Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Отбор проб фотосинтезирующих микробов и их вирусов из окружающей среды: от полевых условий к лабораторным

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68379

⸱

3 июля 2025 г.

 , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative Systems Biology Program, University of California, Merced

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье мы описываем методы отбора проб из эвфотических зон морских и пресноводных экосистем для выделения цианофагов (и их хозяев) и процессы после отбора проб, которые обогащают отдельные генотипы и характеризуют динамику взаимодействия вируса и хозяина.

Аннотация

Отбор проб фотосинтезирующих микроорганизмов и их вирусов в окружающей среде играет важнейшую роль в понимании современного морского и пресноводного биоразнообразия и динамики экосистем, а также воздействия факторов, связанных с изменением климата (например, повышение температуры и подкисление) на эволюционные траектории видов и состав сообществ. К сожалению, разнообразие виросферы не поддерживает единый универсальный процесс отбора проб и эксперимента. Действительно, каждая вирусная система обладает уникальными особенностями, которые требуют модификации стандартных протоколов в вирусологии для достижения исследовательских целей. Хотя обнаружение и характеристика вирусов требуют подходов, специфичных для целевой системы, для всех вирусов цели исследования схожи: изолировать вирус; определение диапазона хоста; подтвердить продуктивное заражение; и характеризуют вирус, хозяина и динамику вирус-хозяин. Надежные описания вирус-хозяин состоят в минимальном объеме из прояснения морфологии, физиологии, биохимии и омиксных профилей. Дополнительная информация может быть получена путем манипулирования системой путем изменения таких факторов, как множественность инфекции, температура, pH, переключение хозяина, направленная эволюция или применение лекарственных препаратов для наблюдения за реакцией вирус-хозяин-система. Наша лаборатория изучает вирусы во всех сферах жизни (археи, бактерии и эукарии). В этом отчете мы подробно описываем методы отбора проб фотосинтезирующих микробов из эвфотической зоны пресной и морской среды, уделяя особое внимание выделению бактериофага (т.е. цианофага) цианобактерий. Цианобактерии являются ключевыми видами, имеющими решающее значение для первичной продукции и круговорота питательных веществ в этих водных экосистемах. Описываемый рабочий процесс включает в себя отбор проб воды на разных глубинах и определение характеристик вирус-хозяин системы с использованием культуры жидких и твердых сред, передовых молекулярно-генетических методов и аналитических подходов. Описанные методы могут быть адаптированы к обнаружению бактериофагов и вирусов в системах вирус-хозяин во всех областях жизни.

Введение

Характеристика динамики инфекций и эволюционных отношений цианофагов и их хозяев является ключом к пониманию текущего и будущего состояния морских и пресноводных экосистем. Передовые методы высокопроизводительного секвенирования и современные аналитические методы позволяют проводить быстрое секвенирование геномов цианофагов (и хозяина) для изучения отношений вирус-хозяин 1,2. Тем не менее, рабочие процессы начинаются с отбора проб окружающей среды для изоляции и идентификации вирусов и их хозяев 3,4,5. Из-за разнообразия виросферы не существует единого протокола отбора проб и характеристики всех вирусов и бактериофагов. Действительно, каждая система вирус-хозяин имеет свои уникальные характеристики. Тем не менее, базовые цели схожи независимо от исследуемой вирусной системы: изолировать вирус; определение диапазона хоста; демонстрировать продуктивное заражение в одном или нескольких хозяевах; Охарактеризовать динамику вируса, хозяина и вирус-хозяина с помощью качественных и количественных подходов. Глубокое понимание вирусной системы можно получить, возмущая систему. Изменение таких параметров, как множественность инфекции (MOI)6, температура, pH, штамм хозяина или применение лекарств для определения реакции системы, дает дополнительное представление о природе динамики вирус-хозяин. Более продвинутые манипуляции, такие как направленная эволюция, могут предоставить дополнительную информацию о потенциальной эволюционной траектории системы и о том, как коэволюционные конечные точки могут повлиять на более крупное микробное сообщество и экосистему.

В этом исследовании мы представляем модельный (но легко адаптируемый) протокол отбора проб из окружающей среды фотосинтезирующих микробов, таких как цианобактерии и микроводоросли, которые играют решающую роль в круговороте питательных веществ и первичной продукции в морских, пресноводных и других водных экосистемах 7,8,9,10,11 . Рабочий процесс сосредоточен на изоляции хозяев от эвфотических зон морской и пресноводной среды, а также их вирусов и бактериофагов, которые являются ключевыми движущими силами в этих экосистемах12. Как вирусы, так и бактериофаги влияют на структуру популяций как эукариот, так и прокариот и оказывают сильное влияние на разнообразие и продуктивность экосистем13. Таким образом, цель здесь состоит в том, чтобы предоставить протокол выборки и рабочий процесс после выборки, который облегчает обогащение хостов и вирусов для исследования: динамики один-вирус/один хост, мульти-вирус/один хост, один вирус/мультихост и мульти-вирус/мульти-хост; -омиксные субстраты, лежащие в основе динамики инфицирования вируса-хозяина; а также потенциальные коэволюционные траектории и эволюционные конечные точки, которые влияют на изучаемую систему вирус-хозяин и более широкую экосистему, из которой были извлечены вирусы и хозяин.

В частности, мы описываем рабочий процесс отбора проб из окружающей среды, предварительную обработку образцов в полевых условиях (т.е. до того, как они попадут в лабораторию), постобработку для выделения бактериофагов (и вирусов), обогащение смешанных культур микроорганизмов с целью идентификации допустимых хозяев, разработку одиночных колоний изолятов предполагаемых хозяев, подтверждение добросовестности отношения вирус-хозяин (т.е. продуктивная инфекция) и характеристика основных свойств инфекции (например, вирулентность). Анализы инфекций не только позволяют рассчитать относительную вирулентность (VR)14 и устойчивость хозяина (RR)15, но также включают этапы экстракции образцов культуры в ключевые моменты времени для исследования -омиксных субстратов, лежащих в основе наблюдаемой физиологии (т.е. динамики взаимодействия вируса и хозяина). Наконец, мы обсудим потенциальные подводные камни, способы устранения неполадок и их устранение, а также способы изменения выбранных шагов для нацеливания на конкретные таксоны. Этот рабочий процесс применим к цианофагам-цианобактериям, фикодинвирусам-микроводорослям и термофильным фузелловирус-архейным системам16,17, демонстрируя его полезность для характеристики вирусов во всех трех областях жизни: бактериях, эукариях и археях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Отбор проб окружающей среды

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает отбор проб фотосинтезирующих микробов в прибрежной зоне в пределах 5 миль от береговой линии у побережья южной Калифорнии. Тем не менее, протокол был адаптирован для отбора проб из озер, замерзших озер или геотермальных горячих источников (Рисунок 1).

  1. Отбор проб окружающей среды на шельфе вдоль южного побережья Калифорнии
    ПРИМЕЧАНИЕ: 6-метровое судно с V-образной глубиной и центральной консолью (т.е. лодка) с двумя подвесными моторами мощностью 150 л.с. было загружено исследовательским оборудованием (Таблица материалов). Для отбора проб эвфотической зоны были выбраны три участка: а) участок 1: 30° с.ш. 15.436, з.д. 117° 31.551; b) Участок 2: 33° с.ш. 12.521, з.д. 117° 25.275; и c) Участок 3: 32° 59,914 северной широты, 117° 17,058 западной долготы. На каждом участке в полдень было отобрано 20 л проб воды с трех разных глубин: < 3 м (поверхностная проба), 6 м и 14 м.
    1. Сборка перекачивающего насоса: По прибытии на каждую пробную площадку разверните якорь лодки и запишите GPS-координаты из навигационной системы. Соберите пробоотборную систему.
      1. Короче говоря, установите один конец синей трубки из ПВХ с внутренним диаметром 2,54 см (50 футов) на всасывающий фильтр диаметром 2,54 см, чтобы предотвратить попадание крупного мусора в насосную систему. Закрепите место соединения сетчатого фильтра с трубкой клейкой лентой. Установите противоположный конец трубки на впускной коллектор перекачивающего насоса из нержавеющей стали мощностью 1 л.с.
      2. Прикрепите к выпускному отверстию насоса 10-футовую секцию с внутренним диаметром 2,54 см и устойчивым к смятию резиновым гибким шлангом. Подключите электрический шнур передаточного насоса к газовому инверторному генератору мощностью 3800 Вт. После сборки заправьте перекачивающий насос и проверьте его работоспособность (Рисунок 1, верхний ряд).
    2. Утяжеление передаточной трубы: Закрепите один конец нейлонового морского каната длиной 25 м и диаметром 1,25 см к отверстию грибовидного якоря весом 14 кг. Используйте клейкую ленту, чтобы прикрепить веревку к синей трубке из ПВХ через каждые 3 м, при этом всасывающий фильтр установлен примерно на 1 м над анкером, чтобы предотвратить застревание сетчатого фильтра в песке или удар о камни под водой. Используйте якорь, чтобы погрузить передаточную трубку (синюю трубку из ПВХ) и избежать сильных подводных течений, создающих большой угол между лодкой и трубкой, что может дать неточные данные о глубине пробы. Опустите анкер/канат и трубу в сборе на глубину.
    3. Отбор проб морской воды: Как только наконечник трубки с сетчатым фильтром окажется на желаемой глубине, включите генератор и насос. Заправьте насос или встряхните передаточную трубку, чтобы вода начала качаться с глубины. После того, как постоянный поток воды будет передаваться с глубины, сбросьте 1-2 объема трубки обратно в океан, чтобы вода с нужной глубины протекала через насос. Соберите пробы воды в кувшины объемом 20 л (рис. 1, верхний ряд, крайний справа).
    4. Транспортировка проб на полевую станцию: Наполните кувшины с водой объемом 20 л примерно до 18 л, чтобы обеспечить газообмен (например, O2/CO2) между пробами воды и свободным пространством во время транспортировки. Перед укупоркой кувшинов для воды зарегистрируйте температуру, pH и соленость проб сырой воды. Затем закройте крышкой и поставьте кувшины с водой на ледяное ложе в подпалубном хранилище и накройте легким листом, чтобы избежать чрезмерного воздействия солнечных лучей и высоких температур.
  2. Полевая предварительная обработка проб воды
    ПРИМЕЧАНИЕ: По прибытии на береговое сооружение (например, гостиничный номер/конференц-зал/полевую станцию) был предпринят ряд этапов предварительной обработки для защиты микробного содержимого в пробах воды и разделения различных фракций проб морской воды в зависимости от размера частиц.
    1. Сборка системы фильтрации: Закрепите один конец куска прозрачной виниловой трубки длиной 1 м с внутренним диаметром 9,525 мм к входному отверстию шланга на вакуумном отверстии портативного вакуумного насоса с воздушной диафрагмой. Закрепите противоположный конец того же шланга на вакуумной чашке фильтра объемом 1,0 л и 0,45 мкм. Используйте фильтрующие чашки длиной 0,45 мкм и 0,22 мкм последовательно, чтобы отделить различные фракции пробы морской воды, как описано ниже.
    2. Чтобы проверить систему на наличие утечек или неисправных/порванных фильтров, отфильтруйте 0,25 л морской воды через мембранный фильтрующий стакан из полиэфирсульфона (PES) длиной 0,45 мкм. Негерметичная система покажет всасывание между фильтром и решеткой после того, как проба морской воды будет полностью отфильтрована.
    3. Фильтрация через узел мембранного фильтра PES длиной 0,45 мкм: Для выделения фотосинтезирующих микроорганизмов (например, микроводорослей и цианобактерий) цель состоит в том, чтобы отфильтровать 2 л пробы морской воды через мембранный фильтрующий стакан PES 0,45 мкм с помощью двух фильтрующих чашек объемом 1 л (или четырех фильтровальных чашек объемом 500 мл). Надлежащим образом маркируйте все флаконы с фильтратом, указывая размер фильтра, глубину, с которой была взята проба, дату и обозначение места отбора проб. Наконец, завинтите крышку и накройте бутылки, содержащие фильтрат 0,45 мкм, полупрозрачной тканью или рукавом для предотвращения чрезмерного солнечного света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания фильтра в фильтрующем стакане. Всегда держите на фильтре тонкий слой жидкости. Фильтр будет накапливать биологический мусор (например, клетки). Если фильтр засорился мусором, осторожно открутите чашку в сборе и отложите использованную чашку фильтра в сторону, но не выбрасывайте засоренную чашку. Подключите новый фильтр 0,45 μм и продолжайте.
    4. Фильтрация через узел мембранного фильтра PES длиной 0,22 мкм: Чтобы изолировать крупные эукариотические вирусы, используйте 1 л фильтрата 0,45 мкм, полученного на предыдущем этапе (шаг 1.2.3), и отфильтруйте через фильтрующий стакан 0,22 мкм. Надлежащим образом промаркируйте бутылку с ультрафильтратом с указанием размера фильтра, глубины, с которой была взята проба, даты и обозначения места отбора проб. Наконец, закрутите крышку и накройте бутылку, содержащую ультрафильтрат 0,22 мкм (от фильтрации 0,45 мкм фильтрата).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания фильтра в фильтрующем стакане. Всегда держите на фильтре тонкий слой жидкости. Фильтр будет накапливать биологический мусор, в котором содержатся биологические пробы. Если фильтр засорился, открутите чашку в сборе и отложите использованную чашку фильтра. Не выбрасывайте забитую чашку. Подключите новый фильтр 0,22 мкм и продолжайте.
    5. Сконцентрируйте биомассу из фильтра 0,45 мкм: Налейте 48 мл фильтрата (из фильтрации 0,22 мкм) в каждую из двух стерильных конических полипропиленовых центрифуг объемом 50 мл. С помощью стерильного скальпеля равномерно разрежьте по внешнему краю израсходованного фильтра 0,45 мкм в пределах чашечки в сборе. Используйте стерильные щипцы для удаления влажного фильтра, насыщенного биомассой. Разрежьте его пополам. Сверните половину фильтровальной бумаги в одну коническую пробирку объемом 50 мл. Повторите то же самое со второй половиной фильтрующей мембраны и второй трубкой. Закрутите крышки туб и закрепите прозрачной пленкой. Наклейте на пробирку маркировку.
    6. Сконцентрируйте большую биомассу вируса из фильтра размером 0,22 мкм: Налейте по 14 мл ультрафильтрата в каждую из двух стерильных конических полипропиленовых пробирок для центрифуги объемом 15 мл. С помощью стерильного скальпеля разрежьте по внешнему краю используемого фильтра 0,22 мкм в сборе чашки. Используйте стерильные щипцы для удаления влажного фильтра, насыщенного биомассой. Разрежьте его пополам. Сверните и вставьте одну половину фильтровальной бумаги в одну из конических пробирок объемом 15 мл. Повторите то же самое для второй половины фильтрующей мембраны и второй конической трубки объемом 15 мл. Закрутите крышки туб и закрепите прозрачной пленкой (например, Parafilm). Пометьте каждую пробирку размером фильтра (например, 0,22 мкм), местом, глубиной и датой.
    7. Сохраните оставшийся фильтрат 0,45 мкм, а также оставшиеся 0,22 мкм фильтрат для отправки обратно в лабораторию. Повторите весь процесс фильтрации (шаги с 1.2.2 по 1.2.6) для каждой глубины и участка отбора проб.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ультрафильтрат используется в лаборатории в качестве медиа-основы (с нативными минералами и другими питательными веществами).
      Микроскопия исходного образца (по желанию): возьмите одну коническую пробирку объемом 50 мл с фильтром 0,45 мкм и осторожно встряхните. С помощью пластиковой пипетки (или пипетки) возьмите 30-50 мл морской воды из конической пробирки объемом 50 мл и подготовьте предметное стекло микроскопа с образцом и крышкой. Используя полевой микроскоп и компьютер, просмотрите содержимое предметного стекла микроскопа, чтобы обнаружить и записать характеристики наблюдаемых микроорганизмов (рисунок 2D).

2. Обработка образцов для концентрации вирусов/бактериофагов и обогащения хозяев

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает первые этапы обработки, необходимые после того, как образцы прибудут в лабораторию с места работы. Перевозка на самолете и на автомобиле может потребовать разных соображений. Жизнеспособность проб окружающей среды будет снижаться при резких изменениях температуры, pH, солености, воздействия или отсутствия воздействия света, концентрации растворенных газов (например, CO2 иO2), а также времени между экстракцией из окружающей среды и лабораторной обработкой.

  1. Спин, концентрирующий и хранящий вирусы и бактериофаги
    ПРИМЕЧАНИЕ: После поступления образцов в лабораторию обработка в течение 8 часов после прибытия может свести к минимуму потерю жизнеспособных микробов из-за временного промежутка между извлечением образца и прибытием в лабораторию. Описанные ниже шаги обеспечат аликвоты концентрированной суспензии бактериофага (или вируса) (т.е. рабочие запасы) для длительного хранения и использования.
    1. Концентрирующий ультрафильтрат: Для каждой глубины отбора проб на каждом участке отправьте оставшиеся ~800 мл ультрафильтрата в лабораторию. Используйте центробежный спиновой фильтр 3K NMWL 15 мл и центрифугируйте при давлении 6000 x g в течение 10-20 минут, чтобы сконцентрировать 50-100 мл ультрафильтрата до 1,0-1,5 мл. Подготовьте сетки для визуализации ПЭМ, как описано ранее16 , чтобы оценить, есть ли какие-либо вирусоподобные частицы (VLP) в полученном концентрированном ультрафильтрате. При обнаружении VLP разделите концентрат на 100 мл аликвот. Хранить при температуре 4 °C (или -20 °C при длительном хранении).
    2. Концентрирование частиц из фильтра размером 0,22 мкм: С помощью стерильного скальпеля аккуратно соскребите мусор с фильтров размером 0,22 мкм в ультрафильтрат в пробирках объемом 50 мл, в которых были транспортированы фильтры. Используйте узел спин-концентратора 10K NMWL для концентрации 50-200 мл суспензии до объема ~3 мл ретентата образца. Подготовьте сетки для визуализации ПЭМ, как описано ранее16 , чтобы определить, есть ли VLP из фильтрата размером 0,45 мкм, которые могли быть захвачены на поверхности фильтра размером 0,22 мкм. При обнаружении VLP разделите концентрат на 100 мл аликвот и храните при температуре 4 °C (или -20 °C при более длительном хранении).
  2. Спиновой концентрирующий и обогащающий ретентат из фильтров 0,45 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смешанные культуры микроорганизмов могут содержать хозяев для вирусов и бактериофагов, выделенных выше (шаги 2.1.1 и 2.1.2). Спиновая концентрация и обогащение смешанных культур обеспечивают рабочую базу для развития чистых культур предполагаемых хозяев (см. шаг 3).
    1. Концентрирование смешанных суспензий: Для каждой глубины отбора проб на каждом участке отправьте в лабораторию ~100 мл ультрафильтрата с фильтром 0,45 мкм, наполненным клеточным мусором. С помощью стерильного скальпеля соскребите мусор с фильтра 0,45 мкм в ультрафильтрат в пробирках объемом 50 мл, в которых они транспортировались. Центрифугируйте образец при температуре 2000 x g в течение 10 минут, 4 °C для гранулирования биомассы. Ресуспендировать гранулы в 5 мл 1:8 разбавить среду BG-111:8 путем осторожного растирания пипеткой.
    2. Обогащение ретентата из фильтра 0,45 мкм: Приготовьте шесть параллельных культур в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 50 мл среды BG-11 (3 колбы) и смесь ультрафильтрата из места отбора проб (40 мл) плюс BG-11 (10 мл). Инокулируйте в каждую колбу 0,5 мл клеточного концентрата (начиная с шага 2.2.1). Инкубировать с легким встряхиванием в фотобиореакторе в течение как минимум 7-10 дней при температуре 25 °C с интенсивностью света 20-40 ммоль фотонов/м2/с.19 Как только рост станет устойчивым (например, наружный диаметр730 нм = 0,8), центрифугируйте при 2000 x g, 10 мин, 4 °C до гранул. Ресуспендируйте гранулу в 10 мл разбавленного в соотношении 1:8 среды BG-11 путем осторожного растирания с помощью пипетки. Приготовьте 10-20 аликвот по 0,5 мл клеточной суспензии в криопробирках с винтовой крышкой для хранения при температуре -80 °С.

3. Разработка одногенотипных чистых культур микробных хозяев

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол описывает процедуры выделения и очистки предполагаемых микробных хозяев от вирусов и бактериофагов из смешанных культур, обработанных из собранных образцов окружающей среды. Множественные фенотипы хозяев могут быть выделены и очищены, что увеличивает вероятность обнаружения допустимых хозяев для вирусов и бактериофагов, присутствующих в хранящихся пробах воды (шаги 2.1.1-2.1.2).

  1. Полосы планшетов и отбор изолятов с одной колонией
    Примечание: Множественные чистые культуры с одним генотипом разрабатываются из смешанных культур для повышения вероятности выделения восприимчивого и восприимчивого хозяина вирусов или бактериофагов, захваченных во время отбора проб окружающей среды, а также для исследования диапазона хозяев вирусов и бактериофагов.
    1. Разработайте изоляты одиночной колонии (SCI), как описано ниже.
      1. Подготовьте БГ-11 агаровых пластин20. Разморозьте на льду одну аликвоту смешанной суспензии, которая хранилась при -80 °С (с шага 2.2.2). Используйте стерильную петлю для нанесения клеточных концентратов на агаровые пластины BG-11 с использованием стандартных методов20. Инкубируйте полосатые пластины в фотобиореакторе в течение ~10 дней при 25 °C с интенсивностью света 20-40 ммоль фотонов/м2/с или до тех пор, пока на планшетах не появятся колонии.
      2. Приготовьте ~10 посевных культур в культуральных пробирках объемом 20 мл с 5 мл среды BG-11 и/или 5 мл смеси ультрафильтрата с места отбора проб и BG-11. Возьмите SCI из планшета стерильной зубочисткой и привите каждую пробирку по отдельности, опустив по одной зубочистке в каждую пробирку. Инкубировать с легким встряхиванием в фотобиореакторе в течение минимум 10-15 дней при 25 °C с интенсивностью света 20-40 ммоль фотонов/м2/с или до тех пор, пока не будет обнаружен рост (например, OD730 нм = 0,4-0,8).
        Примечание: Если на первой пластине есть несколько фенотипов колоний (например, морфология, прозрачность, цвет), выберите отдельные колонии для инокуляции из ряда фенотипов колоний.
    2. Создание чистых культур из рабочих запасов: Как только будет обнаружен положительный рост культуры семян, повторяйте процедуры полосирования до тех пор, пока на пластинах не появится только один фенотип колонии (Рисунок 3B и Рисунок 4B). Увеличьте посевные культуры до 50 мл культур в колбах объемом 250 мл (рисунки 3C и 4C), как описано выше (шаг 2.2.2). Приготовьте ~20 аликвот 0,5 мл суспензии клеток SCI и пипетку в криопробирки с завинчивающейся крышкой объемом 1,0 мл для хранения при температуре -80 °C.
      Примечание: Для получения чистых культур цианобактерий могут потребоваться антибиотики или противогрибковые препараты (например, имипенем, циклогексимид) для снижения контаминации культуры21. Процедура гальванического покрытия является отправной точкой, на которую может быть направлено выделение цианобактерий или микроводорослей. Параметры освещения во время инкубации могут варьироваться с точки зрения интенсивности света или циклов включения-выключения.
  2. Характеристика одного генотипа и хранение оборотных средств
    Примечание: Для подтверждения выделения и обогащения отдельных предполагаемых генотипов хозяина чистые культуры характеризуются морфологически и генетически.
    1. Морфологическая характеристика: После того, как циклы работы жидкой культуры и планшета с твердой средой приводят к получению фенотипа одной клетки, характеризуют морфотипы микроорганизмов как с помощью световой микроскопии (рис. 2A-C), так и, если возможно, с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и/или сканирующей электронной микроскопии (СЭМ; Рисунок 3А и Рисунок 4А). При световой микроскопии (например, при увеличении 60-100x) может наблюдаться зеленая, светло-коричневая или прозрачная одноклеточное, колониальное, нитевидное, спиральное, разветвленное или трихомное клеточное устройство. Это укажет на возможное таксономическое присвоение.
    2. Генетическая характеристика: Валидация выделения одного генотипа микроорганизма путем экстракции ДНК из предполагаемых чистых культур с последующим частичным секвенированием генома. У цианобактерий ген 16S рРНК часто является мишенью (рис. 5A)22. Филогенетический анализ 16S может идентифицировать таксономическую группировку22. В микроводорослях 18S рРНК часто является мишенью23. Для изолятов, представляющих интерес, или новых изолятов может быть проведено полногеномное секвенирование.

4. Разработка суспензий вирусов/бактериофагов с одним генотипом

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол описывает процедуры выделения и очистки множественных вирусных и бактериофаговых суспензий одного генотипа из образцов окружающей среды.

  1. Разбавление и ПЭМ концентратов VLP
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью ПЭМ и анализов бляшек на основе планшетов24 получено подтверждение того, что VLP являются добросовестными бактериофагами (или вирусами), которые инфицируют клетки-хозяева.
    1. Просвечивающая электронная микроскопия фильтратов (0,45 мкм и 0,22 мкм): Используйте концентраты от фильтрации образцов сырой воды 0,45 мкм и 0,22 мкм (см. шаг 2.1) для подготовки сеток ПЭМ16 и изображения для изучения гетерогенности вирусных частиц (т.е. разнообразия морфотипов). Разбавляйте образцы, в результате которых получаются сетки с высокой конфлюенцией (например, 90%), перед выполнением последующих шагов для достижения конфлюенции 30%-50%. Ручной подсчет частиц или использование программного обеспечения для визуализации могут быть использованы для оценки слияния клеток на сетках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сильное слияние на сетках может привести к расчистке газонов хозяев на твердых медиа-пластинах, а не к появлению отдельных табличек, которые могут быть выбраны. Таким образом, разбавление образцов перед анализом бляшек может сэкономить время. В качестве альтернативы, газонные пластины с несколькими хозяевами могут быть проверены на взаимодействие хозяина с вирусом с использованием последовательных разведений концентратов VLP.
    2. Обнаружение активности бактериофага (или вируса) на газонах-хозяевах: На агаровых пластинах BG-11 выращивайте предполагаемые газоны хозяина цианобактерий (или микроводорослей) из рабочих запасов (шаг 3.1.2). Пипеткой нанесите 0,5 мл суспензии VLP в 4,5 мл среды на газоны (рис. 6А, слева) и аккуратно взболтайте до тех пор, пока вся поверхность газона не будет покрыта суспензией. Инкубировать в фотобиореакторе в течение 3-10 дней при температуре 25 °C с интенсивностью света 20-40 ммоль фотонов/м2/с или до тех пор, пока на планшетах не появятся бляшки (рис. 6A, справа).
  2. Выскабливание бляшек и развитие суспензий вируса или бактериофага с одним генотипом
    ПРИМЕЧАНИЕ: Путем соскабливания фенотипов отдельных бляшек и размножения бактериофага в жидких культурах хозяина подтверждаются добросовестные взаимодействия хозяин-бактериофаг (или хозяин-вирус), что позволяет разрабатывать рабочие запасы бактериофагов (или вирусов) для анализа инфекции. Рабочие запасы бактериофага (или вируса) должны быть титрованы с помощью одного из нескольких методов (например, количественной ПЦР, анализа бляшек) для проведения анализов на инфекцию при определенной кратности инфекции (MOI).
    1. Выделение и размножение одного генотипа бактериофага (или вируса): Как только на пластинах можно увидеть отдельные бляшки (из-за адекватного разведения концентрата VLP), используйте стерильную петлю для соскабливания одной бляшки. Закрутите петлю в посевной культуре хозяина объемом 10 мл (рис. 6B, слева). Инкубировать с легким встряхиванием (например, 70-120 об/мин) в фотобиореакторе в течение 3-10 дней при 25 °C с интенсивностью света 20-40 ммоль фотонов/м2/с или до тех пор, пока на дне пробирки не появятся капли наружного диаметра730 нм или клеточный мусор, что указывает на гибель/лизис клеток (рис. 6B, справа)25.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если бляшки образуются на газонах-хозяевах, но нет признаков инфекции в жидкой культуре, бляшки могут быть образованы бактериоцином26 , а не бактериофагом (или вирусом). ПЭМ может поддерживать анализ на планшетах, указывая на гибель клеток в результате бактериофаговой (или вирусной) инфекции.
    2. Количественное определение титра для рабочего состава бактериофага (или вируса): Выделение бактериофага (или вируса) достигается с использованием описанных выше методов фильтрации и спин-концентрирования. Количественное определение титров суспензий бактериофагов (или вирусов) с помощью серийных анализов бляшек разведения27. В качестве альтернативы можно провести экстракцию ДНК и секвенирование всего генома вируса, а также филогенетику (рис. 5B) для разработки праймеров для проведения титрования бактериофага на основе количественной ПЦР с целью создания рабочих запасов для последующих анализов на инфекции.
      Примечание: Размножение генотипов отдельных бактериофагов (или вирусов) может быть увеличено до 50 мл или 100 мл культур, если титр или объемы рабочего фонда слишком малы для экспериментальных нужд. Учитывайте природу системы вирус-хозяин (например, высокая вирулентность или низкая вирулентность), множественность инфекций (MOI), которые планируются для тестов на инфекцию, и сколько тестов на инфекцию будет завершено для проекта при разработке рабочих запасов бактериофага (или вирусов). Не рекомендуется размораживать и повторно замораживать запасы вирусов. Разморозьте и используйте один полный запас вирусов из реплик одного и того же препарата с одним и тем же титром для каждого эксперимента. Описанные методы могут дополняться другими методами титрования, включая ионизацию/масс-спектрометрию с электрораспылением (ESI/MS)28.

5. Анализы на инфекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает анализы инфекции хозяин-фаг (или вирус-хозяин), которые используются для: качественной характеристики вирулентности, диапазона хозяина и фенотипа инфекции (индикатор стратегии репликации) на твердых средах; и количественно оценить кинетику роста, вирулентность вируса14 и устойчивость хозяина15 в жидкой культуре.

  1. Определение относительной вирулентности бактериофагов (или вирусов) и диапазона хозяев на твердых средах
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все анализы твердых сред, включая анализы на газоне, анализы серийного разведения бляшек на одном планшете и анализы с пластинами резистентности хозяина, предоставляют качественные данные о параметрах инфекции бактериофаг-хозяин, таких как вирулентность вируса, диапазон хозяина и стратегия репликации. Анализ роста жидких культур позволяет проводить более количественные измерения и моделировать динамику вирус-хозяин.
    1. Анализы на газоне: Чтобы определить диапазон хозяев, подготовьте газоны из нескольких предполагаемых хозяев, выделенных из образцов окружающей среды или из штаммов, полученных из других лабораторий или коллекций культур. На газонах нанесите 2 мкл суспензии бактериофага (или вируса) на газон с помощью пипетки. На отдельной области той же пластины обратите внимание на тот же объем воды Triton X-100 и наночистой (18 МВт) в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно16. Проведите многократный анализ пятна на газоне с данным бактериофагом (или вирусом) на нескольких хозяевах для оценки диапазона хозяев бактериофага16. Фенотипы бляшек дают представление о стратегии репликации бактериофагов (или вирусов). Бляшки с четкими границами и доходящие до агара указывают на литическую репликацию, в то время как бляшки с диффузными границами или ореолом могут указывать на нелитическую репликацию16,17.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, однопланшетные анализы серийного разведения бляшек показывают, существует ли линейная зависимость между размером бляшки и титром бактериофага. Используйте маркер на обратной стороне тарелки, чтобы разделить тарелку на сетку или круговые секции. Затем, используя тот же объем (т.е. 2 мл), но с разведениями суспензии бактериофагов (например, 1:1, 1:4, 1:16, 1:64), проведите анализ пятна на газоне на одной хозяйской пластине.
    2. Анализы на резистентность хозяина: Чтобы определить, может ли набор бактериофагов вызывать инфекцию на данном хозяине, подготовьте газон хозяина на тарелке, как описано выше. С помощью маркера на обратной стороне тарелки разделите тарелку на сетку или круговые секции. Затем поместите по 2 мл суспензии каждого бактериофага (или вируса) в одну секцию сетки (или пирога), используя Triton X-100 и наночистую воду в качестве контроля. Если все суспензии бактериофагов (или вирусов) добавляются в равных титрах, то оценивайте относительную вирулентность между штаммами бактериофагов (или вирусами) на хозяине качественно (т.е. большая бляшка = более вирулентный вирус).
  2. Количественная оценка вирулентности, устойчивости и роста в анализах на инфекции с жидкими культурами
    Примечание: Первоначальные качественные результаты обеспечивают основу для нацеливания на конкретные пары бактериофаг-хозяин и проведения более количественного анализа динамики взаимодействий вирус-хозяин. В жидкой культуре создается кривая роста инфицированного хозяина, которая сравнивается с неинфицированным (контрольным) ростом хозяина.
    1. Проведите анализ инфекции одного вируса/одного хозяина в жидкой культуре, как описано ниже.
      1. Создание параллельных жидких культур (~6-12) микроорганизма (например, цианобактерии), восприимчивость и платежеспособность которого была доказана с помощью тестов в твердой среде (шаг 5.1) в следующих условиях: 1,0 л (320 мл культуры), 500 мл (160 мл культуры) или 250 мл (80 мл культуры) - колбы с перегородками для культуры, как описано ранее17. В заранее определенный момент времени (обычно 0,5 или 1 время удвоения хозяина) инокулируйте подмножество параллельных культур с эквивалентной плотностью клеток (например, OD730 нм = 0,08) в трипликате суспензией бактериофага, используя соответствующий объем, необходимый для получения предварительно выбранной множественности инфекции (MOI) с доступным титром рабочего запаса.
      2. Другие параллельные культуры (также в трех экземплярах) оставьте непривитыми (т.е. неинфицированными) в качестве контроля. При необходимости инокулируйте третий набор параллельных культур другим штаммом бактериофага (или вируса) для сравнения выбранных пар бактериофаг-хозяин. Дать культурам вырасти в фотобиореакторе в течение 3-10 дней при 25 °С с интенсивностью света 20-40 ммоль фотонов/м2/с.
      3. Построение кривых роста хозяина путем снятия показаний наружного диаметра730 нм через равные промежутки времени (например, 8 ч) у инфицированных бактериофагами и неинфицированных (контрольных) культур (рис. 7A). Используйте ПЭМ-верификацию неинфицированных контрольных культур (рисунок 7C) и продуктивной инфекции в культурах клеток хозяина (рисунок 7D). Цитопатические эффекты 29,30 легко наблюдаются у большинства инфицированных клеток, в то время как неинфицированные клетки не проявляют признаков морфологической трансформации или стресса.
    2. Исходная аналитика для анализов инфекции жидкой культуры: Из анализов инфекции жидкой культуры с одним вирусом/одним хозяином (SVSH) можно получить несколько базовых показателей, таких как: максимальная удельная скорость роста (μ max)31, относительная вирулентность бактериофага (или вируса)14 и относительная устойчивость хозяина15- для более количественного описания динамики бактериофаг-хозяин или вирус-хозяин (рисунок 7B). Стандартные отчетные показатели включают в себя скорость роста (часто указываемую как максимальная удельная скорость роста илиμ максимальную) и относительную вирулентность (ВР)14 по сравнению с неинфицированным хозяином и/или отдельным бактериофагом на том же хозяине. Также могут быть представлены другие показатели, такие как пропускная способность системы (Nasymptote) и относительная устойчивость хоста (RR)15 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Использование портативного электрического генератора с бензиновым двигателем, насоса для перекачки воды и устойчивых к разрушению трубок служит эффективным способом извлечения проб воды из океана, озер, замерзших озер и других водных сред (например, лагун) на выбранных глубинах (рис. 1, верхние три ряда). Для высокотемпературных кислотных вод геотермальных горячих источников, бассейнов и грязевых котлов требуется альтернативное оборудование, которые могут им...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Виросфера обширна и разнообразна, что требует различных экспериментальных подходов к изучению различных вирусных систем. Это включает в себя различные стратегии изоляции вирусов и их хозяев из различных сред и различные методы обработки, чтобы гарантировать, что чистые культуры хозяев и их вирусов могут быть получены из необработанных образцов. Эти чистые культуры могут быть использованы в анализах инфекции SVSH, как на твердых средах, так и в жидких культурах, чтобы можно было получить ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было частично профинансировано грантом OISE No 1856091 (PI-Ceballos) Национального научного фонда США (NSF) и грантом NSF DBI No 2119968 (PI-Ceballos). Авторы выражают признательность д-ру Чиннапонгу Вангнаю и д-ру Чакриту Тачаапайкуну из Технологического университета короля Монгкута в Тхонбури (Таиланд), которые предоставили видеосъемку и полевую поддержку для отбора проб окружающей среды, соответственно. Авторы также благодарят доктора Хорхе Армандо Лейва Санабриа из Университета Коста-Рики в Гуанакасте за его помощь в получении разрешений на отбор проб от национальных парков Коста-Рики и помощь в сборе проб из геотермальных бассейнов. Авторы также благодарят г-на Энрике Маррокина-младшего (Калифорнийский университет в Мерседе) и г-жу Алексию Маседу (Университет штата Мэн, Ороно, штат Массачусетс, США), которые оказали помощь в отборе проб у побережья южной Калифорнии и озер в северной Миннесоте соответственно. Авторы благодарят и выражают признательность за техническую поддержку г-же Сочите Час, которая рассчитала параметры заражения для датасета φSBL14-SWII.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Перекачивающий насос из нержавеющей стали мощностью 1 л.с.Utilitech, Шарлотт, Северная Каролина, СШАН/Д
Тубы 1,5 млwww.eppendorf.com30123611
Спин-концентратор 10K NMWL Centricon Plus 70 www.sigmaaldrich.comUFC701008
250 мл колбы Эрленмейера с перегородкой www.sigmaaldrich.comCLS4450250
Инверторный генератор мощностью 3800 Вт WEN Products, Вест Данди, Иллинойс, СШАWEN 56380i
3K NMWL Amicon 15 мл www.sigmaaldrich.comUFC800308
Колбы Эрленмейера объемом 500 млwww.sigmaaldrich.comCLS4450500
5-галлонные кувшины для воды www.homedepot.comН/Д
80 футов в длину, 0,5 дюйма диаметр, нейлон https://facomex.mx/producto/combo/Н/Д
26-футовая V-образная центральная консоль Sailfish 2660 с двумя подвесными моторами Yamaha мощностью 150 л.с.https://yamahaoutboards.com/Н/Д
Ацетат аммония (CH3CO2NH4)www.sigmaaldrich.com631618
Борная кислота (H3BO3)www.sigmaaldrich.com10043353
Дигидрат хлорида кальция (CaCl2. 2H2O)www.sigmaaldrich.com10035048
Центрифуга 5920  Rwww.eppendorf.com5948000107
Лимонная кислота (C6H8O7)www.sigmaaldrich.com77929
Гексагидрат нитрата кобальта(II) [Co(NO3)2.6H2O]www.sigmaaldrich.com10026229
Резиновый гибкий шланг с защитой от смятия swanhose.comCELTF58050
Пентагидрат сульфата меди(II) (CuSO4.5H2O)www.sigmaaldrich.com7758998
Центрифужные пробирки Corning 50 мл www.sigmaaldrich.comCLS430291
Дикалийфосфат (K2HPO4)www.sigmaaldrich.com7758114
Динатрия этилендиаминтетрауксусная кислота (Na2EDTA)www.sigmaaldrich.com6381926
DS-11 FX+_Microvolume и спектрофотометр и флорометрwww.denovix.comН/Д
Клейкая лента www.homedepot.comН/Д
Трубки Eppendorfwww.sigmaaldrich.comEP022364120
Этанолwww.sigmaaldrich.com64175
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)www.sigmaaldrich.com60004
Цитрат железа-аммония (C6H8O7· xFe3+· yNH3)www.sigmaaldrich.com1185575
Трубки из ПВХ синего цвета flex-plus www.carlonsales.com12008-750
Innova S44i - Штабелируемый шейкер инкубатораwww.eppendorf.com2231001081
LVEM5 Настольная электронная Microscope_Transmission электронная микроскопия (ПЭМ)delongamerica.comН/Д
Гептагидрат сульфата магния (MgSO4,7 H2O)www.sigmaaldrich.com10034998
Тетрагидрат хлорида марганца(II) (MnCl2.4H2O)www.sigmaaldrich.com13446349
Грибной якорь черный с виниловым покрытием / 30 фунтовwww.homedepot.comН/Д
Чашки Петри, полистиролwww.sigmaaldrich.comП5481
Мембранный фильтрующий стакан из полиэфирсульфона (PES) 0,22 ммwww.sigmaaldrich.comZ358193-1КС
Мембранный фильтрующий стакан из полиэфирсульфона (PES) 0,45 ммwww.sigmaaldrich.comZ370622-1КС
Этилксантогенат калия (C2H5OCSSK)www.sigmaaldrich.com140896
Карбонат натрия (Na2CO3)www.sigmaaldrich.com497198
Додецилсульфат натрия [CH3(CH2)11OSO3Na]www.sigmaaldrich.com151213
Дигидрат молибдата натрия (Na2MoO4.2H2O)www.sigmaaldrich.com10102406
Нитрат натрия (NaNO3)www.sigmaaldrich.com7631994
Трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновый ACI (TES) (C6H15NO6S)www.sigmaaldrich.com7365448
Triton X-100 www.sigmaaldrich.comТ8787
Тризма гидрохлорид (Tris-HCl)www.sigmaaldrich.com1185531
Вакуумный/нагнетательный насос Коул-Пармер; Вернон Хиллз, Иллинойс, СШАEW-79204-00
Виниловые трубки www.homedepot.comН/Д
Гептагидрат сульфата цинка (ZnSO4.7H2O)www.sigmaaldrich.com7446200

Ссылки

  1. Zhang, D., You, F., He, Y., Te, S. H., Gin, K. Y. H. Isolation and characterization of the first freshwater cyanophage infecting Pseudanabaena. J Virol. 94 (17), 10-1128 (2020).
  2. Dong, Z. Isolation, Characterization and Ecological Dynamics of Tropical Freshwater Cyanophages. , National University of Singapore. Doctoral dissertation (2022).
  3. Sime-Ngando, T. Environmental bacteriophages: viruses of microbes in aquatic ecosystems. Front Microbiol. 5, 355(2014).
  4. Sigee, D. C. Freshwater microbiology: biodiversity and dynamic interactions of microorganisms in the aquatic environment. , John Wiley & Sons. (2005).
  5. Jacquet, S., Miki, T., Noble, R., Peduzzi, P., Wilhelm, S. Viruses in aquatic ecosystems: important advancements of the last 20 years and prospects for the future in the field of microbial oceanography and limnology. Adv Oceanography Limnol. 1 (1), 97-141 (2010).
  6. Tucker, S., Pollard, P. Identification of cyanophage Ma-LBP and infection of the cyanobacterium Microcystis aeruginosa from an Australian subtropical lake by the virus. Appl Environ Microbiol. 71 (2), 629-635 (2005).
  7. Bhardwaj, A., et al. Cyanobacteria: a key player in nutrient cycling. Cyanobacteria. , 579-596 (2024).
  8. Douterelo, I., et al. Methodological approaches for studying the microbial ecology of drinking water distribution systems. Water Res. 65, 134-156 (2014).
  9. Brandt, J. P., Flannigan, M. D., Maynard, D. G., Thompson, I. D., Volney, W. J. A. An introduction to Canada's boreal zone: ecosystem processes, health, sustainability, and environmental issues. Environ Rev. 21 (4), 207-226 (2013).
  10. Ramanan, R., Kim, B. H., Cho, D. H., Oh, H. M., Kim, H. S. Algae-bacteria interactions: evolution, ecology and emerging applications. Biotechnol Adv. 34 (1), 14-29 (2016).
  11. Atkinson, C. L., Capps, K. A., Rugenski, A. T., Vanni, M. J. Consumer-driven nutrient dynamics in freshwater ecosystems: From individuals to ecosystems. Biol Rev. 92 (4), 2003-2023 (2017).
  12. Mojica, K. D., Brussaard, C. P. Factors affecting virus dynamics and microbial host-virus interactions in marine environments. FEMS Microbiol Ecol. 89 (3), 495-515 (2014).
  13. Graham, E. B., et al. Microbes as engines of ecosystem function: when does community structure enhance predictions of ecosystem processes. Front Microbiol. 7, 214(2016).
  14. Ceballos, R. M., Stacy, C. L. Quantifying relative virulence: when µ max fails and AUC alone just is not enough. J General Virol. 102 (1), 001515(2021).
  15. Hour, S., Pierce, A. J., Heng, S. Y., Plymale, R., Ceballos, R. M. Quantifying Resilience in Single-Host/Single-Virus Infections. Appl Microbiol. 5 (1), 18(2025).
  16. Ceballos, R. M., et al. Differential virus host-ranges of the Fuselloviridae of hyperthermophilic Archaea: implications for evolution in extreme environments. Front Microbiol. 3, 295(2012).
  17. Ceballos, R. M., Drummond, C. G., Stacy, C. L., Padilla-Crespo, E., Stedman, K. M. Host-dependent differences in replication strategy of the Sulfolobus spindle-shaped virus strain SSV9 (aka, SSVK1): infection profiles in hosts of the family Sulfolobaceae. Front Microbiol. 11, 1218(2020).
  18. Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. Microbiology. 111 (1), 1-61 (1979).
  19. Kliphuis, A. M., Janssen, M., van den End, E. J., Martens, D. E., Wijffels, R. H. Light respiration in Chlorella sorokiniana. J Appl Phycol. 23, 935-947 (2011).
  20. Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. J Vis Exp. (111), e54001(2016).
  21. Noroozi, M., Amozegar, M. A., Rahimi, R., Shahzadeh Fazeli, S. A., Bakhshi Khaniki, G. The isolation and preliminary characterization of native cyanobacterial and microalgal strains from lagoons contaminated with petroleum oil in Khark Island. Biol J Microorg. 5 (20), 33-41 (2017).
  22. Nübel, U., Garcia-Pichel, F., Muyzer, G. PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria. Appl Environ Microbiol. 63 (8), 3327-3332 (1997).
  23. Tragin, M., Lopes dos Santos, A., Christen, R., Vaulot, D. Diversity and ecology of green microalgae in marine systems: an overview based on 18S rRNA gene sequences. Perspect. Phycol. 3 (3), 141-154 (2016).
  24. Uchida, H., et al. A coupled assay system for the lysis of cyanobacteria. Japanese J Water Treatment Biol. 34 (1), 67-75 (1998).
  25. Drummond, C. Characterization of Sulfolobus. Spindle-shaped Virus replication. , Portland State University. (2010).
  26. Flores, E., Wolk, C. P. Production, by filamentous, nitrogen-fixing cyanobacteria, of a bacteriocin and of other antibiotics that kill related strains. Arch Microbiol. 145, 215-219 (1986).
  27. Wick, C., McCubbin, P. Characterization of purified MS2 bacteriophage by the physical counting methodology used in the integrated virus detection system (IVDS). Toxicol Methods. 9 (4), 245-252 (1999).
  28. Marei, E. M., Elbaz, R., Hammad, A. Induction of temperate cyanophages using heavy metal-copper. Int J Microbiol Res Rev. 5 (5), 472(2013).
  29. Bratchkova, A., Kroumov, A. D. Microalgae as producers of biologically active compounds with antibacterial, antiviral, antifungal, antialgal, antiprotozoal, antiparasitic and anticancer activity. Acta Microbiol Bulgarica. 36 (3), 79-89 (2020).
  30. Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. The virulence index: a metric for quantitative analysis of phage virulence. Phage. 1 (1), 27-36 (2020).
  31. Omata, T., Murata, N. Isolation and characterization of three types of membranes from the cyanobacterium (blue-green alga) Synechocystis PCC 6714. Arch Microbiol. 139, 113-116 (1984).
  32. Wilson, W. H., Joint, I. R., Carr, N. G., Mann, N. H. Isolation and molecular characterization of five marine cyanophages propagated on Synechococcus sp. strain WH7803. Appl Environ Microbiol. 59 (11), 3736-3743 (1993).
  33. Grasso, C. R., et al. A review of cyanophage-host relationships: Highlighting cyanophages as a potential cyanobacteria control strategy. Toxins. 14 (6), 385(2022).
  34. Srivastava, A., Gupta, N., Mishra, A. K. Cyanophages: interacting mechanism and evolutionary significance. Cyanobacteria. , 255-282 (2024).
  35. Cai, L., et al. Abundant and cosmopolitan lineage of cyanopodoviruses lacking a DNA polymerase gene. ISME J. 17 (2), 252-262 (2023).
  36. Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86 (4), 295-335 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Отбор проб фотосинтезирующих микробов и их вирусов из окружающей среды: от полевых условий к лабораторным
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.