Методическая статья

Одновременный 3D-анализ повреждения сердца и иммунного ответа при реперфузном остром инфаркте миокарда с помощью световой листовой флуоресцентной микроскопии

DOI:

10.3791/68347

⸱

26 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трехмерная (3D) реконструкция повреждения сердца при реперфузном остром инфаркте миокарда (repAMI) позволяет точно количественно оценить и колокализовать связанные с заболеванием паттерны. В этом случае обеспечивается автоматизированный подход к визуализации с помощью световых листов для одновременного измерения повреждения сердца, зоны риска и ответа иммунных клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сложные клеточные взаимодействия определяют функциональное и структурное ремоделирование тканей при реперфузном остром инфаркте миокарда (repAMI). Эти процессы демонстрируют четкое пространственное распределение, поскольку поврежденная сердечная мышца сегментирована на различные области (зона повреждения, зона риска (AAR) и отдаленная область). Трехмерная (3D) визуализация этих областей имеет важное значение для анализа различных взаимодействий между резидентными клетками сердца и инфильтрирующими иммунными клетками, что позволяет идентифицировать возможные цели лечения. Здесь описан протокол для одновременной и автоматизированной 3D-визуализации и количественной оценки области повреждения сердца, AAR и инфильтрирующих иммунных клеток (например, нейтрофилов) после repAMI. Это включает в себя опосредованное прижизненными антителами окрашивание области повреждения сердца (CD31neg) и инфильтрацию нейтрофилов (Ly6G+) после визуализации AAR ex vivo с помощью ретроградной перфузии антител и дальнейшую нетоксичную очистку тканей для визуализации световых листов флуоресцентной микроскопии (LSFM). Этот метод позволяет проводить пространственный анализ клеток-мишеней, например, инфильтрацию иммунных клеток и поврежденных участков в интактном сердце мыши после repAMI. Традиционная гистология и иммуногистохимия могут быть выполнены после нетоксичного очищения тканей и получения изображений с компьютерной постобработкой. Это позволяет мультиплексировать получение информации в одном и том же сердце мыши, повышая надежность данных и особенно важно при такой сложной травме, как repAMI.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Повреждение тканей при реперфузном остром инфаркте миокарда (repAMI) является основным движущим фактором ремоделирования сердца и развития сердечной недостаточности1. Множественные локальные медиаторы и резидентные сердечные клетки, а также инфильтрирующие иммунные клетки влияют на его экспансию в сложном взаимодействии 2,3. Понимание пространственной организации этих процессов имеет важное значение для получения глубоких знаний для определения новых целей терапии для ограничения повреждения тканей после repAMI и улучшения сердечной функции.

Поскольку сердечная мышца сама по себе состоит из различных типов клеток, детальный анализ повреждения сердца является сложной задачей, поскольку каждый тип клеток проявляет свою специфическую способность к резистентности во время ишемии и реперфузионного повреждения 4,5. Одним из важных признаков в контексте repAMI является значительная потеря сосудистой сети, сопровождающаяся ухудшением функции эндотелиальных клеток6. Наиболее известным маркером, используемым для описания структуры сосудов и анализа эндотелиальной дисфункции у мышей и человека, является CD31 (также известный как PECAM-1), молекула адгезии, экспрессируемаяна поверхности эндотелиальных клеток. В различных моделях ишемии/реперфузии потеря CD31 оказалась хорошим суррогатным маркером для дифференциации повреждения эндотелиальной ткани 8,9,10. Кроме того, во время repAMI во всем сердце выделяются три основных травматических отсека. Сердечная ткань, не пораженная ишемией/реперфузионным повреждением (I/R), представляет собой отдаленную область. Миокард после окклюзии сосуда определяется как зона риска (ААР)11,12. После начала реперфузии внутри ААР может быть дифференцирован отдельный участок сердечной ткани, который был поврежден в результате предшествующей ишемии (области повреждения)13. При традиционной оценке повреждения сердечного в/р у мышей используется трифенилтетразолия хлорид (ТТХ) в серийных толстых срезах, демонстрирующих сниженную метаболическую активность поврежденных сердечных клеток13,14. В то же время, для определения AAR15 может быть добавлено окрашивание ex vivo в синий цвет Эвана. Тем не менее, эти установленные методы имеют ряд ограничений, в том числе меньшую возможность совместной оценки инфильтрации иммунных клеток, различие повреждения по типу клеток и точную 3D-реконструкцию тканей.

Световая листовая флуоресцентная микроскопия (LSFM) позволяет визуализировать неповрежденные очищенные целые органы мыши с разрешением сигнала флуоресценции вплоть до клеточного уровня. Недавно был представлен усовершенствованный нетоксичный метод очистки тканей с использованием этилциннамата (ECi) для 3D-визуализации интактных мышиных сердец8. Для устранения ограничений окрашивания TTC/Evan's blue использовали флуоресцентное окрашивание CD31 на основе привитальных антител, выявив повреждение эндотелия сердца как участки без окрашивания CD31 (CD31neg) во время repAMI8. Дополнительное введение ex vivo ретроградной инъекции аорты с флуорофор-конъюгированным анти-CD31 антителом с другим флуоресцентным спектром в качестве прижизненного окрашивания объясняет одновременное 3D-изображение ААР. Кроме того, этот метод может быть расширен за счет добавления окрашивания нейтрофилов, что позволяет анализировать распределение клеток, разделенных по отдаленным областям, AAR и объему повреждения эндотелия сердца, чтобы улучшить понимание функции нейтрофилов во время repAMI.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на экспериментальных животных были одобрены ответственным местным государственным органом (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) и соответствовали всем соответствующим этическим нормам для испытаний и исследований на животных. Эксперименты проводились с самцами мышей C57BL/6J (в возрасте 9-30 недель). Животные содержались и использовались в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF) в местном животноводческом помещении в течение 12 ч/12 ч дневного и ночного цикла.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все оперативные вмешательства выполнялись под внутрибрюшинной индукцией анестезии с использованием кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) с поддержанием изофлураном (1,5 об.). Чтобы уменьшить страдания животных, все животные получали подкожные инъекции 0,1 мг/кг бупренорфина до и после анестезии в течение дня в сочетании с питьевой водой, содержащей бупренорфин, в течение ночи. Хирургический протокол для индукции repAMI был ранее описан в других работах16,17. Прежде чем начать инъекцию прижизненных антител, приготовьте две чашки Петри по 6 см, которые используются для инъекции ретроградных антител ex vivo на более поздних этапах, описанных ниже. Одна неглубокая чашка Петри с PBS на льду необходима для грубого удаления излишков окружающих тканей из сердца (рекомендуется использовать разрезанные по размеру кусочки марли внутри чашки, чтобы облегчить процесс последующего обращения). Еще одна чашка необходима для канюляции аорты с помощью тупой стальной канюльной иглы 20 G, погруженной в PBS на льду с ослабленным узлом шва 5-0 над вырезом канюли. Избегайте или удаляйте пузырьки воздуха внутри канюли, так как они могут блокировать коронарные сосуды и предотвратить полную перфузию.

1. Инъекция прижизненных антител

  1. Обезболите мышь с помощью кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг).
  2. Введите по 10 г непосредственно меченых мышиных антител к CD31 (клон: MEC13.3; флуорофор: AlexaFluor 790) и мышиных антител к Ly6G (клон: 1A8; флуорофор: AlexaFluor 647) в PBS общим объемом 5 мкл на г массы тела (100 мкл для мыши массой 20 г) путем внутривенной инъекции в хвостовую вену.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта инъекция антител помечает весь эндотелий внутри сердца и предназначена для количественной оценки размера повреждения repAMI.
  3. Дайте введенным антителам циркулировать в течение 10 минут, прежде чем продолжить процедуру.

2. Забор сердца

ПРИМЕЧАНИЕ: Разделы 2 и 3 имеют решающее значение по времени и должны быть выполнены менее чем за 6 минут.

  1. Убейте животное при вывихе шейки матки через 10 мин после введения антител. Остановите смерть, оценив рефлексы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимы образцы крови, возьмите их, прежде чем переходить к следующему шагу.
  2. Поместите мышь под стереомикроскоп.
  3. Вскрыть грудную полость и надрезать обнаженную верхнюю полую вену ближе к выходу сосуда из грудной клетки в шею.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте аорту в целости, так как она необходима для инъекции ретроградных антител ex vivo .
  4. Перфузируйте сердца in situ через правое и левое предсердие с помощью PBS, содержащей гепарин (20 ИЭ/мл) с помощью иглы 27 G с роликовым насосом (70 μл/с) в общей сложности 3 мин. Достаточное удаление сердечной крови становится заметным по затуханию поверхностного сосудистого рисунка сердца и отбеливанию легких и печени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте перфузии сердца через правый или левый желудочек, так как это может привести к артефактам визуализации во время флуоресцентной микроскопии светового листа.
  5. Удалите сердце и не менее 5 мм оставшейся аорты вместе с окружающей легочной тканью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не держите сердечную мышцу непосредственно во время иссечения, чтобы избежать повреждения тканей и артефактов визуализации во время флуоресцентной микроскопии светового листа.

3. Инъекция ретроградных антител ex vivo

  1. Переложите сердце в 6-сантиметровую чашку Петри с ледяным ПБС и подготовленной ранее марлей.
  2. Отрежьте оставшуюся окружающую легкую, жировую ткань и ткань сосудов до тех пор, пока не останется только сердце с аортой примерно 5 мм.
  3. Переложите сердце в подготовленную посуду для канюляции аорты.
  4. Натяните оставшуюся аорту на канюлю из тупой стали 20 G и перевязайте ее предварительно узелковым швом 50 до выемки канюли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечник канюли должен быть прижат близко к аортальному клапану, чтобы предотвратить утечку перфузионной жидкости.
  5. Повторно перелинтируйте левую переднюю нисходящую артерию (ПМЖ) навсегда с помощью шва 6-0 в том месте, где ранее использовалась индукция repAMI.
  6. Введите 400 мкл PBS, содержащего 20 мкг мышиного антитела к CD31 (клон: MEC13.3), меченного AlexaFluor 546, ретроградно через вставленную канюлю.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Закройте соединение между инъекционным шприцем и вставленной канюлей герметизирующей пленкой, чтобы обеспечить полную перфузию антител через коронарные артерии. Эта инъекция антитела окрашивает эндотелий только за пределами ААР и, таким образом, может быть использована для количественного определения ААР.
  7. Вытащите вставленную канюлю из аорты.
  8. Перенесите сердце в полипропиленовую реакционную пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл 4% параформальдегида (PFA), и инкубируйте без перемешивания в течение ночи при 4 °C в темноте.

4. Обработка и очистка образцов

  1. Зафиксированное сердце промыть в трех сменах по 5 мл PBS в течение 10 мин при комнатной температуре (ОТ) в темноте, постоянно перемешивая с вращением вблизи головы в полипропиленовых реакционных пробирках объемом 5 мл.
  2. Обезвоженное фиксированное сердце в 5 мл восходящего этанола в концентрации 50%, 70% и 100% в деионизированной воде, каждое в течение не менее 2 ч при ОТ в темноте, всегда взбалтывая с вращением над головой в полипропиленовых реакционных пробирках объемом 5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация в 50% и 70% этаноле может быть продлена до следующего дня, в то время как инкубация в 100% этаноле может быть продлена до 3 дней.
  3. Обезвоженное сердце отбелить в полипропиленовых реакционных пробирках объемом 15 мл, содержащих 10 мл 100% этанола с 5% ДМСО и 5%Н2О2 без перемешивания, в течение 4 ч при 4 °С в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе отбеливания внутри трубки может накапливаться давление; Будьте осторожны при открытии трубки после этого.
  4. Отбеленное сердце промыть в 5 мл 100% этанола три раза в течение 12 ч каждый при РТ в темноте, постоянно перемешивая с близким вращением над головой, в полипропиленовых реакционных пробирках объемом 5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый этап инкубации может быть продлен на срок до 3 дней.
  5. Перенесите сердце в полипропиленовую реакционную пробирку объемом 5 мл, содержащую 4 мл этилциннемата (ЭКi) для очищения тканей, и инкубируйте без перемешивания в течение 3 дней в режиме ЛТ в темноте.
    Примечание: Очищенное сердце может оставаться в ЭКi не менее 3 месяцев без снижения интенсивности флуоресценции при правильном хранении в темноте при ЛТ. Не храните ЭКи или образцы, хранящиеся в ЭКи, при температуре ниже 6 °C, так как ЭКи замерзает при этой температуре, нанося вред образцу в процессе.

5. Приготовление блокировок геллановой камеди

  1. Смешайте 1 г порошка геллановой камеди со 100 мл подогретой водопроводной воды (50-60 °C).
  2. Дайте перемешать до полного разрешения с помощью магнитной мешалки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если порошок не растворяется должным образом, нагрейте раствор до кипения в микроволновой печи.
  3. Отфильтруйте раствор геллановой камеди через клеточное ситечко толщиной 100 мкм.
  4. Тарелкой процедить раствор в неглубокую 10 см чашку Петри.
  5. Дайте остыть, пока гель не застынет.
  6. Нарезать гель на блоки по 15 мм, 15 мм, 5 мм.
  7. Дегидратируйте блоки в 50 мл восходящего этанола в концентрации 50% и 70% в деионизированной воде, каждый в течение не менее 2 ч при РТ, постоянно перемешивая с вращением вблизи верхней части в одной полипропиленовой реакционной пробирке объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заполните реакционную пробирку этанолом после добавления гелевых блоков. Заполните реакционную пробирку только до половины гелевыми блоками.
  8. Инкубировать обезвоженные блоки в 50 мл 100% этанола три раза в течение 12 ч каждый при РТ, постоянно перемешивая с вращением вблизи верхней части в одной полипропиленовой реакционной пробирке объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заполните реакционную пробирку этанолом после добавления гелевых блоков. Заполните реакционную пробирку только до половины гелевыми блоками. Гелевые блоки могут оставаться в последней реакционной пробирке со 100% этанолом в течение длительного времени до тех пор, пока не выйдут из ЭКи.
  9. Перенесите блоки в полипропиленовую реакционную пробирку объемом 50 мл, содержащую 25 мл ЭКи, и инкубируйте без перемешивания в течение 3 суток в режиме РТ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите всего несколько блоков в одну реакционную пробирку с ЭКи, чтобы избежать удаления артефактов. Очищенные блоки могут оставаться в ECi не менее 6 месяцев и храниться в RT.

6. Визуализация

  1. Вырежьте очищенные блоки геллановой камеди до размера, необходимого для стабилизации очищенного сердца в держателе для образцов микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блоки из геллановой камеди можно использовать многократно.
  2. Детектируйте интересующие флуоресцентные сигналы (аутофлуоресцентное окрашивание, окрашивание AAR [анти-CD31-антитело, меченное AlexaFluor 546], связанное с AlexaFluor647-ассоциированным антителом анти-Ly6G и окрашивание CD31-neg [анти-CD31-антитело, меченное AlexaFluor 790]) с соответствующими настройками фильтра возбуждения и излучения. Для съемки используйте объектив 0,1 NA с рабочим расстоянием 17,6 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Детектирование сигналов с помощью лазера белого света (200 мВт; 480-2400 нм). Для определения автофлуоресценции, полученной из соединительной ткани, используйте полосовой фильтр возбуждения 470/30 нм и полосовой фильтр 525/50 нм; Окрашивание CD31 антителом, связанным с AlexaFluor 546, детектируется с помощью полосового фильтра возбуждения 520/40 нм и полосового фильтра эмиссии 585/40 нм; Окрашивание Ly6G антителом, связанным с AlexaFluor 647, детектируется с помощью полосового фильтра возбуждения 630/30 нм и полосового эмиссионного фильтра 680/30 нм; Окрашивание CD31 антителом, связанным с AlexaFluor 790, детектируется с помощью полосового фильтра возбуждения 740/40 нм и полосового фильтра излучения 824/55 нм. Время освещения и процент затухания лазера должны регулироваться в соответствии с качеством сигнала.
  3. Выберите следующие параметры для визуализации световых листов:
    1. Выбирайте лист NA 0,079, в результате чего толщина легкого листа составляет 5 мкм.
    2. Выберите 10 μm в качестве расстояния между двумя отдельными z-плоскостями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это приводит к недостаточной выборке и последующей потере точности при отслеживании и измерении объема. Чтобы этого избежать, расстояние между двумя отдельными z-плоскостями должно быть равно половине толщины светового листа, то есть в данном случае 2,5 мкм. В этом исследовании было решено занизить выборку данных, поскольку преимущества, полученные за счет сокращения времени визуализации и размера стека данных, перевешивают минимальную потерю точности анализа.
    3. Используйте ширину листа 100%, чтобы получить равномерное освещение образца.

7. Постобработка изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Полученные данные цифровых изображений были дополнительно обработаны с использованием научного программного обеспечения для обработки и анализа 3D-изображений, указанного в таблице материалов.

  1. Запустите программу Imaris File Converter 10.1 и загрузите необработанный набор данных в программу, перетащив папку с файлами изображений в окно конвертера файлов Imaris или нажав кнопку «Обзор » и перейдя к папке с файлами изображений.
  2. Выберите выходную папку с помощью инструмента «Выбрать папку».
  3. Нажмите «Начать все » и подождите, пока файлы будут преобразованы в файлы .ims Imis.
  4. Запустите программу и выберите «Превзойти » в левом верхнем углу.
  5. Откройте стеки изображений, выбрав «Открыть», и выберите соответствующий файл данных .ims.
  6. Чтобы создать автоматически сгенерированную поверхность всего сердца, выберите «3D-вид и поверхности».
  7. Выберите «Только областьинтереса», «Обрабатывать все изображение в итоге» и «Статистика объекта-объекта », отключив функцию «Классифицировать поверхности» в разделе «Настройки алгоритма ».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включение функции "Объект-объектная статистика" позволяет выполнять расчет наложения различных поверхностей и функций пятна.
  8. Нажмите кнопку с синей стрелкой в правом нижнем углу листа «Создать », чтобы продолжить выполнение следующих действий.
  9. Определите трехмерную область интереса с помощью манипуляторов, появляющихся в виде изображения.
  10. Перейдите к следующему шагу, выбрав канал источника (канал автофлуоресценции).
  11. Включите Smooth (Плавный ) и выберите значение по умолчанию 11,8 μm.
  12. Перейдите к следующему шагу и определите пороговое значение, необходимое для создания трехмерной поверхности, которая будет визуально удовлетворять друг друга.
  13. На последнем шаге настройте фильтр поверхности, выбрав Количество вокселей в качестве типа фильтра и определив 10 в качестве порога.
  14. Создайте поверхность, нажав кнопку с зеленой стрелкой в правом нижнем углу раздела Создать . С помощью листа Цвет измените материал и цвет создаваемой поверхности по мере необходимости.
  15. Сгенерируйте две дополнительные вручную созданные поверхности для AAR (объем CD31 neg в канале AlexaFluor 546) и объема повреждения эндотелия сердца (объем CD31neg в канале AlexaFluor 790), выбрав 3D View и Surfaces еще раз.
  16. Выберите Сегментировать только область интереса, Обработать все изображение в завершение и Статистика объекта-объекта, отключив Классифицировать поверхности в разделе Настройки алгоритма и нажмите Пропустить автоматическое создание, редактировать вручную.
  17. На листе Board выберите XY для ориентации, None для видимости и вручную настройте контроллер разрешения на максимум.
  18. Перейдите на лист Модель , щелкните значок Расстояние и установите расстояние между вершинами на 100 мкм.
  19. Включите параметр «Рисовать » и обведитеотрицательные области CD31 в канале AlexaFluor 546 или канале AlexaFluor 790 каждые 10 срезов изображения.
  20. После завершения обводки всех соответствующих областей выберите «Автоподгонка » и «Выполнить автоподгонку».
  21. Нажмите кнопку "Создать поверхность" и настройте материал и цвет созданных поверхностей на листе "Цвет".
  22. Чтобы отобразить нейтрофилы в виде пятен Ly6G+, сгенерируйте функцию пятна, выбрав «3D-вид и пятна».
  23. Выберите «Сегментировать только область интереса», «Обрабатывать все изображение в итоге» и «Статистика объекта-объекта », отключив параметр «Классифицировать пятна » в разделе «Настройки алгоритма ».
  24. Перейдите к следующим шагам с помощью кнопки с синей стрелкой в правом нижнем углу листа «Создать ».
  25. Определите трехмерную область интереса с помощью манипуляторов, появляющихся внутри вида изображения, как упоминалось выше.
  26. Перейдите к следующему шагу, используя исходный канал (канал AlexaFluor 647).
  27. Установите расчетный диаметр XY на 10 мкм, включите удлинение модели PSF вдоль оси Z и установите расчетный диаметр по оси Z на 20 мкм.
  28. Отключите вычитание фона.
  29. Перейдите к следующему шагу, выберите «Минимальная интенсивность » в качестве фильтра и установите соответствующий порог.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки порогового уровня нажмите кнопку "Срез " в верхней части окна программы и выберите канал AlexaFluor 647. Наведите курсор на различные места на срезе необработанного изображения, представляющие положительное окрашивание Ly6G, и прочитайте значение интенсивности в левом нижнем углу окна программы.
  30. Создайте точки, нажав кнопку с зеленой стрелкой в правом нижнем углу листа Создать .
  31. Установите Шкалу радиуса на 3.0 в разделе Стиль/Качество точек на листе Создать .
  32. Попал на лист Цвет для настройки плашечного цвета по желанию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный подход с использованием световой листовой флуоресцентной микроскопии (ЛСФМ) позволяет проводить одновременный анализ ААР, повреждения эндотелия и инфильтрации нейтрофилов после repAMI. На рисунке 1A показано окрашивание прижизненных и ex vivo антител мышей C57BL/6J через 24 ч после индукции repAMI. Антитела для окрашивания повреждения эндотелия сердца (анти-CD31, меченные AlexaFluor 790) и инфильтрации нейтрофилов (анти-Ly6G, меченные AlexaFluor 647) вводили внутривен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует несколько визуализирующих объектов для выявления повреждения сердечной ткани во время repAMI у мышей. Эти методы имеют различные преимущества, но также и ограничения. Окрашивание сниженной метаболической активности сердечных клеток с помощью TTC является наиболее часто используемым методом количественной оценки повреждения сердечного внутриклапанного спектра и может сочетаться с окрашиванием синим цветом Эвана для определения AAR 13,14,15.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Элиас Хадж-Йехия сообщает о личных гонорарах и других гонорарах от «АстраЗенека», которые не входят в представленную работу. Саймон Ф. Мерц и Леа Борнеманн в настоящее время работают в компании Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG. Маттиас Тотцек и Тинуш Рассаф сообщают о личных гонорарах, а другие от Edwards and Novartis, Bristol Myers Squibb, Bayer, Daiichi Sankyo и Astra Zeneca, которые не входят в представленную работу. Тинуш Рассаф и Ульрике Б. Хенджен-Котта стали соучредителями Bimyo, компании, специализирующейся на разработке кардиопротекторных пептидов. Маттиас Гунцер получил общее финансирование исследований от компании Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG. Все остальные авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы указывают на следующие источники финансирования: Немецкое научно-исследовательское общество (UMEA Clinician Scientist, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) и Немецкое кардиологическое общество (DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). Часть этой работы была выполнена в Центре визуализации Эссена (IMCES), базовом сервисном центре медицинского факультета Университета Дуйсбург-Эссен, Германия. Мы благодарим сотрудников IMCES за их постоянную техническую поддержку и использование их инструментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Игла 27 гБектон Дикинсон305889BD Eclipse
Обработка 3D-изображений и Программное обеспечение для анализаБитовая плоскостьVers. 10.1.0Имарис
5-0 шовСераг-ВисснерIC108000Шёлк
6-0 шовЭтиконЭХ7814Пролен
Набор для мечения антител AlexaFluor 546ИнвитрогенА20183
Набор для мечения антител AlexaFluor 790ИнвитрогенА20189
Антитело к мышиному Ly6G (AlexaFluor 647)Биолегенда127610Клон: 1A8
Сетчатый фильтр для клеток (100 & микро; m)Корнинг431752
Диметилсульфоксид (ДМСО)Карл Рот7029.1
ЭтанолКарл Рот0911.4
Этилциннемат (ECi)Сигма-Олдрич112372
Программное обеспечение для конвертации файловБитовая плоскостьVers. 10.1.0Имарис
МарляФурман10021
Порошок геллановой камедиСигма-ОлдричП8169Фитагель
Гепарин (25 000 МЕ/5 мл)ЛЕО Фарма15261203
Перекись водорода (H2O2, 30%)Карл Рот8070.2
Инъекционный шприцБ. Браун9161502СОмникан Ф
Кетамин (100 мг/мл)Бела-Фарма402581.00.00
Система светового листового микроскопаМилтеньи Биотек-Ультрамикроскоп Blaze
Шприц с замком ЛюэраБектон Дикинсон303172БД Пластипак
Магнитная мешалкаВВР444-0572
Фотоаппарат Neo sCMOS (4,2 МП)Технология AndorЯчейка ZL41 4.2
ОбъективныйМилтеньи Биотек130-133-625MI Plan 1.1x NA 0.1, WD 17.6 мм
Параформальдегид (PFA, 4%)Сигма-Олдрич1.0049610% формалин, нейтральный буферный
Чашка ПетриGreiner Bio-One632181
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Gibco14190-094Без MgCl2/CaCl2
Полипропиленовая трубка (15 мл)Greiner Bio-One188261
Полипропиленовая трубка (5 мл)Карл РотЭКИ9.1Чёрный
Полипропиленовая трубка (50 мл)Greiner Bio-One227261
Готовящая чашка для канюляции мышиного сердцаHugo Sachs Elektronik73-4327Канюля в комплекте
Очищенное антитело к мышиному CD31Бектон Дикинсон53369Клон: MEC13.3
Роликовый насосИсматекИСМ597-230
Герметизирующая пленкаБемисПМ-996Парафильм
СтереомикроскопЛейкаС6Д
Вращатель трубокГейдольфПолимакс 1040
Лазер белого светаНКТ фотоникаЭкстремальный SuperK200 мВт, 480– 2400 нм
Штамм мыши WTЛаборатория Жанвье-C57BL/6JRj
Ксилазин (2%)Ceva Tiergesundheit6324464.00.00

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
  2. Frangogiannis, N. G. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Curr Opin Cardiol. 30 (3), 240-245 (2015).
  3. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The biological basis for cardiac repair after myocardial infarction: from inflammation to fibrosis. Circ Res. 119 (1), 91-112 (2016).
  4. Koch, A., et al. Capillary endothelia and cardiomyocytes differ in vulnerability to ischemia/reperfusion during clinical heart transplantation. Eur J Cardiothorac Surg. 20 (5), 996-1001 (2001).
  5. Singhal, A. K., Symons, J. D., Boudina, S., Jaishy, B., Shiu, Y. T. Role of endothelial cells in myocardial ischemia-reperfusion injury. Vasc Dis Prev. 7, 1-14 (2010).
  6. Robbers, L. F., et al. Magnetic resonance imaging-defined areas of microvascular obstruction after acute myocardial infarction represent microvascular destruction and haemorrhage. Eur Heart J. 34 (30), 2346-2353 (2013).
  7. DeLisser, H. M., Newman, P. J., Albelda, S. M. Molecular and functional aspects of PECAM-1/CD31. Immunol Today. 15 (10), 490-495 (1994).
  8. Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10 (1), 2312(2019).
  9. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  10. Zhong, X., et al. Tubular epithelial cells-derived small extracellular vesicle-VEGF-A promotes peritubular capillary repair in ischemic kidney injury. NPJ Regen Med. 7 (1), 73(2022).
  11. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17 (4), 268-272 (2012).
  12. Arai, A. E. Magnetic resonance imaging for area at risk, myocardial infarction, and myocardial salvage. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16 (3-4), 313-320 (2011).
  13. Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Res Cardiol. 113 (5), 39(2018).
  14. Rassaf, T., et al. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circ Res. 114 (10), 1601-1610 (2014).
  15. Haj-Yehia, E., et al. CD47 blockade enhances phagocytosis of cardiac cell debris by neutrophils. IJC Heart Vasculature. 48, 101269(2023).
  16. Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., French, B. A., Rassaf, T. A practical approach to remote ischemic preconditioning and ischemic preconditioning against myocardial ischemia/reperfusion injury. J Biol Methods. 3 (4), e57(2016).
  17. Michel, L., et al. Real-time pressure-volume analysis of acute myocardial infarction in mice. J Vis Exp. (137), e57621(2018).
  18. Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2435-H2443 (2008).
  19. Clasen, L., et al. Cardiac ischemia and reperfusion in mice: a comprehensive hemodynamic, electrocardiographic and electrophysiological characterization. Sci Rep. 13 (1), 5693(2023).
  20. Lang, C. I., et al. Expedient assessment of post-infarct remodeling by native cardiac magnetic resonance imaging in mice. Sci Rep. 11 (1), 11625(2021).
  21. Coolen, B. F., et al. Three-dimensional T1 mapping of the mouse heart using variable flip angle steady-state MR imaging. NMR Biomed. 24 (2), 154-162 (2011).
  22. Zhong, X., et al. Comprehensive cardiovascular magnetic resonance of myocardial mechanics in mice using three-dimensional cine DENSE. J Cardiovasc Magn Reson. 13 (1), 83(2011).
  23. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  25. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nat Commun. 10 (1), 1944(2019).
  26. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative visualization of leukocyte infiltrate in a murine model of fulminant myocarditis by light sheet microscopy. J Vis Exp. (123), e55450(2017).
  27. Taki, J., et al. 14C-Methionine uptake as a potential marker of inflammatory processes after myocardial ischemia and reperfusion. J Nucl Med. 54 (3), 431-436 (2013).
  28. Michel, L., et al. PD1 deficiency modifies cardiac immunity during baseline conditions and in reperfused acute myocardial infarction. Int J Mol Sci. 23 (14), 7533(2022).
  29. Park, K. C., Gaze, D. C., Collinson, P. O., Marber, M. S. Cardiac troponins: from myocardial infarction to chronic disease. Cardiovasc Res. 113 (14), 1708-1718 (2017).
  30. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Curr Protoc Neurosci. 81 (2), 28.21-28.28 (2017).
  31. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using light sheet microscopy. J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).
  32. Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nat Protoc. 16 (6), 2732-2748 (2021).
  33. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  34. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  35. Merz, S. F., et al. High-resolution three-dimensional imaging for precise staging in melanoma. Eur J Cancer. 159, 182-193 (2021).
  36. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Front Immunol. 11, 599495(2020).
  37. Pichardo, A. H., et al. Optical tissue clearing to study the intra-pulmonary biodistribution of intravenously delivered mesenchymal stromal cells and their interactions with host lung cells. Int J Mol Sci. 23 (22), 14171(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D3D

Похожие статьи