Методическая статья

Оптимизированная мышиная модель для индуцирования колита-ассоциированного рака толстой кишки с использованием азоксиметана и декстрана сульфата натрия для иммунологических и терапевтических исследований опухолей

DOI:

10.3791/68351

⸱

25 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Immunology, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, 4University of Florida Health Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Колит-ассоциированный рак толстой кишки, вызванный азоксиметаном (AOM)/декстрансульфатом натрия (DSS), является признанным и экономически эффективным подходом к моделированию аутохтонных опухолей толстой кишки у мышей. Мы представляем обновленный протокол и обсуждаем важнейшие соображения по оптимизации дозы DSS для конкретного пола и вклад микробиома в строгость, надежность и воспроизводимость.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Азоксиметан (AOM, агент, повреждающий ДНК) и декстран сульфат натрия (DSS, агент, способствующий колиту) могут вызывать опухоли в толстой кишке мышей с высокой пенетрантностью. Модель рака толстой кишки, ассоциированного с колитом у мышей, индуцированной ОСО/ДСС, является золотым стандартом в исследовании рака толстой кишки, связанного с воспалением, учитывая ее точность в повторении клинических характеристик ККА у человека. К преимуществам модели можно отнести ее происхождение и развитие из эндогенной ткани, иммунную компетентность, сохраняющую полный репертуар опухолево-иммунных взаимодействий, адаптивность к многочисленным штаммам мышей, удобство 3-месячной латентности и относительно низкую стоимость. Несмотря на эти преимущества, эффективность протокола ограничена несколькими проблемами. Вариабельность дозы DSS и пенетрантности опухоли в разных исследованиях приводит к противоречивым наблюдениям. Кроме того, вариации микробиоты кишечника способствуют повышению экспериментальной изменчивости, что негативно сказывается на статистической мощности. Половые различия в ответе на ОСО/ДСС еще больше усложняют интерпретацию результатов. Кроме того, вариабельность DSS от партии к партии препятствует воспроизводимости результатов. Решение этих проблем имеет решающее значение для повышения надежности и применимости данной модели в доклинических исследованиях. Чтобы решить эту проблему, используя мышей C57BL/6J в качестве модели, мы усовершенствовали установленный протокол со стратегиями эффективной оптимизации для повышения воспроизводимости и гармонизации между исследованиями. К ним относятся рекомендации по титрованию дозы DSS как у самцов, так и у самок мышей, реализация гомогенизации микробиоты перед каждым циклом DSS для смягчения гетерогенности кишечной флоры от клетки к клетке. Эти этапы значительно снизили вариабельность и улучшили воспроизводимость, что привело к надежной индукции CAC. Признавая ключевую роль воспаления и клеточных иммунных механизмов в развитии ККА, протокол также описывает процедуры обработки тканей, подходящие для выделения РНК или белка и для профилирования воспалительных цитокинов из опухолей толстой кишки и окружающих тканей толстой кишки. В конечном счете, использование этого метода обеспечивает более строгое, надежное и воспроизводимое производство CAC.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Колоректальный рак (КРР) является третьим по распространенности онкологическим заболеванием в мире и основнойпричиной смертности, связанной с раком1,2. По сравнению со спорадическим КРР, колит-ассоциированный колоректальный рак (ККА) возникает в результате длительного, повторного поражения кишечника у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК)3,4, характеризуется более высокой злокачественной степенью и склонностью к мультифокальным проявлениям в более молодом возрасте. Из-за этих факторов ККА обычно требует более агрессивного лечения с менее благоприятными клиническими исходами5. Несмотря на то, что ККА считается отдельной единицей, по крайней мере частично, из-за уникального времени приобретения мутаций и чрезмерной роли воспалительных иммунных механизмов и микробиома, ККА и спорадический КРР имеют много общего в отношении общего геномного ландшафта и патогенетических особенностей. Для углубления нашего понимания КРР в целом и ККА в частности, а также для совершенствования терапевтических стратегий необходимы надежные доклинические модели.

Среди различных моделей, используемых для изучения CRC, модель CAC, индуцированная AOM/DSS, является наиболее широко распространенной и считается текущим золотым стандартом 6,7. Эта модель, инициированная сильным мутагенным ударом, вызванным ОСО, опирается на повторяющиеся приступы колита, вызванные DSS, которые близко имитируют ВЗК человека, такие как болезнь Крона и язвенный колит, которые являются хорошо установленными факторами риска CAC8. Модель AOM/DSS имеет несколько ключевых преимуществ по сравнению с другими подходами in vivo. В отличие от методов, основанных на введении экзогенного материала, инициирующего рак, для установления боковых или даже ортотопических опухолей, AOM/DSS-индуцированный CAC является аутохтонным, что означает, что инициация опухоли происходит эндогенно, а прогрессирование рака разворачивается в нативном тканевом микроокружении, более точно отражая его биологию и естественное происхождение. В отличие от ксенотрансплантатов клеточных линий человека или материала, полученного от пациента, который может быть выращен только на мышах с ослабленным иммунитетом, он является иммунокомпетентным, что позволяет изучать раково-иммунные взаимодействия. В отличие от генетически модифицированных моделей, производящих опухоли со специфическими генетическими драйверами, она не подвержена предопределенным мутациям, что позволяет более широко моделировать сигнальные пути рака и механизмы иммунного образования. Наконец, модель AOM/DSS может быть легко адаптирована ко многим различным линиям мышей, что устраняет необходимость в длительных схемах разведения, что делает ее эффективной как по времени, так и по затратам. Однако такие факторы, как пол животного, дозировка DSS и различия в микробиоте кишечника, могут вносить вариабельность, влияя на воспроизводимость и усложняя ее применение в трансляционных исследованиях.

Мы стремились усовершенствовать этот протокол, чтобы смягчить влияние этих факторов, лежащих в основе несоответствий в степени воспаления толстой кишки и онкогенеза ККА. Существует значительная вариабельность концентраций DSS, используемых для индуцирования острого воспаления, колита или хронического воспаления, а также CAC 9,10. DSS является полимером, и средняя молекулярная масса может варьироваться в зависимости от партии и производителя, что влияет на вариабельность результатов эксперимента. Поэтому важно тестировать каждую партию DSS, чтобы обеспечить согласованность между исследованиями. Кроме того, степень воспаления, вызванного DSS, в значительной степени зависит от микробиома кишечника, который может значительно различаться между мышиными учреждениями по всему миру и даже между различными местами содержания и колониями в одном и том же учреждении11,12. Эта изменчивость микробного состава может повлиять на результаты модели и привести к противоречивым результатам13. Совместное проживание животных из различных экспериментальных групп, когда это возможно, имеет решающее значение для снижения изменчивости, но может быть недостаточным для устранения этого искажающего фактора, поскольку микробные сообщества претерпевают стохастический дрейф с течением времени и приводят к эффектам клеткив моделях хронического воспаления. Поскольку протокол AOM/DSS предполагает долгосрочное лечение для поддержания хронического воспаления, мы реализовали гомогенизацию микробиоты путем периодического смешивания подстилки из всех клеток, в которых содержались животные, получавшие AOM/DSS. Эта практика помогает гомогенизировать среду микробиоты, что приводит к снижению экспериментальной изменчивости. Кроме того, наблюдения показывают, что эффекты DSS могут варьироваться в зависимости от пола животных15,16, что потенциально приводит к дифференциальным реакциям на воспаление и развитие рака. Мы усовершенствовали существующий протокол, титруя DSS у самок и самцов мышей отдельно, чтобы выбрать подходящую дозировку DSS для обоих полов, обеспечив более однородные результаты и предоставив критически важные входные данные для статистических расчетов мощности для определения оптимальных размеров выборки как у самцов, так и у самок мышей.

В целом, чтобы повысить воспроизводимость модели AOM/DSS, мы представляем стандартизированный набор рекомендаций по протоколам, которые учитывают и смягчают эти искажающие факторы. Мы используем методы гомогенизации микробиома, а также описываем точную корректировку дозы DSS для достижения более согласованных и воспроизводимых результатов, тем самым повышая полезность модели AOM/DSS и гармонизацию в различных исследованиях. Наш протокол выделяется тем, что демонстрирует сниженную вариабельность по сравнению с клетками, гомогенизированными микробиотой, и содержит четкие пошаговые инструкции по внедрению этих методов воспроизводимости. В результате, более низкая внутригрупповая вариабельность, вызванная этими уточнениями протокола, приводит к уменьшению размеров выборки, необходимых для достижения желаемой статистической мощности при обнаружении различий между экспериментальными группами. Этот оптимизированный протокол предназначен для исследователей, которые стремятся адаптировать модель AOM/DSS к своим собственным мышиным моделям и экспериментальным проектам, независимо от штамма или пола, для изучения механизмов онкогенеза, терапевтических мишеней или изучения динамики иммунных клеток.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с животными должны проводиться в соответствии с утвержденным учреждением протоколом для обеспечения гуманного обращения и соблюдения этических норм. Описанные здесь исследования были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Флориды.

1. Оптимизация дозирования DSS

  1. Получить мышей того возраста, штамма и источника, которые будут использоваться в основном эксперименте, с равным распределением самцов и самок. Пометьте каждую мышь ушиным проколом, меткой хвоста или другим одобренным методом для индивидуального отслеживания. Измерьте и запишите начальную массу тела каждого животного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самцы мышей должны содержаться в совместном жилье до отъема и не должны перераспределяться между клетками, чтобы свести к минимуму драки.
  2. При использовании автоматического поения, за неделю до начала эксперимента пересадите животных на бутылки с водой и одновременно закройте стерильными пробками насадки клетки (металлические трубки для поилки в клетке).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что любые изменения в подаче воды, такие как блокировка автоматических форсунок для питьевой воды, одобрены IACUC или соответствующим регулирующим органом, осуществляющим надзор за гуманным использованием животных. Клетки для животных могут требовать ежедневных проверок для обеспечения бесперебойного доступа к питьевой воде.
  3. Приготовьте раствор DSS, растворив DSS в автоклавной стерильной питьевой воде в различных концентрациях от 1,5% до 5% (по массе) с помощью магнитной мешалки и мешалки. Подождите 30 минут при комнатной температуре, чтобы порошок DSS полностью растворился в воде. Готовьте свежую воду DSS каждую неделю и храните ее при температуре 4 °C до одной недели.
  4. Наполните две конические пробирки объемом 50 мл водой DSS в каждой концентрации (одна для мужчин, одна для женщин) и надежно прикрепите стерильную насадку для питья в автоклаве для предотвращения утечки.
  5. Вводите воду DSS в каждой концентрации самкам и самцам мышей, при этом 3 мыши в каждой клетке получают такую же концентрацию. Используйте стерильную питьевую воду без DSS в качестве отрицательного контроля. Заменяйте воду DSS через день.
  6. Вводите воду DSS в течение 7 дней. Ежедневно записывайте вес тела каждой мыши.
  7. На 8-й день переключите всех животных обратно на обычную питьевую воду.
  8. На 8-й день оцените тяжесть диареи на основе консистенции стула с использованием стандартизированной системы подсчета баллов, как описано17 , и рекордных баллов. Оцените «1» как мягкую, но все еще сформировавшуюся гранулу стула, «2» как очень мягкую гранулу стула и «3» как диарею.
  9. На 8-й день соберите 2-3 свежие гранулы кала и оцените наличие скрытой крови (см. Таблицу материалов). Зафиксируйте наличие или отсутствие крови в образце.
  10. Оценивайте кишечное кровотечение на основе комбинации двух критериев оценки: консистенция стула (0-3) и наличие крови в стуле (0-3), для общей оценки от 0 до 6.
  11. С 9-го по 12-й день ежедневно записывайте массу тела каждой мыши и внимательно следите за животными, получавшими DSS, на предмет значительной потери массы тела и сильной диареи. Незамедлительно усыпляйте животных, достигших гуманных конечных точек или превышающих их, путем удушения углекислым газом (CO2) или другим подходящим методом в соответствии с утвержденным протоколом использования животных и установленными этическими принципами.
  12. С 13-го по 18-й день продолжайте наблюдение за животными и ежедневно записывайте массу тела каждой мыши, пока она полностью не восстановится до уровня, существовавшего до эксперимента.
  13. Определите оптимальную концентрацию DSS, которая приводит к потере массы тела примерно на 20% и сопровождается мягким, но все еще сформированным стулом. Оптимальная доза DSS может варьироваться в зависимости от самцов и самок, линий мышей, возраста, партий DSS и помещений для животных.

2. Индукция CAC

  1. День 0-6: Лечение ОСО День 7-28: 1-й цикл лечения DSS
    1. Подготовка массы AOM: Растворите порошок AOM в стерильном физиологическом растворе до достижения концентрации в массовом растворе 10 мг/мл. Отфильтруйте раствор через фильтр 0,45 мкм, распределите 1 мл аликвот по микроцентрифужным пробиркам объемом 1,5 мл и храните при температуре -80 °C до одного года.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ОСО является летучим канцерогеном и должен применяться с осторожностью под капюшоном биобезопасности с соответствующими средствами индивидуальной защиты (СИЗ), следуя рекомендациям производителя по технике безопасности. ОСО и любые материалы, загрязненные ООМ, должны быть утилизированы в соответствии с протоколами учреждения по утилизации опасных химических отходов. В обязанности следователя входит заблаговременное получение необходимых разрешений на охрану окружающей среды, здоровья и безопасности.
    2. При использовании автоматического поения в клетках за 1 неделю до начала эксперимента заблокируйте автоматическую насадку для питьевой воды и переключите животных на бутылки с водой для акклиматизации, как описано на шаге 1.2.
    3. В день 0 взвесьте и запишите массу тела каждой мыши, чтобы рассчитать общее необходимое количество ОСМ. Затем рассчитайте общий объем ОСО (конечная рабочая концентрация 1 мг/мл) на основе веса каждого животного для достижения дозы 10 мг/кг, например, 200 мкл для мыши массой 20 г.
    4. Размораживайте необходимое количество новых аликвот 10 мг/мл AOM на льду перед каждым использованием. Разбавьте каждый 1 мл аликвоты AOM с 9 мл стерильного физиологического раствора до достижения рабочей концентрации 1 мг/мл.
    5. Вводите мышам ОСО через внутрибрюшинную инъекцию. Выполняйте эту процедуру в шкафу биобезопасности, надев соответствующие СИЗ, такие как двойные перчатки и маска N95 для оптимальной защиты.
      ВНИМАНИЕ: Выбросьте любой оставшийся раствор AOM в соответствии с требованиями утилизации опасных химических отходов.
    6. На 3-й день пересадите животных, получавших ОСМ, в чистые клетки. Надевайте соответствующие СИЗ при работе с клетками, загрязненными AOM, и другими материалами для защиты.
      ВНИМАНИЕ: Утилизируйте загрязненную подстилку в клетке и остатки пищи в соответствии с утвержденными в учреждении процедурами утилизации опасных химических отходов.
      ОСО и его метаболиты полностью выводятся через 72 ч после введения18, после чего загрязненная подстилка клетки может быть утилизирована.
    7. На 7-й день проведите гомогенизацию кишечной микробиоты, чтобы свести к минимуму вариабельность от клетки к клетке. Для этого возьмите 25% подстилки из каждой клетки, тщательно перемешайте и перераспределите ее обратно в каждую клетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Воздержитесь от смены клеток в течение недели лечения DSS и в течение пяти дней после этого. При необходимости согласуйте свои действия со службой смены клеток в помещении.
    8. Инициируйте индукцию колита путем введения DSS в питьевую воду с помощью конических трубок объемом 50 мл, оснащенных подходящими форсунками. Ежедневно проверяйте мышей, чтобы убедиться, что животные имеют неограниченный доступ к воде DSS. Заменяйте воду DSS через день. Ежедневно записывайте вес тела каждой мыши.
    9. На 14-й день замените воду DSS обычной питьевой водой. Продолжайте внимательно следить за животными на предмет боли и стресса.
    10. В 14-19 дни взвешивайте каждую мышь ежедневно. Усыпляйте животных, которые теряют более 25% массы тела или если животное достигает любой из гуманных конечных точек, описанных в утвержденном протоколе ухода за животными и их использования. Кроме того, отслеживайте и записывайте любые случаи ректального кровотечения.
  2. День 7-28: 1-й цикл лечения DSS
    1. На 7-й день проведите гомогенизацию кишечной микробиоты, чтобы свести к минимуму вариабельность от клетки к клетке. Для этого возьмите 25% подстилки из каждой клетки, тщательно перемешайте и перераспределите ее обратно в каждую клетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Воздержитесь от смены клеток в течение недели лечения DSS и в течение пяти дней после этого. При необходимости согласуйте свои действия со службой смены клеток в помещении.
    2. Инициируйте индукцию колита путем введения DSS в питьевую воду с помощью конических трубок объемом 50 мл, оснащенных подходящими форсунками. Ежедневно проверяйте мышей, чтобы убедиться, что животные имеют неограниченный доступ к воде DSS. Заменяйте воду DSS через день. Ежедневно записывайте вес тела каждой мыши.
    3. На 14-й день замените воду DSS обычной питьевой водой. Продолжайте внимательно следить за животными на предмет боли и стресса.
    4. В 14-19 дни взвешивайте каждую мышь ежедневно. Усыпляйте животных, которые теряют более 25% массы тела или если животное достигает любой из гуманных конечных точек, описанных в утвержденном протоколе ухода за животными и их использования. Кроме того, отслеживайте и записывайте любые случаи ректального кровотечения.
  3. День 29-49: 2-й цикл лечения DSS
    1. Повторите гомогенизацию микробиоты одновременно с введением DSS, следуя тем же процедурам, что и в шагах 2.2.1-2.2.4. Необязательно: После второго и/или третьего цикла DSS выполните колоноскопию, как описано ранее19.
  4. День 50-70:3-й цикл лечения DSS
    1. Повторите гомогенизацию микробиоты одновременно с введением DSS, следуя тем же процедурам, что и в шагах 2.2.1-2.2.4. Поскольку мыши, как правило, теряют больше всего веса через три дня после третьего цикла DSS, внимательно следите за всеми животными на предмет чрезмерной потери массы тела или любых признаков ректального кровотечения в этот период и предоставляйте влажный корм для поддерживающей терапии, если это показано.

3. Оценка тяжести колита и общей патологии ККА

  1. На 70-й день соберите 2-3 свежие фекальные гранулы от каждой мыши, чтобы проверить наличие скрытых маркеров крови и/или воспаления, таких как липокалин-220 , для оценки тяжести колита. Используйте соответствующие реагенты/наборы (см. список материалов и оборудования) и следуйте инструкциям производителя по проведению анализов, кратко изложенным ниже.
  2. Для подготовки образцов кала для оценки уровня маркера воспаления липокалина-2 поместите свежие гранулы кала в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Растворите гранулы в 1 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) с помощью вихревого смесителя до получения однородного раствора. Центрифугируйте раствор при 10 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Надосадочную жидкость можно использовать сразу для ИФА липокалина-2 или хранить при температуре -80 °C для последующего использования.
  3. Выполните иммуноферментный анализ Lipocalin-2 для мыши в соответствии с инструкциями производителя набора. Проведите пилотные эксперименты по серийному разведению для определения оптимального разведения образцов кала относительно норм.
    Примечание: Ожидается, что уровни липокалина-2 увеличатся, по крайней мере, в 1000 раз у мышей, получавших DSS, по сравнению с контрольными животными, обработанными водой.
  4. Оцените тяжесть колита с помощью системы оценки диареи17 , как описано в шагах 1.8-1.10.
  5. На 70-й день усыпляйте животных путем удушенияСО2 или любым другим одобренным гуманным методом.
  6. Распылите на область живота каждого животного 70% этанола, чтобы свести к минимуму загрязнение во время последующих этапов.
  7. Используйте тонкие хирургические щипцы для подтяжки кожи и брюшинного слоя. Сделайте горизонтальный разрез ножницами, чтобы обнажить брюшную полость.
  8. Вытяните тонкую кишку наружу и определите слепую кишку. Аккуратно приподнимите слепую кишку и толстую кишку с помощью щипцов. Осторожно рассеките толстую кишку, разрезав брыжейку и связанную с ней сосудистую сеть с помощью ножниц, избегая прокола или разреза толстой кишки.
  9. Разрежьте тазовую кость и кожу вокруг ректально-анальной области, чтобы обнажить весь дистальный отдел толстой кишки. Важно рассечь всю толстую кишку с неповрежденной дистальной частью, так как большинство опухолей обычно возникают в этой области.
  10. Поместите рассеченную толстую кишку на чистую полоску фильтровальной бумаги, аккуратно расправив ее.
  11. Измерьте длину двоеточия с помощью линейки и задокументируйте ее фотографией. Включите линейку в фотографию для масштаба.
  12. Очистите пейеровы пятна на внешней стороне толстой кишки, стараясь не проколоть ткань.
  13. Промойте толстую кишку в холодной стерильной PBS.
  14. Закрепите наконечник микропипетки объемом 200 мкл (без фильтра) на шприце объемом 3 мл с помощью парафиновой пленки. С помощью этой установки наполните шприц стерильным PBS, вставьте наконечник пипетки в просвет толстой кишки и аккуратно промойте содержимое толстой кишки 2-3 раза, обеспечивая полное удаление гранул стула.
  15. Аккуратно растяните двоеточие на чистой, предварительно смоченной полоске фильтровальной бумаги. Разрежьте двоеточие в продольном направлении и положите его на фильтровальную бумагу.
  16. Определите более крупные опухоли, которые обычно проявляются в виде выступающих пузырьков, выступающих из стенки толстой кишки с воспаленным, красным видом.
  17. Для небольших опухолей соблюдайте дополнительную осторожность при идентификации. Используйте стерильную петлю для бактериального посева, чтобы аккуратно прощупать поверхность толстой кишки на предмет любых неровностей или неровностей. Убедитесь, что любые обнаруженные бугорки не являются остатками лимфатических узлов или кровеносных сосудов, расположенных на внешней стороне стенки толстой кишки.
  18. Используйте цифровые штангенциркули, чтобы измерить ширину и длину каждой опухоли.
  19. Запишите количество опухолей, а также размер и расположение каждой опухоли на предварительно напечатанной карте толстой кишки.

4. Гистологическое обследование

  1. Используйте две пары щипцов с тонкими наконечниками, чтобы захватить оба боковых конца дистального отдела ободочной кишки. Сверните ободочную кишку от дистального конца к проксимальному концу в форму швейцарского рулета, как описано в другом месте21. Убедитесь, что дистальный конец находится в центре рулона, а проксимальный конец образует самый внешний слой.
  2. Закрепите каждую свернутую по швейцарской крае толстую кишку с помощью иглы 271/2-G.
  3. Поместите каждую защищённую толстую кишку в кассету с соответствующей маркировкой.
  4. Погрузите тканевые кассеты, содержащие свернутые по швейцарской системе толстые кишки, в 4% параформальдегид (PFA) в стерильный PBS. Дайте тканям оставаться в фиксаторе в течение 24 часов.
  5. Через 24 ч переведите салфетки на 70% этанол. Ткани можно хранить в 70% этаноле при температуре 4 °C до трех месяцев.
  6. Швейцарский рулон может быть использован для нескольких гистопатологических исследований, включая обычное окрашивание гематоксилином и эозином (H&E), иммуногистохимию и иммунофлуоресценцию.

5. Забор тканей для выделения белка и РНК из опухолей и окружающей толстой кишки

  1. Работайте на льду и используйте предварительно охлажденные пробирки и реагенты для сохранения целостности биологического материала.
  2. После оценки опухоли препарируйте опухоли и соберите их в предварительно охлажденные, предварительно помеченные пробирки с соответствующим буфером (см. ниже) на льду. В зависимости от плана эксперимента объединяйте все опухоли от одного и того же животного или обрабатывайте их по отдельности. При желании аналогичным образом соберите ~1 см кусочков окружающей неопухолевой ткани толстой кишки.
  3. Выделение белка
    1. Добавьте 0,5 мл 800 мкм шлифовальных стеклянных шариков и 400 мкл буфера для лизиса (1% NP-40 в 150 мМ NaCl с 20 мМ Tris-HCl (pH 7,5) и 1% коктейлем протеазы и ингибитора фосфатазы в каждую пробирку для гомогенизации тканей и перенесите ткань толстой кишки/опухоли в каждую пробирку.
    2. Гомогенизируйте ткань толстой кишки/опухоли с помощью гомогенизатора на основе гранул при скорости 6 М/с в течение 30 с, повторите два раза для полной гомогенизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Помещайте пробирки на лед между циклами, чтобы предотвратить перегрев образца из-за механической гомогенизации.
    3. После гомогенизации аспирируйте 150 мкл лизата (надосадочной жидкости) и переложите в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    4. Уменьшите лизат при 10 000 г при 4 °C, чтобы гранулировать любой нерастворимый материал. При желании переложите надосадочную жидкость в чистую пробирку.
    5. Количественно оценивайте общую концентрацию белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (ВСЦ) или другим подходящим методом.
    6. При желании отрегулируйте концентрацию общего белка до 4 мг/мл для каждого образца с помощью одного и того же буфера для лизиса.
    7. Используйте лизаты белка немедленно для последующих анализов, таких как иммуноблоттинг или анализ цитокинов, или храните при температуре −80 °C для последующего использования.
  4. Очистка РНК:
    1. После вскрытия поместите толстую кишку/опухоли в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и погрузите в 200 мкл соответствующего реагента для сохранения РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точка паузы: свежая ткань толстой кишки/опухоли может быть мгновенно заморожена в жидком азоте и храниться при температуре −80°C для последующей обработки
    2. Разморозьте ткань толстой кишки/опухоли на льду.
    3. Перенесите толстую кишку/опухоль в гомогенизационную пробирку для ткани, содержащую 500 мкл соответствующего буфера для лизиса, подходящего для выделения РНК, и 200 мкл измельчающих стеклянных шариков.
    4. Гомогенизируйте с помощью гомогенизатора тканей на основе гранул со скоростью 6 М/с в течение 30 с три раза, с двухминутным перерывом между каждым циклом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переносите пробирку на лед между циклами, чтобы предотвратить деградацию РНК от перегрева во время механической гомогенизации.
    5. Перенесите 300 мкл лизата в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    6. При необходимости выделите общую РНК с помощью соответствующей процедуры очистки РНК. Измеряйте концентрацию, чистоту и качество/целостность РНК в соответствии с требованиями для последующего использования.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы провели оптимизацию дозы DSS для наших экспериментальных условий. Дозировка DSS должна быть повторно откалибрована для каждого животного помещения, линии мыши, дизайна исследования и партии DSS. Для этого исследования мыши C57BL/6J были помещены в специальный виварий, свободный от патогенов, в вентилируемых клетках со стандартной облученной диетой грызунов с 18% облученным белком. Как самцы, так и самки мышей начинают терять вес, начиная с 5-го дня после помещения в воду DSS, достигая своего самого низкого веса через три дня после отмены DSS (Рисунок 1A, C). В день наибольшей потери веса самцы мышей потеряли около 15% веса, в то время как самки мышей потеряли около 20% (рис. 1B, D). На основании этих результатов мы определили, что оптимальная доза для наших конкретных экспериментальных условий составила 3,0% для самок и 3,25% для самцов. График лечения ОСО/СПС представлен на рисунке 2A, при этом гомогенизация микробиома происходит в начале каждого цикла обработки ДСС до завершения эксперимента для смягчения эффектов и вариабельности клетки. Типичная динамика потери массы и восстановления животных на протяжении всего эксперимента представлена на рисунке 2В. Животные полностью восстанавливаются до исходной массы тела в течение двух недель после прекращения применения DSS. Хорошо откалиброванная модель колита DSS приводит к появлению мягких, но все еще сформированных гранул стула вместо диареи (оценка консистенции стула 1-2), с редким обнаружением скрытой крови в кале, указывающей на субклиническое кровотечение, и несколькими случаями видимой крови в стуле (оценка наличия крови 1-2)17. Для дальнейшей оценки тяжести колита были собраны образцы кала для анализа уровня маркера воспаления липокалина-2. Присутствие скрытой крови не было обнаружено у мышей, регулярно получавших питьевую воду на протяжении всего эксперимента, в отличие от животных, получавших DSS (рис. 2C). Соответственно, уровни липокалина-2 были повышены примерно в 1000 раз у мышей, получавших ОСО/ДСС, по сравнению с контрольной группой, получавшей ОСО/только воду (рисунок 2D).

В конечной точке мы препарировали толстые кишки и подсчитали опухоли с помощью карты записей опухолей (рис. 3A). DSS-колит приводит к значительно меньшей длине толстой кишки, в отличие от ОСО/контроля только воды (Рисунок 3B). Кроме того, у животных, получавших ОСО/ДСС, развиваются видимые опухоли толстой кишки, большинство из которых образуются в дистальном отделе (Рисунок 3C). Гистологическое исследование окрашенных H&E срезов толстой кишки выявило значительную эрозию эпителиальных клеток, иммунную инфильтрацию и изъязвление у мышей с AOM/DSS (рис. 4A). Тяжесть гистопатологии толстой кишки может быть количественно определена с помощью установленных систем оценки DSS-индуцированного мышиного CAC на основе четырех параметров (рис. 4B): иммунная инфильтрация и отек (0-3), изъязвления (0-3), морфология эпителия толстой кишки (0-4) и новообразования (0-4)22,23,24. Результаты таких оценок применительно к примерам гистологии на рисунке 4А представлены на рисунке 4С. Пролиферацию эпителия толстой кишки оценивали с помощью иммуногистохимического анализа с использованием окрашивания Ki67, что свидетельствует о том, что лечение DSS способствует пролиферации эпителиальных клеток толстой кишки. Кроме того, срезы толстой кишки могут быть использованы для иммунофлуоресцентного окрашивания различных маркеров, таких как маркер ангиогенеза CD31 (рис. 4D, E).

Кроме того, мы оценили влияние гомогенизации микробиоты на экспериментальные конечные точки, такие как величина воспаления толстой кишки, потеря массы тела и кумулятивная опухолевая нагрузка у каждого животного. Одна группа мышей содержалась в клетках, которые подвергались смешиванию и перераспределению загрязненной подстилки на 0-й день для достижения гомогенизации микробиоты, вместе с контрольными животными в клетках, в которых эта манипуляция была исключена. Животные в обеих группах получали 2,5% воды DSS в течение 7 дней. В то время как средние уровни маркера воспаления липокалина-2 в кале на клетку на 8-й день существенно не различались между группами (t-критерий Уэлча), мы наблюдали значительно меньшую вариабельность между точками данных в клетках, подвергшихся гомогенизации микробиоты (рис. 5A, F-критерий Уэлча для сравнения дисперсий, p<0,0001). Последовательно, к 8-му дню все животные демонстрировали одинаковую степень потери массы тела по сравнению с исходным уровнем дня 0. Однако мыши в группе гомогенизации микробиоты показали меньшую вариабельность потери массы тела по сравнению с контрольной группой (рис. 5B). Кроме того, в 10-недельном протоколе индукции CAC (рис. 2A) с (гомогенизацией микробиоты) и без (контрольной) подстилкой клетки перед каждым циклом DSS кумулятивная опухолевая нагрузка на мышь была более стабильной в гомогенизированной группе микробиоты по сравнению с контрольной группой, которая была значительно более вариабельной (рис. 5C). В целом, эти данные являются убедительными доказательствами того, что гомогенизация микробиоты значительно повышает надежность и воспроизводимость модели AOM/DSS.

figure-results-1
Рисунок 1. Титрование дозы DSS у самцов и самок мышей. (A-D) Процентное изменение массы тела по сравнению с 0-м днем у 14-недельных самцов (A, B) и самок (C, D) C57BL/6J диких мышей, содержащихся в воде с указанными концентрациями DSS (1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3% для самцов и 2%, 3%, 4% для самок). (А, В) Животным вводили DSS в течение 7 дней и контролировали потерю массы тела до 12 дней. B и D показывают потерю массы тела самцов мышей на 8-й день (B) и самок мышей на 9-й день (D) от начала лечения DSS. Данные представлены в виде средних значений ± SEM; n=3 в A & B, n=4 в C & D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2. Временная шкала и мониторинг CAC, индуцированных AOM/DSS. (A) Временная шкала эксперимента с CAC, индуцированной AOM/DSS. (B) Масса тела относительно 0-го дня у экспериментальных мышей дикого типа C57BL/6J, обработанных AOM/DSS (красный) или контрольной (только AOM, без DSS, черный). Все животные получали одну дозу ОСО (10 мг/кг) и были рандомизированы либо на три цикла 3% DSS (красный), либо на обычную питьевую воду (контроль, черный) в общей сложности на 70 дней. Данные представлены в виде средних значений ± SEM, n=2 и 11. (C) Фекальный гемокультный тест у контрольных (только ОСО) или обработанных DSS (ОСО и 1,5% DSS) самок мышей. (D) Уровни липокалина-2 в кале у 6 контрольных (только ОСО, черный) или 35 обработанных (ОСО и 1,5% DSS, красный) самок мышей на 70-й день. Данные представлены в виде средних значений ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3. Макроскопическая оценка толстой кишки. (A) Пример карты опухолевой записи. (B) Репрезентативные снимки толстой кишки от самок мышей контрольной (только ОСО) или обработанной DSS (ОСО и 1,5% DSS) самок на 70-й день. Укорочение длины толстой кишки указывает на большее воспаление у животных, получавших DSS. Пруток - 5 мм; , p=0.002, критерий ранговой суммы Манна-Уитни; n=12 и 30. (C) Репрезентативные общие патологические снимки толстой кишки с опухолями на 70-й день у самок мышей, получавших ОСО и 3% DSS (опухоли обведены и отмечены черными треугольниками). Брусок - 5 мм. Callout - увеличенный вид дистальных отделов толстой кишки с опухолями; пруток - 1 мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4. Оценка гистологии ККА. (A) Репрезентативные окрашенные H&E срезы свернутых по швейцарской системе толстой кишки от мышей, обработанных AOM/DSS и контрольных (только AOM), на 70-й день с увеличенными дистальными областями от 3 животных, показанных справа. Управляющие двоеточия показывают неповрежденную организацию крипты толстой кишки. Толстые кишки у мышей, получавших лечение AOM/DSS, характеризуются подслизистым утолщением (стреловидные наконечники), иммунной инфильтрацией (стрелками), нарушением или потерей архитектуры крипты (звезда), эрозией эпителиального слоя, эпителиальной гиперплазией или диспластическим эпителием (кругами) с образованием аденомы и аденокарциномы (обведены пунктирной линией). Bar - 500 μm. (B) Гистопатологическая система оценки, используемая для оценки тяжести фенотипа ККА. (C) Пример оценки гистологии толстой кишки у мышей, получавших только ОСО или получавших ОСО/ДСС, показан в А. (D) Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание маркера пролиферации Ki67 в свернутых по швейцарской системе толстой кишке у животных, получавших ОСО, после 1 или 3 циклов DSS. Пролиферирующие Ki67-положительные клетки (коричневого цвета) локализуются на дне крипт толстой кишки, но распространяются вверх и проникают внутрь крипт с инициацией CAC и более поздней патологией. Стержень - 100 мкм. (Е). Репрезентативное иммунофлуоресцентное окрашивание с оценкой васкуляризации на основе эндотелиального маркера CD31 (красный) и компенсированное DAPI для визуализации ядер (синий) в срезах толстой кишки у мышей, получавших AOM/DSS. Стержень - 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5. Гомогенизация микробиоты снижает вариабельность воспаления толстой кишки и опухолевую нагрузку ККА. (A) Средний уровень липокалина-2 в кале у мышей, получавших 2,5% DSS на 8-й день. Статистический анализ был проведен с использованием t-критерия Уэлча для сравнения средних уровней липокалина-2 в кале между двумя группами (p=0,137, n=6 и 12 клеток). Кроме того, был проведен F-критерий дисперсии, в результате которого было получено p-значение 0,0001, что указывает на значительные различия в дисперсии между двумя группами. (B) Средняя потеря массы тела у животных, получавших воду с ОСО/ДСС, на 8-й день. В то время как средняя потеря массы тела между двумя группами существенно не различается (t-критерий Уэлча, p=0,194, n=6 и 12), дисперсия внутри групп значительно различается (F-критерий, p=0,027). (C) Опухолевая нагрузка на одну мышь после 10 недель лечения ОСО/ДСС. Статистический анализ был проведен с использованием t-критерия Уэлча для оценки различий в средней опухолевой нагрузке между группами (p=0,211, n=8 и 18) и F-критерия для оценки разницы между дисперсиями (p=0,013). (А-С) На синих скрипичных графиках изображена группа, подвергшаяся гомогенизации микробиоты, в то время как на зеленых скрипичных графиках изображена контрольная группа (без гомогенизации микробиоты), ns - незначительная. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол AOM/DSS был впервые представлен в 1996 году Okayasu et al.25 и с тех пор был признан отличной моделью для точной имитации инициации и прогрессирования рака толстой кишки от нормальной ткани к аденоматозным изменениям и, в конечном итоге, к карциноме, как было продемонстрировано Suzuki et al. в 2006-26 гг., особенно в контексте воспаления толстой кишки. В последующих исследованиях оценивали влияние AOM и AOM/DSS на различные линии мышей, а также влияние различной продолжительности лечения на фенотип опухоли и пенетрантность 26,27,28. В 2018 году Кристофер Уильямс и его группа опубликовали обновленный протокол29, который заложил важнейшую основу для развития этой методологии. Последние достижения еще раз продемонстрировали полезность модели AOM/DSS для изучения иммунитета слизистых оболочек путем интеграции методов выделения кишечных иммунных инфильтратов и иммунофенотипирования с помощью проточной цитометрии30.

Одним из главных преимуществ протокола AOM/DSS является легкая приспособляемость практически к любой линии мышей, что побуждает к исследованию эффектов различных генетических фонов. Таким образом, Suzuki et al. сравнили восприимчивость к AOM/DSS-индуцированному канцерогенезу толстой кишки у четырех различных линий мышей, используя пенетрантность аденомы толстой кишки в качестве считывания, со следующими результатами: BALB/c > C57BL/6N > DBA/2N = C3H/HeN26. Дополнительные исследования показали, что у мышей FVB/N опухоли толстой кишки развиваются быстрее после повторного лечения ОСО по сравнению со штаммами C57BL/6J и 129/SvJ27. Примечательно, что развитие хорошо дифференцированной аденокарциномы толстой кишки с почти 100% пенетрантностью было зарегистрировано у мышей FVB/N в 10-недельном протоколе индукции AOM/DSS CAC31. Эти результаты в совокупности свидетельствуют о том, что различные линии мышей могут быть не одинаково восприимчивы к лечению AOM/DSS, что способствует вариациям в онкогенезе и еще больше подчеркивает необходимость согласованного набора рекомендаций для гармонизации и воспроизводимости протокола AOM/DSS для разных линий мышей, условий содержания и других переменных. Среди них значительная вариабельность микробиома кишечника препятствует воспроизводимости исследований, посвященных воспалению и пенетрантности опухолей 9,10. В частности, состав кишечного микробиома, включая виды Duncaniella muricolitica и Alistipes okayasuensis, может оказывать огромное влияние на тяжесть колита DSS13. В другом исследовании подчеркивается важность состава микробиоты в индукции ККА, демонстрируя, что у мышей с дефицитом NLRP3 наблюдался обостренный фенотип колита, характеризующийся повышенным присутствием бактериальных типов Bacteroidetes (в частности, Prevotellaceae) и TM710.

Несмотря на популярность метода, существующие протоколы AOM/DSS не решают существенную проблему высокой изменчивости, наблюдаемой у животных в экспериментальных группах32. Для решения этой проблемы мы предложили ряд рекомендаций по оптимизации и гармонизации протоколов путем внедрения титрования DSS (с учетом пола животных) и гомогенизации микробиоты. Наш подход направлен на снижение вариабельности и повышение воспроизводимости модели AOM/DSS для всех линий животных, экспериментальных дизайнов и конечных точек. Хотя мы не можем дать конкретных рекомендаций относительно размеров выборки, количество экспериментальных повторов будет определяться конкретным дизайном исследования и ожидаемыми размерами эффекта для каждого эксперимента. Более низкая внутригрупповая изменчивость, достигаемая этими уточнениями, требует меньшего количества животных в каждом состоянии для достижения той же статистической мощности при обнаружении этих различий. Мы ожидаем, что эти усовершенствования будут способствовать дальнейшему этичному использованию животных, ответственному управлению исследовательскими фондами и сокращению труда, что приведет к повышению эффективности.

Модель AOM/DSS имеет значительную трансляционную ценность в изучении колоректального рака человека, ассоциированного с колитом. Учитывая трудности моделирования КРР человека из-за его сложной этиологии, важно подчеркнуть, что, хотя модель AOM/DSS может дать некоторое представление о патогенезе спорадического КРР, она наиболее подходит для исследований злокачественных новообразований, связанных с воспалением. Кроме того, рак, индуцированный AOM/DSS, имеет низкую частоту метастазирования33,34 и, таким образом, не подходит для изучения метастатического распространения. Несмотря на эти ограничения, модель AOM/DSS является высокопроникающей, надежной, демонстрирует значимую для человека гистопатологию и точно имитирует прогрессирование заболевания от воспаления до дисплазии и аденокарциномы, оставаясь при этом экономически эффективной. В этом протоколе мы даем рекомендации по получению воспроизводимых результатов и минимизации искажающих факторов на основе существующих рабочих процессов 8,35.

Определение оптимальной дозировки DSS с помощью пилотных экспериментов «доза-реакция», учитывающих пол животных как биологическую переменную 16,36,37, является первым важным шагом на пути к созданию надежного протокола AOM/DSS (рис. 1). Мы обнаружили, что лечение 3% DSS в течение 7 дней приводило к более значительному снижению массы тела у женщин (~20%) по сравнению с мужчинами (~15%) (рис. 1B, D). Тем не менее, самцы мышей могут быть более, менее или одинаково чувствительны к DSS по сравнению с самками. Это может быть связано с различными линиями мышей и вариациями в составе кишечного микробиома в разных помещениях для животных, что требует повторной корректировки концентрации DSS с учетом каждого конкретного набора экспериментов. Оптимальная концентрация DSS — это компромисс между максимизацией воспаления толстой кишки и индукцией опухоли без превышения допустимой токсичности. По нашему опыту, этот баланс, скорее всего, достигается при дозах DSS, что приводит к потере массы тела примерно на 20% после первого цикла. Животные, как правило, теряют меньше веса во втором цикле лечения, но большее снижение массы тела обычно наблюдается в третьем цикле DSS, что может быть связано с образованием опухоли в толстой кишке. Таким образом, потеря массы тела на 25% может быть принята в качестве гуманной конечной точки для протоколов использования животных в учреждениях. Кроме того, хорошо откалиброванный колит DSS приводит к мягким, но все еще сформированным гранулам стула, а не к диарее и иногда положительному гемокультному тесту, но в редких случаях видимых следов крови в стуле, при этом ожидается, что животные полностью выздоровеют в течение двух недель после прекращения приема DSS.

DSS представляет собой полимер с молекулярной массой от 36 000 до 50 000 Да. Из-за вариативности производства DSS от партии к партии важно проводить эксперименты по повторной калибровке дозы DSS для каждой новой партии продукта. Для обеспечения согласованности целесообразно оценить общее количество DSS, необходимое для закупки всего исследования из одной и той же партии. Кроме того, в этом протоколе также описаны шаги по стандартизации состава микробиоты во всей экспериментальной когорте мышей во время индукции CAC, тем самым смягчая потенциальные эффекты клеток для снижения вариабельности. В качестве дополнительной меры предосторожности для минимизации эффектов в клетках рекомендуется, чтобы животные из разных экспериментальных групп по возможности содержались вместе. В зависимости от конкретных целей эксперимента и этической политики использования животных, эти соображения должны быть отражены в пилотных экспериментах. Дрейф микробиоты также может быть вызван сменой подстилки во влажной клетке с протекающими бутылками для питья. Лучше всего воздержаться от смены клетки во время доставки DSS и в течение пяти дней после нее. Использование пробирок объемом 50 мл для подачи воды DSS снижает риск утечки и сводит к минимуму отходы DSS. Эти логистические соображения могут потребовать тесного сотрудничества между научным персоналом и техниками по уходу за животными, выполняющими услуги по смене клеток и содержанию.

В этом протоколе мы также обеспечиваем базовый рабочий процесс для забора тканей и клеток, а также для сбора данных. Это включает в себя тестирование на наличие скрытой крови (рисунок 2C) и картирование опухолей (рисунок 3A). Модель AOM/DSS подходит для иммунокомпетентных мышей, что делает ее идеальной системой для исследования иммунного микроокружения опухоли из-за полностью интактной иммунной системы38,39, в отличие от подходов с ксенотрансплантатом. В частности, он поддается экспериментальному возмущению иммунной системы или стромальных компонентов, будь то с помощью генетической системы Cre-Lox для нокаутирования/выхода генов, специфичных для клеточного типа, или репортерных кассет, или приживления или истощения конкретных клеточных популяций. В качестве одного из примеров, объединив модель AOM/DSS с трансплантацией костного мозга, мы ранее исследовали, как мутации в кроветворной системе модулируют тяжесть CAC и нагрузку40. Для содействия таким исследованиям существуют превосходные опубликованные методы выделения жизнеспособных инфильтрирующих опухоль лейкоцитов, пригодных для дальнейших анализов, таких как иммунофенотипирование, функциональные анализы имультиомика одиночных клеток. Наконец, из-за высокой пенетрантности и постоянной латентности модель AOM/DSS подходит для доклинических терапевтических исследований с использованием общей опухолевой нагрузки в качестве первичного считывания.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично профинансирована наградами NIH R01 DK121831 (OAG) и R01 AI067846 (DA). OAG также была поддержана Фондом Эдварда. Эванса и Фондом семьи Окснард. DA поддерживается премией Merit Society. UFHCC является онкологическим центром, назначенным NCI (P30 CA247796).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Порошок азоксиметанаSigma-AldrichCAS 25843-45-2, Cat# A4586Канцероген для индукции опухолей толстой кишки
Настольная микроцентрифугаNA  NAДля подготовки образцов 
C57BL/6J мышиЛаборатория Джексона000664Штамм и возраст в соответствии с каждым конкретным исследованием
Конические трубки, 50 млФишер14955239Для введения воды DSS
Сульфат натрия соль Декстрана, МВт около 40 000Cayman Chemical 23250Для индуцирования инфликации толстой кишки 
Этанол, 70%Fisher 43655223Для дезинфекции рабочих поверхностей и инструментов для препарирования
Шлифовальные стеклянные шарики, 800 & микро; М VWR12621-148Для облегчения гомогенизации толстой/опухолевой ткани
HemoCue America  Beckman Coulter Hemoccult ICT Иммунохимический набор для анализа кала на скрытую кровьHemoCue America 395065AКаталожный No23280010Для обнаружения скрытой крови в кале
Инсулиновый шприц 27GX5/8 1CC BD 3294-12Для инъекций ОСО
блокатор LixitNANAДля блокировки автоматической подачи воды в клетки мышей, если она имеется (предоставлено животноводческим помещением, стерильный)
Магнитная мешалка и мешалка NANAО роспуске DSS 
Гомогенизатор шариков с микротрубками, BeadBlaster 24 BenchmarkD2400Для гомогенизации толстой кишки/опухоли
мышиный Lipocalin-2/NGAL DuoSet ELISAR& D SystemsКаталог No.DY1857Для обнаружения липокалина-2 из образцов кала
раствор NP-40, 10%Thermo Fisher Scientific85124Для лизиса опухоли/ткани толстой кишки
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher ScientificA65453Для количественного определения концентрации белка в общих тканевых лизатах или любым другим подходящим методом
Коктейль ингибиторов протеазы и фосфатов FisherPI78440Для подготовки образцов для анализа цитокинов/белков 
RLTplus bufferQiagen1053393Для выделения РНК или любого другого подходящего метода выделения РНК
RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7021Для сохранения образцов тканей перед выделением
РНК RNeasy Microprep kit QIAGEN74004Для выделения РНК или другого метода выделения и очистки РНК по мере необходимости
Насадка для бутылки с водой для грызунов (30 мм)Зрениетипа EДля введения воды или раствора DSS
Стерильные ножницы и щипцыNANA NAДля рассечения тканей
Иглы для шприца, длина 27 г x 1/2 дюйма (короткая)BD 305109Для фиксации тканей толстой кишки 
Шприцы, замок Люэра, 3 млBD 309657Для промывания толстой кишки перед рассечением и постановкой
TapeStationAgilentДля оценки концентрации РНК и качества/целостности
Teklad 2918Evigo BioproductsT.2918M.15Стандартный рацион грызунов, 18% белка, облученный
Тканевая кассетаVWR#87002-472Для консервации образца для встраивания
Лабораторные весы с верхней загрузкой, 0-220 гNANA Для взвешивания животных
Ватман Промокательная бумагаVWR InternationalCat# 28298-020Для определения стадии рассеченной толстой кишки при грубой патологии и подсчете опухолей

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgan, E., et al. Global burden of colorectal cancer in 2020 and 2040: Incidence and mortality estimates from globocan. Gut. 72 (2), 338-344 (2023).
  2. Siegel, R. L., Wagle, N. S., Cercek, A., Smith, R. A., Jemal, A. Colorectal cancer statistics 2023. CA Cancer J Clin. 73 (3), 233-254 (2023).
  3. Lu, C., et al. Survival outcomes and clinicopathological features in inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer: A systematic review and meta-analysis. Ann Surg. 276 (5), e319-e330 (2022).
  4. Porter, R. J., Arends, M. J., Churchhouse, A. M. D., Din, S. Inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer: Translational risks from mechanisms to medicines. J Crohns Colitis. 15 (12), 2131-2141 (2021).
  5. Pan, Q., et al. Genomic variants in the mouse model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate improperly mimic human colorectal cancer. Sci Rep. 7 (1), 25(2017).
  6. Johnson, R. L., Fleet, J. C. Animal models of colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 39-61 (2013).
  7. De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9(2011).
  8. Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S., Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (aom) and dextran sulfate sodium (dss). J Vis Exp. (67), e4100(2012).
  9. Chen, Y., Zhang, P., Chen, W., Chen, G. Ferroptosis mediated DSS-induced ulcerative colitis associated with Nrf2/Ho-1 signaling pathway. Immunol Lett. 225, 9-15 (2020).
  10. Elinav, E., et al. Nlrp6 inflammasome regulates colonic microbial ecology and risk for colitis. Cell. 145 (5), 745-757 (2011).
  11. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3), G544-G551 (1998).
  12. Bleich, A., Fox, J. G. The mammalian microbiome and its importance in laboratory animal research. ILAR J. 56 (2), 153-158 (2015).
  13. Forster, S. C., et al. Identification of gut microbial species linked with disease variability in a widely used mouse model of colitis. Nat Microbiol. 7 (4), 590-599 (2022).
  14. Mccafferty, J., et al. Stochastic changes over time and not founder effects drive cage effects in microbial community assembly in a mouse model. ISME J. 7 (11), 2116-2125 (2013).
  15. Wagnerova, A., et al. Sex differences in the effect of resveratrol on dss-induced colitis in mice. Gastroenterol Res Pract. 2017, 8051870(2017).
  16. Son, H. J., et al. Effect of estradiol in an azoxymethane/dextran sulfate sodium-treated mouse model of colorectal cancer: Implication for sex difference in colorectal cancer development. Cancer Res Treat. 51 (2), 632-648 (2019).
  17. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
  18. Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. Cancer. 40 (5 Suppl), 2436-2445 (1977).
  19. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
  20. Chassaing, B., et al. Fecal lipocalin 2, a sensitive and broadly dynamic non-invasive biomarker for intestinal inflammation. PLoS One. 7 (9), e44328(2012).
  21. Dooley, S. A., et al. Optimized protocol for intestinal swiss rolls and immunofluorescent staining of paraffin embedded tissue. J Vis Exp. (209), e66977(2024).
  22. Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab Invest. 69 (2), 238-249 (1993).
  23. Arthur, J. C., et al. Intestinal inflammation targets cancer-inducing activity of the microbiota. Science. 338 (6103), 120-123 (2012).
  24. Karrasch, T., Kim, J. S., Muhlbauer, M., Magness, S. T., Jobin, C. Gnotobiotic IL-10-/-;NF-Kappa B(egfp) mice reveal the critical role of TLR/NF-Kappa B signaling in commensal bacteria-induced colitis. J Immunol. 178 (10), 6522-6532 (2007).
  25. Okayasu, I., Ohkusa, T., Kajiura, K., Kanno, J., Sakamoto, S. Promotion of colorectal neoplasia in experimental murine ulcerative colitis. Gut. 39 (1), 87-92 (1996).
  26. Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Nakagama, H., Tanaka, T. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27 (1), 162-169 (2006).
  27. Nambiar, P. R., et al. Preliminary analysis of azoxymethane induced colon tumors in inbred mice commonly used as transgenic/knockout progenitors. Int J Oncol. 22 (1), 145-150 (2003).
  28. Arnesen, H., et al. Induction of colorectal carcinogenesis in the C57BL/6J and a/j mouse strains with a reduced dss dose in the aom/dss model. Lab Anim Res. 37 (1), 19(2021).
  29. Parang, B., Barrett, C. W., Williams, C. S. AOM/DSS model of colitis-associated cancer. Methods Mol Biol. 1422, 297-307 (2016).
  30. Eich, C., Vogt, J. F., Langst, V., Clausen, B. E., Hovelmeyer, N. Isolation and high-dimensional flow cytometric analysis of tumor-infiltrating leukocytes in a mouse model of colorectal cancer. Front Immunol. 15, 1295863(2024).
  31. Barderas, R., et al. Sporadic colon cancer murine models demonstrate the value of autoantibody detection for preclinical cancer diagnosis. Sci Rep. 3, 2938(2013).
  32. Dzhalilova, D., Zolotova, N., Fokichev, N., Makarova, O. Murine models of colorectal cancer: The azoxymethane (AOM)/dextran sulfate sodium (DSS) model of colitis-associated cancer. PeerJ. 11, e16159(2023).
  33. Rosenberg, D. W., Giardina, C., Tanaka, T. Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
  34. Pothuraju, R., et al. Colorectal cancer murine models: Initiation to metastasis. Cancer Lett. 587, 216704(2024).
  35. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2 (8), 1998-2004 (2007).
  36. Lee, S. M., et al. The effect of sex on the azoxymethane/dextran sulfate sodium-treated mice model of colon cancer. J Cancer Prev. 21 (4), 271-278 (2016).
  37. Jang, S., Han, H., Oh, Y., Kim, Y. Sex differences in inflammation correlated with estrogen and estrogen receptor-beta levels in azoxymethane/dextran sodium sulfate-induced colitis-associated colorectal cancer mice. Heliyon. 10 (6), e28121(2024).
  38. Xin, B., et al. Enhancing the therapeutic efficacy of programmed death ligand 1 antibody for metastasized liver cancer by overcoming hepatic immunotolerance in mice. Hepatology. 76 (3), 630-645 (2022).
  39. Rivera, M., et al. Patient-derived xenograft (pdx) models of colorectal carcinoma (crc) as a platform for chemosensitivity and biomarker analysis in personalized medicine. Neoplasia. 23 (1), 21-35 (2021).
  40. Feng, Y., et al. Hematopoietic-specific heterozygous loss of dnmt3a exacerbates colitis-associated colon cancer. J Exp Med. 220 (11), (2023).
  41. Mcmanus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. aJ., Pillai, A. B. Isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e. J Vis Exp. (151), e59821(2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

C57BL 6J
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи