Генетически кодируемые биосенсоры на основе флуорофоров для ратиометрической флуоресцентной визуализации микробов

Краткое содержание

Этот протокол описывает применение генетически кодируемых биосенсоров на основе флуорофоров у микробов для количественной ратометрической флуоресцентной визуализации в контролируемых условиях. Интегрируя эти стратегии биосенсорики с передовыми методами визуализации, метод позволяет проводить анализ с высоким разрешением в режиме реального времени на уровне отдельных клеток, обеспечивая более глубокое понимание динамики малых молекул.

Аннотация

Изучение динамики малых молекул в микробах имеет важное значение для всесторонних исследований микробной функции. Как внутриорганизмовая, так и межорганизменная динамика малых молекул играют решающую роль в физиологии микробов, симбиозе и болезнях. Тем не менее, мониторинг этой динамики с использованием большинства существующих методов остается очень сложным. Генетически кодируемые биосенсоры на основе флуорофоров являются мощными инструментами для отслеживания динамики малых молекул in vivo и обладают большим потенциалом для новых открытий. Эти биосенсоры чаще всего используются при флуоресцентной визуализации, часто в сочетании с перфузионными устройствами, которые позволяют точно контролировать условия окружающей среды. При интеграции с передовыми методами визуализации этот подход позволяет получать данные с высоким разрешением, пространственным и временным разрешением, что позволяет получить представление о реакциях микроорганизмов отдельных клеток. Несмотря на их перспективы, внедрение таких биосенсоров остается технически сложным. Понимание ключевых шагов имеет решающее значение для более широкого внедрения. В этой статье мы представляем протокол, предназначенный для поддержки эффективного развертывания недавно разработанных биосенсоров в микробах для количественной ратометрической флуоресцентной визуализации в контролируемых условиях.

Введение

Биосенсоры на основе интенсивности одного флуорофора и биосенсоры с двумя флуорофорами широко используются исследователями для различных применений:¹. В некоторых исследованиях использовался мультиплексный биосенсорный анализ для одновременного отслеживания нескольких сигналов в одних и тех же клетках². Многие из этих биосенсоров полагаются на лиганд-связывающие домены, в которых события связывания вызывают конформационные изменения, изменяющие флуоресцентные свойства ^3,4. Генетически кодированные биосенсоры стали незаменимыми инструментами для визуализации in vivo в различных системах⁵, обеспечивая мониторинг уровней ионов и метаболитов в пространстве и времени^с высоким разрешением. Ранние биосенсоры, однако, были ограничены в динамическом диапазоне и соотношении сигнал/шум (SNR)⁶. Последние достижения в области интенсиометрических биосенсоров с одним флуорофором на основе конформационно чувствительных флуоресцентных белков (csFP) значительно улучшили производительность. Тем не менее, вариации уровней экспрессии белка могут влиять на измерения in vivo с использованием генетически кодируемых биосенсоров на основе флуорофоров⁶, которые обычно используются для визуализации сигнальных молекул и метаболитов в живых клетках ^7,8. Интенсиометрические биосенсоры с одним флуорофором не позволяют нормализовать уровни экспрессии биосенсоров, которые могут колебаться in vivo. Включение эталонного флуоресцентного белка, однако, может преобразовать биосенсоры с одним флуорофором в версии с двойным флуорофором, что обеспечивает более надежное количественное определение⁹. Из-за потерь энергии от неизлучательных процессов спектр флуоресцентного излучения смещается относительно спектра поглощения, явление, известное как сдвиг Стокса¹⁰. Большие флуоресцентные белки со сдвигом Стокса (LSSFP) были использованы в качестве оптимальных референсных флуорофоров в биосенсорах^с двойным флуорофором ^9,11. Недавним достижением является разработка монохроматически возбудимых биосенсоров Green-Apple (GA) Matryoshka, известных как GA-MatryoshCaMP6s, которые включают в себя красный LSSFP, называемый LSSmApple¹². В сочетании с микроустройствами, такими как микрофлюидные системы, генетически кодируемые биосенсоры на основе флуорофоров предлагают минимально инвазивный подход к количественной ратиометрической визуализации с использованием таких методов, как конфокальная микроскопия. Эта интеграция обеспечивает высокоскоростную визуализацию и мониторинг динамики малых молекул в отдельных клетках в режиме реального времени в условиях воздействия окружающей среды. Например, в дрожжах успешно применяются биосенсоры цАМФ и глюкозы. При использовании в сочетании с мутантными штаммами эти биосенсоры помогли пролить свет на ключевые регуляторные сети, регулирующие поглощение сахара^13,14. Несмотря на значительный прогресс, эти технологии еще не полностью раскрыли свой потенциал для исследования критических биологических вопросов, связанных с динамикой малых молекул in vivo¹⁵. В результате их широкое внедрение в лабораториях остается ограниченным, а стандартизированные методологии для более широкого внедрения все еще отсутствуют.

По сравнению с традиционными методологиями, основанными на нератиометрических однофлуорофорных биосенсорах или объемных измерениях, наш протокол, основанный на биосенсорах GA Matryoshka, позволяет получать визуализацию одиночных клеток с высоким разрешением и количественным ратиометрическим анализом. Интегрируя большой флуорофор со сдвигом Стокса в качестве внутреннего эталона, метод компенсирует вариабельность экспрессии биосенсора, что является ключевым ограничением более ранних конструкций. Кроме того, комбинация с микрофлюидными устройствами позволяет точно контролировать условия окружающей среды, обеспечивая улучшение по сравнению с обычными перфузионными камерами или статическими системами культивирования¹². Этот подход также дает явные преимущества для изучения динамических взаимодействий между микробами и их хозяевами, таких как взаимодействия растений и патогенов и симбиотические ассоциации, такие как микориза, где пространственное и временное разрешение на клеточном уровне имеет важное значение для раскрытия молекулярных механизмов коммуникации и обмена питательными веществами.

В этом контексте мы представляем подробный пошаговый протокол для ратиометрической биосенсорной визуализации микробов. Несмотря на то, что этот протокол специально оптимизирован для реализации на дрожжах, он может быть адаптирован для использования в других микробах, включая бактерии, и распространен на немодельные организмы, такие как микробы, ассоциированные с растениями. Например, биосенсоры могут использоваться в сочетании с микрофлюидными системами для количественной флуоресцентной визуализации передачи сигналов кальция в дрожжах, что позволяет в режиме реального времени отслеживать реакцию кальция в условиях стресса окружающей среды^.

Этот протокол предназначен для того, чтобы помочь исследователям в эффективном развертывании новых биосенсоров, тем самым продвигая исследование биологических процессов с помощью флуоресцентной визуализации на основе биосенсоров в микробных системах. Он включает в себя практические рекомендации по условиям культивирования дрожжей, оптимальным настройкам возбуждения/эмиссии, а также совместимости с широко используемыми штаммами дрожжей (например, K601 и W303-1A MAT-a). Заметными ограничениями являются фотообесцвечивание во время длительных сеансов визуализации и проблемы, связанные с экспрессией биосенсоров в биологических образцах. Поскольку на исход экспериментов по биосенсорной визуализации in vivo могут влиять многочисленные факторы, этот пошаговый протокол также призван помочь исследователям предвидеть и преодолеть потенциальные проблемы, тем самым способствуя воспроизводимым реализациям.

Протокол

1. Рациональное проектирование ратиометрических биосенсоров (Рисунок 1)

Представляющий интерес связывающий белок выбирают в качестве сенсорного домена на основе соответствующих критериев, включая (i) специфичность, (ii) аффинность, (iii) структурную информацию и (iv) конформационную перестройку при связывании с лигандом. Специфичность гарантирует, что биосенсор избирательно реагирует на молекулу-мишень без перекрестной реактивности. Считается, что аффинность согласуется с ожидаемым диапазоном концентраций молекулы-мишени в биологическом контексте. Структурная информация, полученная из экспериментальных данных или вычислительных моделей, таких как сгенерированные AlphaFold, дает представление о трехмерной организации сенсорной области и индуцированных лигандом конформационных изменениях. Эти данные используются для определения подходящих точек вставки флуорофоров. Затем разрабатывается стратегия валидации для оценки чувствительности биосенсора и динамического диапазона в зависимости от предполагаемого применения.

1. Постройте конструкцию Матрешки in silico , вставив кассету Green-Apple Matryoshka¹² в сенсорный домен таким образом, чтобы циркулярно переставленный зеленый флуоресцентный белок (cpGFP), чувствительный к конформационным изменениям, реагировал на индуцированные связыванием лигандов перегруппировки сенсорного домена.
   1. Используйте программное обеспечение для молекулярной визуализации, такое как Chimera, для анализа структуры связывающего домена. Если трехмерная структура недоступна, используйте AlphaFold для создания надежной модели.
   2. Определите гибкие петли в структуре белка как слабые места и потенциальные места вставки для кассеты с двойным флуорофором, выбранные таким образом, чтобы избежать нарушения общей функции или стабильности белка.
   3. Используйте AlphaFold еще раз для прогнозирования структуры химерного белка, содержащего вставленную кассету с двойным FP, подтвердив, что вставка не вносит неблагоприятных структурных изменений.
   4. Клонируйте биосенсорные конструкции в плазмидную ДНК, которая обеспечивает экспрессию в дрожжевых клетках. В частности, с использованием подходящего метода клонирования 12,13,14 можно вставить ген, кодирующий вновь разработанный биосенсор, в дрожжевой челночной вектор pAG416, который содержит соответствующие элементы для экспрессии дрожжей.
   5. После клонирования рекомбинантную плазмиду трансформируют в бактериальные клетки для амплификации плазмидной ДНК. Используйте очищенную плазмидную ДНК для трансформации дрожжей.
   6. Введение очищенной плазмиды в клетки дрожжей путем превращения полиэтиленгликолем (ПЭГ), как описано^{в публикации 16}. Пластинчатые трансформируемые дрожжевые клетки на урацил-дефицитных средах, которые отбирают положительные клоны, содержащие плазмиду, несущую маркер селекции URA3.

2. Подготовка образцов

1. Нанесите дрожжевые трансформанты, экспрессирующие биосенсоры GA-Matryoshka, на селективные средние планшеты (т.е. SC-Ura) и инкубируйте при 30 °C в течение 2-3 дней, чтобы обеспечить рост колоний.
   Примечание: Штамм дрожжей несет ауксотрофию ура3, которая дополняется геном URA3 на плазмиде, что позволяет проводить селекцию на средах с дефицитом урацила. Плазмида, кодирующая биосенсор, включает кассету, которая дополняет ауксотрофию (например, pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s).
2. Получить дрожжевые трансформанты из штамма K601/W303-1A MAT-a (генотип: ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1-1 leu2-3 leu2-112 can1-100). Выполните преобразование с помощью вектора экспрессии, обычно используемого для Saccharomyces cerevisiae, например pAG416¹².
3. После трансформации культивировали дрожжевые клетки при 30 °С на среде SC-URA, приготовленной на литр следующим образом, до появления независимо трансформированных колоний: 0,77 г CSM-URA, 6,7 г дрожжевого азотного основания (YNB) с сульфатом аммония, 20 г глюкозы, 20 г агара и аденином, добавленным до конечной концентрации 150 мкМ.
4. Получить компетентные дрожжевые клетки и провести PEG 3350-опосредованную трансформацию в соответствии с установленным протоколом¹⁶.
5. Для экспериментов по захвату микрофлюидных клеток нанесите 25% запасов глицерина на планшеты SC-Ura и инкубируйте при 30 °C в течение 2 дней, чтобы обеспечить рост независимых одиночных колоний. Ресуспендируют отдельные колонии в 5 мл жидкой среды SC-Ura и инкубируют при 30 °С с встряхиванием до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,5-1,0, делая их пригодными для загрузки в систему перфузии.

3. Подготовка перфузионной системы (Рисунок 2)

1. Подготовьте микрофлюидную пластину для гаплоидных дрожжевых клеток, загрузив в нее 50 мкл дрожжевых клеток, экспрессирующих биосенсоры GA-Matryoshka, вместе с конечными средами SC-Ura для роста и буферным раствором для лечения (например, NaCl или сорбитом).
   1. Удалите накопительный раствор из лунок 1-8. Отсадите фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) из лунок и добавьте 400 μL стерильной воды.
   2. Вымойте лунки 1-6 и 8. Промывка 1: Отсадите раствор стерильной воды из лунок 1-8 и добавьте 400 мкл стерильной воды. Промывка 2: Повторите промывку, аспирировав и добавив 400 мкл стерильной воды. Промывка 3: Повторите еще раз с 400 μл стерильной воды.
   3. Окончательное заполнение скважин 1-6: Аспирируйте водный раствор и добавьте 300 мкл растворов для окончательной перфузии/роста, таких как SC-Ura для роста дрожжей, или буферный раствор, содержащий аналиты, представляющие интерес для обработки.
   4. Загрузка клеток в лунку 8: Добавьте 50 μл суспензии дрожжевых клеток (OD600=0,5-1,0).
2. Загерметизируйте пластины коллектором микрофлюидной платформы с регулируемой температурой и подключите его к системе визуализации живых клеток. Коллекторы поддерживают стабильную тепловую среду при температуре 28 °C, в то время как трубки и насос обеспечивают надлежащую герметизацию и непрерывную перфузию.
   1. Выровняйте пластину по коллектору. Включите пылесос. Включите микрофлюидную платформу.
   2. Нажмите Seal и подождите, пока не загорится зеленый индикатор. Откройте программное обеспечение микрофлюидной платформы, создайте новый эксперимент и выберите из выпадающего списка «Подходящая дрожжевая пластина».
   3. Нажмите кнопку Run Liquid Priming Sequence (Запустить последовательность жидкостного грунта). Нажмите на последовательность загрузки клеток, чтобы загрузить дрожжевые клетки из лунки 8 в камеру для культивирования, где они будут захвачены и выращены в условиях непрерывной перфузии селективной среды SC-Ura в течение ночи при 10 кПа при 28 °C.
   4. На вкладке «Ручной режим» нажмите «Запустить пользовательскую последовательность » или используйте редактор протоколов, чтобы задать экспериментальные параметры, такие как температура при 30 °C, скорость потока при 10 кПа, продолжительность шага (например, 10 минут) и каналы для открытия для перфузии.
3. Выращивать клетки в течение ночи в культивальной камере в условиях непрерывной перфузии селективной средой SC-Ura при температуре 28 °С и давлении 10-17 кПа.

4. Ратиометрическая флуоресцентная визуализация (Рисунок 3, Рисунок 4 и Видео 1)

1. Оценивайте рост и флуоресценцию клеток с помощью быстрой микроскопической визуализации.
   1. Поместите микрофлюидную пластину на предметный столик инвертированного микроскопа. Сфокусируйтесь на центре области просмотра, чтобы найти ячейки.
   2. Используйте светлопольную и/или флуоресцентную микроскопию для оценки морфологии клеток, жизнеспособности и экспрессии биосенсоров.
2. Исследование динамики стационарного состояния кальция в точно контролируемых условиях с использованием микрофлюидной системы и совместимых микрофлюидных планшетов 4,12,13,14.
3. Выполняйте визуализацию живых клеток с помощью инвертированного лазерного сканирующего конфокального микроскопа с увеличением a100x и числовой апертурой (NA) 1,40. Контролируйте биосенсоры с двойным флуорофором, возбуждая GFP и LSSmApple на длине волны 488 нм с помощью аргонового лазера. Собирайте сигналы излучения на длине волны 520 нм для GFP и 610 нм для LSSmApple (рис. 5) и проводите эксперименты по ратиометрической флуоресцентной визуализации для количественной оценки динамических откликов биосенсора. Измерьте отношение интенсивностей выбросов (GFP/LSSmApple) с течением времени для мониторинга изменений, вызванных аналитами.

5. Анализ изображений с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом (Рисунок 6)

1. Получите CellProfiler или любое другое подобное программное обеспечение из официального репозитория и установите его на локальную рабочую станцию.
2. Организуйте покадровые изображения флуоресцентной микроскопии в последовательном порядке (например, img_001.tif, img_002.tif и т. д.), чтобы обеспечить совместимость с автоматизированной пакетной обработкой.
3. Запустите программное обеспечение и инициализируйте новый конвейер анализа, выбрав «Новый проект». Импортируйте последовательность цейтраферных изображений в рабочую область конвейера.
4. Включите модуль IdentifyPrimaryObjects для обнаружения отдельных клеток в каждом кадре на основе сигнала флуоресценции или морфологических критериев.
5. Добавьте модуль TrackObjects для установления временных соответствий между ячейками в кадрах, что позволяет отслеживать отдельные ячейки с течением времени.
6. Включите модуль MeasureObjectIntensity для количественной оценки параметров интенсивности флуоресценции (например, среднего, медианы и интегрированной интенсивности) для каждой отслеживаемой ячейки.
7. Используйте модуль ExportToSpreadsheet для компиляции и экспорта количественных данных в табличный формат (например, CSV) для последующего анализа.
8. Анализируйте экспортированные данные с помощью инструментов статистики или визуализации данных, таких как программное обеспечение для работы с электронными таблицами.

Результаты

Для достижения успешной ратиометрической визуализации биосенсоров в микробных системах необходимо решить ряд технических проблем.

Система выражений: Первая проблема заключается в выборе системы выражений; будь то плазмидные, хромосомно интегрированные, управляемые конститутивными или индуцируемыми промоторами, с субклеточными метками-мишенями или без них. Эти факторы могут существенно влиять на стабильность, токсичность и локализацию биосенсора в клетках (рис. 1)....

Обсуждение

Генетически кодируемые биосенсоры на основе флуорофоров позволяют в режиме реального времени отслеживать концентрации внутриклеточного аналита в живых клетках¹. Эти биосенсоры обычно функционируют путем преобразования конформационных изменений в оптические сигналы, которые могут быть обнаружены либо пропорционально, либо интенсиометрически. Интенсиометрические биосенсоры полагаются на изменения интенсивности флуоресценции от одного FP, что делает их чувствительным...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
	Агар Сигма-Олдрич Ко.	A5306-250G
Пластина CellASIC ONIX для гаплоидных дрожжевых клеток	Merck KGaA	Y04C-02-5PK
CellASIC ONIX2	Merck KGaA	CAX2-S0000
CSM-Ura	Thermo Fisher Scientific	11387899
D-glucose	Sigma-Aldrich Co.	G8270-100G
D-сорбит	Sigma-Aldrich Co.	S1876-10MG
NaCl	Sigma-Aldrich Co.	S9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s	NA	7	Для экспрессии GA-MatryoshCaMP6s в дрожжах
TCS SP8 STED	Leica	NA
Штамм дрожжей K601/ W303-1A MAT-a	NA	8	ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1- 1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNB	BocaScientific	GCM16.0500
α-Фактор спаривания ацетатной соли	Сигма-Олдрич Ко.	Т6901-.5МГ