Методическая статья

Ампликонное секвенирование с использованием технологий длинносчитывательского секвенирования

DOI:

10.3791/68370

⸱

29 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Science and Innovation - National Research Foundation Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был оптимизирован для целенаправленного глубокого секвенирования 18 областей лекарственной устойчивости у Mycobacterium tuberculosis с использованием платформы длинного секвенирования с последующим анализом с помощью биоинформатики, специфичной для туберкулеза, разработанной для длинных данных.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) продолжает подчеркивать настоятельную необходимость в быстром, экономически эффективном и удобном для пользователя методе диагностики туберкулеза (ТБ) и лекарственно-устойчивого туберкулеза (ЛУ-ТБ). Технологии секвенирования нового поколения (NGS), одобренные ВОЗ, значительно улучшили выявление лекарственно-устойчивого туберкулеза. Среди них таргетная NGS (tNGS) позволяет целенаправленно выявлять генетические мутации, связанные с лекарственной устойчивостью, устраняя необходимость в традиционной диагностике на основе культур. Один из широко используемых анализов tNGS обеспечивает быстрое и всестороннее тестирование чувствительности к лекарственным препаратам, но в первую очередь оптимизирован для платформ секвенирования с высокой точностью. Однако высокая стоимость этих систем секвенирования ограничивает их доступность в странах с низким и средним уровнем дохода, особенно в Африке. Портативные технологии секвенирования представляют собой многообещающую альтернативу, обеспечивающую гибкость и сниженные требования к инфраструктуре. В этом исследовании ДНК была экстрагирована из резистентных к рифампицину изолятов ТБ (RR-TB), амплифицирована с помощью анализа tNGS и секвенирована на портативной платформе для секвенирования. Те же продукты амплификации были секвенированы на высокоточной платформе секвенирования с коротким чтением, которая служила в качестве эталона. Данные с портативного секвенатора обрабатывались с помощью биоинформатического конвейера, предназначенного для длинного секвенирования, в то время как данные короткого чтения анализировались с помощью установленного веб-приложения. Анализ показал, что подход к длинному секвенированию успешно идентифицировал высокочастотные варианты, связанные с резистентностью, обнаруженные с помощью короткого секвенирования, но продемонстрировал ограничения в обнаружении низкочастотных вариантов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Туберкулез (ТБ) продолжает оставаться одной из основных причин смертности во всем мире и представляет собой постоянную проблему общественного здравоохранения, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода 1,2. Несмотря на инициативы, направленные на усиление мер по борьбе с туберкулезом, прогресс был медленным, отчасти из-за трудностей в достижении быстрых, точных, экономически эффективных и комплексных методов диагностики 3,4,5. В то время как методы молекулярной диагностики, такие как линейные зондовые анализы (LPA) и автоматизированные тесты амплификации нуклеиновых кислот (NAATs), ускорили идентификацию туберкулеза и лекарственно-устойчивого туберкулеза (ЛУ-ТБ), их ограниченное обнаружение мутаций ограничивает тщательное тестирование на лекарственную чувствительность (DST). Это ограничение особенно значимо в странах с высоким бременем туберкулеза 6,7,8,9.

Для устранения этих ограничений Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендовала использовать технологии секвенирования нового поколения (NGS), которые стали мощными инструментами для эпиднадзора за туберкулезом и выявления устойчивости кнему10,11. Оба подхода к секвенированию всего генома (WGS) и таргетному NGS (tNGS) обеспечивают более широкий охват мутаций, позволяя идентифицировать варианты, связанные с резистентностью, в нескольких препаратах 8,12,13,14,15. В то время как секвенирование всего генома (WGS) предоставляет исчерпывающий отчет о летнем времени, его зависимость от культуры делает его непригодным для быстрой диагностики, поскольку культивирование может занять до шести недель 15,16,17. Целевой NGS предлагает лучшую альтернативу, поскольку он не зависит от культуры; Секвенирование может быть выполнено непосредственно из клинических образцов18. В результате, ВОЗ рекомендовала использовать три теста tNGS для DST: Анализ Deeplex Myc-TB: Этот анализ выявляет устойчивость к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, аминогликозидам (амикацину, канамицину, капреомицину), этамбутолу, пиразинамиду и этионамиду 19,20,21. Тест Sentinel TB: Он нацелен на устойчивость к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам и инъекционным препаратам второго ряда18,20. Анализ AQ-TB: Он выявляет устойчивость к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам и инъекционным препаратам второго ряда. Эти анализы были оптимизированы для использования на платформе короткого считывания благодаря ее высокойточности20. Платформы лонгридов ONT MinION, с другой стороны, обеспечивают данные в режиме реального времени, портативность и потенциал для экономически эффективного внедрения22,23. Тем не менее, широкое использование секвенальной кислотности ограничено требованиями инфраструктуры и стоимостью, особенно в системах краткого чтения10.

Анализ Deeplex является наиболее полным из трех рекомендованных анализов. Первоначально анализ был разработан для проведения мультиплексной ПЦР на 18 участках, связанных с устойчивостью к 13 противотуберкулезным препаратам. Тем не менее, ВОЗ рекомендовала его для 10 противотуберкулезных препаратов, указав на достаточную чувствительность и специфичность. В этом исследовании он был оптимизирован для использования с ONT MK1B MinION, платформой для длинного секвенирования. Портативная и многоразовая система проточных ячеек этой платформы снижает как инфраструктуру, так и потенциальные затраты на секвенирование в расчете на один образец 4,22,23. Несмотря на то, что были разработаны другие тесты, совместимые с длинными чтениями, они, как правило, имеют ограниченную область применения DST, обычно нацеливаясь только на узкий диапазон генов резистентности. В отличие от этого, анализ предлагает широкий охват мишеней, что делает его более комплексным диагностическим инструментом для децентрализованного перехода на летнее время24,25. Подробный список геномных мишеней, амплифицированных с помощью анализа, и соответствующих им ассоциаций лекарств представлен в таблице 1, подчеркивая диагностические возможности анализа25.

Перед экстракцией ДНК образцы должны быть обеззаражены и инактивированы в условиях уровня биобезопасности 3 (BSL-3) с соблюдением необходимых мер предосторожности 25,26,27. Внутреннее усиление и внешний контроль должны быть включены в каждый прогон, при этом загрязнение должно отслеживаться с помощью негативного контроля и регулярных лабораторных оценок25. После секвенирования следует оценить важные показатели качества, включая глубину чтения, ширину охвата и успех амплификации. Для таргетного секвенирования ВОЗ рекомендует минимальную глубину считывания в 100 раз для каждого ампликона и достаточный охват всех целевых областей лекарственной устойчивости, чтобы обеспечить обнаружение незначительных вариантов, присутствующих на уровне ≥5%28. Всемирная организация здравоохранения одобряет эти целевые методы секвенирования для выявления устойчивости к препаратам первого и второго ряда, при условии, что будут созданы системы обеспечения качества и что все целевые регионы будут в достаточной степени охвачены.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было проведено в рамках проекта TS ELiOT, который получил этическое одобрение Комитета по этике исследований человека (HREC) Стелленбошского университета (N21/09/093) 20 октября 2021 года. Кроме того, она получила разрешение от Western Cape Health Research на использование государственных учреждений. Образцы были собраны в рамках совместных усилий NHLS Green Point и Стелленбошского университета под номером одобрения SU HREC N09/11/296. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Подготовка образцов

  1. Инактивация тепла
    1. Инкубируйте культуры MGIT при 80 °C в течение 1 ч для достижения полной тепловой инактивации в условиях BSL-3.
    2. Приступайте к экстракции ДНК методом InstaGene29.
  2. Экстракция ДНК
    1. Поместите 5 мл термоинактивированной культуры MGIT в пробирку объемом 15 мл.
    2. Центрифуга при 4000 х г в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
    3. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования, оставив осадок.
    4. Добавьте в осадок 200 мкл реагента для экстракции ДНК на основе хелатирования и инкубируйте при температуре 56 °C в течение 15 минут.
    5. Перелейте раствор в пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 2 мл и добавьте в каждую по три стеклянных шарика диаметром 2 мм.
    6. Вихрь в течение 10 с развести ячейки и поместить трубки в сухую ванну-инкубатор при температуре 100 °С на 8 мин.
    7. Гомогенизацию образцов с помощью гомогенизатора для взбивания валиков со следующими настройками: 3 цикла по 20 с со скоростью 4,0 м/с.
    8. Центрифугируйте при 12 000 x g в течение 15 мин при RT и осторожно перенесите 130 мкл надосадочной жидкости (жидкости, содержащей ДНК) в пробирку объемом 1,5 мл, избегая осадка и мусора.
    9. Повторно суспензируйте бусины путем щелканья или вортекса и добавьте 156 мкл бусин в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую извлеченную ДНК.
    10. Медленно пипеткой вверх и вниз 10 раз, чтобы перемешать и инкубировать при RT в течение 5 минут.
    11. Поместите пробирки на магнитный штатив на 5 минут, чтобы отделить шарики, связанные с ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Над компактной гранулой темных магнитных шариков на боковой стороне трубки, обращенной к магниту, должна появиться прозрачная надосадочная жидкость, указывающая на готовность к удалению надосадочной жидкости.
    12. Отпижите надосадочную жидкость, не потревожив шарики.
    13. Добавьте 100 μл свежеприготовленного 80% этанола в гранулу гранул, находясь на решетке, и оставьте на 30 секунд, затем удалите этанол. Повторите шаг стирки.
    14. Высушите гранулу шарика на воздухе при температуре RT в течение 5 минут. Убедитесь, что гранула шарика выглядит матовой и не осталось видимой жидкости, прежде чем переходить к следующему шагу.
    15. Снимите трубку с магнитной решетки.
    16. Добавьте 25 μL воды, не содержащей нуклеаз (NFW) непосредственно в высушенные гранулы и повторно суспендируйте, осторожно пипетируя вверх и вниз 10 раз.
    17. Инкубировать при RT в течение 5 минут.
    18. Верните трубку на магнитную решетку еще на 5 минут.
    19. Осторожно перенесите элюированную ДНК (надосадочную жидкость) в новую пробирку объемом 1,5 мл.
    20. Измерьте концентрацию ДНК с помощью высокочувствительного реагента для количественного определения дцДНК на основе флуоресценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК можно хранить в морозильной камере при температуре -20 °C или проводить ПЦР.
  3. Амплификация (ПЦР)
    1. Мультиплексная ПЦР и очистка после ПЦР в соответствии с инструкциями производителя25.
    2. Измерьте концентрацию ДНК с помощью высокочувствительного реагента для количественного определения дцДНК на основе флуоресценции.
  4. Гель-электрофорез
    1. Приготовьте 2% агарозный гель, растворив порошок агарозы в 1x буфере TAE через микроволновый нагрев до полного расплавления.
    2. Добавьте 5 мкл нетоксичного флуоресцентного гелевого красителя ДНК в расплавленную агарозу и тщательно перемешайте.
    3. Вылейте гелевую смесь в лоток для литья геля, оснащенный гребнем, чтобы сформировать лунки.
    4. Дайте гелю застыть при RT.
    5. После затвердевания снимите расческу и поместите лоток для геля в резервуар для электрофореза, заполненный 1x буфером TAE.
    6. Загрузите в первую лунку 5 мкл трапа ДНК kb, смешанного с 5 мкл загрузочного буфера.
    7. Для каждого продукта ПЦР смешайте 5 μL продукта с 5 μL загрузочного буфера и загрузите в отдельные лунки.
    8. Запустите гель при напряжении 100 В в течение 1 часа.
    9. Визуализируйте полосы ДНК с помощью системы документирования геля с трансиллюминацией.

2. Подготовка библиотеки ONT

  1. Конечная подготовка
    1. Рассчитайте 100 нг каждого образца ампликона в зависимости от концентрации и переложите необходимый объем в чистую ПЦР-пробирку.
    2. Чтобы рассчитать общую массу (в нг) ампликонов в данном образце, умножьте концентрацию образца (нг/мкл) на его оставшийся объем (мкл) после контроля качества (КК).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если образец имеет концентрацию 2 нг/мкл и остаточный объем 1 мкл после контроля качества, общая масса ампликона составляет:
      Общая масса = 2 нг/мкл × 1 мкл = 45 нг
      Чтобы приготовить 10 нг ампликонов для секвенирования, используйте формулу разведения:
      C1V1 = C2V2
      Где: C1 = 45 нг, V1 = неизвестно, C2 = 10 нг, V2 = 1 мкл, V1 = (C2 × V2) / C1 = (10 нг × 1 мкл) / 45 нг = мкл
      Таким образом, μL исходного образца ампликона должен быть использован для получения 10 нг ДНК для секвенирования.
    3. Отрегулируйте общий объем каждого образца до 12,5 мкл с помощью NFW.
    4. Аккуратно перемешайте образцы, пипетируя вверх и вниз 10 раз, и коротко отверните.
    5. Добавьте в каждый образец 1,75 мкл реакционного буфера для эндрепарации и А-хвоста и 0,75 мкл смеси ферментов endrepair и A-tailing.
    6. Тщательно перемешайте пипеткой вверх и вниз 10 раз и кратковременно открутите.
    7. Инкубируйте пробирки в амплификаторе при температуре 25 °C в течение 30 минут, а затем при 65 °C в течение 30 минут.
      Примечание: На этом этапе, если пользователь решит прекратить процесс, рекомендуется использовать гранулы для очистки ДНК, подготовленной к концу. Затем очищенную ДНК можно хранить при температуре 4 °C в течение максимум семи дней.
  2. Нативное лигирование штрих-кодов
    1. Разморозьте и подготовьте магнитные шарики для очистки и выбора размера ДНК, парамагнитные бусины для очистки ДНК, ЭДТА И НАТИВНЫЕ ШТРИХ-КОДЫ (NB01-96) в соответствии с инструкциями производителя, а затем поместите их на лед.
    2. В новые пробирки для ПЦР добавьте в последовательности: 2,75 мкл воды, не содержащей нуклеаз, 1 мкл ДНК, 1,25 мкл нативных штрих-кодов (NB01-96) и 5 мкл смеси ферментов лигирования ДНК.
    3. Перемешайте каждую реакцию с помощью пипетирования 10 раз, кратковременно открутите с помощью микроцентрифуги и инкубируйте в течение 20 минут при RT.
    4. Добавьте 1 мкл ЭДТА в каждую лунку, тщательно перемешайте с помощью пипетирования и коротко отверните.
    5. Образцы со штрих-кодами в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    6. Повторно суспендируйте бусины для очистки ДНК путем вортексирования и добавьте в 0,7 раза больше общего объема объединенного образца (например, для 23 образцов общим объемом 253 мкл добавьте 177,1 мкл шариков).
    7. Смешайте раствор с помощью пипетирования и инкубируйте на HulaMixer в течение 10 минут при RT.
    8. Приготовьте 2 мл 80% этанола, смешав 1600 мкл чистого этанола с 400 мкл NFW.
    9. Поместите пробирку на магнитную решетку на 5 минут, пока элюат не станет прозрачным и бесцветным.
    10. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы.
    11. Промойте шарики свежеприготовленным 80% этанолом объемом 700 μл, не повреждая гранулы, затем удалите и выбросьте этанол.
    12. Повторите этап промывки этанолом.
    13. Кратковременно центрифугируйте пробирку, вернитесь на магнитную решетку и удалите остатки этанола.
    14. Дайте бусинам высохнуть на воздухе в течение 30 секунд.
    15. Извлеките трубку из магнитного штатива, осторожно взбейте шарики в воде, не содержащей нуклеаз, объемом 35 μL и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 10 минут.
    16. Верните трубку на магнитный штатив до тех пор, пока элюат не станет прозрачным и бесцветным.
    17. Перелейте 35 мкл элюата в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для последующих этапов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе библиотека может храниться при температуре 4 °C в течение ночи.
  3. Перевязка и очистка адаптера
    1. Подготовьте набор реагентов для быстрого лигирования ДНК в соответствии с инструкцией производителя и положите его на лед.
    2. Смешайте нативный адаптер (NA) и Quick Ligase с помощью пипетирования, затем положите на лед.
    3. Разморозьте элюирующий буфер (EB) на RT, vortex, центрифуге и поместите его на лед.
    4. Разморозьте буфер коротких фрагментов (SFB) в RT, вихре, центрифуге и поместите на лед.
    5. В микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл с низким связыванием смешайте следующее: 30 мкл объединенного образца со штрих-кодом, 5 мкл нативного адаптера (NA), 10 мкл буфера для быстрой реакции лигирования и 5 мкл быстродействующей T4 ДНК-лигазы.
    6. Аккуратно перемешайте пипеткой, кратковременно центрифугируйте и инкубируйте в течение 20 минут при RT.
    7. Повторно суспендируйте шарики очистки ДНК с помощью вортексирования и добавьте 20 μL (0,4x) гранул в реакцию.
    8. Аккуратно перемешайте с помощью пипетирования и инкубируйте на HulaMixer в течение 10 минут при RT.
    9. Раскатайте шарики на магнитном штативе и аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая гранулу.
    10. Промойте шарики, добавив 125 μл буфера коротких фрагментов (SFB), повторно суспендируйте путем перелистывания, кратковременно центрифугируйте и верните на магнитную стойку.
    11. Гранулировать шарики и аспирировать надосадочную жидкость; Повторите этап стирки один раз.
    12. Кратковременно центрифугируете, верните пробирку на магнитный штатив и отасуньте остаточную надосадочную жидкость.
    13. Извлеките трубку из магнитного штатива и снова суспендируйте шарики в 15 μл элюирующего буфера (EB).
    14. Кратковременно центрифугируйте и инкубируйте при 37 °C в течение 10 минут для элюирования ДНК.
    15. Поместите пробирку на магнитный штатив, гранулируйте шарики до тех пор, пока элюат не станет прозрачным и бесцветным, и отасуньте 15 мкл элюата в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    16. Количественно оцените 1 мкл элюата.
    17. Разбавьте библиотеку до 20 фмоль (рассчитайте с помощью калькулятора NEB) и используйте 12 мкл из подготовленной библиотеки 20 фмоль для секвенирования на проточной ячейке R10.4.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Библиотека теперь может храниться при температуре -20 °C, что позволяет использовать ее многократно.
  4. Грунтовка и загрузка проточной ячейки для секвенирования нанопор
    1. Разморозьте буфер секвенирования (SB), библиотечные бусины (LIB), проточный ячеек Tether (FCT) и промывку проточных ячеек (FCF) в RT, смешайте их с помощью вортекса и уменьшите вращение.
    2. Приготовьте смесь для прайминга проточных ячеек, смешав 5 мкл бычьего сывороточного альбумина (BSA, 50 мг/мл), 30 мкл проточного ячеистого троса (FCT) и 1170 мкл промывки проточных ячеек (FCF), перемешав раствор путем инверсии и пипетирования.
    3. Откройте заливное отверстие проточной ячейки, аспирируйте ~20 μL буфера для удаления пузырьков воздуха, загрузите 800 μL грунтовочной смеси в заливное отверстие без введения пузырьков воздуха и подождите 5 минут.
    4. Приготовьте библиотеку, смешав 37,5 мкл секвенирующего буфера (SB), 25,5 мкл библиотечных бусин (LIB) или библиотечного раствора (LIS) и 12 мкл 20 фмоль библиотеки ДНК в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, тщательно перемешав пипетированием.
    5. Снова подготовьте проточную ячейку, осторожно приподняв крышку отверстия для отбора проб проточной ячейки, загрузив 200 мкл грунтовочной смеси в отверстие для заливки без образования пузырьков воздуха, и подготовив библиотеку к загрузке.
    6. Аккуратно перемешайте подготовленную библиотеку с помощью пипетирования и загрузите 75 мкл библиотеки в отверстие для отбора проб проточной ячейки секвенирования по каплям, следя за тем, чтобы каждая капля стекала в порт перед добавлением следующей.
    7. Закройте крышку отверстия для отбора проб проточной ячейки, убедившись, что продувочная ячейка входит в отверстие для отбора проб, затем закройте заливное отверстие.
    8. Подключите портативное устройство для секвенирования к компьютеру (с источником бесперебойного питания) и запустите секвенирование с помощью программного обеспечения для управления и анализа секвенирования.
  5. Параметры программного обеспечения
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это программное приложение, разработанное компанией ONT, используется для комплексного управления прогонами секвенирования и создания подробных отчетов.
    1. Чтобы начать процесс секвенирования, выберите опцию Начать , а затем Начать секвенирование.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Затем вам будет предложено назначить папку для хранения файлов и указать имя для выполнения секвенирования, например, «sequencing_run_1». После этого нажмите « Перейти к настройкам », чтобы выбрать подходящее имя комплекта, например, library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96, и настройте желаемое время выполнения, например, 20 часов (максимальное время выполнения — 72 часа).
    2. Затем выберите тип выходного файла, выбрав один из вариантов, таких как POD5 для чтения необработанных выходных данных и FASTQ для выходных данных basecalled. Затем выберите модель FAST-Basecalling.
    3. Обратите внимание, что некоторые из настроек по умолчанию включают частое сканирование пор каждые 1,5 часа, минимальную длину считывания 200.о. и минимальную оценку качества 8. Наконец, проверьте настройки и начните процесс чтения.

3. Анализ после секвенирования

  1. Требования к системе
    ПРИМЕЧАНИЕ: Руководство по настройке среды и анализу данных секвенирования ампликонов Mycobacterium tuberculosis с помощью конвейера ONT-TB-NF. Инструкции предназначены как для пользователей Windows (через WSL), так и для macOS.
    1. Используйте следующую операционную систему: Windows 10/11 (с WSL2) или macOS; Память: минимум 8 ГБ ОЗУ (рекомендуется 16 ГБ); Место на диске: не менее 50 ГБ свободного места на диске; Интернет: требуется для загрузки пакетов и данных; Разрешения: возможность установки программного обеспечения и управления средами.
  2. Убедитесь, что среда настроена следующим образом: Пользователи Windows (с использованием WSL2). Включите WSL2.
    1. Откройте PowerShell от имени администратора и выполните: wsl - install.
    2. Перезагрузите компьютер при появлении соответствующего запроса.
  3. Установка Ubuntu
    1. После перезагрузки запустите Microsoft Store, найдите Ubuntu и установите предпочитаемую версию (например, Ubuntu 22.04 LTS).
    2. Запустите Ubuntu из меню «Пуск ».
    3. Создайте новое имя пользователя и пароль UNIX при появлении запроса.
    4. Списки пакетов обновлений: sudo apt update & & sudo apt upgrade -y.
  4. Пользователи macOS
    1. Установите Homebrew (если он еще не установлен): /bin/bash -c "$(curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh)".
    2. Установите необходимые пакеты: brew install git wget
  5. Установка Conda или Mamba
    1. Посетите страницу загрузки Miniconda , чтобы загрузить правильный установщик для операционной системы.
    2. Чтобы установить Miniconda, запустите установщик и следуйте инструкциям на экране. После завершения установки перезагрузите терминал.
    3. Настройка каналов Conda:
      conda config --add channels defaults
      conda config --add channels bioconda
      conda config --add channels conda-forge
    4. Установка Mambaforge (Mamba)
      Для Linux:
      wget
      https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh
      Для macOS:
      wget https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh
    5. Установите Mambaforge: bash Mambaforge-*.sh
    6. Следуйте инструкциям, чтобы завершить установку, и перезагрузите терминал, чтобы активировать Mamba.
  6. Настройка конвейера ONT-TB-NF
    1. Создайте новую среду Conda: conda create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    2. В качестве альтернативы используйте Mamba: mamba create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    3. Активируйте окружающую среду: conda activate ont_tb_env
    4. Установите Nextflow: curl -s https://get.nextflow.io | bash, sudo mv nextflow /usr/local/bin/
    5. Клонирование репозитория ONT-TB-NF: GIT CLONE https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git
      cd ONT-TB-NF
    6. Извлечение необходимых образов Docker (при использовании Docker)
      Docker pull hkubal/clair3:v0.1-r12
      Docker pull quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0
  7. Запуск конвейера
    1. Объедините файлы Basecalled FASTQ каждого сэмпла независимо друг от друга с помощью следующей команды.
      кошка *.fastq.gz > concatenated.fastq.gz
      NextFlow запустить run_tb_amplicon.nf \
      read_fq /путь/к/concatenated.fastq.gz \
      sample_name SAMPLE_ID \
      amplicon_bed /путь/к/amplicon_regions.bed\
      нитки 16 \
      output_dir /абсолют/путь/к/output_directory
  8. Выходные файлы и интерпретация
    1. После успешного выполнения убедитесь, что конвейер генерирует следующие выходные данные в указанном каталоге вывода:
      1. Выровненные чтения: файлы *.bam.
      2. Вызовы вариантов: *.vcf файлы, содержащие SNP и indel.
      3. Сводные отчеты: файлы *.csv или *.tsv, обобщающие мутации лекарственной устойчивости и другие соответствующие показатели.
      4. Отчеты о контроле качества: файлы *.htmL, созданные с помощью таких инструментов, как MultiQC.
      5. Logs: Подробные логи выполнения конвейера.
      6. Промежуточные файлы: Хранятся в директории work/ (могут быть удалены после успешного запуска).
        ПРИМЕЧАНИЕ: В случае возникновения ошибок с разрешениями, важно убедиться, что у вас есть необходимые разрешения на чтение и запись файлов, а также на выполнение скриптов. Что касается экологических вопросов, пожалуйста, убедитесь, что соответствующая среда Conda активирована перед запуском трубопровода. Для тех, кто использует профили Docker, крайне важно убедиться, что Docker установлен и работает. Кроме того, необходимо тщательно следить за системными ресурсами, чтобы избежать любых ограничений памяти или хранилища во время выполнения. Обзор этих методологий представлен на рисунке 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выбранный метод экстракции ДНК был выбран из-за его эффективности и превосходного выхода по сравнению с другими быстрыми методами. Она стабильно производила высококачественную геномную ДНК (гДНК), а интеграция этапа очистки на основе гранул помогла свести к минимуму время обработки при одновременном снижении затрат на образец. Это было достигнуто за счет устранения необходимости в дополнительных оценках контроля качества, таких как спектрофотометрические измерения, при этом флуориметрия ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Платформа длинного секвенирования продемонстрировала заметные преимущества в этом исследовании, в частности, ее способность достигать быстрого секвенирования с неизменно высокой шириной охвата. Для всех успешно секвенированных изолятов была достигнута широта охвата в 99,9%, что указывает на почти полную репрезентацию геномных областей, ассоциированных с резистентностью. Средняя глубина охвата по всем целевым генам составила 4462X, при этом ген eis показал наибольшую глубину — 22...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы выразить нашу искреннюю благодарность Центру по борьбе с туберкулезом SAMRC при Университете Стелленбоша за предоставление необходимых ресурсов и средств. Мы также глубоко признательны компании TS ELiOT Study за предоставление образцов, которые были неотъемлемой частью этого исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
15 мл & 1,5 мл или 2 мл ло-связывающие трубкиЭппендорфEP0030108051-250EA
Лестница 1 КБТермо Фишер СайентификSM0311
Трубки с крышками на 2 млScientific Specialties IncP2TUB056C-0001.5ST
Стерильные стеклянные бусины диаметром 2 ммСигма-ОлдричZ273627-1EA
AMPure XP BeadБекман КолтерA63881
Deeplex Myc-TB GenoScreen20090205
Камера электрофорезаТермо Фишер СайентификA25977
Этиловый спирт, чистыйСигма-ОлдричE7023-500ML
Гомогенизатор FastPrepMP Biomedicals116005500
Фильтрующие наконечники пипеток (10 & micro; L) Bio-Smart ScientificFT-10-R
Наконечники фильтрующих пипеток (1000 & micro; L) Bio-Smart ScientificFT-1000-R
Наконечники фильтрующих пипеток (20 & micro; L) Bio-Smart ScientificFT-20-R
Наконечники фильтрующих пипеток (200 & micro; L) Bio-Smart ScientificFT-200-R
Flow-cell Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114
Нагревательный блокЭппендорф5382000031
Матрица InstaGeneБио-РадBBRD7326030
Magnetic Rack Thermo Fisher Scientific 12321D
МикроцентрифугаEppendorf 5406000046
МиньонOxford Nanopore TechnologiesMK1B
Набор для нативного штрихкодирования V14 Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24
Мастер-микс NEB Blunt/TA LigaseКЛЮВM0367
Модуль быстрого лигирования NEBNextКЛЮВE6056
NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing ModuleКЛЮВE7546
Вода без нуклеазы (NFW)Термо Фишер СайентификAM9937
Пипетки (P10, P20, P200 и P1000)ЭппендорфEP3123000918-1EA
Трубки для анализа кубитовТермо Фишер СайентификQ32856
Qubit dsDNA HS Assay KitТермо Фишер СайентификQ33231
Кубитный флуорометрТермо Фишер СайентификQ33226
Безопасный штамм ДНК-геля SYBRТермо Фишер СайентификS33102
UltraPure AgaroseТермо Фишер Сайентифик17852
Universal Hood III трансилминатор (Molecular Imager Gel System Doc XR)Био-Рад170-8170
Вихревой миксерLasecWMBB0L0E0216

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tuberculosis report. Baltimore Health News. , WHO. (2022).
  2. WHO Malaria Department report. Report 20-23. , WHO. (2023).
  3. The End Strategy TB. 53 (1), WHO. 1689-1699 (2015).
  4. Cabibbe, A. M., et al. Application of targeted nextgeneration sequencing assay on a portable sequencing platform for culturefree detection of drugresistant tuberculosis from clinical samples. J Clin Microbiol. 58 (10), e0063220(2020).
  5. Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culturefree prediction of susceptibility or resistance to 13 antituberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
  6. NG, K. C. S., et al. How well do routine molecular diagnostics detect Rifampin. J Clin Microbiol. 57 (1), e0128723(2019).
  7. MacLean, E., Kohli, M., Weber, S. F., Suresh, A. Advances in molecular diagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol. 58 (10), e0158219(2020).
  8. Sibandze, D. B., et al. Rapid molecular diagnostics of tuberculosis resistance by targeted stool sequencing. Genome Med. 14 (1), 42(2022).
  9. Shah, M., Chihota, V., Coetzee, G., Churchyard, G., Dorman, S. E. Comparison of laboratory costs of rapid molecular tests and conventional diagnostics for detection of tuberculosis and drugresistant tuberculosis in South Africa. BMC Infect. Dis. 13 (1), 352(2013).
  10. Hu, T., Chitnis, N., Monos, D., Dinh, A. Nextgeneration sequencing technologies: An overview. Hum Immunol. 82 (10), 801-811 (2021).
  11. Pervez, M. T., et al. A comprehensive review of performance of nextgeneration sequencing platforms. Biomed Res Int. 2022, 3457806(2022).
  12. Tafess, K., et al. Targetedsequencing workflows for comprehensive drug resistance profiling of Mycobacterium tuberculosis cultures using two commercial sequencing platforms: Comparison of analytical and diagnostic performance, turnaround time, and cost. Clin Chem. 66 (6), 809-820 (2020).
  13. Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. WHO rapid communication. , WHO. https://www.who.int/publications/i/item/9789240076372 (2023).
  14. Hazra, D., et al. Impact of wholegenome sequencing of Mycobacterium tuberculosis on treatment outcomes for MDRTB/XDRTB: A systematic review. Pharmaceutics. 15 (6), 1408(2023).
  15. Shea, J., et al. Comprehensive wholegenome sequencing and reporting of drug resistance profiles on clinical cases of Mycobacterium tuberculosis in New York State. J Clin Microbiol. 55 (6), 1871-1882 (2017).
  16. Meehan, C. J., et al. Whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis: Current standards and open issues. Nat Rev Microbiol. 17 (10), 533-545 (2019).
  17. Heupink, T. H., Verboven, L., Warren, R. M., Van Rie, A. Comprehensive and accurate genetic variant identification from contaminated and lowcoverage Mycobacterium tuberculosis whole genome sequencing data. Microb Genom. 7 (1), e000555(2021).
  18. Wang, X., et al. Interpretation of the third edition of WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 3: Diagnosis: Rapid diagnostics for tuberculosis detection. Chin J Antituberc. 46 (2), 120-130 (2024).
  19. Kambli, P., et al. Targeted nextgeneration sequencing directly from sputum for comprehensive genetic information on drugresistant Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 127 (1), 102051(2021).
  20. Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. Rapid Communication. , WHO. 1-8 (2023).
  21. Nandlal, L., Perumal, R., Naidoo, K. Rapid molecular assays for the diagnosis of drugresistant tuberculosis. Infect Drug Resist. 15 (1), 4971-4984 (2022).
  22. Dippenaar, A., et al. Nanopore sequencing for Mycobacterium tuberculosis: A critical review of the literature, new developments, and future opportunities. J Clin Microbiol. 60 (5), e0123422(2022).
  23. Chan, W. S., et al. Rapid and economical drug resistance profiling with nanopore MinION for clinical specimens with low bacillary burden of Mycobacterium tuberculosis. BMC Res Notes. 13 (1), 123(2020).
  24. Feuerriegel, S., et al. Rapid genomic first and secondline drug resistance prediction from clinical Mycobacterium tuberculosis specimens using DeeplexMycTB. Eur Respir J. 57 (4), 2004784(2021).
  25. GenoScreen product brochure. Deeplex MycTB. , GenoScreen. (2023).
  26. Mtafya, B., et al. A practical approach to render tuberculosis samples safe for application of tuberculosis molecular bacterial load assay in clinical settings without a biosafety level 3 laboratory. Tuberculosis. 138 (1), 102194(2023).
  27. Suganthi, P., Usharani, B., Venkateswari, R., Muthuraj, M. Biosafety practices in mycobacteriology laboratory. Research Advances in Microbiology and Biotechnology. 3, B P International (a part of SCIENCEDOMAIN International). Chennai. 1-39 (2023).
  28. consolidated guidelines on tuberculosis. Module 4: Treatment and care. WHO guideline. , WHO. (2022).
  29. Williams, J., et al. Matrixbased DNA extraction for targeted nextgeneration sequencing on decontaminated sputum samples. J Vis Exp. (181), e68147(2025).
  30. Delahaye, C., Nicolas, J. Sequencing DNA with nanopores: Troubles and biases. PLoS One. 16 (2), e0245534(2021).
  31. Zhao, K., et al. Rapid identification of drugresistant tuberculosis genes using direct PCR amplification and Oxford Nanopore Technology sequencing. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2022, 8845672(2022).
  32. Tagliani, E., et al. Culture and nextgeneration sequencingbased drug susceptibility testing unveil high levels of drugresistantTB in Djibouti: Results from the first national survey. Sci Rep. 7 (1), 15076(2017).
  33. Smith, C., Halse, T. A., Shea, J., Modestil, H., Fowler, R. C. Assessing nanopore sequencing for clinical diagnostics: For Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 59 (7), e0123421(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Long Read SequencingAmplicon SequencingDrug Resistant TuberculosisTargeted NGSPortable SequencingDNA Library PreparationResistance Variant DetectionFlow Cell PrimingGel ElectrophoresisBioinformatics Pipeline

Похожие статьи