Методическая статья

Выделение, бактериологическое исследование и характеристика фибробластов, ассоциированных с раком предстательной железы

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68367

⸱

1 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale, 3Division of Urology, Department of Surgical Sciences, University of Turin, 4Department of Surgical Sciences and Urology, Città della Salute e della Scienza di Torino, University of Turin, 5Department of Pathology, University of Turin, and AOU Città della Salute e della Scienza

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает комплексную процедуру выделения, расширения и имморализации фибробластов из радикальных простатэктомий. Кроме того, в нем описаны анализы, разработанные для оценки функциональных эффектов перекрестных помех между фибробластами и опухолевыми клетками, с использованием преимуществ как лечения кондиционированной средой, так и совместного культивирования.

Аннотация

Опухолевая строма может активно формироваться опухолевыми клетками для принятия проопухолевых свойств, что делает ее центром исследований рака. Среди стромальных компонентов раковые фибробласты (CAF) — часто самый распространенный тип клеток в опухолевом микроокружении (TME) — играют ключевую роль в содействии прогрессированию рака за счет их взаимодействия с опухолевыми клетками и другими стромальными компонентами. Выяснение механизмов, лежащих в основе этих взаимодействий, требует надежных методов выделения и характеристики CAF, которые также могут заложить основу для разработки новых методов лечения рака, направленных на CAF. В данном исследовании представлен метод выделения фибробластов как из опухоли, так и из прилегающих нормальных областей образцов радикальной простатэктомии, полученных от пациентов с раком предстательной железы (РПЖ). Такой подход позволяет одновременно изолировать CAF и их нормальные аналоги (NF) от одного и того же индивидуума, создавая парную экспериментальную систему. Предоставляются подробные протоколы для поддержания первичных CAF и NF для последующих анализов in vitro, а также для их увековечивания для облегчения долгосрочных исследований. Мы также описываем функциональные анализы, предназначенные для сравнения влияния CAF и NF на поведение раковых клеток, включая пролиферацию, миграцию и рост, не зависящий от привязки. Подробно описаны два взаимодополняющих подхода: лечение раковых клеток кондиционированной средой (КМ), полученной из фибробластов, и прямое совместное культивирование фибробластов с опухолевыми клетками. Вместе эти методологии представляют собой всеобъемлющий набор инструментов для исследования динамического взаимодействия между CAF и опухолевыми клетками не только при РПЖ, но и потенциально при ряде видов рака человека. Более того, молекулярная характеристика этих взаимодействий может выявить ключевые медиаторы онкогенеза, вызванного CAF, предлагая перспективные мишени для терапевтического вмешательства.

Введение

Рак предстательной железы (РПЖ) является наиболее часто диагностируемым раком у мужчин почти в двух третях стран мира. В 2022 году было зарегистрировано около 1,5 миллиона новых случаев заболевания, в результате которых 3 97 000 человек умерли во всем мире. Эти цифры делают РПЖ вторым по распространенности раком и пятой ведущей причиной смертности, связанной с раком, среди мужчин1.

РПЖ является мультифокальным и биологически сложным заболеванием, характеризующимся значительной межопухолевой гетерогенностью 2,3,4, разнообразными молекулярными подтипами и вариабельными клиническими исходами 5,6, которые существенно влияют на прогноз и терапевтический ответ7.

В то время как критическая роль опухолевого микроокружения (ТМЭ) в инициации и прогрессировании опухоли предстательной железы хорошоизвестна 8,9, молекулярные взаимодействия между опухолевыми клетками и окружающим стромальным компартментом остаются до конца неизученными. Несмотря на то, что хорошо известно, что микроокружение опухоли предстательной железы (TME) играет решающую роль в инициации и прогрессировании опухоли, молекулярные взаимодействия между опухолевыми клетками и окружающей стромой остаются недостаточно определенными. ТМЭ состоит из различных стромальных клеток, в том числе мезенхимального и иммунного происхождения, которые активируются в ответ на сигналы, происходящие от опухоли, и впоследствии приобретают функции, способствующие развитию опухоли10,11. Среди них ассоциированные с раком фибробласты (CAF) часто представляют собой наиболее распространенную популяцию стромы. CAF способствуют ремоделированию внеклеточного матрикса (ВКМ), способствуют росту опухоли и облегчают инвазию и миграцию раковых клеток 4,11,12,13. Посредством секретируемых факторов и прямых межклеточных взаимодействий CAF также влияют на пролиферацию, инвазию и резистентность к терапии. Примечательно, что CAF представляют собой неоднородную популяцию. Хотя в целом они связаны с проопухолевыми функциями, некоторые подтипы могут оказывать роль в подавлении опухолей14,15. Важно отметить, что отсутствие уникальных маркеров для CAF создает проблемы для их точной идентификации и функционального анализа их разнообразных ролей12,16.

Надежный подход к исследованию функциональных перекрестных помех между CAF и опухолевыми клетками включает выделение первичных CAF и совместимых нормальных фибробластов (NF), а затем оценку их соответствующего влияния на поведение опухолевых клеток, такое как пролиферация, миграция, образование колоний и независимый от якоря рост17,18,19. В данной статье описывается усовершенствованный, высоковоспроизводимый протокол выделения CAF и NF из образцов радикальной простатэктомии пациентов с PCa высокого риска. Важнейшим компонентом этого протокола является точная идентификация и вскрытие опухолевых и свободных от опухоли областей экспертом-уропатом, что позволяет получить CAF и NF от одного и того же пациента. Этот подход с использованием парных образцов помогает контролировать межопухолевую гетерогенность и индивидуальные переменные, специфичные для пациента, которые могут влиять на фенотипы фибробластов20,21,22. Чтобы обеспечить наличие достаточного количества опухолевой ткани, мы фокусируемся на образцах от пациентов с оценкой по шкале Глисона ≥7.

Надежная фенотипическая характеристика выделенных фибробластов требует использования нескольких маркеров, чтобы отличить их от других типов клеток, в частности эпителиальных клеток, которые могут иметь общую экспрессию перекрывающихся маркеров16. Поскольку первичные фибробласты РПЖ обычно стареют после 10-15 пассажей, что усложняет долгосрочный анализ, мы также представляем протокол иммортализации клеток через стабильную экспрессию обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT)23.

Чтобы изучить функциональное влияние CAF и NF на опухолевые клетки, мы протестировали и оптимизировали несколько экспериментальных стратегий. Учитывая, что CAF оказывают свое влияние как через секретируемые факторы, так и через прямой межклеточныйконтакт24, разработаны две дополнительные системы анализа: (1) обработка раковых клеток фибробласт-кондиционированной средой (КМ) и (2) прямое совместное культивирование фибробластов и опухолевых клеток. Эти анализы оценивают ключевые свойства раковых клеток, включая пролиферацию, независимый от анкориджа рост и миграцию. Для стандартизации влияния секретируемых факторов кондиционированные среды из CAFs и NF концентрировали и количественно оценивали (conCM) на основе общего содержания белка.

Демонстрация значительных функциональных эффектов с помощью этих анализов может способствовать идентификации критических медиаторов онкогенеза, вызванного CAF, предлагая потенциальные мишени для терапевтического вмешательства.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данное исследование проводилось в полном соответствии с Институциональными рекомендациями по использованию клинических образцов, утвержденными Комитетом по биоэтике больницы Città della Salute Molinette в Турине, Италия. Все образцы были получены после подписания информированного согласия участвующими пациентами. В следующем разделе представлен подробный пошаговый протокол выделения ассоциированных с раком фибробластов (CAF) и их соответствующих аналогов нормальных фибробластов (NF). Протокол включает в себя вскрытие опухоли и прилегающих неопухолевых участков, обработку тканей, культивирование клеток, а также фенотипическую и функциональную характеристику выделенных клеток. Все процедуры должны проводиться в стерильных условиях в сертифицированном шкафу биобезопасности. Клетки культивировали при 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5%CO2 , с использованием полной модифицированной орлиной среды Dulbecco's Modified Eagle Medium (cDMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, если не указано иное. Все этапы центрифугирования выполняются при включенном тормозе. Полный список реагентов, материалов и оборудования, используемых в протоколе, приведен в Таблице материалов . Эта методология была оптимизирована для образцов рака предстательной железы высокого риска с оценкой по шкале Глисона 4+3 или выше.

1. Хирургическая диссекция образца

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура была выполнена на хирургических образцах, собранных в результате процедур радикальной простатэктомии25, выполненных пациентам с раком предстательной железы (РПЖ) высокой степени злокачественности, и лечилась в соответствии со стандартизированными протоколами, основанными на внутренних институциональных рекомендациях и установленной международной литературе и передовой практике.

  1. Поместите предстательную железу под биозащитный капюшон на стерильную простыню, и сориентируйте его в соответствии с анатомическими ориентирами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эту процедуру должен проводить опытный уропатолог.
  2. С помощью стерильного лезвия иссекайте срезы ткани из областей, определенных в отчете о предоперационной биопсии как опухолевые или свободные от опухолевых клеток.
  3. Проведите быстрый криостатический анализ29 на обоих образцах ткани, подготовив срезы ткани толщиной 2,5 мкм и окрашивая их гематоксилином и эозином (H&E) для проверки наличия или отсутствия опухолевых клеток в выбранных областях, в соответствии с диагностическими критериями аденокарциномы предстательной железы последнего издания классификации ВОЗ30 (см. рисунок 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При возникновении расхождений повторяйте процесс забора образцов до тех пор, пока не будет получено гистологическое подтверждение как неопластических, так и неопухолевых областей.
  4. Удалите примерно 10мм2 образцов из опухолевых и неопухолевых областей, поместите их в конические пробирки объемом 15 мл, содержащие 7 мл буфера для хранения ледяных тканей, и храните их на льду для последующих процедур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться при температуре 4 °C до 48 часов в этом буфере.

2. Выделение фибробластов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие процедуры обработки должны выполняться на льду при температуре 4 °C, если не указано иное. Схема приведена на рисунке 1 А.

  1. День 1: Взвесьте образцы тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: в среднем получается 70-100 мг.
  2. Перейдите на посуду размером 6 см и выполните четыре последовательных мытья, дважды по 4 мл ледяного PBS и дважды по 4 мл ледяного cDMEM, оба с добавлением 200 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина (2x), используя стерильные щипцы для переноса ткани из одной чашки в другую.
  3. Механически разрушите ткань, поместив ее в 6-сантиметровую пластину на льду, с 1 мл DMEM с добавлением 100 ед/мл пенициллина-G и 100 мкг/мл стрептомицина, затем измельчите ее на мелкие фрагменты (<1 мм2 ) с помощью ножниц или лезвий.
  4. Переложите в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл ледяного cDMEM. Центрифугируйте при 754 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  5. С помощью пипетки объемом 10 мл осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл ледяного cDMEM. Снова центрифугируйте при 754 x g в течение 5 минут при 4 °C.
  6. Удалите надосадочную жидкость, как указано выше, и повторно суспендируйте гранулу в коллагеназе II (1 мг/мл в DMEM), используя 1 мл/100 мг ткани. Перейдите в микропробирку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за вариабельности партий коллагеназы протестируйте разные партии и убедитесь, что их достаточно для выполнения всех прогнозируемых выделений.
  7. Накройте пробирки парафиновой пленкой и переварите образцы O/N (8-12 ч) при температуре 37 °C при непрерывном покачивании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги в день 2.
  8. Переложите образцы в конические пробирки объемом 15 мл и добавьте 5 мл ледяного cDMEM в клеточную суспензию для инактивации коллагеназы, затем центрифугируйте при 754 x g в течение 5 минут при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коллагеназа утилизируется путем аспирации в контейнер, содержащий моющее средство.
  9. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 10 мл и ресуспендируйте гранулу в 1 мл 0,05% трипсина/ЭДТА. Выдерживать 5 минут при температуре 37 °C, периодически встряхивая.
  10. Добавьте к образцам 1 мл ДНКазы I и хорошо перемешайте. Используйте свежеприготовленный раствор 25 мг/мл в PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение ДНКазой I на этом этапе позволяет получить раствор для одной клетки.
  11. Центрифугируйте при 754 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  12. Используйте пипетку объемом 10 мл для аспирации надосадочной жидкости и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл холодного cDMEM. Центрифугируйте при 754 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  13. Ресуспендируйте клетки в 20% FBS cDMEM. Выложите в тарелку и инкубируйте при температуре 37 °C, 5%CO2 и влажности 95% не менее 3 дней. Следите за тем, чтобы не сдвинуть / не наклонить блюдо. На 70-100 мг ткани распределите клеточную суспензию в 2 посуды по 3,5 см, в 2 мл среды. При необходимости уменьшите масштаб соответствующим образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Менее 50 мг ткани приведет к неэффективному выведению клеток. Схема разделения и замораживания показана на рисунке 1B.
  14. Через 3 дня проверьте клетки на морфологию/жизнеспособность и замените 2/3 среды для поддержания факторов роста, вырабатываемых клетками. Потребуется около 7-10 дней, чтобы клетки достигли слияния, заменяя среду через день.
  15. После слияния пропустите клетки в одну 10-сантиметровую чашку с 20% FBS cDMEM.
  16. Заменяйте среду через день, используя 15% среду FBS дважды, затем один раз, 12,5%, затем 10%. Для анализа FACS экстракция РНК и белка и замораживание запасов следуют схеме, приведенной на рисунке 1B.
  17. Расщепление клеток при примерно 100% слиянии (около 10 дней). Умыть 2-3 раза обильным PBS по 5 мин каждый. Добавьте 1% трипсин/ЭДТА (2x) и поместите в инкубатор, проверяя на отслоение клеток каждые несколько минут.

3. Условия культивирования

  1. Проходите клетки только при 100% слиянии, не более 1:3.
  2. Заморозьте аликвоты, соответствующие 50% сливающейся 10-сантиметровой чашки, в 0,5 мл ледяной морозильной среды (10% ДМСО в FBS). Разморозьте каждую аликвоту в посуде 10 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее время удвоения составляет 80-90 часов.

4. Анализ FACS

Примечание: Этот протокол обеспечивает надежную характеристику популяции фибробластов и выявляет потенциальное загрязнение эпителиальными, эндотелиальными или иммунными клетками. Анализ FACS выполнен в отрывке 2, как показано на рисунке 2A.

  1. Соберите клетки и ресуспендируйте их в буфере FACS (PBS плюс 2% FBS) в концентрации10-6 клеток/мл.
  2. Разметьте пробирки проточной цитометрии и добавьте 1 x 105 клеток объемом 100 мкл в каждую из них. Для окрашивания 4 антителами подготовьте 11 пробирок с учетом как окрашивания, так и шлабирки, как показано в таблице 1
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1 пробирка, без антител (неокрашенный контроль), для оценки аутофлуоресценции клеток, 1 пробирка с контролем изотипа антител, для оценки аспецифического связывания, 4 пробирки, каждая с одним антителом, для компенсации; компенсационные шарики могут заменить клетки, 4 пробирки Fluorescence Minus One (FMO) для гейтирования, каждая из которых пропускает одно из антител, 1 пробирка со всеми 4 антителами (фактический образец). Используются следующие флуоресцентно меченые антитела (см. Таблицу материалов): (1) Anti-EpCAM-PE (маркер эпителиальных клеток), (2) Anti-CD31-VioBlue (маркер эндотелиальных клеток), (3) Anti-CD45-FITC (маркер иммунных клеток), (4) Anti-CD90-APC (маркер фибробластов). Можно использовать антитела, конъюгированные с другими флуорофорами, в соответствии с имеющимися фильтрами проточных цитометров. Выполняйте все действия на льду, чтобы сохранить жизнеспособность клеток.
  3. Инкубируйте клетки с блокаторами фрагментных кристаллизуемых рецепторов (FcR), такими как очищенные антитела к CD16/CD32 или блокирующий буфер (PBS 1%-2% BSA). Используйте 1-5 мкл блокирующего реагента FcR на 100 мкл клеточной суспензии и инкубируйте при 4 °C в течение 10-15 минут.
  4. Приступайте непосредственно к окрашиванию, не промывая. Добавьте в пробирки соответствующие разведения антител или соответствующие контрольные изотипы, как указано в таблице 1.
  5. Аккуратно перемешайте и выдержите при температуре 4 °C в темноте в течение 30 минут.
  6. Промойте 2 мл буфера FACS.
  7. Центрифуга в течение 5 мин при 300 x g, при 4 °C.
  8. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл свежего буфера FACS.
  9. Добавьте краситель для повышения жизнеспособности (йодид пропидия) в соответствии с инструкцией производителя (см. Таблицу материалов).
  10. Соберите образцы на проточном цитометре.
  11. Используйте элементы управления компенсацией с одним пятном для настройки матрицы компенсации. Для анализа данных примените следующую стратегию стробирования на графиках плотности FACS:
  12. Передний и боковой стробирование рассеяния: график FSC-A против SSC-A и спроектировать область вокруг основной популяции клеток, чтобы исключить клеточный мусор.
  13. Для исключения дуплета: график FSC-A против FSC-W (или FSC-H против FSC-A) и спроектируйте область таким образом, чтобы исключить скопления ячеек, которые будут показывать увеличенную ширину относительно площади (или увеличенную площадь относительно высоты). Выделите отдельные ячейки и выполните ту же процедуру, построив график SSC-A и . SSC-W (или SSC-H против SSC-A) для повышения чистоты популяции отдельных клеток.
  14. Составьте график жизнеспособности красителя (т.е. йодида пропидия) в соотношении. SSC-A и выбрать отрицательные живые клетки.
  15. На живых клетках построите график CD326 (ось x) и . CD31 (ось y); использовать соответствующие образцы FMO для точной установки стробов. FMO позволяет объяснить распространение флуоресценции в определенный канал, вызванное другими флуорофорами.
    1. Глядя на образец CD326 FMO, нарисуйте ворота квадранта, включающие все клетки в левом квадранте (т.е. отрицательные для CD326). Повторите ту же процедуру с использованием образца CD31 FMO для регулировки затвора таким образом, чтобы все клетки FMO находились в нижних квадрантах (т.е. отрицательные для CD31). Используйте этот квадрант для анализа образцов и выберите ячейки в нижнем левом квадранте (CD31-CD326-).
  16. Повторите ту же процедуру, построив график CD326 (ось x) относительно . CD45 (ось Y), использующий CD326 FMO и CD45 FMO для установки квадрантного затвора. Используйте этот квадрант для анализа всех образцов и выберите ячейки в нижнем левом квадранте (CD45-CD326-).
  17. Сюжет CD90 против SSC-A и используйте CD90 FMO для установки области, которая исключает отрицательные клетки и включает только CD90+. Используйте эту область для анализа всех образцов, измеряя процент клеток CD90+ . Репрезентативные результаты представлены на рисунке 2А.

5. Увековечение фибробластов

Примечание: Иммортализация популяций CAF и NF достигается путем стабильной трансдукции ретровирусным вектором, экспрессирующим hTERT. Ниже приведены протоколы подготовки инфекционных псевдовирусных частиц и трансдуцирования клеток.

  1. Производство ретровирусных частиц
    1. День 1, покрытие поли-L-лизином и покрытие клеток: Нанесите на 10-сантиметровую чашку 6 мл раствора поли-L-лизина (0,1 мг/мл в H2O), инкубируйте 5 минут под колпаком TC, аспирируйте и дайте открытой чашке высохнуть под колпаком перед нанесением 3 x 106 HEK293T клеток.
    2. День 2: Добавьте 30 мкл катион-липид-опосредованного реагента для трансфекции в 0,75 мл среды, оптимизированной для липофекции без антибиотиков.
    3. Параллельно добавьте 2 мкг pCL-Ampho Retrovirus Packaging Vector и 2 мкг плазмид pBABE-puro-hTERT в еще 0,75 мл среды, оптимизированной для липофекции, не содержащей антибиотиков.
    4. Инкубировать в течение 5 минут при RT.
    5. Смешайте два раствора в конической пробирке объемом 15 мл и инкубируйте в течение 20 минут при RT.
    6. Между тем, замените HEK293T среду 6 мл среды, оптимизированной для липофекции, с добавлением 10% FBS.
    7. Аккуратно распределите комплексы ДНК по поверхности чашки и инкубируйте в течение 6 ч до O/N в увлажненном инкубаторе сCO2.
    8. День 3: Замените среду на 7 мл cDMEM и инкубируйте в течение 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, работа должна выполняться в учреждении для культивирования тканей уровня биобезопасности 3 (BSL3) в соответствии с институциональными правилами.
    9. На 5-й день соберите вирусосодержащую среду и профильтруйте через шприц-фильтр 0,22 мкм.
    10. Аликвоту и хранить при температуре -80 °C.
  2. Вирусная трансдукция
    1. День 1: Планшет фибробластов с низким проходимостью при 60% слиянии в 2 лунках 6-луночного планшета.
    2. День 2: Замените среду 1 мл ранее произведенного ретровирусного препарата pBABE-puro-hTERT, содержащего 8 мкг/мл полибрена, и инкубируйте в течение 12-16 ч.
    3. День 3: Замените вируссодержащую среду 2 мл cDMEM.
    4. День 4: Через 24 ч начните два раунда отбора пуромицина по 48 ч (2 мкг/мл).
      Примечание: Концентрация должна быть определена эмпирически для каждой партии антибиотика и типа клеток, а самая низкая концентрация должна быть выбрана для уничтожения всех клеток в течение 4 дней после отбора.
    5. День 8: Убедитесь, что все неинфицированные контрольные клетки погибли. Замените среду на cDMEM и дайте инфицированным клеткам расти до слияния, прежде чем пропускать их в соотношении 1:3. Дайте клеткам достичь слияния и снова разделитесь 1:3. На этом этапе клетки могут выйти из установки BLS3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте замороженные аликвоты как можно скорее. Чтобы убедиться в том, что иммортализование произошло, пройдите через клетки 5-6 раз и оцените их морфологию и скорость дупликации, которая не должна меняться с каждым пассажем. Функционально сравните иммортализированные клетки с их первичными аналогами, используя методы, описанные ниже.

6. Характеристика фибробластов

  1. Фенотипический анализ выделенных клеток на экспрессию маркеров CAF/NF и функциональная характеристика их потенциальной проонкогенной активности на опухолевые клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Олигонуклеотиды и антитела для количественной ПЦР, оптимизированные для оценки уровней экспрессии маркеров как на уровне РНК, так и на уровне белка, представлены в Таблице 2 и Таблице материалов соответственно. Имейте в виду, что антитела против белка активации фибробластов (FAP) часто неспецифичны. Обязательно включите соответствующие положительные и отрицательные меры контроля 31,32. Для оценки перекрестных помех между фибробластами и опухолевыми клетками можно использовать различные методы. Здесь описаны два альтернативных подхода, состоящих либо в лечении опухолевых клеток кондиционированной средой (КМ), полученной из CAF или NF, либо в совместном культивировании фибробластов и опухолевых клеток. Описана эффективность любого из этих подходов для усиления пролиферации опухолевых клеток.

7. Приготовление и концентрирование кондиционированной среды

ПРИМЕЧАНИЕ: Кондиционированная среда концентрируется и точно дозируется после сбора, чтобы облегчить сравнение между различными клетками.

  1. Поместите клетки на 70% слияние в 15-сантиметровую чашку в cDMEM.
  2. На следующий день переключитесь на 15 мл среды для голодания (DMEM без FBS) и инкубируйте в течение 48 ч для получения CM.
  3. Соберите CM, центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при RT и отфильтруйте через фильтр 0,22 μm для удаления клеточного мусора и стерилизации.
  4. Переложите в концентрирующие пробирки (MWCO 10 000 Да) и центрифугируйте в течение 20 мин при 2000 x g и 4 °C, или в соответствии с инструкциями производителя, чтобы получить около 1 мл концентрированного CM (conCM), т.е. 15 x концентрации.
  5. Аликвотируйте conCM и храните при температуре -80 °C.
  6. Количественно оцените содержание белка в собранном conCM с помощью колориметрического анализа белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя полученная концентрация составляет 0,5 и 2 мкг/мкл. Более низкие концентрации все еще можно использовать.

8. Пробирный анализ

Пролиферацию клеток (с использованием клеточных линий DU145 или LNCaP человеческого PCa) оценивали с помощью инструмента для анализа живых клеток в двух различных условиях: либо обрабатывая опухолевые клетки conCM, либо совместно культивируя их с CAF или NF. В этом случае необходимо использовать флуоресцентные опухолевые клетки. Репрезентативные результаты представлены на рисунке 3.

  1. Пролиферативный анализ при лечении конКМ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для ячеек DU145; Различные ячейки могут потребовать корректировки.
    1. Пластинчатые опухолевые клетки в cDMEM в 96-луночном планшете (750 клеток/лунка), учитывая не менее 3 репликации в каждом состоянии, и инкубируют O/N.
    2. Замените кДМЭМ на среду для голодания, с добавкой или без нее, 50 мкг/мл конКМ.
    3. Перенесите планшет в камеру прибора для анализа живых клеток в инкубаторе.
    4. Дайте нагреться до 37 °C в течение 30 минут, затем начните первое сканирование.
    5. Используйте фазово-контрастный канал, выбрав подходящий объектив и количество желаемых полей/лунки (рекомендуется 10x объектива и 5 полей/лунка), а также стандартный тип сканирования. Сканирование каждые 6 часов в течение 4-5 дней (продолжительность должна быть определена эмпирически для условий и типов клеток).
    6. Выполняйте анализ в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
    7. Рассчитайте для каждой скважины (технические реплики для каждого условия) кратное изменение относительно ее значения в нулевой момент времени. Сгенерируйте соответствующие графики и оцените статистическую значимость с помощью соответствующего программного обеспечения.
  2. Пролиферационный анализ при совместном культивировании
    1. 750 RFP-экспрессирующих клеток DU145 и CAF или NF в соотношении 1:3 в cDMEM в 96-луночном планшете.
    2. На следующий день переключитесь на 2% FBS DMEM. Перенесите планшет в камеру прибора для анализа живых клеток в инкубаторе и запускайте стандартное сканирование каждые 6 ч в течение 4 дней, используя как фазовый контраст, так и оранжевый канал.
    3. Проводите анализ распространения в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
    4. Рассчитайте для каждой скважины (технические реплики для каждого условия) кратное изменение относительно ее значения в нулевой момент времени. Сгенерируйте соответствующие графики и оцените статистическую значимость с помощью соответствующего программного обеспечения.

9. Ранозаживляющий миграционный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь представлена автоматизированная версия классического скретч-анализа33 для измерения миграции клеток с использованием инструмента для анализа живых клеток.

  1. Планшет с опухолевыми клетками в 96-луночном планшете, пригодном для прибора для анализа живых клеток, позволяет получить сливающийся монослой.
  2. На следующий день обработайте клетки 10 мкг/мл митомицина С в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для предотвращения пролиферации клеток во время анализа, которая может исказить результаты.
  3. Нанесите царапину на лунки, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
  4. Промойте 100 мкл PBS для удаления оторвавшихся ячеек.
  5. Добавьте среду для голодания, в дозе 50 мг/мл или без (контроль).
  6. Поместите планшет в камеру для анализа живых клеток в инкубаторе.
  7. Через 30 минут запрограммируйте рекомендованный протокол сканирования заживления ран каждые 4 часа в течение 1 дня или дольше, в зависимости от клеток и условий.
  8. Анализируйте результаты в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).

10. Независимый от анкориджа рост методом анализа мягкого агара

  1. Планшеты CAF или NF при 70% слиянии в 12-луночных планшетах, оставляя три пустые лунки в качестве контроля.
  2. На следующий день приготовьте 4-кратный раствор мягкого агара (3,6%), добавив 0,45 г легкоплавкого агара к 12,5 мл PBS в конической пробирке объемом 50 мл в стерильных условиях.
  3. Растворить в микроволновой печи. Остерегайтесь чрезмерного кипячения, которое может привести к концентрации раствора.
  4. Остудите до 37 °C, затем приготовьте рабочий раствор 1x, разбавив 1:4 предварительно подогретым cDMEM.
  5. Отсадите среду из 12-луночного планшета и добавьте в каждую лунку по 500 мкл 1x раствора агара.
  6. Дайте ему застыть в течение 20 минут при температуре 4 °C, при этом оставшийся раствор агара будет храниться при температуре 37 °C.
  7. Тем временем трипсинизируйте опухолевые клетки и приготовьте клеточную суспензию в концентрации 2 x 104 клеток/мл.
  8. Смешайте равные объемы клеточной суспензии и раствора агара 1x путем многократного пипетирования и распределите 500 мкл (т.е. 5000 клеток) поверх первого слоя агара в каждой лунке. Убедитесь, что приготовили не менее 10% избытка клеточной суспензии.
  9. Дайте агару застыть, выдержав 20 минут при температуре 4 °C.
  10. Добавьте 1 мл cDMEM в каждую лунку и обновляйте его через день, осторожно отсасывая среду от края лунки и добавляя свежую среду к центру, почти по каплям, чтобы избежать смещения мягкого слоя агара.
  11. Инкубируйте до тех пор, пока не появятся легко заметные колонии. Клетки DU145 обычно занимают около 12 дней, с небольшими вариациями.
  12. Выбросьте среду и окрашивайте колонии, добавив 200 мкл раствора нитросинего тетразолия хлорида (1 мг/мл в PBS). Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе.
  13. После того, как колонии будут окрашены, выбросьте раствор красителя и получите изображения с помощью стереомикроскопа. Поместите пластину на предметный столик микроскопа и установите увеличение на минимальное значение (0,8x), чтобы убедиться, что вся лунка видна. Используйте ручку грубой фокусировки, чтобы сделать колонии более четкими, затем отрегулируйте освещение и настройки режима перед съемкой изображений.
  14. Используйте соответствующее программное обеспечение34 для количественного определения численности колонии и занимаемой территории, выполнив действия, описанные в Дополнительном файле 1.
  15. Оцените количество и распределение колоний по размерам (см. рисунок 4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Пары CAF и NF от 7 пациентов с РПЖ высокой степени злокачественности были успешно изолированы с помощью этого протокола. Возраст пациентов на момент операции и баллы по шкале Глисона обобщены в таблице 3. Для оценки чистоты полученных популяций фибробластов пассаж двух первичных CAF и NF отделяли и окрашивали указанными флуоресцентными антителами или йодидом пропидия для оценки апоптоза. Репрезентативные результаты последующего анализа FACS представлены на

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Получение и анализ клеток из ткани РПЖ обеспечивают соответствующую экспериментальную модель, особенно с учетом того, что имеющиеся животные модели не полностью воспроизводят анатомию предстательной железы человека ипрогрессирование заболевания. Предстательные железы шимпанзе анатомически похожи на человеческие, но демонстрируют медленное, стохастическое прогрессирование заболевания, в дополнение к этическим ограничениям. У собак значительно различаются по строени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Итальянской ассоциацией по исследованию рака (AIRC), IG16930 и IG24851 к В..; Министерство университетов и научных исследований Италии (MIUR PRIN 2017 и 2022 до V.P.); Фонд Трууса и Геррита ван Римсдейков, Лихтенштейн, пожертвование В..; Регион Пьемонт (Отклонение). А.С. был поддержан стипендией Итальянского фонда исследования рака (FIRC) для постдокторантуры, а Лос-Анджелес был поддержан Фондом Умберто Веронези. Рисунок 2 был создан с BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12-луночная пластинаСарштедт833921
24-луночный планшетСарштедт833922
6-луночная пластинаСарштедт833920
Планшет на 96 лунокСарштедт833924
Мышиный mAb с защитой от GAPDH (6C5)Сигма ОлдричКБ1001Источник: мышь; Разведение для WB: 1:1000
aSMAСигма ОлдричА5228 Источник: мышь; Разведение для WB: 1:3000
КавеолинТехнология сотовой сигнализацииCST3267Источник: Кролик; Разведение для WB: 1:1000
CD31-VioBlueМилтени Биотек130-119-980Проточная цитометрия Ab, маркер эндотелиальных клеток
CD326-PE (EpCAM)Милтени Биотек130113-826Проточная цитометрия Ab, маркер эпителиальных клеток
КД45-ФИТКМилтени Биотек130-110769Проточная цитометрия Ab, маркер пан-лейкоцитов
CD90-APCМилтени Биотек130-114-903Проточная цитометрия AB, маркер фибробластов
Коллаген VI (COL6A1)АбкамАБ182744Источник: Кролик; Разведение для WB: 1:1000
Коническая трубка 15 млСарштедт62554502
Коническая трубка 50 млСарштедт62547254
Cryopure 2 мл микропробиркиСарштедт72380992
Культуральная пластина диаметром 100 мм;Корнинг353003
Культуральная пластина диаметром 100 мм;Корнинг353025
Культуральная пластина диаметром 60 мм Корнинг353002
Диметилсульфоксид (ДМСО)Сигма АлдирхД8418Использование в биологической вытяжке
Дульбекко s Модифицированный Eagle' s Среда (DMEM)Gibco11965092Хранить при 4 °deg; C, использование в биологической вытяжке
ФАПАбкамАБ53066Источник: Кролик; Разведение для WB: 1:500
Реагент для блокировки FcR человекаМилтени Биотек130-059-901Блокирующий ФК
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco16000044Хранить при 4 °deg; C, использование в биологической вытяжке
Фильтрованные наконечники 10 & микро; LСарштедт703010255
Фильтрованные наконечники 100 & микро; LСарштедт703030255
Фильтрованные насадки 1000 & микро; LСарштедт703060255
Фильтрованные насадки 20 & микро; LСарштедт703030265
Фильтрованные наконечники 200 & микро; LСарштедт703031255
Фильтропур С Плюс 0,20 & микро; М Сарштедт831826102
Щипцы2Биол1102412
ФСП1/С100А4Технология сотовой сигнализацииД9Ф9Д (13018)Источник: Кролик; Разводнение для ВБ: 1:2000
ИЛ6Абклональная технологияА0286Источник: Кролик; Разведение для WB: 1:1000
ИзображениеJНациональный институт здравоохраненияВерсия 1.53cПрограммное обеспечение для анализа изображений
96-луночный планшет INCUCYTE ImageLockСарториусБА-04857
Инкуциты&рег. СХ5СарториусСХ5Прибор для анализа живых клеток 
Липофектамин 2000 Реагент для трансфекцииThermoFisher Scientific11668019катион-липид-опосредованный реагент для трансфекции
MACS® Решение для хранения тканейМилтени Биотек130-100-008
Считыватель микропланшетов (поглощение 600 нм)Компания PromegaГМ3500
Микропробирки 1,5 млСарштедт7269001
НкадАбкамАБ18203Источник: Кролик; Разведение для WB: 1:1000
Нитро Синий Тетразолиум Сигма АлдирхН5514
Парафильм Сигма АлдирхHS234526B
pBABE-puro-hTERTАдджен1771Хранить при -20 °deg; C, использование в биологической вытяжке
pCL-АмфоNovus Biological НБП2-29541Хранить при -20 °deg; C, использование в биологической вытяжке
ПДГФРБСанта-КрусСК-432Источник: Кролик; Разведение для WB: 1:1000
Пенициллин-стрептомицин (PS, 10 000 μ г/мл) Gibco15140122Хранить при 4 °deg; C, использование в биологической вытяжке
Фазово-контрастный микроскоп Олимп БХ42
Фосфатно-солевой буфер  (ПБС)СамодельныйNaCl, 137 мМ; KCl, 2,7 мМ; Na2HPO4, 10 мМ;KH2PO4, 1,8 мМ. Автоклав и хранение в РТ
Раствор поли-L-лизинаСигма АлдирхП8920Хранить при 4 °deg; C, использование в биологической вытяжке
Пуромицина дигидрохлоридСигма АлдирхП8833
Secura Semi Micro BalanceСарториусSECURA125-1С
Серологическая пипетка 10 мл&nbл;Сарштедт861254001
Серологическая пипетка 2 мл&nbл;Сарштедт861252001
Серологическая пипетка 25 мл Сарштедт861256001
Серологическая пипетка 5 мл Сарштедт861253001
СТАТ3САНТИСТОКС9139Источник: мышь; Разведение для WB: 1:1000
СТАТ3 У705САНТИСТОКС9131Источник: Кролик; Разведение для WB: 1:1000
СтереомикроскопЛейкаМЗ125
Шприц 10 млПентаферте00202260Д12
ТермомиксерЭппендорф22331
Трипсин-ЭДТА (0,5%), фенол красный не содержитGibco15400054
ЭнергияСанта-КрусСК-6260Источник: мышь; Разводнение для ВБ: 1:2000
Центробежный концентратор Vivaspin 20 Сигма АлдирхZ614602MWCO 10,000 Da 
Ножницы Вагнера2Биол14070-12

Ссылки

  1. Bray, F. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (6), 229-263 (2024).
  2. Yadav, S. S., Stockert, J. A., Hackert, V., Yadav, K. K., Tewari, A. K. Intratumor heterogeneity in prostate cancer. Urol Oncol. 36 (8), 349-360 (2018).
  3. Owen, J. S., Clayton, A., Pearson, H. B. Cancer-associated fibroblast heterogeneity, activation and function: Implications for prostate cancer. Biomolecules. 13 (1), 67(2023).
  4. Ge, R., Wang, Z., Cheng, L. Tumor microenvironment heterogeneity an important mediator of prostate cancer progression and therapeutic resistance. NPJ Precis Oncol. 6, 1-8 (2022).
  5. Pejčić, T., Todorović, Z., Đurašević, S., Popović, L. Mechanisms of prostate cancer cells survival and their therapeutic targeting. Int J Mol Sci. 24 (3), 2939(2023).
  6. Shoag, J., Barbieri, C. Clinical variability and molecular heterogeneity in prostate cancer. Asian J Androl. 18 (4), 543-548 (2016).
  7. Segura-Moreno, Y. Y., Sanabria-Salas, M. C., Varela, R., Mesa, J. A., Serrano, M. L. Decoding the heterogeneous landscape in the development of prostate cancer. Oncol Lett. 21 (5), 376(2021).
  8. Hägglöf, C., Bergh, A. The stroma-a key regulator in prostate function and malignancy. Cancers (Basel. 4 (2), 531-548 (2012).
  9. Teng, L. K. H., et al. Mast cell-derived SAMD14 is a novel regulator of the human prostate tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13 (6), 1-25 (2021).
  10. Galbo, P. M., Zang, X., Zheng, D. Molecular features of cancer-associated fibroblast subtypes and their implication on cancer pathogenesis, prognosis, and immunotherapy resistance. Clin Cancer Res. 27 (9), 2636-2647 (2021).
  11. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 1-30 (2021).
  12. Pederzoli, F., et al. Stromal cells in prostate cancer pathobiology: Friends or foes. Br J Cancer. 128 (6), 930-939 (2022).
  13. Sasaki, T., Franco, O. E., Hayward, S. W. Interaction of prostate carcinoma-associated fibroblasts with human epithelial cell lines in vivo. Differentiation. 96, 40-48 (2017).
  14. Cirri, P., Chiarugi, P. Cancer-associated fibroblasts, and tumor cells: A diabolic liaison driving cancer progression. Cancer Metastasis Rev. 31 (1-2), 195-208 (2012).
  15. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: A dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
  16. Kahounová, Z. The fibroblast surface markers FAP, anti-fibroblast, and FSP are expressed by cells of epithelial origin and may be altered during epithelial-to-mesenchymal transition. Cytometry A. 93 (9), 941-951 (2018).
  17. Giannoni, E., et al. Reciprocal activation of prostate cancer cells and cancer-associated fibroblasts stimulates epithelial-mesenchymal transition and cancer stemness. Cancer Res. 70 (17), 6945-6956 (2010).
  18. Paland, N., et al. Differential influence of normal and cancer-associated fibroblasts on the growth of human epithelial cells in an in vitro cocultivation model of prostate cancer. Mol Cancer Res. 7 (8), 1212-1235 (2009).
  19. Jaeschke, A., et al. Cancer-associated fibroblasts of the prostate promote a compliant and more invasive phenotype in benign prostate epithelial cells. Mater Today Bio. 8, 100073(2020).
  20. Ellem, S. J., et al. A pro-tumourigenic loop at the human prostate tumor interface orchestrated by oestrogen, CXCL12 and mast cell recruitment. J Pathol. 234 (1), 86-98 (2014).
  21. Lawrence, M. G., et al. Alterations in the methylome of the stromal tumor microenvironment signal the presence and severity of prostate cancer. Clin Epigenetics. 12 (1), 48(2020).
  22. Nguyen, E. V. Proteomic profiling of human prostate cancer-associated fibroblasts (CAF) reveals LOXL2-dependent regulation of the tumor microenvironment. Mol Cell Proteomics. 18 (7), 1410-1427 (2019).
  23. Smith, M. C., Goddard, E. T., Perusina Lanfranca, M., Davido, D. J. hTERT extends the life of human fibroblasts without compromising type I interferon signaling. PLoS One. 8 (3), e58233(2013).
  24. Kay, E. J., et al. Cancer-associated fibroblasts require proline synthesis by PYCR1 for the deposition of pro-tumorigenic extracellular matrix. Nat Metab. 4 (6), 693-710 (2022).
  25. Huynh, L. M., Ahlering, T. E. Robot-assisted radical prostatectomy: A step-by-step guide. J Endourol. 32, S28-S32 (2018).
  26. Srigley, J. R., et al. Protocol for the examination of specimens from patients with carcinoma of the prostate gland with guidance from the CAP Cancer and CAP Pathology Electronic Reporting Committees. , https://documents.cap.org/protocols/cp-prostate-2017-v4020.pdf (2017).
  27. Goldblum, J. R., Lamps, L. W., McKenney, J. K. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology E-Book. , https://books.google.it/books/about/Rosai_and_Ackerman_s_Surgical_Pathology.html?id=7ZEDwAAQBAJ (2024).
  28. Montironi, R., Beltran, A. L., Mazzucchelli, R., Cheng, L., Scarpelli, M. Handling of radical prostatectomy specimens: Total embedding with large-format histology. Int J Breast. 2012, (2012).
  29. Arcega, R. S., Woo, J. S., Xu, H. Performing and cutting frozen sections. Methods Mol Biol. 1897, 279-288 (2019).
  30. IARC. WHO Classification of Tumors, 5th edition, volume 8: Urinary and male genital tumors. , https://www.iarc.who.int/news-events/who-classification-of-tumours-5th-edition-volume-8-urinary-and-male-genital-tumours/ (2025).
  31. Sfanos, K. S., et al. If this is true, what does it imply? How end-user antibody validation facilitates insights into biology and disease. Asian J Urol. 6 (1), 10-25 (2019).
  32. Brennen, W. N., et al. Overcoming stromal barriers to immuno-oncological responses via fibroblast activation protein-targeted therapy. Immunotherapy. 13 (2), 155-175 (2021).
  33. Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. R., Propper, C. R., Kellar, R. S. In vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration. J Vis Exp. (133), e58838(2019).
  34. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  35. Sauzay, C., Voutetakis, K., Chatziioannou, A. A., Chevet, E., Avril, T. CD90/Thy-1, a cancer-associated cell surface signaling molecule. Front Cell Dev Biol. 7, 444743(2019).
  36. True, L. D., et al. CD90/THY1 is over-expressed in prostate cancer-associated fibroblasts and could serve as a cancer biomarker. Mod Pathol. 23 (10), 1346(2010).
  37. Strand, D. W., Aaron, L. T., Henry, G., Franco, O. E., Hayward, S. W. Isolation and analysis of discreet human prostate cellular populations. Differentiation. 91 (4-5), 139(2015).
  38. Krönig, M., et al. Cell type-specific gene expression analysis of prostate needle biopsies resolves tumor tissue heterogeneity. Oncotarget. 6 (2), 1302-1314 (2014).
  39. Goldstein, A. S., et al. Purification and direct transformation of epithelial progenitor cells from primary human prostate. Nat Protoc. 6 (5), 656-667 (2011).
  40. Kassen, A., et al. Stromal cells of the human prostate: Initial isolation and characterization. Prostate. 28 (2), 89-97 (1996).
  41. Linxweiler, J., et al. Cancer-associated fibroblasts stimulate primary tumor growth and metastatic spread in an orthotopic prostate cancer xenograft model. Sci Rep. 10 (1), 12575(2020).
  42. Liu, A. Y., et al. Cell-cell interaction in prostate gene regulation and cytodifferentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10705-10710 (1997).
  43. Olumi, A., et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Res. 59 (19), 5002(1999).
  44. Luthold, C., Hallal, T., Labbé, D. P., Bordeleau, F. The extracellular matrix stiffening: A trigger of prostate cancer progression and castration resistance. Cancers (Basel). 14 (12), 2887(2022).
  45. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  46. Yun, Y. R., et al. Fibroblast growth factors: Biology, function, and application for tissue regeneration. J Tissue Eng. 1 (1), 1-18 (2010).
  47. Baranyi, U., et al. Primary human fibroblasts in culture switch to a myofibroblast-like phenotype independently of TGF beta. Cells. 8 (7), 721(2019).
  48. Ortiz-Otero, N., et al. Cancer-associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи