Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ассоциированные с раком фибробласты из опухолей молочной железы мышей как инструменты для молекулярных и вычислительных исследований

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68364

⸱

3 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Human Technopole, 3Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описываются методы культивирования, манипулирования и анализа мышиных CAF, включая функциональные анализы in vitro/in vivo , транскриптомику и вычислительный анализ. Кроме того, в нем описывается веб-платформа, разработанная для анализа общедоступных транскриптомов микродиссекционных стромальных и эпителиальных компонентов лазерного захвата из коллекции опухолей рака молочной железы человека.

Аннотация

Убедительные исследования подтвердили критическую роль опухолевого микроокружения (ТМЭ) в росте и агрессивности рака молочной железы (РМЖ). Ассоциированные с раком фибробласты (CAF), преобладающий клеточный компонент ТМЭ, существенно влияют на его поведение посредством сложных перекрестных взаимодействий с раковыми и другими стромальными клетками в ответ на активирующие сигналы, полученные от опухоли. Мышиные модели широко используются для изучения механизмов, лежащих в основе роли CAF в прогрессировании РМЖ, поскольку они позволяют оценить эндогенную ТМЭ и оценить вовлечение иммунной системы с помощью сингенных исследований ксенотрансплантатов. В данной работе мы представляем набор методов культивирования CAF, полученных из РМЖ, манипулирования экспрессией генов и оценки их проопухолевых функций с использованием подходов in vitro и in vivo . Мы также описываем протоколы профилирования экспрессии гена CAF и транскриптомного анализа, а также вычислительную процедуру для вывода транскрипционных сигнатур в первичных опухолях с использованием общедоступных объемных данных РНК-секвенирования. Кроме того, мы представляем удобный веб-инструмент для анализа транскриптомов стромальных и эпителиальных компонентов из микродиссекционированных опухолей РМЖ с лазерным захватом. В конечном счете, эти методы могут дать ценную информацию о молекулярных механизмах, управляющих взаимодействием CAF-опухоли, и обладают потенциалом для выявления новых терапевтических мишеней.

Введение

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным злокачественным новообразованием, поражающим женщин, и характеризуется значительной молекулярной гетерогенностью, с четкими молекулярными профилями, определяющими диагноз, принятие решений о лечении и прогноз. Опухолевое микроокружение (ТМЭ) также очень неоднородно и играет решающую роль в прогрессировании опухоли, иммунитете и результатах лечения.

Ассоциированные с раком фибробласты (CAF) являются наиболее распространенным типом клеток в TME и ключевыми регуляторами развития опухоли. Они способствуют отложению и ремоделированию внеклеточного матрикса, ангиогенезу, уклонению от иммунитета и лекарственной устойчивости 1,2,3,4,5,6. CAF влияют на опухолевые клетки посредством прямого межклеточного контакта, высвобождения внеклеточных везикул7 и секреции различных растворимых факторов 2,5 для стимулирования роста опухоли, инвазии и резистентности к терапии 8,9,10. Действительно, сигнатуры генов, связанные со стромой, имеют прогностическую ценность для прогрессирования РМЖ и ответа на терапию и связаны с резистентностью к химиотерапии 11,12,13,14. Однако, несмотря на существенные доказательства того, что CAF являются привлекательной терапевтической мишенью, клинические испытания, нацеленные на эти клетки, в основном не увенчались успехом. Одной из основных проблем является ограниченное понимание молекулярных механизмов, с помощью которых CAF модулируют поведение опухоли. Последние достижения в области анализа одиночных клеток и пространственной транскриптомии позволили глубже понять сложность CAF в BC 16,17,18,19,20,21, что позволило идентифицировать различные подтипы CAF со специфическими функциональными программами 16,22 и еще больше подчеркнуть их сложность и пластичность23.

Генетически модифицированные модели мышей (GEMM), в которых онкогены или гены-супрессоры опухолей чрезмерно экспрессируются или инактивируются, являются хорошо зарекомендовавшими себя моделями для изучения рака человека 24,25,26,27. По сравнению с сингенными моделями, которые включают пересадку опухолевых клеток мышамдикого типа 23,28, GEMM более точно имитируют многоступенчатую прогрессию РМЖ и взаимодействие между раковыми клетками и TME. Однако манипулирование активностью CAF в GEMM было сложной задачей из-за их гетерогенности, что затрудняет нацеливание на все подтипы CAF без побочных эффектов на другие стромальные или эпителиальные компоненты5. Сочетание GEMM с комплементарными подходами, такими как манипуляции с CAF in vitro, может помочь в создании клеточных моделей для экспериментов по потере функции как in vitro, так и in vivo. Тем не менее, разработка стабильных клеточных моделей для изучения функциональных ролей конкретных генов остается сложной задачей из-за быстрого наступления старения.

Здесь мы описываем надежную платформу для стабильных экспериментов по потере функции в CAF с последующим функциональным анализом in vitro и in vivo и транскрипционным профилированием сконструированных клеток; Этот подход предлагает комплексную стратегию анализа функциональной значимости генов, экспрессируемых CAF, при раке молочной железы, с преимуществами в специфичности, воспроизводимости и адаптивности по сравнению с существующими методами. Этот подход также дополняется новым веб-инструментом для изучения транскриптомов микродиссекционных стромальных и эпителиальных компартментов из опухолей молочной железы человека с помощью лазерного захвата, что позволяет проводить межвидовые сравнения и облегчает генерацию гипотез на основе данных о людях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование соответствует всем институциональным рекомендациям по обращению с мышами и забору образцов тканей. Все процедуры были выполнены в соответствии с национальными и международными законами и политиками. Мышей содержали в трансгенном блоке без специфических патогенов в течение 12-часового цикла свет/темнота при температуре 22 °C при влажности 50% и обеспечивали пищей и водой в неограниченном количестве. Хирургические процедуры должны проводиться в соответствии с ветеринарными инструкциями учреждения, чтобы обеспечить надлежащую анестезию и обезболивание, как во время процедуры, так и в послеоперационный период. Таблица материалов содержит подробную информацию о материалах, реагентах и инструментах, используемых в этом протоколе.

1. Культура клеток

  1. Культивирование клеток при 37 °C в атмосфере с 5%CO2 и относительной влажностью 95%, в DMEM (HEK293T, CAFs и иммортализированные CAFs (iCAF)) или среде RPMI (4T1), с добавлением 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (1% Pen/Strepto).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав полнорационных сред (cDMEM, cRPMI): 10% термоинактивированный FBS, состав голодающих сред (sDMEM, sRPMI): без FBS. Среднее время удвоения для ячеек: HEK293T и iCAF составляет 24 ч; Ячейки 4T1 работают 12 часов.
  2. Пассажные ячейки при достижении 80% слияния, в соотношении не более 1:5, никогда не более 10 раз после оттаивания, чтобы избежать фенотипического дрейфа, как описано ниже.
    1. Отсадите среду и аккуратно добавьте 7 мл PBS на бортик 100-миллиметровой посуды. Аспирируйте PBS, добавьте 1 мл трипсина-ЭДТА. Выдерживать 2-3 минуты при температуре 37 °C.
      ВНИМАНИЕ: ЭДТА внесена в список опасных соединений категории 2 для раздражения глаз. Ручка в биологическом/вытяжном шкафу в надлежащих СИЗ.
    2. Инактивируйте трипсин-ЭДТА с помощью 5 мл цDMEM, отделите клетки пипетированием вверх и вниз и соберите в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте при 290 х г в течение 5 мин.
    3. Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 5 мл cDMEM. Для деления в соотношении 1:5 засейте 1 мл ресуспендированных клеток в 100-миллиметровую чашку, содержащую 9 мл cDMEM.
  3. Подсчет клеток: Загрузите 10 мкл клеточной суспензии из шага 1.2.3 на сторону счетной камеры Нейбауэра, подсчитайте клетки в больших квадратах и умножьте полученное число на 1 x 104 , чтобы рассчитать количество клеток, содержащихся в 1 мл клеточной суспензии.
  4. Криоконсервация: Заморозьте 50% чашки диаметром 100 мм (около 3 x 106 клеток) в 0,5 мл ледяной среды для заморозки (10% ДМСО в термоинактивированном FBS), как описано ниже.
    1. Из 100-миллиметровой чашки трипсинизируют клетки, как описано в шагах 1.2.1 и 1.2.2, за исключением того, что клетки ресуспендируют в 1 мл ледяной замораживающей среды.
    2. Дозируйте по 0,5 мл в каждый криовиал и поместите при температуре -80 °C в контейнер, обеспечивая скорость охлаждения около 1 °C/мин. Каждую аликвоту можно разморозить в 100 мм посуде.
  5. Тест на контаминацию микоплазмы: Соберите 1 мл питательной среды для конфлюентных клеток, культивируемых в течение не менее 3 дней. Варить при температуре 95 °C в течение 20 минут. Вращайте при 16200 x g в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Добавьте 5 мкл надосадочной жидкости к 45 мкл реакционной смеси ПЦР (0,15 мМ dNTPs, 1,5 мМ MgCl2, 1x реакционный буфер, 1 U Taq-полимеразы, 0,5 мкМ праймеров A и B, см. таблицу 1). Проведите ПЦР, включая положительный и отрицательный контроль, и разделите продукты ПЦР на 1% агарозном геле вместе с лестницей ДНК. В образцах, загрязненных микоплазмой, будет указан диапазон 600.о.

2. Выделение CAF из опухолей молочной железы

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап оптимизирован для опухолей на поздних стадиях диаметром 5-10 мм (см. ссылку29 ).

  1. Принесите мышь в жертву при вывихе шейки матки. Изолируйте опухоли молочной железы размером не менее 125мм3. Иссекайте опухоль аккуратно, удаляя окружающую кожу, ткани молочной железы и видимые некротические участки. С помощью пинцета соберите в микропробирку объемом 1,5 мл, помещенную на лед.
  2. Взвесьте опухоль с помощью точных весов, иссеките кубический кусок 0,1-0,3 г скальпелем, переложите в новую микротрубку объемом 1,5 мл, наполненную ледяным PBS, и держите на льду. Убедитесь, что ткань погружена в воду, чтобы избежать обезвоживания.
  3. Переложите в блюдо диаметром 60 мм на лед. Мелко измельчите в 1 мл PBS скальпелем до получения кусочков примерно 1-2 мм.
  4. Переложите в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл на 0,1 г опухоли в cDMEM плюс 10 мкг/мл коллагеназы. Промойте чашку 1 мл той же среды, используя пипетку P1000 с разрезанным кончиком, чтобы избежать повреждения клеток. Закрепите крышку уплотнительной пленкой, чтобы избежать протекания.
  5. Инкубировать в горизонтальном положении в течение 1 ч при 37 °C на орбитальном шейкере. Поместите клеточный фильтр 70 μм на коническую трубку объемом 50 мл и перенесите гомогенат с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Используйте заднюю часть поршня шприца объемом 5 мл, чтобы измельчить и протолкнуть образец через фильтр.
  6. Используйте cDMEM (не превышающий 30 мл конечного объема) для извлечения всего из ситечка. Вращайте ячейки при 129 x g при 4 °C в течение 10 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
  7. Добавьте 3 мл буфера для лизиса хлорида аммония и калия (ACK) для удаления эритроцитов (эритроцитов). Плотно закройте трубки и перемешайте путем инверсии. Инкубировать в течение 5 минут при RT на орбитальном шейкере.
  8. Остановите лизис эритроцитов, добавив PBS к конечному объему 30 мл. Вращайте ячейки при 129 x g при 4 °C в течение 10 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
  9. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл cDMEM и подсчитайте жизнеспособные клетки, как на шаге 1.3, используя 10 мкл метиленового синего: живые клетки восстанавливают краситель до бесцветного продукта и становятся неокрашенными, в то время как мертвые клетки окрашиваются в синий цвет.
  10. Высадите 5 x 105 клеток/60 мм в 5 мл cDMEM, инкубируйте 20 мин при 37 °C в атмосфере 5%CO2 , соберите неадгезивные клетки и повторно поместите их на ночь.
  11. Через 48 ч или 72 ч проводят дифференциальную трипсинизацию. Поскольку фибробласты отделяются быстрее, чем эпителиальные и миоэпителиальные клетки30, действуйте так, как описано в шаге 1.2. но внимательно следить за отслоением клеток под микроскопом. Фибробластообразные клетки становятся круглыми и отделяются, в то время как эпителиальные клетки остаются прикрепленными.
  12. Добавьте cDMEM для инактивации трипсина и соберите оторвавшиеся CAF, перенеся их в новую 60 мм чашку в 5 мл cDMEM. Проведите первичный CAF 1:3 (см. шаг 1.2) на три пасса, затем приготовьте замороженные аликвоты на раннем этапе, как описано в шаге 1.4.

3. Увековечение с помощью вирусной трансдукции

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые из следующих шагов должны быть выполнены в среде, подходящей для работы с ретровирусными векторами (например, BSL2+); Проверьте свои институциональные правила.

  1. Приготовление рекомбинантного вируса
    1. Культивируйте HEK293T клетки и проверьте наличие микоплазменных загрязнений (см. шаг 1).
    2. Нанесите мазок на чашку диаметром 100 мм, пипетируя 6 мл 0,1 мг/мл раствора поли-L-лизина в ddH2O в течение 5 минут на RT, аспирируйте и дайте высохнуть под колпаком (около 10 минут).
    3. Засемените 3 x 106 HEK293T клеток (низкий пассаж, микоплазмоотрицательный) в 10 мл цДМ в чашке, покрытой поли-L-лизином, начиная с шага 3.1.2 (см. шаг 1.3).
    4. На следующий день приготовьте две пробирки, содержащие 0,75 мл среды, оптимизированной для трансфекции без антибиотиков. К одному из них добавьте 30 мкл катионного липид-опосредованного трансфекционного реагента (Т1). Ко второму добавьте 2 г pCL-Ampho (ретровирусный упаковочный вектор) и 2 г ретровирусного вектора кДНК pBABE-neo largeT (T2). Добавьте Т2 к Т1, аккуратно перемешайте и выдерживайте 10 минут.
    5. Равномерно распределите среду по клеткам после замены ее на оптимизированную для трансфекции среду без антибиотиков + 10% инактивированный при нагревании FBS. Переместите планшет в помещение для культивирования тканей уровня биобезопасности 2+ (BSL-2+). Замените среду на cDMEM через 6-12 ч и инкубируйте клетки в течение 24-48 ч.
    6. Среду, содержащую псевдовирусные частицы, профильтровать через шприцевой фильтр 0,45 мкм и хранить при температуре 4 °C в течение нескольких дней или при температуре -80 °C при длительном хранении.
  2. Вирусная трансдукция CAF
    1. Посейте 7,5 х 105 CAF в каждую из двух 60 мм чашек по 4 мл cDMEM (см. шаг 1.3) и культивируйте их, как на шаге 1.1.
    2. На следующий день замените среду одной чашки 2 мл псевдовируссодержащей среды из шага 3.1.6 (трансдуцированные CAFs), добавьте 2 мл cDMEM и инкубируйте в течение 24 ч. Оставьте другое блюдо нетронутым (нетрансдуцированные CAF).
    3. На следующий день повторите шаг 3.2.2 на трансдуцированных CAF. Через 24 ч замените среду обеих посуды 4 мл cDMEM.
    4. Еще через 24 ч начните выбор, заменив среду обеих посуды на cDMEM с добавлением 400 мкг/мл G418. Заменяйте среду, содержащую G418, каждые 2-3 дня до тех пор, пока в контрольной чашке нетрансдуцированных CAF не останутся живые клетки.
      Примечание: Нетрансдуцированные клетки чувствительны к G418 и умирают в течение 7-10 дней, что указывает на то, что только устойчивые к G418 трансдуцированные клетки выживут в условиях трансдуцированных CAF. Оптимальную концентрацию антибиотика необходимо определить для каждого типа клеток, выполнив кривые уничтожения (протестируйте концентрацию G418 в диапазоне от 50 до 1000 мкг/мл в течение 7-10 дней и выберите дозу, убивающую все клетки в течение 10 дней).
    5. Пропустите выбранные трансдуцированные клетки 2 раза в соотношении 1:3 (см. шаг 1.2) перед выходом из установки BSL. Подготовьте криоконсервированные аликвоты ранних отрывков, как в шаге 1.4.
    6. Убедитесь, что клетки продолжают размножаться без проявления стареющего фенотипа в течение нескольких пассажей, и приступайте к фенотипической и функциональной характеристике (см. шаги 4 и 6-9).

4. Фенотипическая характеристика

ПРИМЕЧАНИЕ: Маркеры CAFs, такие как альфа-гладкомышечный актин (α-SMA), кавеолин, активирующий фибробласты белок (FAP), N-кадгерин, тромбоцитарный фактор роста бета (PDGFR-β), S100A4 и виментин29 , могут быть оценены с помощью ОТ-кПЦР и вестерн-блоттинга.

  1. ОТ-кПЦР: Извлечь общую РНК с помощью монофазного раствора фенола и гуанидина изотиоцианата, как описано в ссылке15. Выполните обратную транскрибацию 2 мкг общей РНК в объеме 20 мкл, следуя инструкциям производителя по условиям реакции. Разбавьте кДНК в соотношении 1:20 и используйте 3 мкл для проведения реакций ОТ-кПЦР, следуя инструкциям производителя (праймеры см. в Таблице 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем готовить РНК из 12-луночной чашки.
  2. Вестерн-блот
    1. Промойте 2 раза PBS, как описано в шаге 1.2.1, добавьте 0,2 мл ледяного буфера для лизиса, отделите клетки скребком и соберите их в микропробирку объемом 1,5 мл, как описано впункте 29. Оставить на 20 минут на льду.
    2. Вращайте образцы при 16 000 x g в течение 10 минут при 4 °C и соберите надосадочную жидкость. Количественное определение белков с помощью колориметрического анализа в соответствии с инструкциями производителя. Используйте не менее 20 мкг белка для вестерн-блоттинга (см. Таблицу 2 для антител).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем готовить белки не менее чем из 6 лунок в блюде.
  3. Анализ секретируемых белков
    1. Посейте 2 x 106 iCAF (см. шаг 1.3) в чашку диаметром 100 мм в 10 мл cDMEM и культивируйте их, как описано в шаге 1.1.
    2. Через 24 ч удалите среду, промойте 2 раза 10 мл PBS и инкубируйте в течение 48 ч с 10 мл sDMEM (см. шаг 1.1) для получения кондиционированной среды (CM).
    3. Еще через 48 ч отфильтруйте КМ через шприцевой фильтр 0,2 мкм в коническую трубку объемом 15 мл. Крепко держите шприц и трубку и будьте готовы к некоторому сопротивлению. CM может храниться при температуре -80 °C до 6 месяцев.
    4. Сконцентрируйте СМ примерно в 10 раз с помощью белковых концентраторов в соответствии с инструкциями производителя, чтобы получить концентрированный КМ (conCM). Количественно определите конКМ, вскипятите и выполните вестерн-блоттинг (антитела см. в таблице 2 ).

5. Анализ нокдауна гена

Примечание: Чтобы стабильно вмешиваться в экспрессию генов, мы трансдуцируем iCAF лентивирусными частицами, экспрессирующими специально разработанные шРНК. Они могут быть получены путем клонирования целевых последовательностей в подходящем лентивирусном векторе, таком как pLKO.1-Puro, в соответствии с протоколами, доступными в https://www.addgene.org/protocols/plko/#C. Конкретные целевые последовательности могут быть выбраны с помощью общедоступных инструментов проектирования shRNA (например, GPP-Genetic Perturbation Portal от Broad Institute, https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/). В качестве альтернативы коммерчески доступны наборы готовых векторов таргетинга (https://en.vectorbuilder.com/products-services/service/shrna-knockdown-solutions.html, https://www.sigmaaldrich.com/IT/it/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/mission-shrna-getting-started, https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles). Мы рекомендуем разработать 4-5 различных шРНК для каждого гена и выбрать 2 лучших для экспериментов. Генерируйте также нецелевые векторы в качестве отрицательных контролей. Некоторые из следующих шагов должны быть предприняты в среде, подходящей для работы с вирусами, производными от ВИЧ (например, BSL2+). Проверьте свои институциональные правила.

  1. Генерация лентивирусных частиц
    1. Засейте 3 х 10по 6 HEK293T ячеек, как на шагах 3.1.1-3.1.3. На следующий день готовят катион-липид-опосредованные комплексы реагент-ДНК, как описано на шаге 3.1.4, используя соответственно 9 мкг и 3 мкг упаковочных векторов pCMV-R8.74 и pCMV-VSVG, а также 7 мкг shRNA-содержащей конструкции pLKO.1 в 0,75 мл среды, оптимизированной для трансфекции, не содержащей антибиотиков, и действуют, как описано на этапах 3.1.5 и 3.1.6.
  2. Трансдукция CAFs
    1. Инфицируйте клетки, как описано в шагах 3.2.1, 3.2.2 и 3.2.4. Через 24 ч удалите инфекционную среду и начните отбор с 2 мкг/мл пуромицина в cDMEM. Для определения оптимальной концентрации см. примечание к шагу 3.2.5.
    2. Замените пуромицин/цДМЭМ через 48 ч. Выбор обычно завершается за 3 дня. Разверните и заморозьте ячейки, как показано на шаге 3.2.6. Оцените эффективность нокдауна с помощью ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга, как описано в шагах 4.1. и 4.2.

6. Супер-активация iCAFs с КМ из опухолевых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги иллюстрируют методы in vitro характеристики проопухолевой активности iCAF. Проопухолевая активность CAF может быть усилена путем их инкубации с КМ из опухолевых клеток мышиной РЧ (суперактивация, с.а.), как описано ниже.

  1. Подсчитайте 4T1 мышиных BC-клеток, как описано на шаге 1.3, и засейте 2 x 106 клеток в чашку диаметром 100 мм в 10 мл cRPMI (см. шаг 1.1).
  2. Через 24 ч удалите среду, промойте 2 раза 10 мл PBS и инкубируйте в течение 48 ч с 10 мл sRPMI (см. шаг 1.1) для получения CM.
  3. На следующий день высадите 2 x 106 iCAF на чашку диаметром 100 мм в 10 мл cDMEM (см. шаг 1.3) и культивируйте их, как описано в шаге 1.1. Отфильтруйте CM через шприцевой фильтр 0,2 мкм в коническую пробирку объемом 15 мл, как описано в шаге 4.3.3.
  4. Супер-активация (б.а.): удалите среду из формы iCAF, промойте 2 раза 10 мл PBS и добавьте отфильтрованный 4T1 CM (8-10 мл). Инкубировать в течение 48 ч для получения a.a. iCAFs.

7. Пролиферация опухолевых клеток

  1. Предварительно обрабатывают клетки 4Т1 в течение 48 ч iCAFs CM, приготовленными в соответствии с этапами 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3.
  2. Трипсинизируйте и подсчитайте их, затем засейте 4 x 103 клетки/лунку 96-луночного планшета в 100 мкл cRPMI, как описано на шаге 1.3, и культивируют, как описано на шаге 1.1. Пластина техническая тройная.
    1. Приготовьте одну 96-луночную пластину в день временного курса. Предложенное здесь количество ячеек оптимизировано для 4-дневного протокола; Уменьшите масштаб на более длительное время.
  3. Через 4 ч или сразу после прикрепления клеток удалите среду, промойте PBS, осторожно добавив 100 μл, стараясь не отделить клетки, упираясь наконечником в край лунки, многоканальной пипеткой и используя стерильный резервуар. Удалите PBS, затем аналогичным образом добавьте 100 μL sDMEM (контроль) или iCAF CM, оба с добавлением 2% инактивированного при нагревании FBS (см. шаги 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3).
  4. Через 4 часа остановите табличку дня 0, как описано в пункте 7.5. Для остальных временных точек заменяйте носитель через день до конца эксперимента.
  5. Чтобы оценить плотность клеток, извлеките 96-луночный планшет из инкубатора и промойте лунки 2 раза 100 мкл PBS, как описано в шаге 7.3.
  6. Добавьте в вытяжной шкаф по 100 мкл 4% параформальдегида (PFA) в каждую лунку и зафиксируйте ячейки на 10 минут при RT.
    ВНИМАНИЕ: PFA может вызвать серьезное повреждение глаз и раздражение кожи; Он вреден при проглатывании и вдыхании и подозревается в причинении генетических дефектов и рака. Обращайтесь в вытяжном шкафу в надлежащих средствах индивидуальной защиты (СИЗ).
  7. Промойте 3 раза 100 μL PBS, как описано в шаге 7.3, и дайте высохнуть под вытяжным шкафом (около 10 минут).
  8. Инкубировать с 50 мкл 0,1% кристаллического фиалки в 20% метаноле в течение 10 мин при РТ.
    ВНИМАНИЕ: Кристаллический фиолетовый может вызвать серьезное повреждение глаз и зарегистрирован как опасность 4 категории для пероральной острой токсичности и как опасность 2 категории как канцероген. Обращайтесь с ним в вытяжном шкафу, надев соответствующие СИЗ.
  9. Промойте 3 раза 100 μл ddH2O, опорожните лунки и постучите пластиной по впитывающей салфетке или бумажному полотенцу, чтобы полностью удалить жидкость.
  10. Растворите кристаллический фиолетовый в 100 мкл 10% уксусной кислоты в течение 15 мин при ОТ и измерьте оптическую плотность (O.D.) на длине волны 600 нм в считывателе микропланшетов, используя 100 мкл 10% уксусной кислоты в качестве заготовки. Нормализуйте O.D. для этого дня до 0 для каждого условия.

8. Миграция и инвазия

  1. Пипетка 700 мкл DMEM с добавлением 1% термоинактивированного FBS, 1% Pen/Strepto, в лунки 24-луночного планшета. Поместите в каждую лунку поровую вставку Transwell размером 8 мкм, покрытую (инвазия) или нет (миграция) биологически активной матрицей. Оставьте планшет в инкубаторе для равновесия при 37 °C во время сбора и подсчета клеток 4T1, как описано в шаге 1.3.
  2. Отделите клетки 4T1, предварительно обработанные в течение 48 ч iCAFs CM, от чашки диаметром 100 мм, как показано на этапах 4.3.1, 4.3.2 и 4.3.3, используя 1 мл 5 мМ ЭДТА вместо трипсина-ЭДТА.
  3. Добавьте 5 мл cDMEM, соберите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл и гранулируйте центрифугированием, как на шаге 1.2. Ресуспендируйте клетки в sDMEM, считайте, как на шаге 1.3, и разбавьте до 1 x 105 клеток/100 μл.
  4. Добавьте 100 мкл клеточной суспензии в верхнюю камеру трансвелла. В качестве контроля гальванического покрытия засейте 100 мкл клеток в 24-луночный планшет, в 500 мкл cDMEM. Инкубируйте в течение 16 ч (миграция) или 24 ч (инвазия) и остановите эксперимент, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации должно быть определено эмпирически при использовании различных клеток.
  5. Пометьте вкладыши с их верхней стороны тонким маркером и погрузите их в коническую пробирку объемом 50 мл, наполненную PBS, для промывки с помощью пинцета. Тщательно очистите внутреннюю часть трансвелла ватным тампоном.
  6. Под вытяжным шкафом инкубируйте образцы в 700 мкл 4% PFA в течение 10 минут в режиме лучевой терапии (см. шаг 7.6).
  7. Вымойте 3 раза с 700 мкл PBS и дайте высохнуть под капотом (около 10 минут). Инкубируйте вкладыши с 700 мкл 0,1% кристаллического фиолетового в 20% метаноле в течение 10 мин при RT (см. шаг 6.10).
  8. Промойте вкладыши 3 раза, погрузив их в коническую трубку объемом 50 мл, заполненную ddH2O с помощью пинцета. Тщательно очистите внутреннюю часть трансвелла ватным тампоном. Храните образцы в RT и делайте снимки в течение 3 дней.
  9. Используя фазово-контрастный микроскоп, сделайте один снимок с 10-кратным объективом, визуализировав большую часть поверхности скважины, затем получите снимки из 5 независимых областей с помощью 20-кратного объектива.
  10. Растворите кристаллический фиолетовый в 10% уксусной кислоте следующим образом: для лунок добавьте 100 μл уксусной кислоты и перемешайте на орбитальном вибростенде в течение 10 минут при RT; Для трансвеллов положите их, опустив поверхность вверх, на скамейку, нанесите 50 мкл уксусной кислоты на поверхность и перемешайте пипетированием до полного растворения кристаллического фиалки.
  11. Считывание абсорбции при длине волны 600 нм в 96-луночном планшете с использованием 50 мкл растворенного материала на предыдущем этапе. Используйте 10% уксусную кислоту в качестве заготовки.
  12. Нормализуйте оптическую плотность (O.D.) контроля гальванического покрытия с шага 8.5 и экспрессируйте миграцию или инвазию в зависимости от контрольного условия.

9. Рост первичной опухоли и образование метастазов в легких

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий шаг иллюстрирует методы in vivo для характеристики проопухолевой активности CAF. Этот шаг оптимизирован для оценки проопухолевых особенностей CAF in vivo путем совместной инъекции в сингенных моделях мышей. Поскольку и CAF, и клетки 4T1 взяты из мышиного фона BALB/c, используются мыши BALB/c.

  1. За 2 дня до инъекции 6-недельные самки мышей BALB/c с металлическими ушными бирками и бритвой4-я область молочной железы.
  2. Соберите и подсчитайте клетки 4T1 и s.a. iCAF, приготовленные, как описано в шаге 6. В конической пробирке объемом 15 мл смешайте 1 x 105 элементов 4T1 и 3 x 105 a.a. iCAFs/мышь, учитывая превышение не менее 20%. Используйте 4T1 только в качестве элемента управления.
  3. Центрифугировать при 290 х г в течение 5 мин, ресуспендировать в объеме PBS, рассчитанном на получение вышеуказанного количества клеток/мышей в 50 мкл, перенести в микропробирку объемом 1,5 мл и держать на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, чтобы ввести 10 мышей, смешайте 1,2 x 106 4T1 клетки с 3,6 x 106 s.a. iCAF, пеллетными клетками, и ресуспендируйте в 600 мкл PBS. Введите 50 μл клеточной суспензии на каждую мышь.
  4. Подготовьте рабочую зону, очистив и продезинфицировав поверхность ламинарного вытяжного шкафа. Накройте операционную доску из пенопласта защитным листом для скамейки.
  5. Обезболивайте мышей по одной, в соответствии с институциональными процедурами (мы используем внутрибрюшинное введение тилетаминового основания/золазепамного основания + ксилазин 70 мг/кг + 5 мг/кг). Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость. С помощью ватного наконечника продезинфицируйте кожу раствором повидон-йода.
  6. Используйте тест на защемление пальцев ног, чтобы убедиться, что мыши находятся под надлежащей анестезией. С помощью иглы для подкожных инъекций введите 50 мкл клеточной суспензии в4-й жировой пакет молочной железы. Используйте сосок в качестве ориентира и сделайте инъекцию примерно на 3 мм в направлении ипсилатеральной ноги.
  7. Осматривайте мышей в течение нескольких часов после инъекции и в последующие дни. Опухоли становятся пальпируемыми через 4 дня.
  8. Измеряйте размер опухоли каждые 48 часов с помощью штангенциркуля, определяя максимальный и минимальный диаметры. Рассчитайте объем опухоли по формуле: (длина х ширина2)/2.
  9. Через 10 дней после инъекции хирургическим путем удалите первичные опухоли, как описано ниже.
    1. Подготовьте операционную область, как описано в шаге 9.5. Стерилизуйте инструменты путем автоклавирования и размещайте их на стерильной поверхности во время работы. Стерилизуйте инструменты между животными с помощью стерилизатора с горячими шариками.
    2. Обезболите мышей, как описано в шагах 9.6 и 9.7. С помощью лезвия скальпеля сделайте разрез на 5-8 мм вплотную к опухоли и аккуратно оттяните кожу, создав небольшой карман для доступа к опухоли. Прижгите любой видимый кровеносный сосуд низкотемпературной ручкой-прижигателем, чтобы избежать кровоизлияний при рассечении.
    3. Используйте скальпель для удаления опухоли, стараясь не удалять кожу. Верните кожные лоскуты в исходное положение, сшите их вместе с помощью хирургической нити 5-0 иглой 17 мм 1/2c и добавьте хирургический клей, чтобы полностью запечатать рану.
    4. Не оставляйте мышей без присмотра до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения за грудиной. Животные, перенесшие операцию, не возвращаются в компанию других животных до полного выздоровления.
  10. Внимательно наблюдайте за животными после операции и в последующие дни, при необходимости, проводите обезболивающее лечение в соответствии с протоколами учреждения. Мы используем подкожные инъекции Карпрофена (3-5 мг/кг).
  11. Взвесьте опухоль с помощью прецизионных весов, как показано в шаге 2.2. Разрежьте опухоль пополам с помощью скальпеля. Поместите одну половинку в микропробирку объемом 1,5 мл, заморозьте в жидком азоте и храните при температуре -80 °C для молекулярного анализа. Зафиксировать другую половину в 5 мл 4% PFA в конической пробирке объемом 15 мл на 24 ч при 4 °C для гистологического анализа.
  12. На 21-й день после инъекции принесите мышей в жертву воздействию CO2 и соберите легкие после внутритрахеальной инфузии с 4% PFA, как описано ниже. Работа под вытяжным шкафом.
    1. Откройте грудную полость с помощью хирургических ножниц. Удалите кожу из подчелюстной области и слюнных желез, чтобы четко обнажить трахею.
    2. Приготовьте игольчатый шприц 22G, содержащий 4% раствор PFA. Введите иглу в трахею мыши, направляя ее в сторону легких, одновременно зажимая трахею по направлению к голове. Вводите раствор до тех пор, пока легкие не набухнут (около 2 мл).
    3. Рассеките легкие и поместите их в пробирку объемом 15 мл, содержащую 4% раствор PFA. Осторожно переверните трубку несколько раз и дайте ей зафиксироваться в течение 24 часов при температуре 4 °C.
  13. Выполняйте полусерийные срезы легких и окрашивайте гематоксилином и эозином (H&E) по одному срезу каждые 50/100 мкм до тех пор, пока образец не будет исчерпан, как описано в ссылке31.
  14. Оценка метастазов с помощью программного анализа микрофотографий участков, окрашенных H&E.

10. Сигнатуры экспрессии генов

  1. Определите сигнатуру гена, как описано ниже.
    1. В зависимости от условий эксперимента и конкретного исследуемого биологического вопроса, получить сигнатуру гена можно несколькими способами. Чаще всего оценивают дифференциальную экспрессию между двумя состояниями (например, CAF по сравнению с нормальными аналогами или лечащимися несколькими способами (например, сверхактивированными или глушими) и нелеченными.
    2. В качестве альтернативы можно определить наиболее вариабельно экспрессируемые или информативные гены в анализируемых образцах (например, гены с высокой дисперсией или с высокой нагрузкой на первые компоненты анализа главных компонент). В качестве примера мы будем использовать подпись, регулируемую STAT3. Эта сигнатура была определена как гены, подавленные при подавлении STAT3 в BC CAFs29, как описано ниже. Подробное описание секвенирования РНК см. в ссылках32,33.
  2. Извлеките общую РНК в техническом трехкратном виде из каждого образца, как описано на шаге 4.1.1, и оцените качество РНК для проверки целостности РНК (RIN ≥ 9).
  3. Подготовьте библиотеки из 2 мкг поли(А) выбранной РНК и секвенируйте их. Мы использовали платформу NextSeq 500.
  4. Карта считывает данные в эталонную сборку Mus musculus mm9 с помощью TopHat v2.0. 1034.
  5. Вычисление количества генов с помощью инструмента htseq-count из пакета HTSeq (http://www.huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html).
  6. Выполнение анализа дифференциальной экспрессии с помощью R и пакета DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/DESeq2.html). Отфильтруйте пониженные регуляции гены с помощью FDR < 0,05, чтобы определить сигнатуру STAT3.

11. Оценка экспрессии сигнатуры при первичных опухолях

Примечание: Следующие шаги описывают процедуру вычислительной оценки экспрессии STAT3-регулируемой сигнатуры29 в общедоступных транскриптомных данных первичных опухолей РМЖ, проверяя ее связь с оценочной пропорцией стромы в том же наборе образцов.

  1. Установите R (https://cran.r-project.org/) и RStudio (https://posit.co/products/open-source/rstudio/). Запустите его и установите необходимые библиотеки: GSVA35, TCGAbiolinks36.
  2. Загрузите данные экспрессии генов первичной опухоли, такие как данные TCGA из https://portal.gdc.cancer.gov/, данные METABRIC из http://synapse.org/ (syn1757063) или другие транскриптомные данные из Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) в виде предварительно нормализованных матриц экспрессии. Данные должны быть отформатированы в виде числовой матрицы со строками в качестве генов и столбцами в качестве образцов, а также нормализованы в зависимости от платформы и масштабированы в логарифмическом масштабе со смещением 1.
    1. Скачайте список ортологов генов мыши-человека от Biomart по ссылке https://www.ensembl.org/biomart/martview/, выберите базу данных: ensembl genes, выберите набор данных генов человека и нажмите на выбор атрибутов в левой вкладке.
    2. В предварительно выбранных функциях откройте вкладку ВНЕШНИЕ и отметьте символом HGNC, выберите Гомологи в поле в верхней части страницы и отметьте флажок Ортологи мыши / Имя гена мыши.
    3. Нажмите кнопку «Результаты » в верхнем левом углу, выберите формат CSV и нажмите кнопку «GO», чтобы загрузить файл.
  3. Загрузите сигнатуру экспрессии генов (набор генов) в R. В данном случае мы используем список генов, подавленных при сайленсинге STAT3 в мышиных CAF.
  4. Загрузите список ортологов гена мыши-человека в R и сопоставьте сигнатуру STAT3 с соответствующими человеческими ортологами с помощью таблицы Biomart.
  5. Загрузите данные экспрессии генов первичной опухоли в R и вызовите функцию GSVA с параметрами в качестве объекта ssgseaParam, включая данные о первичной опухоли, и список, содержащий сигнатуру STAT3.

12. Проверьте взаимосвязь между экспрессией сигнатуры гена и клиническими особенностями

  1. Определите интересующие вас переменные. Стромальный процент представляет собой долю клеток в секвенированном образце опухоли, принадлежащих к опухолевой строме. Используйте следующие клинические признаки, часто связанные с омическими данными: размер опухоли, стадия, возраст пациента на момент постановки диагноза, состояние лимфатических узлов, статус метастазов и т. д. Предварительно рассчитанные оценки стромального процента доступны для TCGA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В частности, доступные оценки стромы следующие: EDec Immune/Stromal = Эпигеномная деконволюция стромального/иммунного процента37; Иммунный балл = ssGSEA на основе профилей экспрессии генов 141 иммунного гена38; LUMP = Неметилирование лейкоцитов для чистоты, которое в среднем составляет 44 неметилированных иммуноспецифических сайта CpG39; Стромальный балл = ssGSEA на основе профилей экспрессии генов 141 стромального гена38; ИГХ = оценен путем анализа изображений окрашенных гематоксилином и эозином стекол, полученных с помощью основного ресурса биообразцов Национальной детской больницы40; ABSOLUTE = на основе данных соматического числа копирования41.
  2. Загрузите данные EDEc от http://genboree.org/theCommons/documents/569, Stromal and Immune scores от https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease.html (RNASeqV2), а также данные о чистоте опухоли (LUMP, IHC, ABSOLUTE) от TCGAbiolinks. Для других наборов данных вычислите процент стромы, использующей пакет GSVA, вычислив ssGSEA для стромы и иммунных сигнатур, полученных от Yoshihara et al.38.
  3. Вычислите корреляцию между числовым вектором оцененной стромальной пропорции и числовым вектором экспрессии сигнатуры STAT3 в образцах первичной опухоли. Это может быть достигнуто с помощью функции cor.test в R.
  4. Загрузите клинические данные, связанные с набором транскриптомных данных первичных опухолей, в виде таблицы с образцами в строках и клиническими признаками в столбцах.
  5. Загрузите клинические данные в R и убедитесь, что образцы в транскриптомной матрице и в таблице метаданных расположены в том же порядке, что и функция соответствия.
  6. Для числовых переменных (например, размера опухоли) вычислите корреляцию между числовым вектором экспрессии сигнатуры STAT3 в образцах первичной опухоли и вектором значений клинических признаков с помощью функции cor.test.
  7. Для категориальных переменных (например, статуса метастазирования) проверьте разницу в экспрессии сигнатуры STAT3 между двумя группами образцов (например, метастатическими и неметастатическими опухолями) с помощью непараметрического критерия ранговой суммы Вилкоксона (предполагая, что две группы образцов независимы). Это может быть достигнуто с помощью функции wilcox.test в R.

13. Тестирование регуляции сигнатуры в опухолевой строме

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспрессия стромальной сигнатуры в первичных опухолях, проанализированных с помощью объемного секвенирования РНК, имеет преимущество в том, что она опирается на большие когорты пациентов с подробными клиническими аннотациями. С другой стороны, только разделение стромы и эпителия позволяет определить изменения экспрессии генов в любом из двух клеточных компартментов опухоли по сравнению с нормальной тканью42. MetaLCM — это приложение ShinyApp, которое облегчает анализ транскриптомных наборов данных микродиссекционных опухолей молочной железы с лазерным захватом. С помощью этого инструмента пользователь может искать устойчивые дифференциально экспрессируемые гены между двумя состояниями в транскриптомных наборах данных микродиссектированных опухолей молочной железы с помощью лазерного захвата и проверять регуляцию ранее определенных сигнатур генов в опухолевой строме. Ниже описано, как использовать MetaLCM.

  1. Доступ к приложению можно получить по ссылке https://aurorasavino.shinyapps.io/metalcm/. Чтобы начать анализ, выберите признаки сравниваемых условий.
  2. Выберите направление для сравнения. При выборе генов с повышенной регуляцией показаны гены с более высокой экспрессией в условии 1.
  3. Выберите пороговое значение p-значения для дифференциального выражения и нажмите Run для запуска анализа, и каждый раз настройки будут изменены.
  4. Чтобы ограничить анализ предварительно определенным списком генов, введите символы генов через запятую или импортируйте файл CSV, содержащий символы генов в одном столбце.
  5. Нажмите Отправить список генов, чтобы импортировать символы генов. Нажмите Reset, чтобы восстановить анализ по всем генам. Сохранение списка дифференциально экспрессируемых генов: когда список генов предоставляется, выполняется коррекция множественного тестирования только для этих генов. Таблица содержит среднее значение logFC, свернутое p-значение, а также отдельные logFC и p-значения для дифференциального выражения в каждом доступном наборе данных.
  6. Постройте тепловую карту с изменениями фолда дифференциально экспрессируемых генов. Тепловая карта показывает только дифференциально экспрессируемые гены с полностью когерентным признаком дифференциальной экспрессии в наборах данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оценка деятельности CAF in vitro
Вклад фибробластов, ассоциированных с раком (CAF), вызванных опухолью молочной железы, в агрессивные признаки рака молочной железы (РМЖ) был изучен с использованием иммортализованных CAF (iCAF), полученных в соответствии с этапом 3. iCAF суперактивировали, как описано на шаге 6, а затем морили голодом в sDMEM для сбора их КМ, который использовался для лечения клеток 4T1 в течение 48 ч (см. шаг 7.1). За этим лечением последовали функциональные...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании мы представляем оптимизированные протоколы иммортализации мышиных CAF и характеристику их проопухолевой активности как in vitro , так и in vivo. Вместо того, чтобы селективно выделять конкретные подтипы CAF на основе экспрессии маркеров, мы решили сохранить всю популяцию клеток для сохранения гетерогенности. Клетки были функционально охарактеризованы как единое целое, и профили экспрессии их генов были проанализированы, чтобы отразить их разнообразие...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Итальянской ассоциацией исследования рака (AIRC, IG16930 и IG24851 к В..); Министерство университетов и научных исследований Италии (MIUR PRIN 2017 и 2022 до V.P.); Фонд Трууса и Геррита ван Римсдейков, Лихтенштейн, пожертвование В..; Регион Пьемонт (Отклонение). А.С. был поддержан стипендией Итальянского фонда исследования рака (FIRC) для постдокторантуры, а Лос-Анджелес был поддержан Фондом Умберто Веронези.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1Kb плюс лестница для анализа ДНКThermoFisher Scientific10787018
24-луночный планшетСарштедт833922
Планшет на 96 лунокСарштедт833924
Уксусная кислотаСигма Алдирх695092
AgeI-HFБиолаборатории Новой АнглииР3552Хранить при -20 °deg; C
БетадинМеда Фарма23907076
Bü rker Счетная камера ВВР40443703
Прижигание низкотемпературным дисп FineTipКиллерAX10339KL
ЦентрифугаЭппендорф5810Р
Коническая трубка 15 млСарштедт62554502
Коническая трубка 50 млСарштедт62547254
Cryopure 2 мл микропробиркиСарштедт72380992
Кристально-фиолетовыйСигма АлдирхС0775Хранить в RT, использовать в вытяжном шкафу 
Культуральная пластина диаметром 100 мм;Сарштедт833902
Культуральная пластина диаметром 60 мм Сарштедт833920
ддН20СамодельныйХранить в RT, использовать в биологической вытяжке
Цифровой штангенциркульПречива02-301-2
Цифровой микроскопЛейкаДМ6В
ДиметилсульфоксидСигма АлдирхД8418Использование в биологической вытяжке
Дульбекко s Модифицированный Eagle' s Среда (DMEM)Gibco11965092Хранить при 4 °deg; C, использование в биологической вытяжке
ЭкоРИ-ВЧБиолаборатории Новой АнглииР3101Хранить при -20 °deg; C
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Сигма АлдирхЕ6758Хранить в RT, использовать в биологической вытяжке
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco16000044Хранить при 4 °deg; C, использование в биологической вытяжке
Фильтрованные наконечники 10 & микро; LСарштедт703010255
Фильтрованные наконечники 100 & микро; LСарштедт703030255
Фильтрованные насадки 1000 & микро; LСарштедт703060255
Фильтрованные насадки 20 & микро; LСарштедт703030265
Фильтрованные наконечники 200 & микро; LСарштедт703031255
Фильтропур С Плюс 0,20 & микро; М Сарштедт831826102
Фильтропур С Плюс 0,45 & микро; М Сарштедт831826
Тонкие ножницы2Биол1406009
Щипцы2Биол1102412
ГенетикинGibco10131035Хранить при 4 °deg; C, использование в биологической вытяжке
Липофектамин 2000 Реагент для трансфекцииThermoFisher Scientific11668019Хранить при 4 °deg; C, использование в биологической вытяжке
Инвазионные камеры Matrigel с 8 μ m ПЭТ мембрана Корнинг354480
Считыватель микропланшетов (поглощение 600 нм)Компания PromegaГМ3500
Микропробирки 1,5 млСарштедт7269001
ОптимемGibco31985047Хранить при 4 °deg; C, использование в биологической вытяжке
Параформальдегид (PFA)Сигма Алдирх158127Хранить в RT, использовать в вытяжном шкафу
pBABE-neo largeTcDNA Адджен1780Хранить при -20 °deg; C, использование в биологической вытяжке
pCL-АмфоNovus Biological 18746853Хранить при -20 °deg; C, использование в биологической вытяжке
пКМВ-Р8.74Адджен22036Хранить при -20 °deg; C, использование в биологической вытяжке
pCMV-VSVG Адджен8454Хранить при -20 °deg; C, использование в биологической вытяжке
Пенициллин-стрептомицин (Pen Strepto, 10,000 μ г/мл) Gibco15140122Хранить при 4 °deg; C, использование в биологической вытяжке
Фазово-контрастный микроскоп Олимп БХ42
Фосфатно-солевой буфер  (ПБС)СамодельныйХранить в RT, использовать в биологической вытяжке
pLKO.1-Puro Адджен10878Хранить при -20 °deg; C, использование в биологической вытяжке
Раствор поли-L-лизинаСигма АлдирхП8920Хранить при 4 °deg; C, использование в биологической вытяжке
Пуромицина дигидрохлорид из  Streptomyces albonigerСигма АлдирхП8833
Буфер rCutSmart Биолаборатории Новой АнглииВ6004Хранить при -20 °deg; C
Бритва для грызуновЭскулапГТ416
Мемориальный институт Розуэлл Парк (RPMI)Gibco61870010Хранить при 4 °deg; C, использование в биологической вытяжке
Тампоны с круглым наконечникомСигма АлдирхZ744127
СкальпельГима27041
Secura Semi Micro BalanceСарториусSECURA125-1С
Серологическая пипетка 10 мл&nbл;Сарштедт861254001
Серологическая пипетка 2 мл&nbл;Сарштедт861252001
Серологическая пипетка 25 мл Сарштедт861256001
Серологическая пипетка 5 мл Сарштедт861253001
Стежки 5-0Этикон1866Г
Шприц 10 млПентаферте00202250Э14
Шприц 5 млПентаферте00202250Э12
Шприц Омниканский инсулин 1 млБраун9151125С
Тканевый адезивный3М Ветбонд1469СБ
Вставки Transwell 8 & микро; m pore Сокол353097
Вкладыши Transwell Matrigel 8 & микро; m pore Корнинг354480
Трипсин-ЭДТА (0,5%), фенол красный не содержитGibco15400054
Vivaspin 20 центробежный концентратор MWCO 10 000 Da Сигма АлдирхZ614602

Ссылки

  1. Bhattacharya, S., et al. Group behavior and emergence of cancer drug resistance. Trends Cancer. 7 (4), 323-334 (2021).
  2. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  3. Marusyk, A., et al. Spatial proximity to fibroblasts impacts molecular features and therapeutic sensitivity of breast cancer cells influencing clinical outcomes. Cancer Res. 76 (22), 6495-6506 (2016).
  4. Su, S., et al. Cd10(+)gpr77(+) cancer-associated fibroblasts promote cancer formation and chemoresistance by sustaining cancer stemness. Cell. 172 (4), 841-856.e16 (2018).
  5. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  6. Watson, S. S., et al. Microenvironment-mediated mechanisms of resistance to HER2 inhibitors differ between HER2+ breast cancer subtypes. Cell Syst. 6 (3), 329-342.e6 (2018).
  7. Xie, J., et al. Cancer-associated fibroblast-derived extracellular vesicles: Regulators and therapeutic targets in the tumor microenvironment. Cancer Drug Resist. 8, 2(2025).
  8. Du, R., et al. PDPN-positive CAFs contribute to HER2-positive breast cancer resistance to trastuzumab by inhibiting antibody-dependent NK cell-mediated cytotoxicity. Drug Resist Updat. 68, 100947(2023).
  9. Zhang, H., et al. Define cancer-associated fibroblasts (CAFs) in the tumor microenvironment: New opportunities in cancer immunotherapy and advances in clinical trials. Mol Cancer. 22 (1), 159(2023).
  10. Zheng, S., et al. Dissecting the role of cancer-associated fibroblast-derived biglycan as a potential therapeutic target in immunotherapy resistance: A tumor bulk and single-cell transcriptomic study. Clin Transl Med. 13 (2), e1189(2023).
  11. Bainer, R., et al. Gene expression in local stroma reflects breast tumor states and predicts patient outcome. Sci Rep. 6, 39240(2016).
  12. Farmer, P., et al. A stroma-related gene signature predicts resistance to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Nat Med. 15 (1), 68-74 (2009).
  13. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Res. 17 (1), 23(2015).
  14. Xie, J., et al. Turning up a new pattern: Identification of cancer-associated fibroblast-related clusters in TNBC. Front Immunol. 13, 1022147(2022).
  15. Chen, Y., Mcandrews, K. M., Kalluri, R. Clinical and therapeutic relevance of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Clin Oncol. 18 (12), 792-804 (2021).
  16. Bartoschek, M., et al. Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Commun. 9 (1), 5150(2018).
  17. Liu, S. Q., et al. Single-cell and spatially resolved analysis uncovers cell heterogeneity of breast cancer. J Hematol Oncol. 15 (1), 19(2022).
  18. Massa, D., Tosi, A., Rosato, A., Guarneri, V., Dieci, M. V. Multiplexed in situ spatial protein profiling in the pursuit of precision immuno-oncology for patients with breast cancer. Cancers. 14 (19), 4885(2022).
  19. Tietscher, S., et al. A comprehensive single-cell map of T cell exhaustion-associated immune environments in human breast cancer. Nat Commun. 14 (1), 98(2023).
  20. Tzoras, E., et al. Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution. Cancers. 14 (8), 1999(2022).
  21. Wu, S. Z., et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers. Nat Genet. 53 (9), 1334-1347 (2021).
  22. Ning, L., et al. Scrna-seq characterizing the heterogeneity of fibroblasts in breast cancer reveals a novel subtype sfrp4(+) caf that inhibits migration and predicts prognosis. Front Oncol. 14, 1348299(2024).
  23. Salemme, V., et al. The role of tumor microenvironment in drug resistance: Emerging technologies to unravel breast cancer heterogeneity. Front Oncol. 13, 1170264(2023).
  24. Attalla, S., Taifour, T., Bui, T., Muller, W. Insights from transgenic mouse models of pymt-induced breast cancer: Recapitulating human breast cancer progression in vivo. Oncogene. 40 (3), 475-491 (2021).
  25. Ferreira, T., Azevedo, T., Silva, J., Faustino-Rocha, A. I., Oliveira, P. A. Current views on in vivo models for breast cancer research and related drug development. Expert Opin Drug Discov. 19 (2), 189-207 (2024).
  26. Holen, I., Speirs, V., Morrissey, B., Blyth, K. In vivo models in breast cancer research: Progress, challenges and future directions. Dis Model Mech. 10 (4), 359-371 (2017).
  27. Pedroza, D. A., Gao, Y., Zhang, X. H., Rosen, J. M. Leveraging preclinical models of metastatic breast cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1879 (5), 189163(2024).
  28. Nuckhir, M., Withey, D., Cabral, S., Harrison, H., Clarke, R. B. State of the art modelling of the breast cancer metastatic microenvironment: Where are we. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 14(2024).
  29. Avalle, L., et al. Stat3 induces breast cancer growth via angptl4, mmp13 and stc1 secretion by cancer associated fibroblasts. Oncogene. 41 (10), 1456-1467 (2022).
  30. Halaban, R., Alfano, F. D. Selective elimination of fibroblasts from cultures of normal human melanocytes. In Vitro. 20 (5), 447-450 (1984).
  31. Avalle, L., et al. Micrornas-143 and -145 induce epithelial to mesenchymal transition and modulate the expression of junction proteins. Cell Death Differ. 24 (10), 1750-1760 (2017).
  32. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with rna-seq. J Biomed Biotechnol. 2010, 853916(2010).
  33. Ura, H., Togi, S., Niida, Y. A comparison of mrna sequencing (rna-seq) library preparation methods for transcriptome analysis. BMC Genomics. 23 (1), 303(2022).
  34. Kim, D., et al. Tophat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36(2013).
  35. Hanzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. Gsva: Gene set variation analysis for microarray and rna-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 7(2013).
  36. Mounir, M., et al. New functionalities in the tcgabiolinks package for the study and integration of cancer data from gdc and gtex. PLoS Comput Biol. 15 (3), e1006701(2019).
  37. Onuchic, V., et al. Epigenomic deconvolution of breast tumors reveals metabolic coupling between constituent cell types. Cell Rep. 17 (8), 2075-2086 (2016).
  38. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nat Commun. 4, 2612(2013).
  39. Aran, D., Sirota, M., Butte, A. J. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nat Commun. 6, 8971(2015).
  40. Liu, J., et al. An integrated tcga pan-cancer clinical data resource to drive high-quality survival outcome analytics. Cell. 173 (2), 400-416.e11 (2018).
  41. Carter, S. L., et al. Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer. Nat Biotechnol. 30 (5), 413-421 (2012).
  42. Savino, A., De Marzo, N., Provero, P., Poli, V. Meta-analysis of microdissected breast tumors reveals genes regulated in the stroma but hidden in bulk analysis. Cancers. 13 (13), 3371(2021).
  43. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral rnai system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  44. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  45. Pfefferle, A. D., et al. Transcriptomic classification of genetically engineered mouse models of breast cancer identifies human subtype counterparts. Genome Biol. 14 (11), R125(2013).
  46. Hahn, W. C., et al. Enumeration of the Simian virus 40 early region elements necessary for human cell transformation. Mol Cell Biol. 22 (7), 2111-2123 (2002).
  47. Counter, C. M., et al. Dissociation among in vitro telomerase activity, telomere maintenance, and cellular immortalization. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14723-14728 (1998).
  48. Ferrari, N., et al. Dickkopf-3 links hsf1 and Yap/Taz signalling to control aggressive behaviours in cancer-associated fibroblasts. Nat Commun. 10 (1), 130(2019).
  49. Herrera, M., et al. Cancer-associated fibroblast-derived gene signatures determine prognosis in colon cancer patients. Mol Cancer. 20 (1), 73(2021).
  50. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  51. Cobos, F. A., et al. Effective methods for bulk RNA-seq deconvolution using scRNA-seq transcriptomes. Genome Biol. 24 (1), 177(2023).
  52. Cheng, P. S. W., Zaccaria, M., Biffi, G. Functional heterogeneity of fibroblasts in primary tumors and metastases. Trends Cancer. 11 (2), 135-153 (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Микроокружение опухолирак молочной железыпрофилирование экспрессии геновтранскриптомный анализанализ инвазиианализ миграциигены-мишени STAT3лазерная микродиссекция
Ассоциированные с раком фибробласты из опухолей молочной железы мышей как инструменты для молекулярных и вычислительных исследований
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.