Методическая статья

В естественных условиях Визуализация нейронной активности у взрослых мух дрозофилы без анестезии

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68332

⸱

20 июня 2025 г.

 , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Georgetown University

В этой статье

Краткое содержание

Существенным препятствием для изучения клеточной активности во время когнитивных процессов, таких как обучение и память, является использование анестетиков для подготовки визуализации in vivo . Анестезия ухудшает кратковременную память и когнитивные способности у многих моделей, включая дрозофил. В этом исследовании представлен уникальный метод подготовки взрослой дрозофилы к визуализации in vivo без анестезии.

Аннотация

Визуализация in vivo имеет решающее значение для изучения нейробиологии дрозофил, поскольку она позволяет в режиме реального времени визуализировать нейронную активность, развитие и пластичность интактной мухи. Этот метод дает бесценную информацию о динамических процессах, таких как синаптическая функция и связность цепей, которые не могут быть точно зафиксированы в фиксированных препаратах или препаратах ex vivo . Большинство методов подготовки мух к визуализации in vivo включают обезболивание мух незадолго до функциональной визуализации. Тем не менее, многочисленные данные свидетельствуют о том, что анестезия влияет на ряд когнитивных и физиологических процессов. По этой причине визуализация in vivo взрослой особи Drosophila melanogaster без использования анестетиков во время подготовки животных является сложным, но очень желательным подходом. Представленный здесь протокол включает в себя обездвиживание головы бодрствующих мух путем отсасывания хоботка в небольшую металлическую трубку, подключенную к вакуумной системе. В то время как голова неподвижна, муха подготавливается к функциональной визуализации без необходимости анестезии. Этот протокол является быстрым и воспроизводимым, что гарантирует отсутствие вреда для мухи. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет избежать использования анестезии, что объясняет потенциальное комплексное воздействие анестезии на нейронную активность. Этот метод является как доступным, так и легко адаптируемым, с использованием недорогих, настраиваемых инструментов. Это позволяет успешно визуализировать живых мух, улавливая быстрые изменения в нейронной активности, связанные с динамическими когнитивными процессами.

Введение

Последние достижения в области репортеров генетически закодированной активности произвели революцию в нейробиологии, предоставив в режиме реального времени очень специфическую информацию об активности нейронов. Эти репортеры, такие как кальциевые или вольтовые датчики 1,2,3,4,5,6,7,8,9, позволяют исследователям отслеживать электрические и химические сигналы внутри нейронов с беспрецедентной временной точностью и пространственным разрешением. Позволяя отслеживать конкретные, отдельные нейроны нейронным сетям в различных областях мозга, эти инструменты углубили наше понимание того, как паттерны возбуждения нейронов связаны с когнитивными процессами, такими как обучение, памятьили принятие решений.

Чтобы воспользоваться этими генетически закодированными индикаторами, исследователи разработали передовые методы подготовки своего модельного организма к визуализации in vivo. Первое сообщение о нейрональной пластичности с помощью функциональной визуализации in vivo, часто называемое «следом памяти», было обнаружено в антенной доле медоносных пчел после аппетитного обонятельного обусловливания. Это открытие вдохновило на исследования генетически универсального модельного организма Drosophila melanogaster, что привело к разработке инновационных методов визуализации in vivo 10,16,17,18.

Дрозофила служит отличной моделью для понимания обучения и памяти благодаря своей устойчивой способности формировать обонятельные воспоминания с помощью классического обусловливания, когда запах (условный стимул – КС) начинает ассоциироваться либо с отвратительным, либо с вознаграждающим стимулом (безусловный стимул – УС)19,20,21,22. У дрозофил запахи слабо представлены в теле гриба (MB)23, важнейшей области мозга для ассоциативной памяти, которая состоит примерно из 2000 нейронов клеток Кеньона (KC) на каждое полушарие24. Обонятельная информация передается от чашечки к долям MB через аксоны KC, которые объединяются вместе, образуя доли. Во время обонятельного обусловливания УЗИ, такие как удар электрическим током или вознаграждение за сахар, передаются в доли MB через различные дофаминергические нейроны (DAN): нейроны PPL1 для аверсивных стимулов и нейроны PAM для вознаграждающих стимулов 25,26,27,28,29,30. Считается, что приобретение памяти включает в себя одновременную активацию CS и US-путей, что приводит к синергетическому увеличению циклического АМФ (cAMP), который кодирует память31,32. Этот процесс индуцирует пластичность синапсов KC→MBON, изменяя их синаптический вес 11,12,13,33,34,35,36,37. DAN-опосредованная пластичность в конечном итоге приводит к тому, что выходные нейроны грибовидного тела (MBON) вызывают либо приближение, либо поведение избегания по отношению к усвоенному запаху. Существующая модель предполагает, что поток информации от KC к MBON преобразует представление запаха от идентичности запаха в KC к более абстрактной информации в MBON, такой как валентность запаха на основе предыдущего опыта34,38. В отличие от KC, MBON имеют широко настроенные реакции на запах; любой заданный запах приводит к ответной реакции на большинство MBON39. Настройка запахов MBON изменяется под влиянием синаптической пластичности и значительно варьируется у разных мух, что позволяет предположить, что MBON меняют свою реакцию на запахи на основе опыта. Существует 34 MBON, при этом большая часть сети MBON, по-видимому, разделена на два взаимно антагонистических класса, которые управляют любым изподходов к поведению избегания. По этой причине использование визуализации in vivo для изучения восстановления памяти путем записи в различных MBON получило широкое распространение.

Ранние методы функциональной визуализации in vivo включают проведение операций по удалению участка кутикулы в верхней части капсулы головки, который затем накрывался небольшим кусочком полиэтиленовой пленки18. Несмотря на то, что это положило начало визуализации in vivo у дрозофил, с тех пор были достигнуты значительные успехи в методах подготовки мух и доставке стимулов под микроскоп для исследования таких процессов, как обучение и память. Тем не менее, даже сегодня большинство методов подготовки мух к визуализации in vivo включают обезболивание мух. Эта практика сопряжена с трудностями, поскольку существует обширное количество доказательств и целая область исследований, демонстрирующих, как анестезия влияет на память, а также на другие когнитивные и физиологические процессы. Например, было проведено исследование, чтобы понять эффекты различных анестетиков, которые очень часто используются в лабораторных условиях (углекислый газ, изофлуран, севофлуран и холодовой шок). Они обнаружили, что чем дольше воздействие анестезии, тем больше времени восстановления, изменяется двигательная активность, снижается плодовитость, а также может влиятьна запасы воды и липидов. Кроме того, сообщалось, что введение анестезии при холодовом шоке сразу после тренировки может полностью нарушить кратковременную память. Из этого первоначального исследования теперь известно, что у дрозофил существует неконсолидированная память (чувствительная к анестезии память), которая распадается в течение 6-8 часов, и форма консолидированной памяти (устойчивая к анестезии память), которая формируется постепенно после обучения и может длиться около 24 часов41 минут. Исходя из этого, анестезия может влиять на когнитивные процессы и активность нейронов, что в конечном итоге позволяет правильно выразить память.

Влияние анестезии на память не ограничивается дрозофилами. Многочисленные исследования на людях и других млекопитающих продемонстрировали аналогичные результаты. Например, перекрестное исследование, проведенное в университетской больнице, показало, что кратковременная память значительно снизилась у пациентов через 24 часа после общей анестезии. Другое исследование, проведенное на мышах, показало, что общая анестезия значительно снижает динамику спайков, декорирует клеточные ансамбли и изменяет динамику позвоночника в области CA1 гиппокампа, важной области мозга, участвующей в обучении и памяти умлекопитающих. Чтобы преодолеть эти трудности, целью данного исследования является разработка нового протокола, который исключает использование анестезии во время подготовки мухи к визуализации in vivo , оставляя тело мухи полностью свободным. Этот подход позволяет более точно регистрировать активность нейронов, улучшает здоровье мух при более длительных записях и устраняет возможные искажающие эффекты анестезии по сравнению с другими подходами. Этот протокол предназначен для записи активности нейронов у дрозофил, в частности, для изучения того, как нейроны проявляют пластичность во время и после обучения. Тем не менее, протокол вскрытия универсален и может быть адаптирован к различным приложениям в исследованиях визуализации в реальном времени.

Протокол

Подробная информация об оборудовании и реагентах, использованных для данного исследования, приведена в Таблице материалов.

1. Трансгенные плодовые мушки, Drosophila melanogaster

  1. Скрещивайте самок девственниц и самцов мух (выращенных при температуре 25 °C при 60% относительной влажности в течение 12-часового цикла свет/темнота), несущих желаемые конструкции Gal4 и UAS соответственно, чтобы получить мух, у которых конкретные нейроны, представляющие интерес, экспрессируют желаемый генетически закодированный репортер активности.
  2. Возраст потомства вышеуказанных кроссов до тех пор, пока они не окажутся в диапазоне 2-5 дней после экклюзии. Можно использовать как самцов, так и самок, так как камеры визуализации изготавливаются по индивидуальному заказу для представителей обоих полов.

2. Сборка аспиратора (рабочий процесс 5 минут)

  1. Отрежьте силиконовую трубку диаметром 6 мм длиной около 8 дюймов с помощью лезвия бритвы. Возьмите наконечник для пипетки p200 и отрежьте его примерно пополам с помощью лезвия бритвы для мундштука (рис. 1A). Вставьте отрезанный кончик в трубку. Отрежьте наконечник пипетки p1000 настолько, чтобы муха могла пройти через него.
  2. Возьмите небольшой кусочек ваты и накройте силиконовой трубкой. Это необходимо для того, чтобы муха не попала в рот экспериментатора. Поместите отрезанный наконечник p1000 на трубку, покрытую ватой.
  3. Закройте наконечник для дозатора p1000 новым наконечником для дозатора p200. Чтобы определить подходящую длину для разрезания наконечника пипетки p200, сначала извлеките наконечник пипетки p200 и втяните муху в наконечник пипетки p1000. Снова прикрепите наконечник p200. Осторожно подуйте и постучите по мухе, чтобы переместить ее как можно дальше в наконечник p200.
    1. Как только она больше не сможет продвигаться дальше, используйте препарирующий микроскоп, чтобы отметить точку, где заканчивается голова мухи и начинается грудная клетка, используя лезвие бритвы. Втяните муху обратно в наконечник пипетки p1000 и разрежьте наконечник пипетки p200 в отмеченном месте.

3. Создание аспиратора хоботка из металлической трубки (рабочий процесс 5 - 10 минут)

  1. Отрежьте металлическую трубку для подкожных инъекций калибра 22X до нужного размера (~10 см) с помощью инструментов Dremel и алмазного пильного диска. Отполируйте концы металлических трубок с помощью отрезного круга Dremel 420 для создания гладкого и чистого отверстия. Это отверстие будет вмещать хоботок мухи.
  2. Оберните трубку вокруг центрифужной пробирки объемом 15 мл, чтобы получить желаемую изогнутую форму (Рисунок 1A). Изгиб должен создавать крючкообразную форму, которая позволит телу мухи находиться на одной линии с камерой.
  3. Отрежьте кусок (длиной ~7 см) подкожной металлической трубки калибра 12TW с помощью инструментов Dremel (эта трубка должна поместиться в наконечник пипетки объемом 2 мкл). Возьмите наконечник для дозатора объемом 2 мкл и обрежьте его конец лезвием бритвы, чтобы он подходил к металлической трубке калибра 22X. Вставьте большую металлическую трубку в другой конец наконечника для дозатора объемом 2 мкл.
  4. Смешайте небольшое количество смолы и отвердитель эпоксидного клея. Наносите смесь в том месте, где маленькая металлическая трубка встречается с наконечником пипетки, а большая металлическая трубка соединяется с наконечником пипетки. Дайте клею полностью застыть в течение ночи, прежде чем подключать сборку к держателю на микроманипуляторе. При необходимости отрегулируйте угол.

4. Создание пипетки для подачи шока и запаха для экспериментов по обучению и памяти под микроскопом (рабочий процесс 10 минут)

  1. Алмазным инструментом Dremel разрежьте 1 мл в стеклянной пипетке 1/100 на отметке 3 мл. Вырежьте небольшой прямоугольный кусочек акрилового листа размером 24,5 мм х 8 мм и толщиной 1/8 дюйма.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, эта деталь может быть напечатана на 3D-принтере, чтобы лучше приспособиться к ударной решетке (файлы stl и obj можно найти в Дополнительном файле 1 и Дополнительном файле 2).
  2. Вырежьте медную ударную сетку по размеру прямоугольной акриловой детали из предыдущего шага. Припаяйте два электрических провода на противоположных концах медной сетки. Поместите медную сетку в прямоугольный акриловый кусок и согните ее так, чтобы брюшко и ноги мухи поместились на ударной сетке (Рисунок 1I).
  3. Приклейте медную сетку к прямоугольному пластику с помощью куска изоленты. С помощью пистолета для горячего клея надежно прикрепите стеклянную пипетку к ударной решетке, убедившись, что она прямая и правильно отцентрирована. С помощью цифрового мультиметра убедитесь, что медная сетка эффективно наносит удар по ногам мухи.

5. Сборка платинового резистора для плавления клея (миристиновая кислота) (рабочий процесс 20 минут)

  1. С помощью зачистки проводов отрежьте 200 мм проводов нужной длины и зачистите один конец обоих проводов. Отрежьте около 60 мм платиновой проволоки (этой длины должно хватить для создания петли, которая будет использоваться для расплавления клея).
  2. С помощью паяльника припаяйте один конец платинового провода к электрическому проводу. Пропустите термоусадочную трубку через электрический провод и с помощью горелки Бунзена насадите трубку на провод, чтобы покрыть паяемые детали.
  3. Отрежьте две части резиновой трубки диаметром 2,55 мм диаметром 20 мм и пропустите их через платиновую проволоку (для облегчения этого процесса держите платиновую проволоку прямой). С помощью паяльника припаяйте другой конец платинового провода к другому электрическому проводу. Используйте новую термоусадочную трубку, чтобы закрыть эту новую паяную деталь.
  4. Снимите поршень шприца BD tb 1 мл и пропустите провода от предыдущих этапов через цилиндр. Платина должна торчать из конца цилиндра шприца. Не должно быть оголенных проводов, а небольшая резиновая трубка должна закрывать платиновую проволоку за исключением самого конца.
  5. С помощью устройства для зачистки проводов зачистите небольшое количество обоих других концов электрических проводов. С помощью паяльника припаяйте каждый провод к банановой вилке до тех пор, пока она не будет надежно соединена.
  6. Используйте эпоксидный клей для склеивания верхней и нижней части цилиндра шприца, чтобы склеить провода и цилиндр вместе; Это позволит избежать натяжения проводов внутри шприца и обеспечит более длительный срок службы резистора. Дайте клею застыть в течение ночи.
  7. Подключите готовый резистор к источнику питания постоянного тока.

6. Строительство камеры записи - (2-х дневный рабочий процесс)

  1. Следуя дополнительному файлу 3, вырежьте лазером черный лист прокладки (толщина 0,0125 дюйма). Размер отверстия в середине камеры может быть изменен в соответствии с размером мух (размер в файле обычно подходит для самок и самцов).
  2. Возьмите предметное стекло микроскопа, которое будет служить основанием камеры. Смешайте смолу и эпоксидную смолу вместе. Возьмите черную акриловую камеру и с помощью эпоксидного клея прикрепите магниты из неодима 3 мм х 2 мм на все четыре угла. Рекомендуется приклеивать по одному магниту и держать его, пока клей затвердевает, с помощью скрепки.
  3. Поместите по два новых магнита на каждый из магнитов, приклеенных к камере ранее. Используя эпоксидную смолу, приклейте последний прикрепленный магнит к предметному стеклу и с помощью скрепк удерживайте его на месте во время курирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как клей подобран, камера готова, и можно добавить больше магнитов для регулировки высоты камеры для экспериментов. В Дополнительном файле 4, Дополнительном файле 5 и Дополнительном файле 6 показана собранная записывающая камера.

7. Протокол диссекции in vivo без анестезии - (рабочий процесс 5 - 7 минут)

  1. Извлеките наконечник пипетки p200 из аспиратора. Вставьте аспиратор во флакон и втяните одну муху в наконечник пипетки p1000. Установите наконечник пипетки p200 обратно на аспиратор. Осторожно подуйте и щелкните аспиратором так, чтобы муха была обездвижена в верхней части наконечника пипетки p200 головой вперед.
  2. Поместите камеру для вскрытия на держатель манипулятора. Подсоедините вакуум к трубке для удержания мух и при необходимости отрегулируйте уровень потока (~500 мл/мин). Используйте быстроразъемный разъем для простого и быстрого подключения/отключения пылесоса (рис. 1A).
  3. Переместите вакуумную металлическую трубку, чтобы центрировать ее в поле зрения при взгляде в микроскоп. Убедитесь, что камера расположена правильно, чтобы она находилась прямо на металлической трубке, когда будет готова приклеить ширинку. Осторожно втяните хоботок мухи в вакуумный держатель (Рисунок 1A).
  4. Как только мушка окажется в правильном положении, переместите манипулятор так, чтобы голова мухи оказалась на одной линии с отверстием камеры.
  5. Включите источник питания постоянного тока. Ток должен быть установлен в диапазоне 0,40-0,50 ампер. Более высокие токи могут привести к тому, что миристиновая кислота расплавится до такой степени, что ее вязкость станет слишком низкой, что увеличивает риск растекания клея по голове мухи.
  6. Используя резистентность платины, приклейте боковые стороны глаз и грудную клетку к камере, используя расплавленную миристиновую кислоту (Рисунок 1В). Чтобы предотвратить попадание клея на кутикулу головы, используйте как можно меньше клея, особенно при склеивании боковых сторон глаз.
  7. После того, как глаза и грудная клетка будут приклеены, отсоедините вакуумную трубку и с помощью манипулятора снимите записывающую камеру с вакуумной трубки. Переверните камеру вверх дном и используйте сопротивление платины для приклеивания хоботка снизу (Рисунок 1С). Приклеивание глазков снизу не является обязательным и может помочь удержать муху на месте во время вскрытия, но это не обязательно.
  8. Как только все будет приклеено, выключите источник питания постоянного тока, переверните камеру вертикально и прикрепите ее к стеклянному боковому основанию. Отрежьте небольшой кусочек ленты с помощью ножниц и приложите его прямо спереди и сзади головы мухи (Рисунок 1D).
  9. Поверните камеру так, чтобы голова была обращена к экспериментатору на 90 градусов. С помощью рассекающей иглы сделайте вертикальный надрез по бокам глаз (рисунок 1Е). Поверните камеру так, чтобы она была расположена горизонтально. С помощью рассекающей иглы разрежьте кутикулу поперек (рисунок 1Е).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что только что созданное «окно» кутикулы можно приподнять с помощью иглы для препарирования. Если она поднимается без сопротивления, положите иглу для рассечения обратно на крышку. На этапах 13 и 14 не используется физиологический раствор для предотвращения преломления света, которое может затруднить четкий обзор во время порезов.
  10. Добавьте 100 μL физиологического раствора в верхнюю часть головы мухи (Рисунок 1F). С помощью острых щипцов аккуратно снимите окно (рисунок 1G). С помощью острых щипцов осторожно удалите остатки жира или трахеи. Теперь мозг должен быть готов к визуализации (Рисунок 1H-1J).

8. Визуализация пластичности, вызванной обучением, с помощью аверсивного обонятельного кондиционирования (20-минутный рабочий процесс)

  1. С помощью конфокального микроскопа, оснащенного лазером и объективом для погружения в воду, поместите подготовленную муху на предметное столико микроскопа. По желанию используйте камеру с макрообъективом, чтобы сфокусироваться на мухе, убедившись, что муха здорова и движется.
  2. Отрегулируйте положение шоковой решетки/дозатора с помощью микроманипулятора так, чтобы муха сидела на шоковой решетке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Муха должна по-прежнему иметь возможность свободно двигаться, так как ударная сетка касается только ног и слегка живота (муха должна иметь возможность убрать свои ноги и брюшко от сетки, если она втянута). Пипетка для доставки запаха должна быть направлена в сторону усиков мухи.
  3. С помощью ручки грубой регулировки по оси Z просканируйте ось Z мозга и найдите интересующую область мозга. Отрегулируйте размер рамки до 512 х 512 пикселей. Частота сканирования должна быть отрегулирована до нужной скорости – с минимумом 2 Гц. Наконец, установите продолжительность записи.
  4. Начните записывать интересующий вас нейрон с помощью специально разработанной или коммерческой системы доставки запаха и одновременно инициируйте «предварительную тренировку» доставки запаха (рис. 2C). Установите запись на 2 минуты. Предварительная тренировка представления запаха начинается с записи реакции на первый импульс запаха (CS-) в течение 5 секунд, за которым следует второй импульс запаха в течение 5 секунд (CS+) с интервалом между стимулами в 30 секунд.
  5. После сбора ответов перед обучением подождите 5 минут, прежде чем инициировать протокол обучения в системе доставки запаха. В данном примере во время тренинга был представлен только CS+. Запах CS+ подается в течение 1 минуты через 30 с после срабатывания системы доставки запаха. Шоковый стимулятор запрограммирован на одновременную подачу разрядов напряжением 12, 90 В при подаче запаха.
  6. После тренировки подождите 5 минут или 15 минут, прежде чем получить ответы после тренировки. Запишите ответы после тренировки таким же образом, как были записаны ответы до тренировки на шаге 6. Сохраните все файлы в соответствующем формате для последующего анализа изображений.

9. Анализ изображений

  1. Чтобы проанализировать записи, нарисуйте область интереса (ROI) вокруг области нейрона. Это должно быть как можно точнее, чтобы ограничить влияние фоновой флуоресценции.
  2. Используйте инструмент измерения для извлечения данных о средней интенсивности флуоресценции в пределах ROI для каждого кадра записи. Экспортируйте эти данные в виде файла CSV.
  3. Откройте данные в MATLAB или любой другой программе анализа данных, чтобы рассчитать значения ΔF/Fo для каждой следа запаха. Объедините данные, чтобы получить среднее значение ΔF/Fo для отдельных мух и построить график средних следов реакции на запах до и после обучения (рис. 2E, F).

Результаты

В данной работе визуализация in vivo взрослой дрозофилы без анестезии используется для исследования аверсивного обонятельного обусловливания, индуцирующего пластичность в хорошо охарактеризованном нейроне вывода грибного тела (MBON γ2α'1)12. Кальциевый индикатор GCaMP6f2 вместе с красным флуоресцентным белком TdTom экспрессируются в выходном нейроне MB, дендриты которого иннервируют компартмент γ и α' долей MB и генетически нацелены на MBON γ2α'1 с использованием линии расщепленного Gal4 MB077C34 (рис. 2A, B).

Чтобы наблюдать за пластичностью после аверсивного обонятельного обусловливания, муху помещают под конфокальный микроскоп, причем ее брюшко и ноги выровнены по центру ударной решетки, а пипетка для доставки запаха направлена в сторону антенны мухи. Сначала регистрировались реакции на запах кальция на 5-секундный импульс 4-метилциклогексанола (MCH), за которым следовал 5-секундный импульс 3-октанола (ОКТ), разделенный 30-секундным интервалом между стимулами. Через пять минут мухи обучались путем одновременного предъявления 1-минутного импульса ОКТ (CS+) вместе с 12 ударами напряжения 90 В. Этот график ассоциативного обусловливания создает устойчивую поведенческую аверсивную память. Наконец, через 5 минут и 15 минут после тренировки реакция кальция на MCH и OCT регистрировалась так же, как и до тренировки. MBON γ2α'1 устойчиво реагирует кальциевыми переходными процессами как на MCH, так и на ОКТ перед кондиционированием (рисунок 2D-F). Тем не менее, в соответствии с предыдущими результатами, через12,5 минут после кондиционирования реакция кальция на CS+ (ОКТ) полностью подавлена (рисунок 2D-F). Кроме того, реакция на CS- (MCH) была значительно усилена. Через пятнадцать минут после тренировки были получены аналогичные результаты, так как реакция кальция на CS+ была значительно подавлена, а CS- потенцировался. Эти результаты указывают на то, что след памяти, наблюдаемый в обоих запахах, сохраняется в течение как минимум 15 минут (Рисунок 2D-F). Эти реакции были количественно оценены с использованием средней реакции на запах в течение 5 секунд пульса и сравнены внутри мухи. Эти изменения в реакциях на запах также могут быть визуализированы с помощью псевдоцветового представления изменения флуоресценции GCaMP6 до и после аверсивного обучения (рис. 2E). Напротив, обезболивание мухи во время подготовки показывает сниженную пластичность как к CS+, так и к CS-. У животных, находящихся под наркозом, наблюдается лишь частичная депрессия к КС+, так как посттренировочные реакции все еще присутствуют. Кроме того, реакции CS- существенно не отличаются после обучения (рис. 2G, H). Чтобы лучше наблюдать это, мы рассчитали индуцированную пластичность как отношение CS+/CS- и показали, что мухи без анестезии демонстрируют значительно большую пластичность по сравнению с животными под наркозом (рис. 2I). Эти репрезентативные результаты указывают на то, что данный протокол подходит для изучения обучения и памяти под микроскопом и обеспечивает здоровье мухи при визуализации нейронов в течение длительного периода времени. Этот протокол достаточно универсален и может быть применен к другим типам визуализации in vivo и другим нейронам, представляющим интерес.

figure-results-1
Рисунок 1: Подготовка к визуализации дрозофилы in vivo без использования анестезии. (A) Верхняя панель: Диаграмма, иллюстрирующая этапы подготовки аспиратора. Нижняя панель: Схема, показывающая камеру, удерживаемую в микроманипуляторе во время позиционирования мухи. Хоботок мухи помещается в отверстие металлической трубки, подключенной к вакууму со скоростью 500 мл/мин с помощью аспиратора. Впоследствии камера располагается над мухой. (Б) Боковые стороны глаз и грудная клетка склеиваются миристиновой кислотой с помощью изготовленного на заказ платинового резистора. (C) Хоботок мухи удаляется из металлической трубки, а камера переворачивается, чтобы хоботок мог быть приклеен на место, тем самым сводя к минимуму движение во время записи. (D) Камера прикреплена к основанию из стеклянного предметного стекла. Скотч наклеивается на верхнюю часть камеры, охватывающую усики, и на тыльную сторону, чтобы предотвратить вытекание физиологического раствора. (E) Два вертикальных надреза делаются вдоль кутикулы возле сложных глаз, а затем третий разрез поперек кутикулы возле грудной клетки, создавая «окно» в мозг. (F) От 100 до 200 μL физиологического раствора добавляется в голову мухи в месте надрезов. (G) Окно кутикулы приподнимается, оттягивается и отделяется с помощью острых тонких щипцов, чтобы обнажить мозг. (H) Жир и ткань трахеи удаляются, чтобы обеспечить четкую визуализацию клеток мозга под микроскопом. (I) Подготовленную муху помещают под микроскоп и располагают так, чтобы ее тело было выровнено по вершине ударной решетки. (J) Псевдоцветное изображение, показывающее паттерн экспрессии MBON γ2α′1. Область интереса обведена пунктирной линией, окружающей дендритную беседку. Масштабная линейка: 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Пластичность, индуцированная обучением, у MBON γ2α'1 после аверсивного обонятельного обусловливания. (A) Шаблон экспрессии драйвера MB077C-splitGal4, экспрессирующего GCaMP. Мозг был препарирован и окрашен анти-GFP и компенсирован анти-nc82. Масштабная линейка: 50 мкм. (B) Псевдоцветное изображение MBON γ2α′1, на котором выделено тело клетки, процесс удлинения и дендритная беседка. Дендритная область представляет собой область, из которой были собраны ответы кальция. Масштабная линейка: 50 мкм. (C) Схема протокола аверсивного обучения. Мух подвергали воздействию 5-секундных импульсов MCH и OCT с 30 с чистым воздухом между ними. После 5-минутного интервала мух обучали связывать ОКТ с двенадцатью электрическими разрядами напряжением 90 В. Запись реакции кальция на MCH и ОКТ проводилась через 5 минут и 15 минут после тренировки. (D) Следы реакции на запах на MCH (верхняя панель) и OCT (нижняя панель) отображаются для предварительного обучения, а также через 5 и 15 минут после обучения. Толстые черные полосы указывают на время появления запаха. (E) Псевдоцветные изображения дендритного ствола MBON γ2α'1 до тренировки и через 5 минут и 15 минут после тренировки в ответ на MCH и OCT. Потенцирование флуоресценции наблюдается для CS- (MCH), в то время как флуоресценция отменяется для CS+ (OCT). Масштабная линейка: 20 мкм. (F) Средняя реакция запаха на MCH значительно потенцируется через 5 минут и 15 минут после тренировки, в то время как реакция на ОКТ (CS+) значительно подавляется. Непараметрический парный тест Вилкоксона, N = 12. (G) Следы реакции на запах до MCH (верхняя панель) и OCT (нижняя панель) показаны для мух, подвергшихся анестезии, до и через 5 минут после обучения. Толстые черные полосы указывают на подачу запаха. (H) У животных, находящихся под наркозом, реакция среднего запаха на MCH не демонстрирует значительного потенцирования после обучения, а реакция на ОКТ демонстрирует лишь частичное подавление по сравнению с животными без анестезии. (I) Пластичность, вызванная тренировкой, рассчитанная как соотношение CS+/CS-, значительно ниже у мух, находящихся под наркозом, по сравнению с теми, кто был подготовлен без анестезии. Непараметрический парный критерий Вилкоксона, N = 8-12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный файл 1: Grid_holder (STL). STL-файл специально разработанного компонента, используемого для удержания электрической сети. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Grid_holder (OBJ). OBJ специально разработанного компонента, используемого для удержания электрической сети. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Chamber_LaserCut. Файл Adobe Illustrator используется для лазерной резки верхнего компонента записывающих камер как самцов, так и самок мух. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 4: Recording_chamber (STL). STL-файл специально разработанной записывающей камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 5: Recording_chamber (OBJ). OBJ файла специально разработанной записывающей камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 6: Recording_chamber_animation. Видео в формате MP4, демонстрирующее анимацию собранной камеры звукозаписи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Понимание нейронных цепей, лежащих в основе обучения и памяти, является центральной целью в области нейробиологии. Генетический инструментарий, доступный у дрозофилы, в сочетании с простотой и универсальностью поведенческого тестирования, делает ее идеальным модельным организмом для изучения этих процессов. В опубликованных исследованиях, проведенных в различных лабораториях, описаны различные протоколы подготовки мух к функциональной визуализации без использования анестезии44,45. Тем не менее, эти протоколы сильно различаются и часто полагаются на узкоспециализированные, специализированные инструменты с ограниченными рекомендациями по их созданию или использованию. В этом протоколе представлен метод выполнения функциональной визуализации in vivo у мух, который позволяет избежать искажающих эффектов общей анестезии. Кроме того, этот подход позволяет регистрировать нейронную активность в режиме реального времени у одной и той же мухи, что позволяет напрямую сравнивать нейронные реакции до и после воздействия различных стимулов.

При выполнении этого протокола критически важными шагами являются обеспечение правильного размещения хоботка мухи в вакуумной трубке. Этот шаг гарантирует, что последующее склеивание будет происходить в нужных местах, и он гарантирует, что голова находится под правильным углом для визуализации интересующих нейронов. Минимальное нанесение клея необходимо для поддержания здоровья мух; Использование наименьшего количества, необходимого для закрепления мухи на месте, является идеальным. Этот протокол также допускает некоторые модификации в соответствии с конкретными потребностями, такие как склеивание только боковых сторон глаз, чтобы все тело было свободным. Аналогичным образом, перфузионная камера может быть прикреплена к верхней части записывающей камеры для облегчения перфузии звонка или доставки лекарств. Наконец, вращающаяся плавающая беговая дорожка может быть размещена под мухой, как сообщалось ранее, что позволяет анализировать направленность движения46,47.

Этот протокол имеет некоторые ограничения, в том числе стресс, которому подвергаются мухи во время микрохирургии для подготовки мух к визуализации в реальном времени. Обращение с мелкими мухами, бережное нанесение клея и осторожное вскрытие капсулы головы, не повреждая мозговые ткани или тело, требует значительного опыта, который можно приобрести только путем тщательной практики и повторения. Хотя этот метод особенно полезен для изучения когнитивных процессов на клеточном уровне, визуализация in vivo все еще имеет некоторые ограничения по сравнению с электрофизиологическими записями. Кроме того, несмотря на то, что наш протокол позволяет избежать использования анестезии перед визуализацией, муха по-прежнему ограничена физической камерой, что всегда может изменить клеточные реакции. Тем не менее, наша методология обеспечивает наиболее близкий способ сохранения здоровья мухи для оптимальной визуализации in vivo . По сравнению с существующими методами, которые используют анестезию и ограничивают муху, наш метод направлен на то, чтобы муха двигалась как можно свободнее, имея при этом возможность получать изображения из клеток с минимальным движением.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук для 1R01GM147917-01A1 и Фондом исследований мозга и поведения для 30442.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,102 мм Платиновая проволокаSurepure Chemetals2690
0,25 OD, 0,125 ID, платиновая силиконовая трубкаVWR89068-474
0,3 мм ID Силиконовая трубка Fisher Scientific11-189-14
Банановые заглушкиAmazon
Черный акриловый лист для камеры 0.0125 впрецизионной марке44250
Хлорид кальцияSigma-Aldrich746495
Медная ударная решеткаИзготовленный
блок питания постоянного тока для платинового резистораFisher ScientificS35740
Dremel tool 3000-1Dremel3000-N/18
Drosophila melanogaster / ;; uas-tdtomBDSC36328
Drosophila melanogaster / ; uas-gcamp6f;BDSC42747Эта линейка беспилотных летательных аппаратов была объединена с ;; uas-td-tom для генерации запаса, содержащего обе вставки
Drosophila melanogaster/ ;; MB077C-gal4BDSC68287
Эпоксидный клей Gorilla4200102
Расходомер газа 1,5 л/минAmazonB01N0UWZ2T
Стекло 1 мл серологическая пипетка Fisher Scientific50-232-9516
Стеклянные слайдыFisher Scientific 12-550-A3
ГлюкозаSigma-AldrichG7528
HEPESSigma-AldrichH4034
Трубка для подкожных инъекций 12TW калибраМикрогруппа316H12TW
Подкожная трубка калибра 22XМикрогруппа304H22X
Магния хлорид гексагидратSigma-AldrichM9272
Миристиновая кислотаAcros Organics156961000
неодимовые магниты 3X2 ммAmazonB0CXSQ387M
P1000 наконечникиGenesee Scientific 23-165RL
P200 советыGenesee Scientific 23-150RL
Пневматический нажимной соединитель 6 мм ODAmazonB07ZHG8Y1Y
хлорид калияSigma-AldrichP3911
трубка из ПТФЭ 6 мм ODAmazon
Бритва лезвия B08LYD6645
Бикарбонат натрияSigma-AldrichS5761
Хлорид натрияFisher ScientificS271-500
Фосфат натрия двухосновнойSigma-AldrichS0876
СахарозаSigma-AldrichS9378
ТрегалозаSigma-AldrichT0167
на заказ Amazon

Ссылки

  1. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  2. Chen, T. W., Wardill, T. J., Sun, Y., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  3. Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  4. Akerboom, J., Chen, T. W., Wardill, T. J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  5. Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  6. Sun, F., Zeng, J., Jing, M., et al. A genetically encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
  7. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  8. Wang, L., Wu, C., Peng, W., et al. A high-performance genetically encoded fluorescent indicator for in vivo cAMP imaging. Nat Commun. 13 (1), 5363(2022).
  9. Jing, M., Zhang, P., Wang, G., et al. A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies. Nat Biotechnol. 36 (8), 723-737 (2018).
  10. Yu, D., Akalal, D. B. G. B., Davis, R. L. Drosophila alpha/beta mushroom body neurons form a branch-specific, long-term cellular memory trace after spaced olfactory conditioning. Neuron. 52 (5), 845-855 (2006).
  11. Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic plasticity underlies aversive olfactory learning in Drosophila. Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).
  12. Berry, J. A., Phan, A., Davis, R. L. Dopamine neurons mediate learning and forgetting through bidirectional modulation of a memory trace. Cell Rep. 25 (3), 651-662 (2018).
  13. Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L., Berry, J. A. Rac1 impairs forgetting-induced cellular plasticity in mushroom body output neurons. Front Cell Neurosci. 14, 258(2020).
  14. Martinez-Cervantes, J., Shah, P., Phan, A., Cervantes-Sandoval, I. High order unimodal olfactory sensory preconditioning in Drosophila. Elife. 11, 79107(2022).
  15. Faber, T., Joerges, J., Menzel, R. Associative learning modifies neural representations of odors in the insect brain. Nat Neurosci. 2 (1), 74-78 (1999).
  16. Yu, D., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Davis, R. L. Detection of calcium transients in Drosophila mushroom body neurons with camgaroo reporters. J Neurosci. 23 (1), 64-72 (2003).
  17. Yu, D., Keene, A. C., Srivatsan, A., Waddell, S., Davis, R. L. Drosophila DPM neurons form a delayed and branch-specific memory trace after olfactory classical conditioning. Cell. 123 (5), 945-957 (2005).
  18. Yu, D., Ponomarev, A., Davis, R. L. Altered representation of the spatial code for odors after olfactory classical conditioning: Memory trace formation by synaptic recruitment. Neuron. 42 (3), 437-449 (2004).
  19. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophilamelanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
  20. Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophilamelanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (3), 708-712 (1974).
  21. Quinn, W. G., Dudai, Y. Memory phases in Drosophila. Nature. 262 (5569), 576-577 (1976).
  22. Tempel, B. L., Bonini, N., Dawson, D. R., Quinn, W. G. Reward learning in normal and mutant Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (5), 1482-1486 (1983).
  23. Turner, G. C., Bazhenov, M., Laurent, G. Olfactory representations by Drosophila mushroom body neurons. J Neurophysiol. 99 (2), 734-746 (2008).
  24. de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263 (5147), 692-695 (1979).
  25. Schwaerzel, M., Monastirioti, M., Scholz, H., Friggi-Grelin, F., Birman, S., Heisenberg, M. Dopamine and octopamine differentiate between aversive and appetitive olfactory memories in Drosophila. J Neurosci. 23 (33), 10495-10502 (2003).
  26. Kim, Y. C., Lee, H. G., Han, K. A. D1 dopamine receptor dDA1 is required in the mushroom body neurons for aversive and appetitive learning in Drosophila. J Neurosci. 27 (29), 7640-7647 (2007).
  27. Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Curr Biol. 15 (21), 1953-1960 (2005).
  28. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: Anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3 (5), 1-17 (2009).
  29. Liu, C., Plaçais, P. Y., Yamagata, N., et al. A subset of dopamine neurons signals reward for odour memory in Drosophila. Nature. 488 (7412), 512-516 (2012).
  30. Burke, C. J., Huetteroth, W., Owald, D., et al. Layered reward signaling through octopamine and dopamine in Drosophila. Nature. 492 (7429), 433-437 (2012).
  31. Tomchik, S. M., Davis, R. L. Dynamics of learning-related cAMP signaling and stimulus integration in the Drosophila olfactory pathway. Neuron. 64 (4), 510-521 (2009).
  32. Gervasi, N., Tchenio, P., Preat, T. PKA dynamics in a Drosophila learning center: Coincidence detection by rutabaga adenylyl cyclase and spatial regulation by dunce phosphodiesterase. Neuron. 65 (4), 516-529 (2010).
  33. Séjourné, J., Plaçais, P. Y., Aso, Y., et al. Mushroom body efferent neurons responsible for aversive olfactory memory retrieval in Drosophila. Nat Neurosci. 14 (7), 903-910 (2011).
  34. Aso, Y., Sitaraman, D., Ichinose, T., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, 04580(2014).
  35. Pai, T. P., Chen, C. C., Lin, H. H., et al. Drosophila ORB protein in two mushroom body output neurons is necessary for long-term memory formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (19), 7898-7903 (2013).
  36. Owald, D., Felsenberg, J., Talbot, C. B., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).
  37. Perisse, E., Owald, D., Barnstedt, O., Talbot, C. B., Huetteroth, W., Waddell, S. Aversive learning and appetitive motivation toggle feed-forward inhibition in the Drosophila mushroom body. Neuron. 90 (5), 1086-1099 (2016).
  38. Aso, Y., Rubin, G. M. Dopaminergic neurons write and update memories with cell-type-specific rules. Elife. 5, 16135(2016).
  39. Hige, T., Aso, Y., Rubin, G. M., Turner, G. C. Plasticity-driven individualization of olfactory coding in mushroom body output neurons. Nature. 526 (7572), 258-262 (2015).
  40. MacMillan, H. A., Nørgård, M., MacLean, H. J., Overgaard, J., Williams, C. J. A critical test of Drosophila anaesthetics: Isoflurane and sevoflurane are benign alternatives to cold and CO2. J Insect Physiol. 101, 97-106 (2017).
  41. Margulies, C., Tully, T., Dubnau, J. Deconstructing memory in Drosophila. Curr Biol. 15 (17), R700-R713 (2005).
  42. Amiri, A., Karvandian, K., Ramezani, N., Amiri, A. Short-term memory impairment in patients undergoing general anesthesia and its contributing factors. Saudi J Anaesth. 14 (4), 454-458 (2020).
  43. Wang, R., Zhang, L., Wang, X., et al. Electrophysiological activity pattern of mouse hippocampal CA1 and dentate gyrus under isoflurane anesthesia. Front Cell Neurosci. , 18(2024).
  44. Berry, J. A., Cervantes-Sandoval, I., Chakraborty, M., Davis, R. L. Sleep facilitates memory by blocking dopamine neuron-mediated forgetting. Cell. 161, 1656-1667 (2015).
  45. Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Sci Rep. 10, 1-15 (2020).
  46. Moore, R. J. D., et al. FicTrac: A visual method for tracking spherical motion and generating fictive animal paths. J Neurosci Methods. 225, 106-119 (2014).
  47. Seelig, J. D., Chiappe, M. E., Lott, G. K., et al. Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior. Nat Methods. 7 (7), 535-540 (2010).

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Функциональная визуализациязабывание памятиконфокальная микроскопиякальциевый имиджинггрибовидное телопрепарат бодрствующей мухисинаптическая пластичность
В естественных условиях Визуализация нейронной активности у взрослых мух дрозофилы без анестезии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.