Методическая статья

Использование метода переноса капель для надежной подготовки гигантских однослойных везикул

DOI:

10.3791/68340

⸱

19 сентября 2025 г.

 ,  ,  , 
1The Biorobotics Institute, Sant'Anna School of Advanced Studies - Pisa, 2Department of Excellence in Robotics & AI, Sant'Anna School of Advanced Studies

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом руководстве для начинающих представлен общий протокол подготовки гигантских униламеллярных везикул (GUV) методом переноса капель, обсуждаются критические шаги и приводятся идеи, которые помогут внести возможные корректировки, необходимые для различных применений, включая синтетическую биологию и микроробототехнику.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последние два десятилетия метод капельного переноса, также известный как инвертированная эмульсия, двойная эмульсия, фазовый перенос или перенос эмульсии, доказал свою эффективность для получения гигантских униламеллярных везикул (GUV) и, в частности, для их загрузки различными грузами, тем самым играя решающую роль в синтетической биологии. Благодаря эффективности инкапсуляции и простоте исполнения, она широко используется для разработки искусственных клеток. В литературе наблюдается большая вариабельность по нескольким параметрам, что приводит к крайне вариабельным исходам. Отчасти это связано с тем, что для различных нужд и применений этого универсального метода требуются корректировки, но он может оказаться дезориентирующим для исследователей, впервые обращающихся к этой технике.

Чтобы дать новичкам базовое представление о методе и роли критических параметров, представлен протокол вместе с подсказками о фундаментальных физико-химических принципах, лежащих в основе формирования GUV путем переноса капель. Таким образом, данное пошаговое руководство по подготовке GUV включает в себя соображения и практические предложения, основанные на литературе и непосредственном опыте.

Рассматривая возможные источники изменчивости, несколько аспектов выделяются как критические: чувствительность фосфолипидов к свету, окислению и гидролизу; выбор масла для растворения фосфолипидов (липидный раствор или ЛС); и восстановление GUV после центрифугирования. Предложены экономически эффективные меры по минимизации интерференции атмосферного кислорода и влажности. Чтобы помочь определить подходящие комбинации масла и фосфолипидов, общий протокол дополнен обсуждением соответствующих физико-химических свойств LS. Наконец, чтобы избежать непрактичных процедур, предлагается простой и безопасный метод полного удаления масляной фазы сразу и восстановления чистой дисперсии GUV. Эти меры ускоряют внесение коррективов в новые составы GUV, потенциально расширяя их применение в синтетической биологии и смежных областях, включая микроробототехнику.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Реализуя ранее описанный метод получения липосом1, Pautot et al. разработали протокол для получения липидных везикул диаметром от 0,1 до 1 мкм в диаметре2. Метод капельного переноса быстро доказал свою эффективность при производстве еще более крупных везикул (диаметр более 1 мкм)3, завоевывая все большую популярность благодаря простоте исполнения и высокой эффективности инкапсуляции. Действительно, по сравнению с методами набухания (такими как набухание гелем или электроформирование), этот протокол уменьшает объем раствора груза, необходимый для образования сопоставимого количества везикул и связанных с ними отходов4. GUV могут быть собраны из жидкостных интерфейсов с помощью альтернативных методов с сопоставимой эффективностью инкапсуляции. Однако, по сравнению с чипами на основе микрофлюидных чипов 5,6 или непрерывной инкапсуляции через границу раздела капель (cDICE)7, перенос капель предлагает самую простую конфигурацию, доступную в любой лаборатории с базовым оборудованием. Кроме того, микрофлюидные методы могут привести к образованию GUV с нежелательными масляными включениями в мембране. По этим причинам капельный перенос был методом выбора для загрузки GUV с ценными грузами в области искусственных ячеек 3,8,9,10 и, в последнее время, микроробототехники 11,12.

Метод основан на формировании створок мембран путем стабилизации границ раздела вода/масло, опосредованной фосфолипидами. Сначала фосфолипиды растворяют в масле (липидном растворе, ЛС), затем готовят водно-масляную эмульсию с водным раствором, содержащим в маслянистом ЛС желаемый груз GUV (внутренний раствор, IS). Затем эмульсия переносится в трубку, где другой водный раствор (называемый наружным раствором, OS) предварительно уравновешивается LS с образованием границы раздела вода-масло. GUV образуются, когда капли воды вынуждены пересекать эту границу раздела OS/LS путем центрифугирования: внутренний листок GUV образуется на поверхности капель IS, в то время как внешний листок образуется между OS и LS (рис. 1).

Было описано множество вариантов протоколов с параметрами, скорректированными в соответствии с условными экспериментальными потребностями. Первая обширная попытка оптимизации процесса была описана Moga et al.13, в то время как Zhang et al. собрали большую часть соответствующих примеров внедавнем обзоре. Несмотря на многие описанные параметры, влияющие на протокол, нет никаких указаний на то, как можно было бы провести процесс оптимизации для новой формулы GUV, а также на лучшие практики восстановления GUV и манипуляций с ним после производства. Основываясь на доступной научной литературе и нашем непосредственном опыте, мы приводим здесь общий протокол производства GUV, обсуждая основные принципы. Таким образом, мы предоставляем указания, полезные для оптимизации новых составов GUV, и две меры предосторожности, всегда применимые к протоколу: приготовление LS в контролируемой среде и метод легкого удаления верхней фазы масла для восстановления чистого образца GUV. Мы выбрали два примера: один с 240 мМ сахарозы в качестве IS и 0,2 мМ DOPC в силиконовом масле AR20 в качестве LS (условие E [пустой], см. Таблицу 1), а другой состоит из 0,2% микрочастиц полистирола 1,1 мкм в 240 мМ сахарозе в качестве IS и 3,18 мМ DOPC в минеральном масле в качестве LS (условие P [с частицами], см. таблицу 1). Оба образца были получены с 240 мМ глюкозой в качестве ОВ. Мы выбрали эту осмолярность для получения ГУВ, которые в физиологических условиях имеют расслабленную липидную мембрану (низкое натяжение мембраны).

figure-introduction-1
Рисунок 1: Схематическое изображение метода переноса капель. (А) В отдельных флаконах получают три раствора: фосфолипиды в масле (желтая фаза) с образованием липидного раствора, сахарозасодержащий раствор (голубой) в качестве внутреннего раствора и эквиосмолярный раствор глюкозы (белого цвета) в качестве наружного раствора. (B) LS затем смешивают с IS с образованием стабильной эмульсии, затем (C) границе раздела между OS и LS позволяют уравновеситься, прежде чем (D) эмульсию заливают поверх нее. (E) Капли воды под действием центробежной силы вынуждены пересекать границу раздела LS/OS, что (F) позволяет образовывать GUV. Рисунок не является масштабным и предназначен только для того, чтобы предоставить схему метода. Сокращения: LS = липидный раствор; IS = внутреннее решение; OS = внешний раствор; GUV = гигантский однослойный пузырь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Если не указано иное, процессы проводятся при комнатной температуре.

1. Приготовление растворов

  1. Приготовление водных растворов (ИС и ОС)
    1. В двух разных лодочках взвешивания весят 2,16 г глюкозы и количество сахарозы, указанное в таблице 1. Добавьте порошок в два стакана объемом 150 мл, добавьте 40 мл сверхчистой воды и перемешайте, помешивая.
    2. Переложите растворы в два цилиндра по 50 мл и добавьте сверхчистую воду до 50 мл для получения 240 мМ растворов глюкозы и растворов сахарозы с концентрациями, указанными в таблице 1. Накройте цилиндры куском парапленки и перемешайте растворы, перевернув цилиндры несколько раз.
    3. Отфильтруйте растворы с помощью шприцев объемом 50 мл и фильтров 0,22 мкм, чтобы предотвратить загрязнение микроорганизмами.
    4. Для условия Р готовят следующую смесь: 2 мкл 100 мг/мл 1,1 мкм дисперсии частиц полистирола, 24 мкл раствора сахарозы, приготовленного на стадии 1.1.1, и сверхчистой воды до 100 мкл (конечная суспензия: 0,2% микрочастиц в 240 мМ растворе сахарозы). Хранить растворы при температуре +4 °C до 1 недели или приготовить по 1 мл аликвот в пробирках объемом 1,5 мл и хранить при температуре -20 °C для длительного хранения.
  2. Настройка перчаточной камеры для приготовления ЛС в контролируемой среде
    1. Отрежьте пять кусков силиконовой трубы, имеющей внутренний диаметр 7 мм, внешний диаметр 13 мм и длину, указанную в таблице 2 (трубы с 1 по 5).
    2. Отрежьте четыре куска силиконовой трубы, имеющие внутренний диаметр 3 мм, внешний диаметр 7 мм и длину, указанную в таблице 2 (трубы с 6 по 9).
    3. Подсоедините один конец трубы 1 к двухходовому клапану, а другой конец — к трехходовому соединению (рисунок 2A).
    4. Подсоедините трубу 2 к другим концам двустороннего клапана, затем подсоедините трубу 3 и трубу 4 к трехходовому соединению, при этом труба 3 должна быть подключена к оконечности, противоположной трубе 1 (рисунок 2A).
    5. Подсоедините свободный конец трубы 4 к входному отверстию перчаточной камеры (впускная труба, рисунок 2В).
    6. Подсоедините трехходовой клапан, входящий в комплект поставки перчаточной камеры, к выпускному отверстию, затем подсоедините клапан к трубе 5 (выпускная труба, рисунок 2C).
    7. Подсоедините один конец трубы 6 к игле 18 G, а другой конец к двустороннему соединению. Повторите то же самое с трубкой 7 и иглой 21 G (Рисунок 2D).
    8. Вставьте две иглы в колпачок флакона с перегородкой: этот колпачок с иголками обеспечит контролируемый приток азота и отток азота и хлороформа. Храните колпачок в пустой пробирке объемом 50 мл без колпачка, чтобы избежать контакта с иглами (рисунок 2D).
    9. Отожмите и вставьте патрубки 8 и 9 соответственно во входное и выходное отверстия с внутренней стороны перчаточной камеры (рисунок 2Е).
  3. Приготовление ЛС
    1. Переместите бардачок внутрь или рядом с химическим колпаком. Откройте перчаточную камеру и вставьте на дно камеры кристаллизатор, наполненный частицами кремнезема (рис. 2F). Накройте кристаллизатор белой опорной поверхностью и накройте его бумажными полотенцами.
    2. Вставьте в бардачок все необходимые материалы (Рисунок 2G): гигрометр, 1,2-диолеол-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC) в растворе хлороформа, масло(я) (Таблица 1), чистые 20 мл темного стекла флаконы (открытые и с соответствующими крышками), шприц Hamilton (Таблица 1), микропипетку P10000 и наконечники. Поместите стеклянный флакон с раствором хлороформа на держатель пробкового кольца, стакан объемом 150 мл или любой другой подходящий держатель как можно ближе к стороне оператора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта мера предосторожности предотвратит опрокидывание бутылок, вызванное надуванием и сдуванием перчаток во время циклов вакуума и потока азота.
    3. Закройте бардачок, убедившись, что две половинки не могут скользить, и запечатайте их пластиковыми винтами, входящими в комплект перчаточной камеры.
    4. Закройте выпускной клапан и опустите трубку 5 в стакан объемом 500 мл, наполовину заполненный водой (рисунок 2H).
    5. Подсоедините регулируемый клапаном конец впускной трубы (труба 2) к вакуумной магистрали, а другой конец — к азоту (труба 3, рисунок 2A). Теперь перчаточная камера полностью установлена, как показано на рисунке 2J.
    6. Откройте клапан и вакуумную линию до тех пор, пока сброс давления не накачает перчатки до такой степени, что они станут слишком жесткими для сгибания. Закройте вакуумную линию и клапан.
    7. Открывайте азот до тех пор, пока давление не сдует перчатки до такой степени, что они выйдут из бардачка. Закройте азотную линию.
    8. Повторите шаги с 1.3.6 по 1.3.7 не менее 10 раз, следя за тем, чтобы внутренняя влажность упала ниже 40%.
    9. Контролируйте внутреннее давление с помощью вакуума и азота, чтобы оператору было удобнее носить перчатки.
    10. С помощью шприца Гамильтона переложите объем DOPC в растворе хлороформа, указанный в таблице 1 , во флакон из темного стекла. Закройте флакон игольчатым колпачком, подготовленным на шаге 1.2.9.
    11. Соедините трубу 6 с трубой 8 и трубу 7 с трубой 9 через двусторонние соединения (рисунок 2I).
    12. Снимите перчатки и откройте выпускной клапан.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Второй оператор может помочь с шагов 1.3.13 по 1.3.15 для ускорения процесса.
    13. Очень медленно откройте поток азота и проверьте поток газа, наблюдая за пузырьками в стакане, где ранее была размещена труба 5 (шаг 1.3.4). Постепенно регулируйте поток азота, пока он не достигнет относительно высокой скорости, при которой отдельные пузырьки остаются видимыми. Дайте азоту течь в течение 3 минут, затем закройте азотную линию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное давление азота может привести к тому, что раствор DOPC в хлороформе будет диспергироваться по всему флакону, уменьшая количество фосфолипидов, доступных для последующего липидного раствора (LS). Кроме того, высокое давление увеличивает риск выталкивания игл из флакона. Поэтому важно тщательно регулировать поток азота до оптимального уровня, который мягко перемешивает хлороформ, не вызывая неконтролируемого разбрызгивания.
    14. Тем временем приготовьте водяную баню в кристаллизаторе и нагрейте ее до 80 °C на горячей плите.
    15. Подождите, пока последний пузырь не выйдет из стакана, затем закройте выпускной клапан. Снова наденьте перчатки и отсоедините трубы 8 и 9 от двусторонних соединений.
    16. Убедитесь, что весь хлороформ испарился из темного флакона, затем откройте его и переместите крышку обратно в пробирку объемом 50 мл. Откройте бутылку с маслом, перелейте необходимый объем масла (табл. 1) в темный флакон и закройте его крышкой. Снимите перчатки и откройте бардачок.
    17. Заклейте ЛС парапленкой. Энергично поворачивайте флакон в течение не менее 30 с. Выдерживать при температуре 80 °С в течение 30 мин на водяной бане, приготовленной на шаге 1.3.14. Энергично поворачивайте флакон в течение не менее 30 с. Инкубировать при комнатной температуре в течение ночи.
    18. Приступайте к приготовлению GUV или храните их при температуре +4 °C до 1 недели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В асимметричных препаратах GUV две различные LS могут быть использованы для границы раздела и эмульсии для получения двух различных мембранныхстворок 15.

2. Производство GUV

  1. Настройка емкости для легкого удаления масла
    1. Ножницами отрежьте колпачок от тюбика объемом 5 мл. Просверлите отверстие ~8 мм в центре колпачка и убедитесь, что отверстие достаточно широкое, чтобы обеспечить посадку и фиксацию наконечника P1000 (Рисунок 3A). Если отверстие слишком узкое, повторите два предыдущих шага; Если колпачок слишком широкий, сбросьте колпачок и начните с нового с шага 2.1.1.
    2. Отрежьте кусок наждачной бумаги размером 2 х 5 см и отшлифуйте отверстие. Поместите продырявленный колпачок обратно на пробирку объемом 5 мл и центрифугируйте при давлении 3 000 × г в течение 5 минут, чтобы удалить весь оставшийся пластиковый мусор из отверстия. Снимите крышку и выбросьте тюбик.
    3. Отрежьте колпачок от нового тюбика объемом 5 мл и замените его дырявым колпачком. Поместите уплотнительное кольцо на верхнюю часть колпачка и вставьте наконечник P1000 через отверстие. Зафиксируйте уплотнительное кольцо между наконечником и колпачком и убедитесь, что наконечник нельзя протолкнуть дальше по трубке (Рисунок 3B). Заполните пробирку объемом 5 мл 5,5 мл ОС через наконечник.
  2. Формирование интерфейса OS/LS
    1. Приготовьте водяную баню в кристаллизаторе и нагрейте ее до 50 °C на горячей плите.
    2. Пробирку LS, приготовленную в разделе 1.3, энергично обработать в течение не менее 30 с. Нагрейте LS до 50 °C на водяной бане в течение 30 минут.
    3. Водные растворы, приготовленные в разделе 1.1, уравновесить при комнатной температуре в течение не менее 10 минут.
    4. Пипетка 300 мкл ОС в пробирке объемом 1,5 мл или пробирке объемом 5 мл, модифицированной в соответствии с шагом 2.1. Медленно пипетируйте 100 мкл LS поверх OS, следя за тем, чтобы в пробирке образовались две отдельные и непрерывные фазы. Дайте интерфейсу уравновеситься в течение 10 минут.
      Примечание: Чтобы обеспечить образование однородного монослоя фосфолипидов, LS должен быть равномерно распределен поверх OS (рис. 4A). Если слой LS не является непрерывным, перераспределите объем LS с помощью микропипетки или увеличьте объем LS (это может быть очень полезно при работе с высоковязкими маслами, такими как парафин).
  3. Образование водо-масляной эмульсии
    1. В пробирку объемом 2 мл пипетку в указанном порядке 250 мкл LS и 6,25 μл IS для 2,5% водно-масляной эмульсии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, такое соотношение воды и масла, скорее всего, обеспечивает стабильную эмульсию, тем самым увеличивая вероятность успеха протокола (Рисунок 5). Чтобы увеличить выход GUV, мы рекомендуем увеличивать объем эмульсии, а не соотношение IS/LS.
    2. Смешивайте две фазы одним или несколькими из следующих методов, пока смесь не станет однородной и стабильной: вихревой, механическим перемешиванием над стандартным штативом для микропробирок или постукиванием пальцем по пробирке (примеры однородной эмульсии см. на рисунке 5 ).
    3. Перенесите 200 мкл эмульсии поверх интерфейса OS/LS, подготовленного в разделе 2.2.
    4. Если вы используете трубку объемом 1,5 мл, просто закройте трубку; при использовании модифицированной пробирки объемом 5 мл из раздела 2.1 поместите резиновый колпачок поверх наконечника и осторожно перенесите пробирку в коническую трубку объемом 50 мл.
  4. Перенос капель с помощью центрифугирования
    1. Центрифугируйте пробирки при комнатной температуре, следуя указаниям таблицы 1. В конце центрифугирования проверьте наличие непрозрачной гранулы на дне пробирки и прозрачной масляной фазы в верхней части.

3. Восстановление GUV

  1. Удаление масла
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментальных потребностей, масло может быть удалено в три различных этапа.
    1. Если ГУВ были приготовлены в стандартных пробирках объемом 1,5 мл, медленно удалите масло с помощью пипетки Р1000 и Р200 для последних капель, следя за тем, чтобы гранула не потревожилась.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более узкие наконечники способствуют удалению масла, поэтому вставка наконечника для меньших объемов (10-200 мкл) в наконечник P1000 повысит точность этого шага.
    2. Если вы имеете дело с несколькими препаратами GUV в разных пробирках объемом 1,5 мл, удалите масло с помощью колбы Бюхнера. Подсоедините один кусок толстой силиконовой трубки (внутренний диаметр 7 мм, внешний 13 мм) к вакуумной магистрали и вставьте другую трубу в отверстие колбы, запечатав ее резиновой прокладкой. На другом конце этой трубки вставьте наконечник P1000, оберните его парапленкой, отрежьте около 3 мм наконечника и вставьте его в наконечник P200. Откройте вакуум и втяните масло с помощью наконечника P200, затем закройте вакуум и удалите последние капли через пипетку P200.
    3. Если GUV были приготовлены в контейнере, описанном в шаге 2.1, снимите наконечник с пробирки, убедившись, что резиновый колпачок не оторвался (Рисунок 3D). Затем выбросьте наконечник и сохраните резиновый колпачок, уплотнительное кольцо и дырявый колпачок для повторного использования.
    4. С помощью микропипетки P1000 удалите ОВ из пробирки (рис. 3E), оставив около 50 мкл объема, следя за тем, чтобы гранула не была нарушена.
    5. Поменяйте наконечник, снова суспензируйте гранулу в оставшемся объеме и переложите ее в чистую пробирку объемом 2 мл.
  2. Моек GUV
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этих шагов является удаление следов масляной фазы, которые не были удалены на шаге 3.1. При необходимости следует повторять шаги 3.2.1 и 3.2.2 до тех пор, пока в трубке не исчезнет капля масла.
    1. Наполните пробирку 2 мл OS и центрифугируйте при 1500 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
    2. Удалите OS, оставив около 50 μL объема, следя за тем, чтобы гранула не была нарушена.
    3. Повторите последние два шага.
  3. Уравновешивание объема
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы включили этот раздел, чтобы можно было сравнить урожайность различных препаратов GUV.
    1. С помощью микропипетки P200 повторно суспендируйте гранулу в 50 мкл объема, оставшегося после последнего повторения шага 3.2.2.
    2. Измерьте этот объем, установив дозатор на 20 и увеличив объем, погрузив наконечник в дисперсию GUV, не касаясь стенки трубки, чтобы жидкость могла течь внутрь наконечника.
    3. Добавьте OS для достижения конечного объема 100 μL.

4. Наблюдение и размерный анализ

  1. Получение микроскопических изображений
    1. Аккуратно перемешайте дисперсию GUV, постукивая пальцем по трубке.
    2. Загрузите в камеру Буркера 10 μL образца GUV и подождите не менее 5 минут, чтобы GUV осели на дне камеры.
    3. Рассмотрите образец под фазово-контрастным микроскопом. Используя линии Беркера в качестве опорных, перемещайтесь по образцу и получите не менее 20 изображений, убедившись, что области наблюдения не перекрываются.
  2. Размерный анализ
    1. Загрузите изображения в ImageJ.
    2. Чтобы рассчитать коэффициент преобразования пиксель/мкм, выберите одно изображение, показывающее квадрат камеры Буркера размером 50 х 50 мкм (правильное определение см. в техническом описании производителя), затем выберите инструмент выделения прямой линии , проведите линию между двумя последовательными углами квадрата и измерьте линию, нажав на кнопку «Анализ» | Измерьте. Повторите 3 раза и рассчитайте среднее значение.
    3. Установите коэффициент пересчета, нажав на кнопку «Анализировать» | Установите масштаб. Вставьте значение из шага 4.2.2 в поле Расстояние в пикселях, затем вставьте значение 50 в поле Известное расстояние и μм в Единицу длины.
    4. Нажмите на «Анализ» | Установите размеры и выберите поле Площадь . Выберите инструмент для овального выделения , затем нажмите левую кнопку мыши и, удерживая клавишу Shift, наложите получившийся круг вокруг GUV. Измерьте диаметр, нажав на кнопку «Анализировать» | Измерьте. Повторяйте это для каждого GUV на каждом изображении.
    5. В окне «Результаты» нажмите « Файл» | Сохранить как... , чтобы экспортировать csv-файл области GUV, а затем проанализируйте распределение размеров с помощью скрипта, доступного на GitHub16.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно пропустить шаг 4.2.3 и запустить скрипт с указанием коэффициента конвертации пиксель/мкм. Чтобы рассчитать это значение, разделим полученное на шаге 4.2.2 на 50.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптимальное приготовление GUV характеризуется образованием прозрачной масляной фазы и отчетливой гранулы (рис. 4A). В тех случаях, когда капли воды не могут превратиться в GUV, они обычно разрушаются и оставляют фосфолипидный мусор на границе OS/LS (рис. 4C). Этот эффект, скорее всего, вызван агрегацией фосфолипидов и других молекул из масляной фазы, что является результатом недостаточного уравновешивания фосфолипидов на границе раздела вода/нефть. Тем не менее, несмотря на отсутствие видимой гранулы или наличие мусора на границе раздела, GUV все же могут образовываться, что позволяет продолжить процесс. Несмотря на то, что этапы промывки не совсем эффективны для удаления всех фосфолипидных остатков, они значительно помогают устранить капли масла, повышая общее качество образца (сравните Рисунок 6A и Рисунок 6B).

Использование старых LS или LS, приготовленных в условиях высокой влажности, часто приводит к уменьшению дисперсий GUV с меньшим выходом и более высоким содержанием неупорядоченных агрегатов, которые, скорее всего, образуются фосфолипидами и другими молекулами из масляной фазы (рис. 6C). Для ЛС, приготовленных в условиях высокой влажности, мы наблюдали коэффициенты вариации выше 0,8 при производстве ГУВ (с образцами, содержащими очень мало ГУВ), в то время как для ЛС, приготовленных в модифицированной перчаточной камере, коэффициент вариации был ниже 0,5.

Различные условия центрифугирования могут повлиять на выход и качество GUV. В результате качественного анализа было установлено, что 20 мин при концентрации 3300 × g является хорошим состоянием для GUV с сахарозой (образец E). Снижение скорости (45 мин при 500 × г) приводило к снижению выхода, в то время как увеличение (5 мин при 16 600 × г) приводило к более высокому образованию неупорядоченных фосфолипидных агрегатов. Слабая центробежная сила может препятствовать пересечению большого количества капель через границу раздела OS/LS, что приводит к снижению выхода, в то время как сильная сила может не обеспечить достаточного времени для организации фосфолипидов на внешнем листке во время пересечения границы раздела (рис. 7). Инкапсуляция микрочастиц также может быть оптимизирована путем корректировки параметров центрифугирования при условии, что массовая плотность микрочастиц примерно соответствует плотности ИС. Для этой цели снижение ускорения центрифугирования (и, в свою очередь, увеличение времени центрифугирования) позволяет обеспечить более однородную инкапсуляцию частиц, избегая разрушения фосфолипидной мембраны из-за силы, оказываемой твердыми частицами (пример хорошей инкапсуляции показан на рисунке 6D, в то время как исследование оптимальных параметров центрифугирования все еще продолжается).

Поскольку на диффузию фосфолипидов может влиять масляная фаза, можно провести простой качественный тест для оценки стабильности эмульсии (Рисунок 5). С помощью красящего красителя (Brilliant Blue FCF), растворенного в ИС для улучшения визуализации, можно готовить эмульсии с различным соотношением воды/масла и наблюдать за ними с течением времени. Потеря стабильности может быть визуализирована путем агрегации капель воды и последующего отделения от масляной фазы. Поскольку крупные капли (видимые невооруженным глазом) с меньшей вероятностью преобразуются в GUV, мы рекомендуем использовать эмульсионное условие, которое обеспечивает наименьшее разделение фаз.

Влияние изменений в протоколе может быть проверено с помощью анализа распределения по размерам, как описано в разделе 4 протокола: диаметры GUV могут быть измерены с помощью ImageJ по изображениям фазово-контрастного микроскопа, а распределение размеров может быть проанализировано с помощью скрипта, доступного на GitHub16. Следуя этому протоколу, можно было, например, наблюдать увеличение GUV с большими диаметрами при выборе минерального масла вместо силиконового масла AR20 (рис. 8).

figure-results-1
Рисунок 2: Настройка перчаточной камеры. На этом рисунке показаны основные модификации перчаточной камеры для приготовления липидного раствора. (А) Входное соединение с азотом и вакуумом; (В) входное соединение с перчаточной камерой; (В) выпускной клапан; (D) игольчатый колпачок для испарения растворителя; (Д) тонкие трубки для испарения растворителя; (F) частицы кремнезема для поглощения влаги; (G) предметы, помещаемые в бардачок: цифровой термогигрометр (1), липидный раствор в органическом растворителе (2), держатель пробкового кольца (3), стеклянный шприц (4), открытый колпачок с перегородкой и иглами (5), масляный раствор (6), открытый темный флакон с колпачком (7), наконечники объемом 10 мл (8), пипетка P10000 (9); (H) конец выпускной трубы погружен в воду; (I) флакон закрыт крышкой с игольчатым подшипником, соединенным с входным и выпускным отверстиями; (J) схемы модифицированной перчаточной камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 3: Контейнер для легкого удаления масла. Основные этапы подготовки GUV в емкости для легкого удаления масла в соответствии с разделом 2.1 протокола. (A) В крышке пробирки объемом 5 мл просверливается отверстие, чтобы обеспечить установку наконечника P1000; затем (B) колпачок помещается на пустую пробирку объемом 5 мл, а наконечник вставляется в отверстие через уплотнительное кольцо. (C) Растворы помещают в пробирку в соответствии с разделами 2.2 и 2.3 протокола, наконечник закрывают, и пробирку помещают внутрь пробирки объемом 50 мл. Для улучшения визуализации в GUV, приготовленные из 0,2 мМ DOPC в силиконовом масле, добавляли 230,7 мМ сахарозы и 3,1 мМ Brilliant Blue FCF. (D) После центрифугирования верхняя масляная фаза задерживается внутри наконечника вместе с частью буфера GUV (который кажется голубым из-за того, что часть капель не может превратиться в GUV и высвобождает краситель в OS). Благодаря резиновому колпачку наконечник можно легко извлечь из пробирки объемом 5 мл вместе с содержимым жидкости, что позволяет быстро и легко удалить всю масляную фазу. (E) Гранулы GUV могут быть легко собраны со дна пробирки в прозрачной дисперсии, без видимого загрязнения маслом, что подтверждено (F) с помощью фазово-контрастной микроскопии. Масштабная линейка = 20 мкм. Сокращения: LS = липидный раствор; IS = внутреннее решение; OS = внешний раствор; GUV = гигантский однослойный пузырь; DOPC = 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 4: Формирование GUV. Примеры (A) интерфейса OS/LS, (B) чистой GUV-гранулы с прозрачной масляной фазой и (C) GUV-гранулы с мусором на границе OS/LS (обломки и гранулы выглядят красноватыми, потому что IS этой популяции GUV была дополнена 1,65 мМ новым кокциновым красителем для улучшения визуализации). Сокращения: LS = липидный раствор; IS = внутреннее решение; OS = внешний раствор; GUV = гигантский однослойный пузырь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Иллюстрация 5: Стабильность эмульсии при различных соотношениях масла и воды в масле. На рисунке показана стабильность эмульсий с течением времени в зависимости от типа масла и используемого соотношения вода/масло (w/o). IS состояла из 230,7 мМ сахарозы и 3,1 мМ Brilliant Blue FCF для улучшения визуализации эмульсий. Эмульсии, приготовленные с минеральным маслом, менее стабильны, чем их аналоги, изготовленные с силиконовым маслом AR20. Этот эффект еще больше усиливается с увеличением соотношения выхода/выхода. Хотя эмульсии в силиконовом масле AR20 значительно более стабильны, их стабильность также снижается по мере увеличения соотношения w/o, при этом разделение фаз видно сразу после эмульгирования (силиконовое масло AR20 при 10%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 6: Наблюдение за GUV с помощью фазово-контрастного микроскопа. 20-кратное увеличение насыщенных сахарозой GUV, приготовленных из LS, состоящего из 3,18 мМ DOPC в минеральном масле. (А) Проба, полученная после удаления масла; (B) образец, извлеченный после этапов промывки; (C) низкий выход GUV, полученный от LS, приготовленного в условиях с нерегулируемым кислородом и влажностью; (D) GUV, загруженные микрочастицами. Масштабная линейка = 10 мкм; Капли масла обведены кружком, а примеры неупорядоченных агрегатов фосфолипидов и молекул масла обозначены стрелкой. Сокращения: LS = липидный раствор; GUVs = гигантские однослойные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 7: Влияние различных условий центрифугирования на образование GUV. Фазово-контрастные изображения ГУВ с сахарозой, полученных с помощью ЛС, состоящей из 0,2 мМ DOPC в силиконовом масле AR20. На рисунке показано качественное сравнение GUV при (А) 16 600 × г в течение 5 мин, (В) 3 300 × г в течение 20 мин и (В) 500 × г в течение 45 мин. В то время как высокая скорость центрифугирования приводит к большему присутствию фосфолипидных агрегатов, низкая скорость центрифугирования приводит к снижению выхода. Масштабная линейка = 50 мкм. Сокращения: LS = липидный раствор; GUV = гигантский однослойный пузырь; DOPC = 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 8: Анализ распределения по размерам. Сравнение двух насыщенных сахарозой образцов GUV, полученных из (A) 0,2 мМ DOPC в минеральном масле и (B) 0,2 мМ DOPC в силиконовом масле AR20 (*образец был разбавлен в 10 раз, чтобы обеспечить четкое различие GUV под фазово-контрастным микроскопом). Анализ, проведенный в соответствии с разделом 4 протокола, показывает смещение распределения размеров в сторону больших диаметров образца минерального масла по сравнению с образцами силиконового масла AR20. Тем не менее, выход образца силикона почти в 20 раз выше. Сокращения: GUV = гигантский униламеллярный везикул; DOPC = 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

ШагУсловие ЕСостояние PОписание
1.1.14,11 г17,11 гМасса сахарозы
1.1.12,16 г2,16 гМасса глюкозы
1.1.2240 мМ1000 мМКонцентрация сахарозы
1.1.2240 мМ240 мМКонцентрация глюкозы
1.3.2Силиконовое маслоНефтепродуктМасляная фаза для LS
1.3.2Стеклянный шприц 0,1 млСтеклянный шприц 0,5 млСтеклянный шприц для переноса DOPC в растворах хлороформа
1.3.1063 мкл500 мклОбъем DOPC в растворе хлороформа
1.3.1610 мл5 млОбъем масла
2.4.13300 г 20 минут500 г 45 минутУсловия центрифугирования

Таблица 1: Вариации в протоколе. В таблице приведены вариации для различных этапов протокола (указанных в первом столбце) для подготовки двух различных популяций GUV: GUV, загруженных сахарозой (условие E) и GUV, загруженных микрочастицами (условие P).

ИДЕНТИФИКАТОРНеобходимые шагиВнутренний диаметр (мм)Внешний диаметр (мм)Длина (мм)
11.2.1; 1.2.371350
21.2.1; 1.2.4; 1.3.571350
31.2.1; 1.2.4; 1.3.5713100
41.2.1; 1.2.4; 1.2.57132000
51.2.1; 1.2.6; 1.3.137132000
61.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
71.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
81.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200
91.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200

Таблица 2: Патрубки для газовых и вакуумных соединений в перчаточной камере. В таблице указаны размеры силиконовых трубок, используемых для подключения перчаточной камеры к азотной и вакуумной линиям. Для облегчения процесса сборки предоставляются ссылочные идентификаторы.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы производства GUV можно разделить на две основные группы: методы, основанные на набухании из подложек путем гидратации, и методы, основанные на сборке из жидких интерфейсов. Методы из первой группы очень эффективны для получения больших популяций GUV для биофизической характеристики липидных мембран или трансмембранных белков. В отличие от этого, такие методы, как перенос капель, в первую очередь выбирают для инкапсуляции грузов из-за снижения расхода груза и более высокой эффективности инкапсуляции18.

По этой причине множество различных грузов было инкапсулировано в GUV, что делает перенос капель эталонным процессом для искусственных клеток 3,8,9,10 и возможным решением для создания новых биомиметических микророботов11,12. Для модуляции физико-химических свойств ГУВ-мембран могут быть включены различные молекулы, такие как ионные фосфолипиды10, жирные кислоты19, полимеры, такие как ПЭГ-20, или холестерин-21 (хотя гидрофобные молекулы, такие как холестерин, обладают высоким сродством к маслу, что приводит к более низкому контролю состава мембраны по сравнению с методами набухания).). Протокол достаточно универсален, чтобы допускать эти изменения, но некоторые шаги имеют большее влияние, чем другие.

Чтобы обсудить критичность метода, мы описали здесь протокол получения двух различных популяций GUV: одного препарата GUV, содержащего раствор сахарозы, и одного препарата GUV, инкапсулирующих микрочастицы. Различия в протоколе подробно описаны в таблице 1 в виде условия E (пустое) и условия P (с частицами). Этот метод позволяет формировать GUVs путем переноса капель воды из масляной фазы в водную фазу в бистабильном процессе, приводимом в действие фосфолипидами23 и подверженным влиянию физико-химических свойств всех трех участвующих фаз: IS, OS и LS.

Среди этих трех видов LS является наиболее чувствительным из-за восприимчивости фосфолипидов к свету, окислению и гидролизу 24,25,26. По этой причине начальный этап выпаривания органического растворителя, используемого для длительного хранения фосфолипидов при -20°C (обычно хлороформа или метанола), должен быть выполнен в янтарных флаконах под потоком азота или аргона. Если в лабораторных условиях не обеспечивается низкий уровень влажности, фосфолипиды могут быть повреждены13, 14, 27. Таким образом, LS следует готовить в замкнутых условиях, таких как перчаточный ящик или экономически эффективная модифицированная перчаточная камера, описанная в данном протоколе. После добавления масла в липидную пленку ЛС можно удалить из бардачка, а полное растворение фосфолипидов осуществляется путем вортексирования и нагревания раствора.

Несмотря на то, что некоторые протоколы включают ультразвуковую обработку на этом этапе13, локализованное повышение температуры может привести к еще не описанным повреждениям некоторых составов LS. По этой причине нагревание раствора на водяной бане может обеспечить более контролируемый и однородный процесс. Чтобы еще больше снизить вероятность повреждения ЛС, этот протокол предлагает использовать две разные температуры: поскольку растворение вновь приготовленного ЛС требует более высокой энергии, чем ранее растворенного ЛС (из-за более плотной упаковки молекул фосфолипидов в пленке, нанесенной на поверхность стеклянного флакона), для первого растворения липидной пленки принимается 80 °C, а для простого повторного растворения фосфолипидов непосредственно перед их использованием, 50 °C. Поскольку для 3,18 мМ DOPC в минеральном масле обычно наблюдается увеличение вариабельности производительности с течением времени (рис. 4C), использование LS в течение недели является общепринятой практикой. Тем не менее, некоторые комбинации масла и фосфолипидов могут иметь увеличенный срок службы, а использование перчаточной камеры, по-видимому, также улучшает стабильность LS с течением времени.

Адаптация GUV-мембран с определенными комбинациями фосфолипидов может потребовать индивидуальной реализации протокола. Чтобы ориентироваться среди всех возможных вариаций, можно ориентироваться на физико-химические свойства LS. Критические мицеллярные концентрации (КМЦ) и диффузионность фосфолипидов в LS зависят от химических взаимодействий с молекулами в растворе28. Таким образом, на образование капель воды в эмульсии IS/LS влияет то, насколько быстро фосфолипиды могут диффундировать в масляной фазе и достигать границ раздела вода/масло, образуя стабильный монослой (внутренний листок мембраны). Различия в диффузии наблюдались для двух масел, используемых в этом протоколе, при этом силиконовое масло AR20 обеспечивало более высокую стабильность эмульсии IS/LS (рис. 6). Поскольку наиболее стабильная эмульсия для обоих масел наблюдалась при диспергировании воды в соотношении 2,5% (в соответствии с предыдущими наблюдениями в минеральном масле13), мы зафиксировали это соотношение как общедопустимое.

Тем не менее, поскольку более высокие соотношения могут обеспечить полезные свойства (например, POPC в минеральном масле показал сдвиг в сторону больших GUV13), мы рекомендуем провести предварительный качественный тест, подобный тому, который представлен на рисунке 6, чтобы получить представление о стабильности эмульсии и, следовательно, об ожидаемой эффективности инкапсуляции. Здесь мы советуем читателям не полагаться на точное время или итерации процедур для формирования эмульсии, потому что эффективность строго зависит от оператора или используемого инструмента. Вместо этого мы предоставляем контрольную точку, чтобы помочь оператору понять, когда качество эмульсии достаточно хорошее, чтобы — по крайней мере, теоретически — максимизировать шансы преобразования капель в GUV. Диффузия фосфолипидов в масле также влияет на их способность перестраиваться во время переноса капель и образовывать наружный листок мембраны GUV 2,7,18,29. Этому шагу способствует правильная балансировка интерфейса LS/OS. В то время как время инкубации, принятое в соответствии с этим протоколом, соответствует общим рекомендациям18, с учетом измерений межфазного натяжения из предыдущих отчетов7 и наших предварительных экспериментов, GUV, приготовленные с использованием различных LS, могут выиграть от более длительного времени инкубации.

На формирование наружного листа также влияет скорость пересечения каплями воды границы раздела LS/OS, этапа, связанного с плотностью и вязкостью трех фаз30. Разница плотностей всегда должна соответствовать порядку: IS > OS > LS. Это необходимо для того, чтобы сначала обеспечить осаждение капель IS в направлении границы раздела LS/OS, а затем пересечение границы для преобразования в GUV и их осаждение по направлению ко дну трубки. Несмотря на то, что этот процесс может происходить спонтанно, даже когда деионизированная вода используется в качестве IS и OS23, разница в плотности между IS и OS была введена в пользу образования GUV31. Наиболее распространенной парой для этой цели является сахароза в ИС и глюкоза в ОВ: в эквиосмолярных концентрациях, необходимых для предотвращения повреждения формирующихся ГУВ из-за осмотического стресса, сахароза дает более плотный раствор, чем глюкоза. Поскольку разница в плотности увеличивается с осмолярностью этих растворов, выход GUV изменяется соответственно, при этом дальнейшего улучшения не наблюдается за пределами 600мОсм13.

Оптимальные условия центрифугирования тесно связаны с плотностью и вязкостью трех фаз и диффузией фосфолипидов. В случае отсутствия полной характеристики трех фаз необходимо провести скрининг нескольких состояний. На основании качественных испытаний (рисунок 4Е и рисунок 5) и предварительного систематического анализа17 удалось определить хорошие условия центрифугирования для двух образцов, описанных в этом протоколе; Тем не менее, качество образцов может быть улучшено, если будет проверено больше условий. Когда баланс между диффузией фосфолипидов в LS и плотностью и вязкостью трех фаз не поддерживается должным образом, фосфолипидам не хватает времени для равновесия на границе LS/OS и правильной перегруппировки по мере продвижения капель воды к OS. Это часто приводит к образованию белесого осадка на границе раздела или чуть ниже него, вероятно, состоящего из фосфолипидов и других молекул масляной фазы, которые капли не могут собраться в GUV во время центрифугирования.

Инкапсуляция гомогенного раствора может быть обусловлена увеличением плотности IS при сохранении осмотического баланса с ОС (как для пары сахароза-глюкоза), но инкапсуляция дисперсии микрочастиц требует, чтобы плотность водной фазы соответствовала плотности микрочастиц32. На эффективность герметизации груза также влияет химический состав грузового раствора/дисперсии. Предыдущие отчеты показали негативное влияние на выход GUV, вызванное многими галогенидами щелочных металлов33 или колебаниями рН13, скорее всего, из-за взаимодействий или сдвигов в суммарном заряде цвиттерионных гидрофильных головок фосфолипидов. Таким образом, инкапсуляция биологических реакций (таких как ферментативный или бесклеточный синтез белка) часто требует компромисса, поскольку pH и концентрации солей (таких как KCl или NaCl) должны быть скорректированы до уровней, которые не являются оптимальными для самой реакции. Тем не менее, даже сложные реакционные смеси, такие как синтез бесклеточного белка, могут быть модифицированы для получения функциональных искусственных клеток на основе GUV34.

С практической точки зрения, хотя метод переноса капель предлагает очень простой процесс, восстановление GUV из ОС может иметь некоторые ограничения. Для удаления масла из верхней фазы после этапа центрифугирования можно использовать два наконечника для дозатора для более тонкого удаления (шаг протокола 3.1.1) или колбу Бюхнера для более быстрого удаления при подготовке нескольких образцов (шаг протокола 3.1.2). Тем не менее, поскольку масло удаляется не полностью, необходимо выполнить этап промывки для получения чистой дисперсии GUV (шаг протокола 3.2). Несмотря на то, что этапы промывки привели к эффективному удалению остаточных капель масла без заметной потери GUV (рис. 4A, B), этот переход может быть менее простым при использовании высоковязкого масла, и он может занять очень много времени при приготовлении нескольких составов GUV. Описан альтернативный способ обхода удаления масла и извлечения ГУВ со дна трубки через отверстие, пробитое с помощью иглы35. Этот процесс, однако, может не обеспечить полного восстановления пули GUV, если трубка не проколота в правильном положении и, кроме того, он потенциально опасен для оператора.

Чтобы помочь восстановлению GUV, мы представляем здесь новый и простой подход к быстрому удалению масляной фазы. Это основано на захвате верхней, менее плотной масляной фазы в наконечнике пипетки с крышкой, чтобы после центрифугирования наконечник можно было извлечь таким образом, чтобы жидкость не капала. Эта простая стратегия позволяет быстро и легко удалить всю масляную фазу сразу, значительно упрощая этот трудоемкий этап.

Для оценки эффективности протокола было реализовано несколько методов автоматического обнаружения GUV для ускорения подсчета и анализа распределения по размерам. Мечение GUV с помощью флуоресцентных зондов обеспечивает простую и эффективную стратегию, применяемую как к проточной цитометрии 36,37, так и к микроскопической визуализации в сочетании с алгоритмами детектирования кругов 13,37,38,39. В последнее время для улучшения этого процесса изучаются инструменты на основе искусственного интеллекта для обнаружения объектов 40,41. Тем не менее, флуоресцентные красители потенциально могут влиять на свойства GUV, тем самым внося артефакты в анализ. Если исключить детектируемый флуоресцентный сигнал, микроскопия остается наиболее надежным вариантом, при этом фазово-контрастная микроскопия является предпочтительным методом для оптимальной визуализации18 и применения алгоритмов обнаружения круга38.

В качестве альтернативы можно использовать специфические свойства конкретных формул для создания уникальных стратегий обнаружения. Hadorn et al., например, использовали присутствие электролитов в ИС для обнаружения GUV с помощью счетчика ячеек на основе импеданса33. Когда ни один из этих автоматизированных или специфичных для рецептур методов невозможен, ручное аннотирование кругов остается универсально применимым запасным вариантом. В таких случаях ImageJ предлагает практичный инструмент для ускорения процесса и легкого извлечения исходных измерений диаметра, как описано в этом протоколе.

Несмотря на широкое распространение метода переноса капель, мало внимания уделяется процессам оптимизации, необходимым для новых составов GUV. В этой работе мы собрали доступную информацию из литературы для реализации систематического протокола для управления и упрощения этой оптимизации. В данном практическом руководстве рассматриваются основополагающие принципы, связанные с производством новых составов GUV и извлечением минимально загрязненной нефтью пробы, что часто упускается из виду в протоколе13,14. Несмотря на то, что предсказать оптимизацию, которая требуется для любой формулы GUV, невозможно, в этом руководстве содержатся полезные советы и идеи для ускорения внедрения новых GUV, которые могут привести к их применению, включая искусственные клетки и микророботов.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конкурирующих интересов, о которых они могли бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эти результаты являются частью проекта CELLOIDS (Cell-inspired particle based intelligent microrobots), который получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках программы исследований и инноваций Европейского Союза Horizon 2020 (грантовое соглашение No 948590). Эта работа была частично поддержана Европейской комиссией в рамках проекта NextGenerationEU BRIEF. Мы благодарим Мишель Ибрахими за техническую поддержку в установке перчаточной камеры и за полезную дискуссию о внедрении контейнера для легкого удаления масла.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 & микро; m Смешанные эфиры целлюлозы мембранные  Шприцевые фильтрыМеркSLGSVR255F
Пробирки объемом 1,5 млБиокласс06.0279.00
100 μ Стеклянный шприц LМерк20737
Стакан 150 млАвантор 213-1123Не менее 3
20 мл флаконы из темного стекла ND24Авантор 548-9001А
2 мл пробирокБиокласс07.3534.99
Баллон 50 млАвантор 612-3843
500 μ Стеклянный шприц LГамильтон549-1166
Пробирка Falcon 50 млМеркCLS352070
50 мл шприца Научный центр Фишера8SS50L1
Пробирки объемом 5 млГрайнер биоуан622201
Стакан 600 млАвантор 213-1126
Bü Колба ХнераМеркZ740682
Пробковые кольца для колб с круглым дномАвантор 217-1000
КристаллизаторДатчер080474А
D-(+)-глюкозаСигма-ОлдричГ8270
Д-(+)-СахарозаСигма-ОлдричС9378
Цифровой термогигрометрБолендерВ1863-07
ДОПКИсследование Avanti850375К
СверлоDremel4000
Соль динатрия эриоглауцина (Brilliant Blue FCF)Сигма-Олдрич861146
Игла для шприца G18ТерумоAN1838R1
Игла для шприца G21ТерумоAN2138R1
БардачокБел-АртФ50030-0000При наличии можно использовать перчаточный ящик, но в лабораториях с низким уровнем влажности он может не понадобиться
Магнитная мешалка с подогревомLLG Лабораторная посуда6.263 448
Легкое минеральное маслоСигма-Олдрич330779
Новый кокцинСигма-Олдрич199737
Уплотнительное кольцо из нитрилового каучука, отверстие 8 мм, внешний диаметр 12 ммРС196-4863
Открытые винтовые колпачки с перегородкой ND24Авантор 548-0031А
Микропипетка P1000Научный центр Фишера12346132
Микропипетка P10000Авантор 89079-978
Микропипетка P200Научный центр Фишера12326132
Бумажные полотенцаАвантор KIMB6657
ПарафильмАвантор 291-1214
Наконечники для пипеток (1000)Эппендорф0030000919
Наконечники для пипеток (10000)Эппендорф0030000765
Наконечники для пипеток (200)Эппендорф0030000870
Частицы полистирола, 1.1 & микро; mСигма-ОлдричЛБ11-1МЛ
Резиновый колпачокБиокласс S.r.l.12.2300.05
Резиновая коническая прокладкаАвантор 217-0211
Винтовые крышки  НД24Авантор 548-0161А
Силиконовое масло AR20Сигма-Олдрич10836
Силиконовая труба (внутренний диаметр 1,6 мм, внешний диаметр 3 мм)РС667-8441
Силиконовая труба (внутренний диаметр 6 мм, внешний диаметр 12 мм)РС273-2541Не менее 6 м
Трехсторонняя развязкаРС795-405
Двусторонняя развязкаРС419-7287
Двухходовой клапанКлабер91280
Сверхчистая водаThermo Fisher Scientific 22934При наличии этого продукта его можно заменить водой, очищенной с помощью систем Milli-Q
Универсальные ножницыБохем4154

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Träuble, H., Grell, E. Carriers and specificity in membranes. IV. Model vesicles and membranes. The formation of asymmetrical spherical lecithin vesicles. Neurosci Res Program Bull. 9 (3), 373-380 (1971).
  2. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  3. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  4. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
  5. Ernits, M., et al. Microfluidic production, stability and loading of synthetic giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 14 (1), 14071(2024).
  6. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  7. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), (2011).
  8. Elani, Y., Law, R. V., Ces, O. Vesicle-based artificial cells as chemical microreactors with spatially segregated reaction pathways. Nat Commun. 5 (1), 5305(2014).
  9. Heili, J. M., et al. Controlled exchange of protein and nucleic acid signals from and between synthetic minimal cells. Cell Syst. 15 (1), 49-62.e4 (2024).
  10. Shimane, Y., Kuruma, Y. Rapid and facile preparation of giant vesicles by the droplet transfer method for artificial cell construction. Front Bioeng Biotechnol. 10, 873854(2022).
  11. Sato, Y., Hiratsuka, Y., Kawamata, I., Murata, S., Nomura, S. M. Micrometer-sized molecular robot changes its shape in response to signal molecules. Sci Robot. 2 (4), eaal3735(2017).
  12. De Remigis, E., et al. Infiltration of cell-inspired ultra-deformable magnetic microrobots in restrictive environments. IEEE Trans Med Robot Bionics. 7 (1), 123-129 (2024).
  13. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  14. Zhang, Y., Obuchi, H., Toyota, T. A practical guide to preparation and applications of giant unilamellar vesicles formed via centrifugation of water-in-oil emulsion droplets. Membranes. 13 (4), 440(2023).
  15. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  16. Palagi, S. GUV-dimensional-analysis. , https://github.com/microrobotlab/GUV-dimensional-analysis/tree/v1.0 (2025).
  17. De Remigis, E., et al. Optimisation of encapsulation technique for confining microparticles in lipid membranes. Zenodo. 2023, DOI: 10.5281/zenodo.8069819 (2023).
  18. Dimova, R., Stano, P., Marques, C. M., Walde, P. Preparation methods for giant unilamellar vesicles. Giant Vesicle Book. , 3-20 (2019).
  19. Tyler, A. I. I., Greenfield, J. L., Seddon, J. M., Brooks, N. J., Purushothaman, S. Coupling phase behavior of fatty acid containing membranes to membrane bio-mechanics. Front Cell Dev Biol. 7, (2019).
  20. Hamada, S., et al. Giant vesicles functionally expressing membrane receptors for an insect pheromone. Chem Commun. 50 (22), 2958(2014).
  21. Roberti, E., Petrocelli, E. L., Cecchi, D., Palagi, S. Dimensions, stability, and deformability of DOPC-cholesterol giant unilamellar vesicles formed by droplet transfer. Open Res Eur. 5 (77), (2025).
  22. Weakly, H. M. J. Several common methods of making vesicles (except an emulsion method) capture intended lipid ratios. Biophys J. 123 (19), 3452-3462 (2024).
  23. Ito, H., et al. Dynamical formation of lipid bilayer vesicles from lipid-coated droplets across a planar monolayer at an oil/water interface. Soft Matter. 9 (40), 9539-9547 (2013).
  24. Reis, A., Spickett, C. M. Chemistry of phospholipid oxidation. Biochim Biophys Acta BBA Biomembr. 1818 (10), 2374-2387 (2012).
  25. Storage and handling of lipids. , https://avantiresearch.com/tech-support/storage-handling-of-lipids (2025).
  26. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  27. Faizi, H. A., Tsui, A., Dimova, R., Vlahovska, P. M. Bending rigidity, capacitance, and shear viscosity of giant vesicle membranes prepared by spontaneous swelling, electroformation, gel-assisted, and phase transfer methods: a comparative study. Langmuir. 38 (34), 10548-10557 (2022).
  28. Lehtinen, O. -P., et al. Effect of temperature, water content and free fatty acid on reverse micelle formation of phospholipids in vegetable oil. Colloids Surf B Biointerfaces. 160, 355-363 (2017).
  29. Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
  30. Whittenton, J., Harendra, S., Pitchumani, R., Mohanty, K., Vipulanandan, C., Thevananther, S. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  31. Hamada, T., Miura, Y., Komatsu, Y., Kishimoto, Y., Vestergaard, M., Takagi, M. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
  32. Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
  33. Hadorn, M., Boenzli, E., Hotz, P. E. A quantitative analytical method to test for salt effects on giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 1 (1), 168(2011).
  34. Toparlak, ÖD., et al. Artificial cells drive neural differentiation. Sci Adv. 6 (38), eabb4920(2020).
  35. Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoc. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  36. Matsushita-Ishiodori, Y., Hanczyc, M. M., Wang, A., Szostak, J. W., Yomo, T. Using imaging flow cytometry to quantify and optimize giant vesicle production by water-in-oil emulsion transfer methods. Langmuir. 35 (6), 2375-2382 (2019).
  37. Caliari, A., Hanczyc, M. M., Imai, M., Xu, J., Yomo, T. Quantification of giant unilamellar vesicle fusion products by high-throughput image analysis. Int J Mol Sci. 24 (9), 8241(2023).
  38. van Buren, L., Koenderink, G. H., Martinez-Torres, C. DisGUVery: a versatile open-source software for high-throughput image analysis of giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 12 (1), 120-135 (2023).
  39. Pazzi, J., Subramaniam, A. B. Nanoscale curvature promotes high yield spontaneous formation of cell-mimetic giant vesicles on nanocellulose paper. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (50), 56549-56561 (2020).
  40. Ekosso, C., Liu, H., Glagovich, A., Nguyen, D., Maurer, S., Schrier, J. Accelerating the discovery of abiotic vesicles with AI-guided automated experimentation. Langmuir. 41 (1), 858-867 (2025).
  41. Lee, I. -H., Passaro, S., Ozturk, S., Ureña, J., Wang, W. Intelligent fluorescence image analysis of giant unilamellar vesicles using convolutional neural network. BMC Bioinformatics. 23 (1), 48(2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи