Рентгенологическая визуализация внутрипротоковой абляционной инфузии на основе этанола для профилактики рака молочной железы на моделях кроликов

Краткое содержание

Этот протокол представляет собой процедуру инфузии под визуальным контролем в протоковую систему дерева молочной железы кролика. Мы демонстрируем контролируемую инфузию абляционного раствора на основе этанола рентгеноконтрастного вещества во все отверстия сосков с помощью рентгеноскопии в реальном времени.

Аннотация

Рак молочной железы является второй по значимости причиной смерти женщин от рака. Несмотря на то, что существует несколько упреждающих вмешательств для женщин со средним риском, профилактическая мастэктомия является наиболее эффективным вмешательством, снижающим риск, для женщин с высоким риском. Тем не менее, профилактическая мастэктомия — это инвазивная процедура, при которой удаляются все эпителиальные клетки молочной железы вместе с окружающей стромой, жировой тканью и/или мускулатурой. Наша общая цель исследования заключается в разработке неинвазивной процедуры внутрипротоковой (ID) доставки, которая локально убивает эпителиальные клетки молочной железы путем заполнения всего протокового дерева абляционным раствором. Ранее мы продемонстрировали, что ID-доставка этанола в виде абляционного раствора эффективна на моделях грызунов (мышей и крыс). Этот протокол представляет собой подачу 10-70% раствора этанола, содержащего йогексол (90-300 мг/мл) в качестве рентгеноконтрастного агента, в систему многопротоковых деревьев молочной железы кролика. Молочная железа кролика (Oryctolagus cuniculus) с системой нескольких протоков больше похожа на человеческую грудь, чем у других крупных животных (например, коров, овец). Этот протокол для кроликов решает технические проблемы, связанные с масштабируемостью, визуализацией в реальном времени и доставкой идентификаторов в систему многоканального дерева в промежуточной модели для крупных животных. Этот протокол предусматривает доставку многоканального ID под контролем рентгеноскопии с инструментами, материалами и реагентами, которые могут быть непосредственно применены в клинике. Анализ тканей позволяет оптимизировать концентрацию этанола для максимальной эпителиальной абляции и минимального повреждения сопутствующих тканей в качестве отправной точки для будущей первой оценки на человеке этой абляционной процедуры для первичной профилактики рака молочной железы.

Введение

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным и вторым по величине уровнем смертности, связанной с раком, среди женщин в Соединенных Штатах. Прогнозы на 2025 год показывают, что будет зарегистрировано 316 950 новых случаев рака молочной железы, и 42 170 женщин умрут от BC¹. В настоящее время двусторонняя профилактическая мастэктомия является наиболее эффективной процедурой для профилактики РМЖ. Тем не менее, это высокоинвазивная процедура, которая предполагает полное удаление эпителиальных клеток, из которых возникает карцинома молочной железы, и окружающих тканей. Из-за своей инвазивности, а также психологического и социального воздействия этой процедуры, менее 50% женщин с высоким риском подвергаются мастэктомии, снижающей риск². Мы, как и другие, разработали процедуры внутрипротокового (ID) введения для первичной профилактики и/или местного лечения рака молочной железы у грызунов моделей ^2,3 в качестве альтернативы существующим методам профилактики и лечения. Этанол (EtOH) обладает низким профилем токсичности и безопасности, который хорошо известен и используется во многих клинических применениях, таких как склерозирующие агенты для лечения венозных мальформаций и в качестве абляционного агента для местного лечения некоторых видов^рака. Как правило, в этих клинических процедурах вводится или доставляется несколько миллилитров EtOH в концентрации 90-100%. В нашей предыдущей работе доставка 70% EtOH непосредственно в систему протокового дерева моделей мышей и крыс была эффективной для химической абляции эпителиальных клеток молочной железы с ограниченным повреждением прилегающих нормальных тканей, а также для предотвращения образования опухолей молочной железы 4,5,6,7. Поскольку эта процедура масштабируется до более крупной системы протоковых деревьев кролика с большим отношением объема света к площади поверхности люминального эпителия, мы исследуем абляционные свойства раствора с более низким процентом EtOH (от 10% до 70%). В поисках клинического перевода мы полагаем, что самый низкий процент этанола, который эффективен в удалении эпителиальных клеток, будет наиболее хорошо переносимым и иметь наилучший профиль безопасности.

Подтверждение полного пломбирования протокового дерева необходимо для того, чтобы гарантировать, что аблятивный раствор вступил в непосредственный контакт с эпителиальными клетками молочной железы. В наших предыдущих исследованиях на моделях грызунов после процедуры использовалась рентгеновская визуализация введенных протоковых деревьев с помощью микрокомпьютерной томографии. Из-за требуемого времени для обезболивания, перемещения, установки и позиционирования животного для визуализации, одобренный FDA Omnipaque (иогексол) или аналогичные быстро диффундирующие контрастные вещества, содержащие йод, не подходили для визуализации протоковых деревьев у грызунов ^6,8. Мы обнаружили, что контрастные вещества на основе наночастиц, особенно содержащие нанокристаллы оксида тантала, медленнее диффундируют и больше подходят для визуализации протоковых деревьев у грызунов 6,7,8,9. Тем не менее, это апостериорное подтверждение с помощью микрокомпьютерной томографии не позволяет нам отслеживать или контролировать количество введенного объема и отклоняется от клинически установленных диагностических процедур, таких как дуктография^10,11, для визуализации протокового дерева. Таким образом, ключевым шагом к установлению технической возможности трансляции этой процедуры ИД на человека является демонстрация рентгеноскопии визуализации введенного протокового дерева в режиме реального времени на животной модели с возрастающим размером и сложностью его молочных желез. Этот протокол масштабирует эту абляционную процедуру от грызунов ^4,5 до кроличьих моделей. Эволюционно, анатомически и физиологически молочные железы кроликов больше похожи на человеческую грудь, чем на молочные железы грызунов или других крупных животных, таких как коровы и ^овцы. Самки кроликов имеют четыре пары молочных желез, каждая из которых содержит четыре протоковых дерева, в то время как грызуны имеют только одно протоковое дерево на молочную железу. Соски кролика могут быть канюлированы^15,16 с использованием процедуры, аналогичной введению контрастного вещества в клинической дуктографии в первом клиническом исследовании на человеке. Таким образом, кролики представляют собой практичную и актуальную промежуточную модель крупного животного для трансляционного применения этой абляционной процедуры ИД к человеку. Этот протокол решает технические проблемы, связанные с доставкой идентификаторов и визуализацией in vivo многоканальной системы дерева, которые не могли быть решены на моделях грызунов. В этом протоколе используются инструменты, реагенты и материалы, совместимые с современной клинической практикой для визуализации протоковых деревьев. Таким образом, описанная процедура инфузии абляционного раствора на основе этанола под контролем рентгеноскопии может быть легко реализована и оценена в первых клинических испытаниях на людях.

Этот метод был реализован в нашей лаборатории для успешного канюлирования и последовательного введения всем четырем протоковым деревьям одной или нескольких молочных желез кролика за один сеанс абляционным раствором на основе этанола, содержащим контрастное вещество (рис. 1, рис. 2, рис. 3). Этот метод включает в себя введение абляционного раствора непосредственно в отверстие канюлированного соска с помощью иглы с тупым наконечником 27 г кролика (4-месячного девственника) на рентгеноскопическом столе. Эта процедура проводится животному под общим наркозом (изофлуран) с пери- и постпроцедурным противовоспалительным лечением (кетопрофен, нестероидный противовоспалительный препарат). Рентгеноскопическая визуализация позволяет нам контролировать заполнение протокового дерева в режиме реального времени, контролировать скорость и количество выдаваемого объема и/или определять, насколько успешна доставка ID в каждой отдельной системе дерева (Рисунки 1, Рисунок 2, Рисунок 3). Этот метод рентгеноскопии более приближен к предполагаемому клиническому применению для визуального контроля абляционного лечения и может помочь ограничить общую дозу облучения, налагаемую на пациента. Этот протокол демонстрирует, что одобренный FDA Omnipaque (иогексол) является подходящим контрастным веществом для визуализации первоначального заполнения протокового дерева кролика (Рисунок 3). Наблюдения при тщательном осмотре и гистологическом анализе показывают, что концентрация этанола в 70% вызывает быстрое повреждение тканей внутри и за пределами протокового дерева и выходит за пределы структуры молочной железы (Рисунок 3). Концентрация этанола в диапазоне 10-40% обеспечивает адекватную абляцию эпителиальных клеток с меньшим повреждением коллатеральных тканей, чем 70% этанол (Рисунок 4). Потребуются лонгитюдные исследования с использованием этой процедуры с соответствующим размером группы на абляционный раствор и временными сборами тканей для установления оптимальных параметров абляционного раствора для его клинической оценки у пациентов.

Протокол

Все описанные эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете штата Мичиган. Кролики (Oryctolagus cuniculus) ухаживали в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованием и Законом о благополучии животных Министерства сельского хозяйства США в учреждении, аккредитованном AAALAC.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод проводили на девственных (нерожавших) и вышедших на пенсию заводчиков (многородящих) животных породы новозеландской белой породы в возрасте (от 4 месяцев до > 1 года) и весе (от 2,6 до 4,2 кг), полученных из коммерческих источников. По нашему опыту, размер животного, определяемый по весу, более надежен, чем возраст животного, чтобы предсказать размер сосков. Как правило, животные весом более 3,3 кг поставляются с подходящими сосками для канюляции. Описанный ниже протокол ориентирован на девственных животных в возрасте 4-5 месяцев и весом более 3,3 кг, поскольку они больше подходят для долгосрочных исследований эффективности, заживления ран, токсичности и безопасности.

1. Предоперационная подготовка

1. Акклиматизируйте животных в новом учреждении не менее 1 недели по прибытии, особенно это касается животных, предназначенных для восстановительных процедур и длительных исследований. В течение этой первой недели ежедневно контролируйте/проверяйте кроликов и давайте им лакомства, обогащенные питательными веществами в соответствии с рекомендациями учреждения, чтобы помочь в процессе акклиматизации.
2. Приобретите кролика (~ 4 месяца новозеландской белой) в утвержденном жилищном учреждении. Запишите массу тела перед процедурой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вес тела может быть зарегистрирован за день до процедуры, чтобы подготовить необходимые расчеты для анестезии. Также можно использовать выведенных на пенсию заводчиков (> возрасте 1 года, > 3,5 кг), так как они имеют более крупные соски и позволяют легче канюлировать отдельные протоки (Рисунок 3). По этим причинам вышедшие на пенсию заводчики могут быть использованы в первоначальных экспериментах для ознакомления и оптимизации внутрипротоковой процедуры.
3. Введите 35 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина внутримышечно за 20 минут до введения изофлурана для успокоения животного.
   Примечание: Анестезия вводится в зависимости от веса кролика и диапазоны для каждого препарата следующие: 15-35 мг/кг для кетамина и 2-5 мг/кг для ксилазина. Убедитесь, что животное находится под действием успокоительных, прежде чем переходить к удалению шерсти и интубации. Это необходимо для благополучия и безопасности животных и персонала. После подтверждения седации кролик может быть помещен дорсально на операционный стол.
4. Введите 5 мг/кг кетопрофена подкожно для обезболивания после появления клинических признаков седативного эффекта (т.е. спокойного поведения, частично закрытых и розового цвета глаз).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анальгезия назначается в зависимости от веса кролика, а диапазон для кетопрофена составляет 2-5 мг/кг.
5. Интубируйте кролика с помощью соответствующего оборудования (например, эндотрахеальной трубки или устройства для надгортанных дыхательных путей) и подключите его к аппарату изофлурана (1-2% изофлурана, 1,0 л/мин кислорода), который был адекватно протестирован и сертифицирован для анестезии кролика. Внимательно следите за дыханием животного, чтобы убедиться, что анестезия поддерживается на уровне 1-2% изофлурана. Следите за сатурацией крови кролика на предмет насыщения кислородом с помощью SpO₂, частоты сердечных сокращений, частоты дыхания и температуры на протяжении всей процедуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер интубационной трубки зависит от веса и размера кролика. Тем не менее, диапазон размеров не всегда точен, поэтому полезно иметь различные размеры, чтобы понять, какой из них лучше всего подходит для конкретного кролика. Маска с конусом носа также может быть использована вместо эндотрахеальной трубки для целей анестезии¹⁷, зная, что эта маска не обеспечивает защиту дыхательных путей животного, обеспечиваемую интубацией. Тепловодные циркуляционные одеяла (теплые одеяла), установленные при температуре 37°С, кладут под полотенца для поддержания температуры тела кролика.
6. Установите и закрепите венозный катетер 25 G в краевой ушной вене для экстренного введения лекарства.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера вены кролика можно использовать диапазон от 24 до 26.
7. Нанесите глазную смазку на оба глаза, чтобы предотвратить раздражение глаз и высыхание роговицы.
8. Сбрейте шерсть вокруг второй и третьей пар сосков с помощью электрической бритвы. С помощью аппликатора с ватным наконечником нанесите крем для удаления волос на область соска. Дайте крему соприкоснуться с областью в течение 15 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать крайнюю осторожность, чтобы не повредить соски бритвой. Беспроводной пылесос также может использоваться для поддержания чистоты в процедурной зоне.
9. Смочите марлевый тампон стерильным физиологическим раствором и с его помощью смойте крем и отдохните шерсть животного через 15 с после нанесения крема для эпиляции. Убедитесь в хорошей видимости и доступе к области соски, с которой был снят мех. При необходимости повторите.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крем должен оставаться на кролике в течение как можно более короткого промежутка времени, от 10 до 30 с, и быть полностью удален во избежание химических ожогов кожи.

2. Внутрипротоковая инфузия

1. Приготовьте абляционный раствор путем смешивания соответствующих объемов из исходных растворов в стерильных условиях в капюшоне для культуры тканей BSL2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Йогексол (350 мг йода/мл) следует хранить в темном месте из-за чувствительности к свету. В ходе эксперимента использовался диапазон концентраций EtOH. Для проверки других процентных соотношений EtOH разбавьте стоковые растворы до необходимой концентрации абляционного раствора. Для поддержания одинаковой концентрации йода в абляционном растворе с разным процентным содержанием этида, PBS или стерильной воды можно использовать для восполнения разницы в объеме.
2. Для этого примера приготовьте свежий абляционный раствор 10% EtOH, 280 мг йода/мл йогексола, 1% пищевого красителя в тюбике объемом 5 мл. Для конечного объема 5 мл добавьте 4 мл бульона йогексола (350 мг йода/мл), 500 мкл 100% этиона (200 proof), 450 мкл PBS, 50 мкл бульона синего пищевого красителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое дерево протоков может быть заполнено до 400 μл, но обычно 250-350 μЛ для животных весом менее 3,5 кг. Evans Blue в концентрации до 0,2% можно использовать вместо пищевого красителя. Evans Blue может быть предпочтительным вариантом, если сразу после инфузии (инфузий) планируется провести анализ всей ткани или другие тканевые анализы.
3. Удалите омертвевшую кожу, которая закрывает отверстия протоков, тонкими заостренными щипцами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: У кроликов может быть ороговевшая пробка, выступающая из соска, которая может помешать успешному канюляции, если ее не удалить. Местный лидокаин также может быть введен вокруг соски, чтобы свести к минимуму раздражение вокруг места инъекции (Таблица 1).
4. Протрите место настоя марлевыми салфетками с хлоргексидином.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хлоргексидин используется в качестве очищающего средства для дезинфекции места инъекции перед канюляцией (Таблица 1).
5. Вставьте скос иглы 28 G (длина: 12,7 мм) в боковую часть соски и медленно введите 200 мкл 0,9% физиологического раствора со скоростью 200 мкл/мин. Это позволяет лучше визуализировать отверстия в воздуховодах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется вводить в сосок не все 200 мкл физиологического раствора; Прекратите инъекцию, как только вы увидите, что физиологический раствор выходит из одного или нескольких протоковых отверстий.
6. Асасируйте 1 мл приготовленного абляционного раствора с помощью шприца с замком Люэра объемом 1 мл. Прикрепите шприц к женскому, «крылатому» концу 12-дюймовой удлинительной линии «самец-самка». Осторожно прикрепите иглу с тупым концом 27 G (длина: 12,7 мм) к наружному концу удлинительной линии. Загрунтуйте линию раствором. Протрите иглу начисто спиртовой марлевой салфеткой. Кроме того, будьте осторожны, чтобы не опрокидывать шприц с абляционным раствором, так как это может привести к образованию пузырьков воздуха.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведены рекомендуемые объемы, направленные на полное заполнение протокового дерева (деревьев): до 300 мкл в каждом дереве и до 1,2 мл на цервикальные и/или паховые молочные железы (^1-я и^4-я пары), до 400 мкл на каждом дереве и до 1,6 мл на грудные и/или брюшные молочные железы (^2-я и^3-я пары). Для других применений может быть целесообразно использовать меньшие или большие объемы в зависимости от требований эксперимента и/или рекомендаций рентгеноскопии, чтобы избежать переполнения протокового дерева. Удлинительная линия позволяет лучше контролировать скорость потока и одновременно проводить инфузию и рентгеноскопию в реальном времени. Для сравнения, рекомендуемые объемы внутрипротоковой инфузии в возрасте 9-12 недель у мышей моделей⁴ составляют: до 30 мкл в шейных и паховых и до 50 мкл в грудных и брюшных молочных железах, а у крысовых моделей⁵: до 100 мкл в шейных и паховых и до 300 мкл в грудных и брюшных молочных железах.
7. Используйте лампу с 10-кратным увеличением, чтобы помочь найти отверстия в воздуховодах. Аккуратно удерживайте соску пальцами и канюлируйте иглу в протоковое отверстие. Осторожно продолжайте вводить иглу с тупым кончиком 27 G, пока кончик полностью не окажется внутри соски. Чтобы вместить иглу в соску, поднесите соску вверх к игле, а не продавливайте иглу внутрь соски. Следите за тем, чтобы следовать по траектории отверстия в протоке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: У некоторых кроликов вы можете чувствовать сопротивление при попытке ввести иглу в отверстие (отверстия) соска. Осторожно надавите на него, чтобы прорвать верхний слой эпителиальных клеток. По нашему опыту, требуется устройство увеличения, чтобы четко определить отверстие протока для канюляции. Это может быть увеличительная лампа, линза, лупа или подобное устройство.
8. Медленно вводите 300 мкл раствора с постоянной скоростью около 200 мкл/мин после полного введения иглы. Подождите 30 с после настаивания, чтобы извлечь иголку из канюлированного дерева; Это гарантирует, что впрыскиваемый объем остается в пределах проточного дерева и снижает вероятность утечки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, один исследователь канюлирует и держит иглу, в то время как второй исследователь держит шприц и нажимает на поршень с желаемой скоростью. Для более контролируемого расхода можно использовать шприцевой насос, так как резкие изменения скорости инфузии могут привести к разрыву или повреждению протоковых деревьев.
9. Смойте пролитый раствор влажной марлей или салфеткой EtOH, чтобы избежать попадания постороннего контрастного раствора на изображениях.

3. Рентгеноскопия

1. Делайте рентгеноскопические снимки после инфузии каждого протокового дерева. Параметры рентгеноскопии: 30 кадров в секунду, 67 кВ и 17,3 мА на рентгеноскопическом рентгеноскопическом приборе. Тем не менее, корректируйте их в зависимости от эксперимента и потребностей в визуализации.
2. Используйте рентгеноскопические изображения, чтобы определить, требуется ли дополнительный объем для полного заполнения протокового дерева.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рентгеноскопия может проводиться в режиме реального времени одновременно с инфузией абляционного раствора. Металлические или пластиковые щипцы могут использоваться для удержания соски во время визуализации, чтобы защитить персонал от вредного рентгеновского излучения. Это позволяет контролировать заполнение протокового дерева (деревьев). Живая рентгеноскопия может определить, когда следует прекратить инфузию, основываясь на увеличенном объеме на концах альвеол. Рентгеноскопия после инфузии может подтвердить, было ли протоковое дерево полностью заполнено или была утечка. Подтверждающая рентгеноскопия обычно проводится после инфузии каждого протока в пределах одной и той же молочной железы.

4. Послеоперационный уход и восстановление

1. Прекратите подачу изофлурана после последней внутрипротоковой инфузии.
2. Внутримышечно вводят 0,5 мг/кг атипамезола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время восстановления варьируется у разных животных, но у кролика должны появиться признаки восстановления через 5-20 минут после инъекции.
3. Обеспечьте животному непрерывную тепловую поддержку на согревающем одеяле до полного восстановления от анестезии. Поддерживайте приток кислорода в течение 5 минут перед снятием с анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Признаки выздоровления включают движения рта, такие как жевание, кашель, подергивание носа и/или движение глаз. Кролики должны обладать рефлексом выпрямления и быть в состоянии поддерживать себя в положении грудины до того, как их снова положат в восстановительную переноску. Восстановитель вводят исходя из веса кролика с диапазоном 0,1-1 мг/кг атипамезола.
4. Введите 5 мг/кг кетопрофена подкожно.
5. Удалите внутривенный катетер, как только кролик сможет удерживать себя в положении грудины. Поднесите марлевую салфетку к тому месту, где был удален катетер, чтобы остановить чрезмерное кровотечение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление катетера может происходить, когда кролик находится в переноске.
6. Перевезите кролика обратно в соответствующее жилищное учреждение.
7. Продолжайте подкожные инъекции 5 мг/кг кетопрофена в течение как минимум 3 дней после процедуры.
8. Наблюдайте за кроликом на предмет признаков дискомфорта, дистресса, боли и членовредительства один раз в день в течение как минимум 3 дней после процедуры. Если у кролика проявляется какой-либо из этих клинических признаков, лечение кетопрофеном может быть продлено. Записывайте и контролируйте массу тела для оценки признаков анорексии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кетопрофен назначают в зависимости от веса кролика в диапазоне 2-5 мг/кг. Его можно вводить каждые 24 часа в течение 5 дней после внутрипротоковой инфузии для уменьшения воспаления и минимизации рубцевания. Чтобы свести к минимуму побочные эффекты, такие как изъязвления кожи или другие проблемы, связанные с заживлением ран, нанесите лидокаин местно на место инъекции. Любое животное, проявляющее постоянные признаки дискомфорта, дистресса, боли или травмы после лечения кетопрофеном, должно быть усыплено.

5. Анализ тканей

1. Внутривенно вводят раствор эвтаназии (пентобарбитал натрия и фенитоин натрия) в дозе 100 мг/кг. Через 60 с проверьте признаки жизни путем пощипывания пальцев ног/ушей, признаков дыхания или сердцебиения, роговичного рефлекса и/или стимуляции зрачков.
2. Проведите вскрытие для получения ткани молочной железы (молочных желез) и процесса для рутинной процедуры заделки парафина через 24-36 ч в 10% нейтральном буферизованном формалине¹⁸. Затем проводят стандартное окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и/или иммуногистохимическое окрашивание маркером, специфичным для типа клеток, чтобы помочь в желаемых показаниях анализа¹⁸. Утилизируйте тушу в соответствии с надлежащим протоколом утилизации (например, сжигание).
3. Анализируйте ткани молочной железы после консультации с патологоанатомом. Используйте компьютерную программу для количественной оценки скорости абляции и сопутствующего повреждения тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ тканей был проведен на 4-месячных кроликах новозеландской белой породы в течение одного часа после инфузии (Рисунок 4) с помощью программного обеспечения QuPath Open Software for Bioimage Analysis (https://qupath.github.io/). Этот анализ основан только на тканях, окрашенных H&E. QuPath или аналогичное компьютерное программное обеспечение требует ввода и калибровки патологоанатомом. Некоторые клетки могут быть неправильно классифицированы только по морфологическим признакам (рис. 4). Использование маркеров, специфичных для типа клеток, таких как цитокератины и α-гладкомышечный актин, может быть использовано для улучшения компьютерной классификации⁶. В конечном счете, анализ клеточной классификации должен быть курирован и проверен патологоанатомом.

Результаты

Каждая из 8 молочных желез самки кролика содержит 4 протоковых дерева, которые открываются у независимых отверстий соска (рис. 2). Из-за разницы в размерах и количестве протоковых деревьев на молочную железу у грызунов (всего 1 проток на молочную железу), кролики являются хорошей промежуточной моделью для человеческого перевода. Мы можем ввести до 400 μL 10-70% раствора EtOH для заполнения всего протокового дерева любой молочной железы 4-месячных кроликов новозеландской белой породы (Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4 ^4,8,9). Аблятивным раствором можно ввести до 4 протоковых деревьев в 8 молочных желез за один сеанс. Типичный план эксперимента заключается во введении 2-3 протоковых деревьев в пределах одной молочной железы в 4 молочных железах специальным абляционным раствором, содержащим рентгеновское контрастное вещество на основе йода (Рисунок 2,  Рисунок 3). Для абляционного раствора, содержащего иогексол (90-300 мг йода/мл), рентгеноскопию проводят во время и/или после каждой инфузии для определения индивидуального успеха введения частичного или полного количества инфузионного раствора в каждом протоковом дереве (рис. 2, рис. 3). Забор ткани молочной железы позволяет оценить, как изменения в рецептуре влияют на разрушение эпителиальных клеток молочной железы (Рисунок 4). Эти визуализирующие анализы предоставляют информацию, позволяющую понять наиболее подходящее решение для достижения максимальной абляции при минимизации повреждения окружающих тканей. Мы определили, что 10% раствор EtOH обеспечивает сопоставимую скорость абляции с абляционными растворами, содержащими более высокий процент EtOH (рис. 4).

Рисунок 1: Рабочий процесс внутрипротоковой процедуры. Выделены ключевые этапы процедуры идентификации. Пожалуйста, посмотрите видео для получения более подробной информации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Основные этапы внутрипротоковой канюляции и инфузии. (А) Инъекция физиологического раствора перпендикулярно соску для расширения отверстий протоков для канюляции (вид в срединной плоскости). (B) Канюляция и заполнение протокового дерева (D1) можно отслеживать с помощью синего красителя в абляционном растворе (вид в срединной плоскости). (C) Рентгеноскопическая визуализация в режиме реального времени обеспечивает точный мониторинг заполнения протокового дерева (D1) с высоким разрешением йогексолом в абляционном растворе (вид в дорсальной плоскости). Отверстия в виде дерева воздуховодов нумеруются слева направо, начиная с верхнего квадранта (D1, левый верхний квадрант) и заканчивая нижним квадрантом (D4, правый нижний квадрант). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Размер соски и успешная доставка абляционного раствора в несколько воздуховодов. Типичное представление размеров сосков у кроликов новозеландской белой породы. Размер соски варьируется в зависимости от веса и возраста кролика. Молочные железы пронумерованы от верхнего левого угла (L1, левый шейный) до нижнего правого (R8, правый паховый). Все изображения показаны в дорсальной плоскости. (A) Девственный кролик весом 2,8 кг (вверху) с меньшими сосками, трудно поддающийся канюлированию, девственный кролик весом 3,5 кг (средний) с подходящими сосками для канюляции, и многородящий кролик весом 4,1 кг (внизу) с большими сосками, который гораздо легче канюлируется. (В) Синий пищевой краситель в инфузионном растворе может быть использован in vivo в качестве доказательства внутрипротоковой доставки и заполнения протокового дерева. Неудачная инфузия обозначается красным контуром (доставка жирового пакета, верх), а успешные инфузии – синим контуром (внутрипротоковая доставка, середина и низ). 70% раствор EtOH вызывает больше повреждений кожи (эритема) через несколько минут после инфузии (темно-синий, средняя панель) по сравнению с 10% раствором (светло-голубой, нижняя панель). (В) Рентгеноскопия предоставляет in vivo доказательства внутрипротокового рода. Неудачная инфузия (доставка жирового пакета, верхняя панель). Успешная последовательная инфузия сначала протокового D1 и второго протокового дерева D2 (нижняя левая панель). Рентгеноскопия в реальном времени обеспечивает визуальное наведение на пломбирование (белыми стрелками) протокового дерева D3 (нижняя правая панель); Также видна линия разгибания, заполненная абляционным раствором, содержащим Iohexol, и щипцы для удержания соска. Масштабные линейки соответствуют 1 см на изображениях при разном увеличении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Анализ тканей молочных желез у новозеландских белых кроликов после внутрипротоковой процедуры абляционным раствором на основе этанола. (A-B) Репрезентативное H&E-окрашивание правой паховой молочной железы 4-месячного животного без абляционного лечения по сравнению с правой паховой молочной железой другого животного с 10% абляционным лечением EtOH. Срезы тканей разрезаются по срединной плоскости, поэтому D1 и D3 (деревья левых протоков) представлены на одних и тех же срезах ткани. На снимке всей ткани (А) и снимке с большим увеличением (В) показаны морфологические и хроматические эффекты абляции EtOH на окрашивание H&E (верхние панели) и выведены классы эпителиальных и стромальных клеток на основе компьютерно обученного классификатора (нижние панели). Черная масштабная линейка соответствует 1 мм в А , а белая масштабная линейка — 100 мкм в В. (C) Линейка графика показывает распределение классов клеток в протоковых деревьях (n > 4 в группе), обработанных различными концентрациями EtOH или оставленных необработанными. Звездочками обозначено p-значение непарного t-критерия Уэлча для каждого класса клеток в каждой группе по сравнению с соответствующим классом клеток в группе с 10% EtOH (* <0,05, ** < 0,01, **** <0,0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

В наших предыдущих исследованиях мы показали, что доставка ID, содержащая 70% EtOH, удаляет эпителиальные клетки молочной железы, вызывая при этом минимальное повреждение окружающих тканей у грызунов ^6,7. В этой процедуре мы продемонстрировали, что инфузия аблятивного раствора может быть масштабирована до модели кролика. В частности, в этой более крупной модели с многопротоковой древовидной системой мы демонстрируем, что последовательная инфузия всех протоков в молочной железе может быть успешно инфуцирована. Это представляет собой следующий этап в превращении этой абляционной процедуры в жизнеспособную альтернативу профилактической мастэктомии для первичной профилактики у лиц с высоким риском.

Одобренное FDA рентгеновское контрастное вещество на основе йода Omnipaque (иогексол) позволяет нам оценить успех инфузии путем визуализации процесса доставки раствора через протоковое дерево в режиме реального времени. Использование рентгеноскопии для визуализации инфузионной молочной железы тесно связано с тем, что, вероятно, будет оборудованием и инструментами, используемыми для проведения этой процедуры под визуальным контролем в клинике^10,11. Этот метод визуализации позволит нам знать, когда следует прекратить инфузию, что делает рентгеноскопию в реальном времени ключевым компонентом клинической реализации этой абляционной процедуры. Мы установили масштабируемость этой процедуры от грызунов до кроличьих протоковых деревьев, но необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить процент этиленоксида, который наилучшим образом удаляет эпителиальные клетки молочной железы, минимизируя повреждение окружающих тканей в этой более крупной животной модели. В этом протоколе основное внимание уделялось целесообразности внутрипротоковой инфузии и анализу тканей сразу после процедуры. Стратегии устранения неполадок и полезные советы подробно описаны в таблице 1. В то время как основное внимание в этом протоколе уделяется поставке абляционных растворов на основе этанола, этот протокол может быть использован в других приложениях для локальной доставки других визуализирующих реагентов, ген-модифицирующих систем, таких как CRISPR/Cas9, лентивирусных векторов, миРНК, факторов роста и/или канцерогенов ^2,3 для изучения других аспектов развития молочных желез и онкогенеза у кроликов.

В заключение, этот протокол предоставляет исследовательские инструменты, необходимые для проведения систематического и лонгитюдного исследования местных и системных эффектов различных абляционных растворов. Эта информация позволит определить безопасность данной процедуры и выявить любые опасения, связанные с дальнейшими разработками и клинической оценкой в первых клинических испытаниях на людях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10-кратное увеличительное стекло со светом и зажимом, большая гусиная шея	Амазонка	B0D982JCZ2	Для визуализации сосков
Инсулиновые шприцы Exel International	Научный центр Фишера	14-841-31	Для перипротоковых инъекций физиологического раствора
Объемные тупые иглы калибра 27 длина 0,5	Инфузионные технологии SAI	B27-50 100 Сыпучий	Для внутрипротоковой канюляции
Эванс синий	Сигма	Э2129-50Г	Для визуализации молочных желез
Рентгеноскопическая система рентгеновской визуализации	GE HealthCare	DT-C31-01	Для получения изображений флуроскопии
Ветеринарное согревающее одеяло HotDog	Хотдог	WC71V	Для внутрипротоковой процедуры/предоперационной подготовки
Удлинители мужские-женские, длина 12 дюймов	Инфузионные технологии SAI	EXT-12	Для внутрипротоковой процедуры
Omnipaque 500 мл (350 мг йода/мл)	GE Healthcare	0407-1414-72	Контрастное вещество для рентгеновской визуализации (рентгеноскопии)
Стерильный синий пищевой краситель	Маккормик	930641	Для визуализации молочных желез
Стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS)	ТермоФишер	14190250	Для приготовления раствора
Шприцы	БД	309659	Для внутрипротоковой инфузии
V-гель	Доксинновент	Д30001 - 30006	Для интубации (каталожный номер зависит от размера V-геля)
Кетопрофен	Коветрус	#005488	Для обезболивания
кетамин	Коветрус	71069	Для обезболивания
Лидокаин для местного применения	Коверт	70859	Для обезболивания
ксилазин	Коветрус	80907	Для анестезии
Эвтасол	Коветрус	#009444	Для эвтаназии
Лубрикант для глаз	Коветрус	75848	Для анестезии
атипамезол	Коветрус	82124	Для анестезии
Банановые чипсы	Био-Серв	#F7161	Для акклиматизации
Драгоценные камни Furity	Био-Серв	#F5136-1	Для акклиматизации
Капли для йогурта	Био-Серв	#F7200-1	Для акклиматизации