что можно использовать следующую концентрацию. В окончательной концентрации хранить глаза при температуре 4 °C в течение примерно 12 часов.
- На следующий день удалите излишки 30% сахарозы и поместите глазки в круглый алюминиевый контейнер диаметром 2 см, расположенный в соответствии с экспериментальными группами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовьте контейнер из алюминиевой фольги соответствующего размера в соответствии с количеством экспериментальных групп. - Под бинокулярным стереоскопическим микроскопом с увеличением 10x удалите излишки сахарозы изнутри и вокруг глазного яблока с помощью пипетки или фильтровальной бумаги, соблюдая необходимую осторожность, чтобы не повредить структуру тканей.
- Поместите глаза в среду с оптимальной температурой резки (OCT), стараясь избежать образования пузырьков внутри или вокруг глаз, и оставьте их на 1 час при RT.
- Через 1 ч в ОКТ расположите глаза так, чтобы ранее отмеченная точка отсчета была обращена вверх. Поместите контейнер из алюминиевой фольги на подходящую алюминиевую пластину в небольшую коробку из пенополистирола для заморозки.
- Осторожно налейте жидкий азот на алюминиевую пластину, вокруг емкости из фольги. Следите за тем, чтобы азот равномерно распределялся по поверхности. Это способствует равномерному замораживанию тканей. Следите за тем, чтобы жидкий азот не попадал в глаза внутри контейнера с фольгой. Затем приступайте к разделению глаз с помощью криостата.
6. Подготовка предметного стекла
- Распределите поли-L-лизин (200 мкг/мл) на предметные стекла с матовыми краями.
- Подождите 12 часов, чтобы слайды высохли и были готовы к использованию.
7. Секционирование криостата
- На криостате поместите замороженный блок на платформу.
- Поверните маховик, чтобы получилась секция толщиной 10 мкм.
- Отрегулируйте положение блока так, чтобы все глаза одинаково присутствовали в разрезе.
- Продолжайте резать до тех пор, пока зрительный нерв не будет идентифицирован, с помощью светлопольного микроскопа.
- Соберите срезы на предварительно обработанных поли-L-лизином предметных стеклах.
- Храните предметные стекла при температуре -20 °C до анализа.
8. Иммунофлюоресценция
Примечание: Иммунофлюоресценцию проводили, как описано ранее, с некоторыми корректировками19,20.
- Полученные из среза стекла инкубировать в криостате со 100 мкл 0,5% Triton X-100 в 0,01 М PBS в течение 15 мин при РТ для проникновения в плазматическую мембрану клетки.
- Дважды промойте предметные стекла с 0,01 M PBS в течение 5 минут каждый при RT, чтобы удалить излишки Triton X-100.
- Инкубировать со 100 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в дозе 0,01 М PBS в течение 30 мин при ЛТ для блокирования сайтов связывания неспецифических антител.
- После блокировки инкубируйте срезы со 100 мкл антирекаверина в концентрации 1:1500, разведенного в BSA 1% для мечения фоторецепторных клеток, в течение ночи при 4 °C (холодильник).
- На следующий день инкубируют срезы со 100 мкл антикроличьего поликлонального вторичного антитела 488 или антикроличьего поликлонального вторичного антитела 568 1:500, разведенного в BSA 1% в течение 2 ч в режиме ЛТ.
- Дважды вымойте предметные стекла с помощью 0,01 M PBS в течение 5 минут каждый на RT.
- Инкубируйте срезы со 100 мкл DAPI 1 мг/мл (4',6-диамидино-2-фенилиндол) в течение 2-3 мин в режиме РТ.
- Промойте предметное стекло один раз 0,01 M PBS в течение 5 минут при RT.
- Наконец, срезы обрабатывают монтажной средой, содержащей 2,5 г n-пропилгаллата в 40 мл глицерина в 0,1 М фосфатном буфере pH 7,4. Они будут действовать как реагент против выцветания и монтажная среда, сохраняя образцы. Поместите покровное стекло (24 мм 50 мм) поверх слайдов, затем заклейте секции лаком для ногтей. После этого приступают к рассмотрению образцов под микроскопом.
9. Фотомикроскоп флуоресцентного микроскопа
- Для получения изображений меченых клеток с помощью иммуногистохимического метода используют флуоресцентный оптический микроскоп, оснащенный фильтрами синего, зеленого и красного цветов. Дополнительно прикрепите фотоаппарат для слайд-фотосъемки. Для получения микрофотографий используется компьютер с программным обеспечением LAS V3.7 (Leica) (программное обеспечение для визуализации), который должен быть открыт для одновременной визуализации с помощью микроскопа.
- Поместите предметное стекло на предметное стекло микроскопа. Первоначально используйте объектив с наименьшим увеличением и синий фильтр.
- Регулируйте фокус с помощью ручек грубой и тонкой фокусировки до тех пор, пока сетчатка с помеченными синим цветом клетками (ядра клеток) не станет четко визуализированной.
- Выберите нужный участок сетчатки для визуализации. Постепенно увеличивайте увеличение объектива до 40x, регулируя фокус по мере необходимости.
- После регулировки фокусировки потяните за байпасный штифт, чтобы передать изображение микроскопа в программное обеспечение для обработки изображений. Выберите нужные фильтры (A4 (синий), L5 (зеленый) и TX2 (красный)). Отрегулируйте следующие параметры: экспозиция, усиление и гамма, чтобы изображение было четким и максимально приближенным к тому, что наблюдается под микроскопом.
- При увеличении 400× захватить четыре поля площадью 113 × 113 мкм, следуя ориентации от периферии к центру сетчатки. Убедитесь, что два из этих полей представляют периферическую область, а два — центральную область сетчатки.
- Для получения микрофотографий периферийного поля необходимо получать изображения на расстоянии примерно 50 мкм от краев глаза. Для микрофотографий центрального поля выберите соседние области, расположенные на расстоянии 50 мкм от зрительного нерва, и получите изображения. Используйте как правый, так и левый глаз для количественной оценки, в результате чего на одну обработку будет проанализировано восемь полей.
- После того, как вы сделаете все микрофотоснимки, приступайте к ручному количественному определению иммунометеных клеток.
10. Количественное определение клеток
- Откройте программу ImageJ v.1.54g. В программе нажмите « Файл», затем «Открыть» и выберите изображение, сохраненное на компьютере.
- Когда изображение уже открыто, нажмите « Многоточечный». Используйте этот инструмент для количественной оценки ячеек, щелкнув левой кнопкой мыши по каждой ячейке, которую нужно подсчитать.
- Количественно определите колокализованные клетки, т.е. положительные на рекаверин и DAPI, во внешнем ядерном слое (ONL).
- Когда подсчет будет завершен, дважды щелкните левой кнопкой мыши, чтобы увидеть общее количество помеченных ячеек.
- После определения количества рекереин-положительных клеток введите количество клеток в таблицу количественной оценки Excel и перейдите к следующей микрофотографии.
- Повторите все шаги для 8 полей, соответствующих каждому животному.
- Вычислите среднее значение этих восьми полей, соответствующее одной экспериментальной точке для всей сетчатки (n=1). Для графика периферической сетчатки используйте среднее значение периферических полей, всего четыре поля: два от левого глаза и два от правого глаза. Это среднее значение соответствует одной экспериментальной точке для периферической сетчатки (n= 1). Создайте центр графа сетчатки таким же образом, как и периферический граф, изменяя только область.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Иммунофлуоресцентная методика мечения фоторецепторов, рекаверин-положительных клеток, позволила наблюдать характер дегенерации фоторецепторов у животных rd10 и C57Bl6, причем последние считались здоровыми (рис. 1). Как можно видеть, мечение для рекаверин-положительных клеток является исключительным для внешнего ядерного слоя (ONL), где находятся фоторецепторы, включая мечение сегментов, внутренних этих клеток, как у rd10, так и у животных дикого типа. По мере...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Сетчатка – это нежная ткань, к которой трудно получить доступ; Поэтому необходимо рассмотреть метод, который будет использоваться для проведения фармакологического лечения, нацеленного на эту ткань. Интравитреальная инъекция является хорошо зарекомендовавшим себя и широко используемым методом доставки лекарств непосредственно к сетчатке, особенно при лечении глазных заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация21, диабетическая ретинопатия
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Благодарности
Эта работа проводилась во время исследовательской стипендии при поддержке Национального совета по научному и технологическому развитию (CNPq), Фонда Карлоса Шагаса Фильо по поддержке исследований штата Рио-де-Жанейро (FAPERJ), а также частично финансировалась Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,3% Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Раствор для блокирующего буфера |
| 1% BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | Раствор для блокирующего буфера |
| 1% Human BD Fc Block | BD Biosciences | 564220 | Fc Block требуется для блокирующего буфера |
| 150 Вт светодиодная лампа | Amazon | B07VH3CVSF | светодиодный источник света для фотооблучения тканей |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | Решение для блокировки буфера и ступеней промывки |
| Контейнер для хранения 20 галлонов | Amazon | B001B1C4G0 | Контейнер для процесса фотооблучения |
| 40 Вт RGBW светодиодная лампа | Источник света Amazon | B08QFPJSMD | RGB для фотооблучения тканей |
| Ag85B | Abcam | ab43019/NA | Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1. |
| Альфа-гладкомышечный актин DyLight 755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R/NA | антитело для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1. |
| Набор для блокирования авидина/биотина | Abcam | ab64212 | Авидин и раствор для блокирования биотина |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Раствор для фиксации |
| BOND Dewax Solution | Leica Biosystems | NC0221076 | раствор для депарафинизации |
| BOND Раствор для извлечения эпитопов 1 | Leica Biosystems | NC0235529 | Раствор для извлечения эпитопа pH 6 на основе цитрата ( ER1) |
| Раствор для извлечения эпитопов BOND 2 | Leica Biosystems | NC0235530 | Раствор для извлечения эпитопов pH 9 на основе ЭДТА (ER2) |
| Система обнаружения исследований | BOND Leica Biosystems | NC0396648 | Автоматизированный реагент для окрашивания исследований |
| BOND RX Research Stainer | Leica | Biosystems NA | Автоматизированная платформа для окрашивания исследований |
| BOND Wash Solution | Leica Biosystems | NC0221077 | Промывочный буфер |
| CD15 | BD Biosciences | 347420/AB_400298 | Антитело для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1. |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82/AB_11150959 | Антитело для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1. |
| CD4 Alexa Fluor 488 | R& D Systems | FAB8165G/AB_2728839 | Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1. |
| CD45 Антитела к фикоэритрину (PE) | Novus Biologicals | NBP2-34528PE/NA | для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1. |
| CD68 iFluor 594 | Caprico Biotechnologies | 1064135/AB_2892745 | антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1. |
| Антитело к козлятам IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814/AB_2762838 | для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1. |
| Антитело против мышей Donkey IgG Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Scientific | A32787/ AB_2762830 | антитело для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1. |
| Ослиный антимышиный IgM Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020/AB_2340844 | Антитело для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1. |
| Ослиный антикролиацкий IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Scientific | A32794/AB_2762834 | Антитело для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1. |
| Система окрашивания EasyDip | Newcomer Supply | 5300KIT | Система окрашивания слайдом |
| Fluoromount-G | Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 | Монтажный материал |
| Hoechst | Biotium | 40046 | Ядерное окрашивание для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1. |
| Imaris File Converter x64 10.2.0 | Imaris Oxford Instruments | Бесплатный конвертер файлов | |
| ImarisViewer программное обеспечение x64 10.2.0 | Imaris Oxford Instruments | Бесплатное программное обеспечение для обработки изображений | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Гидрофобная барьерная ручка |
| Борогидрид лития (1 грамм) | STREM Chemicals | 93-0397 | Химикат для инактивации красителя, купите небольшие аликвоты этого химиката (1 грамм) |
| Lumican Biotin | R& D Systems | BAF2846 | антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1. |
| Очки Micro Cover | VWR | 48393-241 | Стеклянные предметные стекла |
| Pan-cytokeratin Alexa Fluor 750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750/AB_2868569 | Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1. |
| PELCO BioWave Pro Микроволновая система | Ted Pella Inc | 36500-230 | Ненагреваемая научная микроволновая печь |
| PELCO SteadyTemp Pro | Ted Pella Inc | 50062 | Полностью автоматизированный контроль температуры для научной микроволновой печи |
| SimpleITK | Программное обеспечение с открытым исходным кодом Программное обеспечение | для регистрации и обработки каналов | |
| Streptavidin Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | Реагент для мечения для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1. |
| Широкопольный микроскоп | Leica Microsystems | NA | Leica Microsystems THUNDER тепловизор с источником света LED8 и программным обеспечением LAS X (3.7.1.21655). Для флуоресцентной визуализации был использован специальный четырехполосный фильтр с внешним фильтрующим колесом (PN: 11536075) и двумя дополнительными однополосными фильтрами (PN: 8118215) для получения изображения семи каналов красителя за проход. Линии возбуждения, дихроии и излучения фильтра: (1) четырехполосный куб: дихроичный при 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, без фильтров возбуждения или излучения; (2) колесо внешнего фильтра положение 1: 434/32, положение 2: 520/40, положение 3: 585/20, положение 4: 720/60, положение 5: сквозной; (3) однополосный 1— 585/22 возбуждение, 594 дихроичное, 625/30 излучение; (4) однополосный 2— 635/20 возбуждение, 647 дихроя, 667/30 излучение. |
| Zeiss Optical Lens Cleaner | Amazon | B00GPVQVCO | Microscope Очиститель объектива |
| объективаАнтитела | |||
| Ag85B | Abcam | ab43019 | Polyclonal Rabbit IgG, цикл 1 |
| Альфа-гладкомышечный актин DyLight 755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R | 1A4/asm-1, цикл 1 |
| CD4 Alexa Fluor 488 | R&;D Системы | FAB8165G | Поликлональный козий IgG, цикл 1 |
| CD8 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 372906 | C8/144B, цикл 1 |
| CD68 iFluor 594 | Caprico Biotechnologies | 1064135 | KP1, цикл 1 |
| Осел антикозий IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814 | Поликлональный осел, цикл 1 |
| Осел антимышиный IgG Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Scientific | A32787 | Поликлональный осел, цикл 1 |
| Осел анти-кролик IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Scientific | A32794 | Поликлональный осел, цикл 1 |
| Hoechst | Biotium | 40046 | Ядерная метка, цикл 1 |
| CD15 | BD Biosciences | 347420 | MMA, цикл 2 |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82 | L26, цикл 2 |
| CD45 Фикоэритрин (ПЭ) | Novus Biologicals | NBP2-34528PE | 2B11 + PD7/26, цикл 2 |
| Осел антимышиный IgM Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020 | Поликлональный осел, цикл 2 |
| Lumican Biotin | R& D Systems | BAF2846 | поликлональным козьим IgG, цикл 2 |
| Pan-цитокератин Alexa Fluor 750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750 | AE-1/AE-3, цикл 2 |
| стрептавидин Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | N/A, цикл 2 |
| Hoechst | Biotium | 40046 | цикл 2 |
| Solutions | |||
| Blocking Buffer (Цикл 1) | |||
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 0,3% по объему |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 1% по объему |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences | 564220 | 1% по объему |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | 97,7% по |
| объему<сильно>Раствор для окрашивания первичных антител #1 (Цикл 1) | |||
| Блокирующий буфер (Цикл 1) | Смотрите выше | Доливайте до объема после добавления антител | |
| Hoechst | Biotium | 40046 | 1:5000 |
| CD8 AF647 | BioLegend | 372906 | 1:10 |
| <сильно>первичный раствор для окрашивания антител #2 (цикл 1) | |||
| (цикл 1) | Смотрите выше | Пополнить до объема после добавления антител | |
| CD4 AF488 | Р и D Systems | FAB8165G | 1:10 |
| Ag85B | Abcam | ab43019/NA | 1:100 |
| Secondary Antibody Staining Solution #1 (Цикл 1) | |||
| Blocking Buffer (Цикл 1) | Смотрите выше | Пополнить до объема после добавления антител | |
| Donkey Anti-Goat AF Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814/AB_2762838 | 1:100 |
| Donkey anti-Rabbit AF Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A32794/AB_2762834 | 1:100 |
| Donkey anti-Mouse AF Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32787/AB_2762830 | 1:50 |
| Первичный раствор для окрашивания антител #3 (Цикл 1) | |||
| Blocking Buffer (Цикл 1) | Смотрите выше | Доливайте до объема после добавления антитела | |
| CD68 iF594 | Caprico Biotechnologies | 1064135 | 1:10 |
| a-SMA DL755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R/NA | 1:30 |
| Блокирующий буфер без BSA (цикл 2) | |||
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 0,3% по объему |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences | 564220 | 1% по объему |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | 98,7% по |
| объему<сильный>первичный раствор для окрашивания антител #4 (цикл 2) | |||
| BSA-free блокирующий буфер (цикл 2) | Смотрите выше | Доливать до объема после добавления антител | |
| CD15 | BD Biosciences | 347420 | 1:30 |
| Lumican Biotin | R& D Systems | BAF2846 | 1:100 |
| CD45 PE | Novus Biologicals | NBP2-34528PE | 1:20 |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82 | 1:10 |
| Пан-цитокератин AF750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750 | 1:10 |
| ><сильный раствор для окрашивания вторичных антител #2 (Цикл 2) | |||
| Блокирующий буфер без БСА (Цикл 2) | См. выше | Доведите до объема после добавления антител | |
| Donkey anti-Mouse IgM AF488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020/AB_2340844 | 1:100 |
| Strepavidin AF594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | 1:200 |
Ссылки
- Kels, J., et al. Anatomy and physiology of the retina: a comprehensive review. Retinal J. 21, 75-92 (2015).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Tsang, S. H., Sharma, T. Retinal degeneration and gene therapy: present and future approaches. Prog Retin Eye Res. 67, 93-120 (2018).
- Gasparini, S. J., Favretto, F., La Greca, C. Biology of the retina: structure, function, and dysfunction. J Biomed Sci. 19 (3), 289-300 (2019).
- Masland, R. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
- Hoon, M., et al. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Liu, W., et al. Retinitis pigmentosa: progress in molecular pathology and biotherapeutical strategies. Int J Mol Sci. 23 (9), 4883(2022).
- Hamel, C. Retinitis pigmentosa. Orphanet J Rare Dis. 1, 40(2006).
- Verbakel, S. K., et al. Non-syndromic retinitis pigmentosa. Prog Retin Eye Res. 66, 157-186 (2018).
- O'Neal, T. B., Tripathy, K., Luther, E. E. Retinitis Pigmentosa. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), e112142(2014).
- Chang, B., et al. Two mouse retinal degenerations caused by missense mutations in the beta-subunit of rod cGMP phosphodiesterase gene. Vision Res. 47 (5), 624-633 (2007).
- Jae, S. A., et al. Electrophysiological and histologic evaluation of the time course of retinal degeneration in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Korean J Physiol Pharmacol. 17 (3), (2013).
- Strettoi, E., et al. Inhibition of ceramide biosynthesis preserves photoreceptor structure and function in a mouse model of retinitis pigmentosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18706-18711 (2010).
- Rösch, S., Johnen, S., Mataruga, A., Müller, F., Pfarrer, C., Walter, P. Selective photoreceptor degeneration by intravitreal injection of N-methyl-N-nitrosourea. Investig Ophthalmol Vis Sci. 55 (3), 1711-1723 (2014).
- Kellish, P. C., et al. Intravitreal injection of a rationally designed AAV capsid library in non-human primate identifies variants with enhanced retinal transduction and neutralizing antibody evasion. Mol Ther. 31 (12), 3441-3456 (2023).
- Molday, L. L., Cheng, C. L., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells and Subcellular Organelles by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. New York. (2019).
- Cheng, C. L., Djajadi, H., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
- Girgis, S., Lee, L. R. Treatment of dry age-related macular degeneration: a review. Clin Exp Ophthalmol. 51 (8), 835-852 (2023).
- Lee, J. Y., et al. Superoxide dismutase 3 prevents early stage diabetic retinopathy in streptozotocin-induced diabetic rat model. PLoS One. 17 (1), e0262396(2022).
- Isiegas, C., et al. Intravitreal injection of proinsulin-loaded microspheres delays photoreceptor cell death and vision loss in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Investig Ophthalmol Vis Sci. 57 (8), 3610-3618 (2016).
- Doshi, R. R., Bakri, S. J., Fung, A. E. Intravitreal injection technique. Semin Ophthalmol. 26 (3), 104-113 (2011).
- Kim, H. M., Woo, S. J. Ocular drug delivery to the retina: current innovations and future perspectives. Pharmaceutics. 13 (1), 108(2021).
- Jones, B. W., Marc, R. E., Pfeiffer, R. L. Retinal Degeneration, Remodeling and Plasticity. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , University of Utah Health Sciences Center, Salt Lake City. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482309/"K482309 (2016).
- Roche, S. L., Wyse-Jackson, A. C., Byrne, A. M., Ruiz-Lopez, A. M., Cotter, T. G. Alterations to retinal architecture prior to photoreceptor loss in a mouse model of retinitis pigmentosa. Int J Dev Biol. 60, 127-139 (2016).
- Ladha, R., Caspers, L. E., Willermain, F., de Smet, M. D. Subretinal therapy: technological solutions to surgical and immunological challenges. Front Med. 9, 846782(2022).
- Varela-Fernández, R., et al. Drug delivery to the posterior segment of the eye: biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations. Pharmaceutics. 12 (3), 269(2020).
- Bussing, D., et al. Pharmacokinetics of monoclonal antibody and antibody fragments in the mouse eye following intravitreal administration. J Pharm Sci. 112 (8), 2276-2284 (2023).
- Roberge, F. G., de Kozak, Y., Utsumi, T., Faure, J. P., Nussenblatt, R. B. Immune response to intraocular injection of retinal S-antigen in adjuvant. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 227 (1), 67-71 (1989).
- Ishikawa, T., Hokama, H., Katagiri, Y., Goto, H., Usui, M. Effects of intravitreal injection of tacrolimus (FK506) in experimental uveitis. Curr Eye Res. 30 (2), 93-101 (2005).
- Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry: the red, brown, and blue technique. Vet Pathol. 51 (1), 42-87 (2014).
- Gargini, C., Terzibasi, E., Mazzoni, F., Strettoi, E. Retinal organization in the retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse: a morphological and ERG study. J Comp Neurol. 500 (2), 222-238 (2007).
- Haverkamp, S., Wässle, H. Immunocytochemical analysis of the mouse retina. J Comp Neurol. 424, 1-23 (2000).
- Haverkamp, S., Ghosh, K. K., Hirano, A. A., Wässle, H. Immunocytochemical description of five bipolar cell types of the mouse retina. J Comp Neurol. 455, 463-476 (2003).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
