Методическая статья

Многоразовый инструмент для печёночной визуализации: многоразовый 3D-печатный инструмент для печёночной интравитальной микроскопии

DOI:

10.3791/68337

⸱

17 марта 2026 г.

 ,  ,  , 
1Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge, 2Thoracic and GI Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 3Facultad de Ciencias Físicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências de Materiais, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal de Pernambuco

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол вводит передовой многоразовый инструмент для печёночной визуализации (RHIT) для интравитальной микроскопии (IVM) живых мышей, который повышает стабильность тканей для быстрых и острых экспериментов. 3D-печатная конструкция RHIT обеспечивает экономичное производство, масштабируемость и универсальность, позволяя длительное наблюдение за метаболическими процессами у мышей разных размеров.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Функция и дисфункция печени можно оценить путем прямой визуализации динамических процессов печени с помощью конфокально-основанной интравитальной микроскопии (IVM). В частности, отличная пространственная и временная точность достигается при извлечении как качественной, так и количественной информации. На стадии микроскопа поддержание физиологического состояния тканей при достижении стабильности и повторяемости остаётся сложной задачей. Повышенный вес и содержание липидов в печени негативно влияют на этот процесс у животных моделей диабета II типа (T2D) и неалкогольной жировой болезни печени (МАЖБ). Чтобы преодолеть эти ограничения, мы создали RHIT — революционную конструкцию инструмента визуализации, которая улучшает доступ тканей и их стабильность. RHIT — это многоразовое, масштабируемое устройство для печёночной визуализации, изготовленное с помощью 3D-печати эффективным одноэтапным методом. Её размеры могут быть изменены для мышей разных размеров. Кратко, RHIT — это 3D-печатный аппарат для позиционирования и стабилизации лабораторных животных во время интравитальной печененной микроскопии, используемый после короткой хирургической подготовки для минимизации обращения, стресса и вариабельности. Его многоразовый, стандартизированный дизайн легко производится и настраивается, поддерживая различные размеры и потенциальные экспериментальные конструкции. Первоначальные результаты демонстрируют заметное улучшение стабильности и надёжности печёночной интравитальной визуализации, что позволяет детально визуализировать субклеточные структуры, такие как липидные капли. Эта повышенная точность способствует проведению метаболических и физиологических исследований с повышенной ясностью, воспроизводимостью и потенциалом продольных конструкций. Протокол предлагает стандартизированный и доступный подход, который решает давние технические проблемы в печёночном IVM.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Интравитальная микроскопия — это мощный инструмент для динамической визуализации биологических процессов in vivo 1,2,3 в отличие от традиционной иммунофлуоресцентной гистологии с фиксированной тканью или живыми клетками и анализом проточной цитометрии изолированных клеток. Для осмотра печени IVM применяется для изучения секреции и кровотокажелчи 4,5, мобилизацииглюкозы 6,7, непаренхимальныхклеток 8,9,10 и заболеванийпечени 11,12. Кроме того, в области исследования накопления липидов IVM позволяет в реальном времени получать информацию о динамике образования, роста и деградации липидных капель в живых тканях, например, визуализировать и количественно оценивать капи с высоким пространственным разрешением, а также прямую корреляцию накопления липидных капель с другими клеточными и физиологическимипроцессами 13. Несмотря на эти преимущества, IVM остаётся технически сложной задачей: она требует специализированного оборудования и знаний, может вызывать повреждение тканей, изменять поведение клеток и требовать инвазивных процедур. Традиционные in vivo исследования, основанные на поведенческом наблюдении, физиологическом мониторинге и генетическом анализе, предоставляют ценную информацию, но не имеют пространственного и временного разрешения, которое обеспечивает интравитальная микроскопия.

Первая серьёзная проблема с IVM — контроль нестабильности артефактов, вызванных сердцебиением и дыханием исследуемого животного, что может ухудшить качество изображения и привести к затуманенным или искажённым изображениям наблюдаемыхбиологических процессов 15. Попытки исправить это с помощью обработки изображений часто приводят к потере важной пространственной и временной информации или требуют современного хирургического оборудования и обслуживания16,17. Во-вторых, мышиные модели для исследований заболеваний печени, такие как MAFLD и T2D, часто имеют ожирение и, следовательно, труднее стабилизируются из-за увеличенного размера и содержания липидов втканях 16,18. В моделях мышей с ожирением NAFLD и T2D увеличение массы тела создаёт механические трудности для интравитальной визуализации, превышая нагрузку стандартных стадий микроскопа и усложняя стабилизацию животных19. Этот дополнительный вес увеличивает риск артефактов движения и сжатия тканей, которые снижают точностьвизуализации 20.

Одновременно повышенное содержание липидов в печени увеличивает непрозрачность тканей и рассеяние света, что ухудшает разрешение изображения и контраст. Эти эффекты часто усугубляются метаболическими сопутствующими заболеваниями, такими как изменённая перфузия и воспаление, что дополнительно снижает распределение красителя и ясностьсигнала 21. Наконец, поддерживать физиологию и биологическую активность тканей может быть сложно и ухудшает повторяемость. Кроме того, стабильное положение печени на стадии микроскопа во время IVM имеет решающее значение для предотвращения механического напряжения или повреждениятканей 7. Обнажение тканей печени — деликатная процедура, требующая технической точности для предотвращения сильного кровотечения и повреждения паренхимыпечени 7. Чтобы уменьшить артефакты движения, грудная клетка мыши ранее поднималась с микроскопа с помощью картона, что позволяло гравитации оттащить печень от остальной частитела. Хотя этот подход оказался успешным в получении количественных данных, картонный материал неустойчив, так как теряет форму и его трудно чистить. Кроме того, сложно изменить размеры картонной вставки для моделей мышей с ожирением.

В последние годы появились несколько передовых методов печёночной интравитальной микроскопии, включая сканирующую световую микроскопию и вычислительно улучшенные оптические системы, которые показали улучшение пространственно-временного разрешения23, снижениефототоксичности 24, увеличенную глубину изображения25,26 и подавление артефактовдвижения 27. Эти достижения, как показаны недавнимиисследованиями 28, 29 и 30, представляют собой важный технологический прогресс в этой области. В этой статье представлен многоразовый инструмент для печеночной визуализации (RHIT) — инновационный инструмент для IVM печени мышей. RHIT вносит вклад в этот развивающийся ландшафт, предлагая масштабируемый и многоразовый инструмент, который повышает механическую стабильность и доступность тканей на различных животных моделях, включая тех, у кого есть метаболические заболевания. Его дизайн решает постоянные проблемы движения, вариабельности и сложности установки, интегрируя анатомическую подгонку, воспроизводимость постановок и простоту использования. Совместимость RHIT как с традиционными, так и с современными методами визуализации расширяет возможности этих новых методов, способствуя надёжной и физиологически стабильной внутрижизненной визуализации печени.

Хотя были предложены различные методы стабилизации ткани во время IVM, такие как хирургическоеокно 9,31,32,33,34,35,36 и индивидуально собранный акриловый этап 6,37, эти методы также вводят множество ограничений и сложностей в отношении масштабируемости, воспроизводимости и хирургических навыков. Для сравнения, RHIT функционально отличается своей целью и дизайном. Он не использует прямую компрессию или гель-вложение38. Вместо этого RHIT служит масштабируемым, многоразово используемым, анатомически оформленным инструментом, который поддерживает изоляцию печени с помощью гравитационного положения, сохраняя физиологическую ориентацию без ограничения и искажения ткани. Критически важно, что RHIT улучшает воспроизводимость данных, точность изображения и процедурную согласованность при широком диапазоне размеров мышей. Это устраняет необходимость в гелях, клеях или сложных хирургических интерфейсах, одновременно упрощая выравнивание тканей и контроль температуры. Кроме того, RHIT — это специализированный инструмент, соединяющий животное с микроскопом, разработанный для поддержки как физиологической поддержки, так и точности визуализации.

RHIT напрямую решает механические и оптические задачи метаболически компрометированных моделей с помощью масштабируемой геометрии, которая учитывает более крупные размеры животных и равномерно распределяет вес для минимизации нестабильности платформы. Углублённое отверстие печени стабилизирует ткань с помощью гравитации без сжимающей силы, обеспечивая постоянный доступ и уменьшая движение во время визуализации. Его многоразовый, химически инертный дизайн обеспечивает совместимость с биологическими тканями и поддерживает гигиеническое повторное использование. Обеспечивая стабильное позиционирование, минимизацию артефактов движения и поддержание целостности тканей, RHIT обеспечивает фундаментальный прогресс в процессах внутривитальной микроскопии. Его адаптивность и доступность с открытым исходным кодом дополнительно способствуют широкой полезности в лабораториях и на животных моделях, устанавливая новый стандарт для инструментов визуализации, поддерживающих как образец, так и систему визуализации.

Кроме того, коммерчески доступные нагреваемые ступени микроскопа могут требовать сложных установок и обработкимикроскопа 39. Они не масштабируются по образцу и, как правило, дороже, что делает их менее доступными для многих исследователей. Таким образом, многоразовая масштабируемая вставка важна для стандартизации IVM для различных животных моделей. Технология 3D-печати, также известная как аддитивное производство, становится всё более популярной в научныхлабораториях, меняя протоколы биохимии, физики и биологии. Для IVM используется 3D-технология для производства лёгких оптических окон для визуализации41,42, улучшения доступноститканей 43 и облегчения восстановления и реконструкциитканей 44. Таким образом, индивидуальный инструмент для стабилизации тканей, который, насколько нам известно, не был описан, представляет собой отличную возможность для применения 3D-печати для преодоления некоторых трудностей печеночного IVM.

RHIT создаётся с использованием одноэтапного метода 3D-печати и значительно улучшает стабилизацию тканей на длительное время. RHIT очень доступен и подходит для острых экспериментов IVM, требующих минимальной хирургической экспертизы. Кроме того, RHIT легко масштабируется по размеру животных и имеет низкую производственную стоимость. Наконец, мы показали, что RHIT обеспечивает стабильную флуоресцентную визуализацию с таймлапсом и улучшает стабильность тканей по сравнению с ранее использованной картонной вставкой. RHIT упрощает IVM гомеостаза липидов печени без прямого контакта или измеримого влияния на физиологические состояния. Таким образом, RHIT предоставляет конкурентное преимущество как ускоренный, многоразовый и адаптируемый вклад вIVM 34,36,45.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Конструкция RHIT. (A) Конструкция и размеры 3,0 мм RHIT, масштабированные для мыши с ожирением. Вид с лицевой стороны (слева) показывает размеры, расположение и размер отверстия ткани, а также ориентацию мыши во время визуализации. Боковой вид (справа) показывает размеры и указывает положение грелки и вставки температурного датчика. Параметры масштабирования для разных размеров мышей приведены в таблице 1. (B) 3D enface view RHIT, сгенерированный из открытого файла STL, показывающий, куда провод ректального зонда вставляется через пользовательский порт (помечен размеры вставки ректального зонда, показанные в правом верхнем углу). (C) Техническая сборка RHIT, показывающая интеграцию нагревательного устройства и индивидуальных структурных вставок для различных размеров RHIT, провод вставляется в ректальный зондовый вставку для доступа температурного датчика. Сокращение: RHIT = многоразовый инструмент для печёночной визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

RHIT изначально был разработан как однокомпонентная сборка с использованием ABS (акрилонитрил-бутадиен стирол), широко используемого термопластичного полимера для моделирования сплавленного осаждения (3D-печать). ABS предлагает несколько преимуществ для этого применения: он лёгкий, термостойкий (температура плавления ~200 °C) и обладает хорошей ударостойкостью46, 47, 48. Конструкция RHIT использует регулируемую плотность ABS, позволяя ему поглощать физиологические движения, такие как сердцебиение и дыхание. Увеличенная плотность заполнения улучшает демпфирование движения, что приводит к большей стабильности изображения и улучшению качества изображения.

RHIT предназначен для поглощения движения путём корректировки плотности химически инертного материала, такого как ABS. В этом контексте плотность относится именно к внутреннему проценту заполнения, используемому при 3D-печати, что влияет на жёсткость и способность платформы снижатьвибрацию 49,50,51. Увеличение плотности ABS зафиксировано снижает передачу движений, вызванную сердцебиением и дыханием, что обеспечивает стабильную платформу для визуализации и улучшает качество изображения. Мы протестировали конструкции RIT с разной плотностью внутреннего заполнения (20-100%) и качественно наблюдали, что конфигурации с высокой плотностью приводят к заметному снижению артефактов движения при интравитальной визуализации печени у мышей. Формальная количественная оценка не проводилась, так как конфигурация с высокой плотностью оказалась достаточно прочной и эффективной для всех тестируемых размеров RHIT, а также стабильно обеспечивала надёжную работу при рутинных условиях визуализации. Для большинства пользователей такая стандартная плотность будет удобна без дополнительных изменений. Однако для экспериментов, требующих специфических механических характеристик, плотность заполнения и параметры конструкции могут быть изменены, а также предоставлены полные инструкции по 3D-печати для поддержки такой настройки.

Для печати могут использоваться альтернативные материалы; однако ABS является предпочтительным материалом для изготовления RHIT, поскольку он обладает рядом ключевых преимуществ. Он химически инертный, минимизируя риск взаимодействия с тканями или биологическими жидкостями, и нерастворим в воде, что обеспечивает эффективную очистку, хранение и повторное использование. Эти свойства делают ABS надёжным и долговечным выбором для экспериментального использования. Когда доступ к принтеру для моделирования сплавленного осаджения ограничен, можно использовать другие техники и материалы для 3D-печати. Стереолитография, селективное лазерное спекание и многоструйный термоядерный синтез подходят для использования таких материалов, как нейлон, фотополимерные смолы или композитные порошки. Нейлон обеспечивает долговечность и гибкость, тогда как стереолитографические смолы обеспечивают высокое разрешение для задач, требующих мелких структурных деталей. Дизайн RHIT легко адаптируется к допускам и ограничениям различных материалов, что делает его совместимым с различными печатными платформами. Пользователям следует выбирать материалы на основе механической устойчивости, биосовместимости, совместимости с рабочими процессами изображения и доступных печатных ресурсов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все исследования на животных проводились на объектах Национальных институтов здоровья в соответствии с руководящими принципами и протоколами, санкционированными Этическим комитетом по экспериментам на животных (протокол No LCMB-037). Весь персонал обязан пройти должную подготовку перед выполнением следующих протоколов. Обращение с животными проводилось в соответствии с институциональными рекомендациями.

Протокол RHIT описывает подготовку многоразовых инструментов для печёночной визуализации (RHITs) для использования в экспериментах внутривитальной микроскопии (IVM). Экспериментальные процедуры проводятся в стерилизированной микроскопической комнате или капюшоне и включают ряд этапов: сначала печать RHIT, анестезия и флуоресцентная маркировка мыши, затем установка микроскопа, затем хирургическая процедура и, наконец, нанесение IVM с помощью RHIT. На рисунках 1 и рисунке 2 показаны необходимые компоненты для визуализации живых образцов с помощью конфокального микроскопа, включая металлическую вставку 5,6,7 (адаптер для изображения живых образцов) для установки RHIT, а также RHIT для использования при продвинутой или контролируемой стеатозе. Для тестирования системы были взяты самцы C57BL/6J Mus musculus в возрасте 6-10 недель и кормлены стандартной или западной диетой в течение 8-10 недель до эксперимента.

1. Проектирование RHIT с модификациями

  1. Чтобы воссоздать RHIT, используйте программное обеспечение для 3D-проектирования продуктов (см. Таблицу материалов). Откройте программное обеспечение для проектирования и создайте новую стандартную деталь. Сохраните файл с соответствующим описанием.
  2. Создайте эскиз RHIT на передней плоскости с помощью функции Create 2D Sketch .
    1. Кликните на иконку прямоугольника и разместите его нижний левый угол в начале плоскости эскиза.
    2. Нарисуйте второй прямоугольник внутри первого, чтобы представить окно визуализации RHIT.
    3. Добавьте размерности к обоим прямоугольникам с помощью особенности Dimension , гарантируя, что все длины и ширины соотносятся с началом координат и относительно друг друга.
    4. Регулируйте размеры RHIT в зависимости от размера мыши.
    5. Добавьте толщину RHIT, выбрав только внешний прямоугольник и нажав на extrude. Когда появляется всплывающее окно, выберите эскиз с помощью инструмента Extrude , чтобы оставить отверстие в центре.
    6. Выберите нижнюю поверхность экструдированного RHIT и начните новый 2D-эскиз с помощью функции Start 2D Sketch .
  3. Нарисуйте прямоугольник, чтобы определить карман для грелки. Примените полученные размеры с помощью функции Dimension .
    1. Выйдите из 2D-эскиза и выполните удаление материала с помощью инструмента Cut Extrude , чтобы создать глубокую полость для нагревательной площадки.
  4. Начните новый эскиз температурного датчика на той же поверхности, что и полость. Нажмите «Начать 2D-эскиз » и выберите иконку круга . Разместите окружность на поверхности плоскости и соответствуйте её размерам. Выйдите из режима эскиза .
    1. Нажмите на extrude и выберите эскиз круга. В режиме extrusion нажмите на вырезать экструду и дождитесь, когда появится всплывающее окно с опцией «сквозь все» для удаления материала. Нажмите OK. Выйти из режима экструзии .
    2. Добавьте филе по краям окна, кликнув по значку филе и выбрав все восемь острых краёв. Добавьте размер филе и режим выхода из филе .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется дополнительное поглощение движений, пользователи могут увеличить внутреннюю плотность заполнения во время подготовки к 3D-печати.
  5. Подготовьте модель к 3D-печати, перейдя на вкладку среды и выбрав вкладку 3D-печати .
    1. Используйте функцию Set Orientation , чтобы убедиться, что модель лежит ровно на печатной платформе, а не вертикально.
    2. Нажмите на «Опции печати», чтобы настроить настройки устройства и при необходимости отрегулировать масштаб.
    3. Сохраните финальную модель. Формат STL с использованием функции экспорта STL .
    4. Выйдите из вкладки окружения и нажмите « Сохранить», чтобы сохранить RHIT как надёжную часть.
  6. Закройте программу дизайна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что принтер совместим с . Формат файла STL или конвертация в соответствующий формат в зависимости от программного обеспечения для 3D-принтера.

2. Загрузка и печать RHIT из STL-файлов

  1. Импортируйте .stl-файл из рисунка 1A или дополнительного файла 1 в программное обеспечение для 3D-автоматизированного проектирования (CAD), нажав Импорт и выбрав .stl-файл. Нажмите кнопку «Подготовить », чтобы разрезать модель на тонкие слои для 3D-печати.
  2. Выберите подходящий коммерческий 3D-принтер и нажмите «Печать». Затем следите за ходом печати, а после завершения печати удаляйте и очищайте 3D-напечатанный объект по мере необходимости.
Размер мышиВес тела мыши (g)Толщина RHIT (мм)Размер окна изображения L X W (мм)
Малый (S)17-201.517 x 17
Средний (М)22-252.521 x 21
Большой (L)35-40326 x 26

Таблица 1: Масштабирование размера мыши до RHIT. Вес мыши масштабируется до толщины RHIT, где вес более 30 г (наконечник стрелки) соответствует наибольшему RHIT (3,0 мм). Самая лёгкая мышь соответствует самой тонкой RHIT, а тучные мыши представлены самым толстым RHIT. Эти размеры можно регулировать в CAD-программном обеспечении. Длина RHIT и отверстие изображения могут варьироваться в зависимости от расположения органа используемого образца; постоянная длина и апертура изображения для всех трёх RHITS подходили для этого исследования. Сокращения: RHIT = многоразовый инструмент для печёночной визуализации; CAD = автоматизированное проектирование.

3. Подготовка микроскопа и использование RHIT

figure-protocol-1
Рисунок 2: IVM печени с использованием техники RHIT. (A) Схема установки инвертированного конфокального микроскопа с анестезиированной мышью. (B) Для размещения мыши на стадии микроскопа для живой съёмки использовался металлический адаптер микроскопа (вставка). (C) 3D-печатный RHIT использовался с марлевой полосой для лёгкой обработки паренхимы печени. (D) Изображение предварительно экстерьеризированной печени перед позиционированием RHIT. Носовой конус использовался для анестезии до и во время операции. (E) Изображение внешней печени перед позиционированием RHIT во время острой процедуры. Бритьё не требовалось. (F) Изображение перевёрнутой мыши в финальном положении лицом вниз на RHIT для съёмки. (G) RHIT надёжно прикреплён к ступени микроскопа. (H) Мышь, расположенная на RHIT и металлическом адаптере. (I) Худощавые мыши (синяя стрелка) и ожиренные (зелёная стрелка) мыши, показанные с соответствующими чешуйчатыми вставками RHIT в J-L, изображают грубые анатомические изображения ожиренной и худой печени (соответственно). Высокое разрешение IVM изображает M, N печени у ожиренных и худощавых мышей, помеченных BODIPY (зелёным, изображаемым розовой стрелкой) для маркировки липидных капель, и Hoechst 33342 (белый, изображаемый голубой стрелкой) для маркировки ядер соответственно. Сокращения: RHIT = многоразовый инструмент для печёночной визуализации; IVM = интравитальная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Подготовьте обычный инвертированный конфокальный микроскоп для IVM печени, как показано на рисунке 2.
    1. Вставьте сценический адаптер для размещения сэмпла. Чтобы следовать этому протоколу, используйте индивидуально изготовленную металлическую вставку с круглым отверстием 35 мм и крышкой 40 мм.
    2. Тщательно очищайте обе стороны стекла перед и после каждого снимка с использованием 70% этанола, если это необходимо.
  2. Закрепите соответствующую RHIT по размеру мыши (Таблица 1) лентой (опционально), выровняя диафрагму RHIT с объективом и параллельно над скользящим слоем изображения (рисунок 2G) на металлической вставке с лентой на стекле крышки.
  3. Выбирайте объектив для съёмки на основе размера площади, пространственного разрешения и времени съёмки, например, водный объектив 25x/0,95.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя большее увеличение повышает разрешение, оно также увеличивает вероятность появления артефактов движения.
    1. Выровняйте объектив близко к стеклу крышки.
  4. Закрепите полоску марли (примерно 1 x 8 см, рисунок 2C,D) через окно RHIT скотчем, чтобы помочь позиционировать ткань и отделить её от других органов брюшной полости (рисунок 2C).
  5. Предварительное разогревание RHIT с помощью грелки, вставленной в слот, и закрепления теплового датчика рядом с RHIT (рисунок 2G,H) для поддержания температуры тела мыши во время съёмки.

4. Флуоресцентная маркировка и анестезия мышей

  1. Уменьшите стресс мыши, продезинфицируя камеру анестезии, чтобы убрать последние следы запаха животных.
  2. Включите кислородный конденсатор, систему охраны окружающей среды (EPS) и испаритель изофлурана.
  3. Поместите мышь в индукционную камеру и анестезируйте с использованием 2-3% изофлурана примерно 3-5 минут или до тех пор, пока у животного не появится стабильное дыхание и потеря выпрямления и педальных рефлексов.
    1. После анестезии перенесите мышь на грелку и поддерживайте анестезию, используя 1-2% изофлурана, подаваемого через носовой конус (рисунок 2D), корректируя по мере необходимости, чтобы обеспечить стабильную хирургическую плоскость анестезии на протяжении всей процедуры.
    2. Оцените глубину анестезии, проведя тест на сжатие пальца, чтобы наблюдать любое произвольное движение.
  4. Для маркировки структур, богатых липидами, введите 200 нмоль BODIPY 665/676, разбавленной в PBS (общий объём 200 мкл) через хвостовую вену с помощью инсулинового шприца на 31 G.
    1. Для оптимального сигнала вводите BODIPY один раз в день в течение двух последовательных дней до проведения визуализации. Дайте минимум 3-4 часа после второй инъекции для системного очищения фона и стабилизации сигнала в тканях.
  5. Для получения ядерного контраста введите Hoechst 33342 (2 мкг/г массы тела), разбавленный в растворе гепарина 1x (приготовленный путём смешивания 120 мкл гепарина с 180 мкл физиологического раствора для получения 400 Ед/мл) через ретроорбитальный синус с использованием инсулинового шприца на 31 G.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Hoechst вводят отдельно, чтобы избежать осадков при смешивании с другими красителями.
  6. Для визуализации сосудистой системы введите 18 мкг/г веса тела флуоресцентного декстрана (70 кДа), разбавленной в том же растворе 1x гепарина, описанном в шаге 4.5, через контралатеральный ретро-орбитальный синус с помощью инсулинового шприца на 31 Г (Таблица 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гепарин включён для уменьшения образования сгустков и обеспечения равномерного кровотока во время визуализации.
  7. Подождите 10-15 минут после инъекций Хёхста и декстрана, прежде чем начинать операцию и визуализацию.
Флуоресцентный репортёрНазначениеДоза на вес (или концентрация)
Hoechst 33342Ядра окрашивания2 мкг/г: дополнение объёма инъекции до 50 мкл раствором гепарина
Бодиби 665/676Окрашивание липидных капель0,8 мкг/г: дополнение объёма инъекции до 200 мкл в физиологическом растворе
2M тетраметилродамин-декстран (Декстран)Окрашивающая сосудистая система18 мкг/г: дополнение объёма инъекции до 50 мкл раствором гепарина

Таблица 2: Варианты люминесцентного репортёра. В этой таблице подробно описаны методы маркировки мышиных тканей для in vivo визуализации. Сначала готовят раствор гепарина, а затем используют для получения растворов DAPI-гепарина и декстран-гепарина7. Hoechst 33342 вводится ретро-орбитально в один глаз, а BODIPY — непосредственно в хвостовую вену за 2–3 дня до этого, с более высокой концентрацией у мышей с ожирением. Декстран вводится ретро-орбитально в другой глаз. Важно проводить ретро-орбитальные инъекции отдельно в каждый глаз. Аббревиатура: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол.

5. Операция на мыши

  1. Сбрийте брюшную шерсть с помощью машинки для стрижки и/или крема для удаления волос. Удалите остатки волос и используйте 70% этанола для очистки открытой кожи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от требований учреждения IACUC, может использоваться чередующий скраб бетадина и этанола для обеспечения надлежащей подготовки хирургического участка.
  2. Переоцените глубину анестезии перед операцией.
  3. Обнажите печень, сделав горизонтальный разрез в форме полумесяца диаметром 2-3 см под грудной клеткой хирургическими ножницами из ксифовидного мышца, заканчивающийся на левой боковой стороне верхней части живота.
  4. После начального разреза аккуратно сделайте меньший вторичный разрез в мышечном слое, чтобы открыть левую долю печени, затем прижгите (по желанию) при необходимости, чтобы избежать кровотечения (рисунок 2E).
    1. Предотвращайте тепловое повреждение печени при использовании каутеризатора, положив марлю, пропитанную физиологическим раствором, между печенью и мышечным слоем, чтобы поглотить исходящее тепло мышечного слоя.
    2. Избегайте чрезмерных кровотечений, хирургических или механических травм, а также внешней компрессии.
  5. После обнажения печени переведите мышь на стадию микроскопа.

6. Размещение мыши на стадии микроскопа

  1. Разместите живот обезболезненной мыши лицом вниз на платформу RHIT микроскопа.
    1. Отрегулируйте носовой конус так, чтобы мышь оставалась под анестезией.
    2. Используйте аппликатор с хлопковой наконечником, увлажнённым физиологическим раствором, чтобы аккуратно приблизить левую боковую долю печени к покрывающему слою, одновременно оказывая мягкое внешнее давление на грудную полость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте гравитацию, чтобы аккуратно вывести печень на стекло крышки.
    3. Используйте марлевую полоску, чтобы аккуратно отделить печень от тела мыши (рисунок 2E-H).
  2. Проверьте носовой конус ещё раз, чтобы убедиться, что мышь находится под анестезией во время обследования.
  3. Предотвращайте обезвоживание тканей, нанося гель на водную основу по краям открытой полости и избегая прямого контакта с грелкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание температуры и влажности также может поддерживаться микроскопом с закрытой камерой влажности 5,6,7.
  4. Нанесите глазную мазь на глаза, чтобы предотвратить пересыхание роговицы.
  5. Настройте таймлапс IVM для начала съёмки 7,52.
    1. Откройте лазерные затворы, оцените флуоресцентную маркировку и определите стабильную область интереса с заметным кровотоком. Выберите подходящие параметры получения изображения, включая формат изображения, скорость захвата, интервалы съёмки, общую продолжительность забора и усреднение строк/кадр (512 × 512 пикселей; 1-5 кадров с²¹ на регион; интервалы съёмки 5-30 с; общее время получения 5-20 минут; среднее значение строки по кадру 2-8, в зависимости от экспериментальных требований). Оптимизировать экспозицию флуоресцентной вспышки с учётом используемых флуорофоров.
    2. Определите верхнюю и нижнюю границы для Z-стеков , выбрав Z-стек в панели приобретения , отрегулировав верхнюю и нижнюю фокальные плоскости с помощью элементов Z-позиции и подтвердив диапазон с помощью Set First/Set Last; затем инициируйте таймлапс-запись, нажав Start Experiment (или Start Acquisition). По завершении визуализации усыпьте животное в соответствии с протоколами, одобренными комитетом по уходу и использованию животных.

figure-protocol-2
Рисунок 3: Измерение улучшенной печёночной IVM стабильности RHIT с помощью SSIM. Печеночная IVM нижней левой доли печени при трёх условиях стабилизации: (A) без вставка (NO), (B) картонная вставка и (C) RHI. Ткани маркируются BODIPY (пурпурные, липиды), Hoechst 33342 (зелёные, ядра) и Dextran (циан, сосудистые органы); панели A и B показывают видимые искажения и артефакты движения, тогда как C демонстрирует повышенную чёткость с RHIT. (D) Для количественной оценки устойчивости изображения был рассчитан индекс структурного сходства (SSIM). Полоски показывают среднее ± SEM, и каждая цветная точка представляет отдельную биологическую реплику: RHIT (n = 14), картон (n = 10), нет вставка (n = 8). Эти группы являются подмножествами из общей экспериментальной когорты примерно из 50–70 мышей. Только сессии, соответствующие определённым критериям изображения (например, согласованное выравнивание кадров и качество изображения), анализировались через SSIM. RHIT стабильно выражал более высокие значения SSIM (среднее 0,511 ± SEM), что свидетельствовало о повышении стабильности и разрешения в зависимости от условий визуализации. Шкала = 15 мкм. Показаны репрезентативные изображения; SSIM отражает серийные сеансы IVM без заметных повреждений или нарушений тканей. Сокращения: RHIT = многоразовый инструмент для печёночной визуализации; IVM = интравитальная микроскопия; SSIM = индекс структурного сходства; CARD = картонная вставка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RHIT был разработан с использованием CAD-приложения (рисунок 1). Размеры RHIT масштабируются для размещения малых, средних и крупных мышей (Таблица 1). Конструкция RHIT состоит из плоского материала ABS длиной 107,50 мм с апертурой, расположенной для съёмки печени. IVM проводилась при оптимальных (RHIT) и субоптимальных (без вставка или картона) условиях (см. рисунок 3A-C). Это иллюстрирует диап...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Интравитальная микроскопия печени была широко изучена, однако предыдущие методы часто требуют сильно инвазивных и нестандартизированных хирургических вмешательств для стабилизации терминальнойвизуализации 5,6,7,9,31,32. Движение, пожалуй, является самым сложным барьером, препятствующим воспро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Программой внутренних исследований при Национальном институте здравоохранения США, Национальным институтом рака и библиотекой NIH. Х. Санчес Корнехо благодарит перуанское агентство CONCYTEC за финансовую поддержку через грант No PE501087367-2024-PROCIENCIA. Мы хотим поблагодарить членов лаборатории Пората-Шлиома и сотрудников группы по квантовой физике Кембриджского университета за критическое чтение, сотрудников библиотеки NIH и Генети Гагу за техническую помощь. 3D-изображение на рисунке 2A было создано с помощью Biorender.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
½-дюймовая малярная лентаМалярная лента универсального назначения 3M:b40069428
40-мм укрытиеBioptech40-1313-03191
70% (v/v) этанолаТермо Фишер СайентификBP2818-470% этанола по объёму и 30% воды по объёму
Аппарат для анестезии: AMD-3 PlusСомниAMD-17106
Гель для ультразвуковой трансмиссии Aquasonic 100Лаборатории Паркера  01 08
BODIPY 665/67Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)B3932См. Таблицу 2
CAD-программное обеспечение (Autodesk Inventor или его аналог) Autodesk (представительское CAD-программное обеспечение)н/дПрограммное обеспечение
Система коагуляцииБлизнецыGEM 5917
Дезинфектант ClidoxФармацевтические исследовательские лаборатории Инк.VWR, MSPP-96118F
Конфокальный микроскоп (Leica SP8 или его аналог)LeicaSP8
Аппликаторы на ватном наконечникеПуританские медицинские продукты25-806 1WC
Индивидуально изготовленная алюминиевая вставка для ступени (толщина 3 мм, углубление 35 мм)Н/ДН/Д
FORANE (изофлуран, USP) жидкость для вдыхания, 250 млБакстер10019-360-60
Машинка для стрижки волос (по выбору)Onyx Fine InstrumentsASWRHC
Грелка с ректальным зондомНаучные инструменты ALAГРЕЛКА-1/2
Гепарин натрий, 1000 USP U/mLХикма0641-0391-12
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)62249См. Таблицу 2
Грелка для мышиНаучные инструменты ALAГРЕЛКА-1/2
Mus musculusЛаборатория ДжексонаC57BL/6Лабораторная мышь
Обычный физиологический раствор (0,9% хлорида натрия)Термо Фишер Сайентифик7210-16
RHIT (многоразовый инструмент для печёночной визуализации) соответствующий размерПредоставленоН/ДСм. Таблицу 1
Хирургические щипцы, изогнутый кончикТонкие научные инструменты11251-23
Хирургическая марляМаккессон6939
Хирургические ножницыТонкие научные инструменты14001-14
Тетраметилродамин декстранThermo Fisher Scientific (Invitrogen)D7139См. Таблицу 2
Ультратонкие шприцы U-100 с инсулином, 31 гБетти МиллсBD326730

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scheele, C. L. G. J., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 89(2022).
  2. Hor, J. L., Germain, R. N. Intravital and high-content multiplex imaging of the immune system. Trends Cell Biol. 32 (5), 406-420 (2022).
  3. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J Cell Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  4. Meyer, K., et al. A predictive 3D multi-scale model of biliary fluid dynamics in the liver lobule. Cell Syst. 4 (3), 277-290.e9 (2017).
  5. Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
  6. Acevedo-Acevedo, S., et al. LKB1 acts as a critical brake for the glucagon-mediated fasting response. Hepatol Commun. 6 (7), 1949-1961 (2022).
  7. Stefkovich, M. L., Kang, S. W. S., Porat-Shliom, N. Intravital microscopy for the study of hepatic glucose uptake. Curr Protoc. 1 (1), e139(2021).
  8. Zhang, X. Y., Sun, C. K., Wheatley, A. M. A novel approach to the quantification of hepatic stellate cells in intravital fluorescence microscopy of the liver using a computerized image analysis system. Microvasc Res. 60 (2), 232-240 (2000).
  9. Gola, A., et al. Commensal-driven immune zonation of the liver promotes host defence. Nature. 589 (7840), 131-136 (2021).
  10. Kamoun, W. S., Schmugge, S. J., Kraftchick, J. P., Clemens, M. G., Shin, M. C. Liver microcirculation analysis by red blood cell motion modeling in intravital microscopy images. IEEE Trans Biomed Eng. 55 (1), 162-170 (2008).
  11. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Front Immunol. 10 (1), 2988(2020).
  12. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  13. Soulet, D., Lamontagne-Proulx, J., Aube, B., Davalos, D. Multiphoton intravital microscopy in small animals: motion artefact challenges and technical solutions. J Microsc. 278 (1), 3-17 (2020).
  14. Mempel, T. R., Bauer, C. A. Intravital imaging of CD8+ T cell function in cancer. Clin Exp Metastasis. 26 (4), 311-327 (2009).
  15. Lee, S., Courties, G., Nahrendorf, M., Weissleder, R., Vinegoni, C. Motion characterization scheme to minimize motion artifacts in intravital microscopy. J Biomed Opt. 22 (3), 036005(2017).
  16. Rhodes, G. J. Surgical preparation of rats and mice for intravital microscopic imaging of abdominal organs. Methods. 128 (1), 129-138 (2017).
  17. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  18. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Front Immunol. 10 (1), 2988(2019).
  19. Dawson, C. A., et al. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nat Protoc. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  20. Murphy, K. J., Reed, D. A., Trpceski, M., Herrmann, D., Timpson, P. Quantifying and visualising the nuances of cellular dynamics in vivo using intravital imaging. Curr Opin Cell Biol. 72 (1), 41-53 (2021).
  21. Pereira, E. N. G. dS., et al. Hepatic microvascular dysfunction and increased advanced glycation end products are components of non-alcoholic fatty liver disease. PLoS One. 12 (6), e0179654(2017).
  22. Stefkovich, M. L., Kang, S. W. S., Porat-Shliom, N. Intravital microscopy for the study of hepatic glucose uptake. Curr Protoc. 1 (1), e139(2021).
  23. Lu, Z., et al. Long-term intravital subcellular imaging with confocal scanning light-field microscopy. Nat Biotechnol. 43 (4), 569-580 (2025).
  24. Lu, Z., et al. A practical guide to scanning light-field microscopy with digital adaptive optics. Nat Protoc. 17 (8), 1953-1979 (2022).
  25. Zhang, Y., et al. Computational optical sectioning with an incoherent multiscale scattering model for light-field microscopy. Nat Commun. 12 (1), 6391(2021).
  26. Zhao, Z., et al. Two-photon synthetic aperture microscopy for minimally invasive fast 3D imaging of native subcellular behaviors in deep tissue. Cell. 186 (11), 2475-2491.e22 (2023).
  27. Lu, Z., et al. Virtual-scanning light-field microscopy for robust snapshot high-resolution volumetric imaging. Nat Methods. 20 (5), 735-746 (2023).
  28. Chen, S., et al. Hepatocyte-specific Mas activation enhances lipophagy and fatty acid oxidation to protect against acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. J Hepatol. 78 (3), 543-557 (2023).
  29. Chen, S., et al. Myeloid-Mas signaling modulates pathogenic crosstalk among MYC+CD63+ endothelial cells, MMP12+ macrophages, and monocytes in acetaminophen-induced liver injury. Adv Sci. 11 (1), 2306066(2024).
  30. Wu, J., et al. Iterative tomography with digital adaptive optics permits hour-long intravital observation of 3D subcellular dynamics at millisecond scale. Cell. 184 (12), 3318-3332 (2021).
  31. Benechet, A. P., Ganzer, L., Iannacone, M. Intravital microscopy analysis of hepatic T cell dynamics. Methods Mol Biol. 1514 (1), 49-61 (2017).
  32. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following Leishmania infection: an assessment of hepatic hemodynamics. J Vis Exp. 98 (1), e52303(2015).
  33. Heymann, F., et al. Long-term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (98), e52607(2015).
  34. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128 (1), 12-19 (2017).
  35. Wang, J., Kubes, P. A reservoir of mature cavity macrophages that can rapidly invade visceral organs to affect tissue repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
  36. Wang, Y., Wang, J. Intravital imaging of inflammatory response in liver disease. Front Cell Dev Biol. 10 (1), 922041(2022).
  37. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  38. Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. J Vis Exp. 188 (1), e64239(2022).
  39. Liu, T. W., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, D. Multi-modal multi-spectral intravital microscopic imaging of signaling dynamics in real time during tumor-immune interactions. Cells. 10 (3), 499(2021).
  40. Burkovskiy, I., Lehmann, C., Jiang, C., Zhou, J. Utilization of 3D printing for an intravital microscopy platform to study the intestinal microcirculation. J Microsc. 264 (3), 224-226 (2016).
  41. Kuss, M., Crawford, A. J., Alimi, O. A., Hollingsworth, M. A., Duan, B. Three-dimensional printed abdominal imaging windows for in vivo imaging of deep-lying tissues. Machines. 10 (8), 697(2022).
  42. Xie, W., et al. 3D-printed lightweight dorsal skin fold chambers from PEEK reduce chamber-related animal distress. Sci Rep. 12 (1), 11599(2022).
  43. Burkovskiy, I., Lehmann, C., Jiang, C., Zhou, J. Utilization of 3D printing for an intravital microscopy platform to study the intestinal microcirculation. J Microsc. 264 (3), 224-226 (2016).
  44. Urciuolo, A., et al. Intravital three-dimensional bioprinting. Nat Biomed Eng. 4 (8), 901-915 (2020).
  45. Dul, S., Gutierrez, B. J. A., Pegoretti, A., Alvarez-Quintana, J., Fambri, L. 3D printing of ABS nanocomposites: comparison of processing and effects of multi-wall and single-wall carbon nanotubes on thermal, mechanical and electrical properties. J Mater Sci Technol. 121 (1), 52-66 (2022).
  46. Stansbury, J. W., Idacavage, M. J. 3D printing with polymers: challenges among expanding options and opportunities. Dent Mater. 32 (1), 54-64 (2016).
  47. Ligon, S. C., Liska, R., Stampfl, J., Gurr, M., Mulhaupt, R. Polymers for 3D printing and customized additive manufacturing. Chem Rev. 117 (15), 10212-10290 (2017).
  48. Das, A., et al. Current understanding and challenges in high-temperature additive manufacturing of engineering thermoplastic polymers. Addit Manuf. 34 (1), 101218(2020).
  49. Turaka, S., Jagannati, V., Pappula, B., Makgato, S. Impact of infill density on morphology and mechanical properties of 3D-printed ABS/CF-ABS composites using design of experiments. Heliyon. 10 (9), e29920(2024).
  50. Ahmad, M. N., Yahya, A. Effects of 3D printing parameters on mechanical properties of ABS samples. Designs. 7 (6), 136(2023).
  51. Nguyen, T. T., Tran, V. T., Nguyen, V., Nguyen, V. T. T. Effect of infill ratios in SLA 3D printing on mechanical properties of castable wax patterns for molded shells in investment casting. PLoS One. 20 (2), e0311245(2025).
  52. Acevedo-Acevedo, S., et al. LKB1 acts as a critical brake for the glucagon-mediated fasting response. Hepatol Commun. 6 (7), 1949-1961 (2022).
  53. Wang, Z., Bovik, A. C., Sheikh, H. R., Simoncelli, E. P. Image quality assessment: from error visibility to structural similarity. IEEE Trans Image Process. 13 (4), 600-612 (2004).
  54. Madhav, B. T. P., Rao, M. V. G., Pisipati, V. G. K. M. Identification of liquid crystalline phases in 7O.O9 compound based on structural similarity index measure. Liq Cryst. 42 (2), 198-203 (2015).
  55. Zhou, W., Bovik, A. C. A universal image quality index. IEEE Signal Process Lett. 9 (1), 81-84 (2002).
  56. Winkler, S. Human Vision and Electronic Imaging IV. , 175-184 (1999).
  57. Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Front Cell Dev Biol. 8 (1), 620471(2020).
  58. Matsumoto, S., Kikuta, J., Ishii, M. Intravital Imaging of Dynamic Bone and Immune Systems: Methods and Protocols. Ishii, M. , 137-143 (2018).
  59. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  60. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (5), 551-558 (2013).
  61. Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. J Vis Exp. 188 (1), e64239(2022).
  62. de Paz, J. L., et al. Profiling heparin-chemokine interactions using synthetic tools. ACS Chem Biol. 2 (11), 735-744 (2007).
  63. Taqueti, V. R., Jaffer, F. A. High-resolution molecular imaging via intravital microscopy: illuminating vascular biology in vivo. Integr Biol (Camb). 5 (3), 278-290 (2013).
  64. Freund, J. B., Goetz, J. G., Hill, K. L., Vermot, J. Fluid flows and forces in development: functions, features and biophysical principles. Development. 139 (7), 1229-1245 (2012).
  65. Tabira, K., et al. An in vitro study of digital impressions and three-dimensional printed models of orbital defects using mobile devices and monoscopic photogrammetry. J Oral Sci. 65 (2), 127-130 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи