Визуализация органоидов сетчатки с клеточным разрешением

Краткое содержание

Этот протокол сочетает в себе оптическое очищение и иммуномечение для полнообъемной конфокальной визуализации органоидов сетчатки целиком. Он сохраняет 3D-структуру, обеспечивая детальную визуализацию ключевых нейронных путей, улучшая изучение созревания сетчатки, пространственной организации и ее потенциального применения в моделировании заболеваний и персонализированной медицине.

Аннотация

Органоиды сетчатки, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, представляют собой сложные 3D-структуры, имитирующие сетчатку человека, предлагая мощную платформу для изучения развития сетчатки, механизмов заболевания и потенциальных терапевтических стратегий. Более того, поскольку они получаются от пациентов, они становятся все более популярными, поскольку имеют большие перспективы в качестве инструмента персонализированной медицины. В отличие от обычных 2D-клеточных культур, органоиды сетчатки сохраняют нативную 3D-архитектуру сетчатки, что позволяет получать более реалистичное представление и проводить более физиологически значимые исследования. Тем не менее, их структурная сложность, высокая плотность клеток и разнообразный состав создают значительные проблемы для характеризации.

Чтобы решить эти проблемы и улучшить наше понимание созревания органоидов сетчатки при сохранении 3D-контекста, мы объединили методы оптического клиринга с иммуномаркировкой, чтобы визуализировать всю структуру органоидов цельного крепления с помощью конфокальной микроскопии. Для этого мы использовали метод очистки, совместимый с объективами с низкой и большой числовой апертурой, что облегчает получение полнообъемной визуализации и захватывает определенные области интереса с клеточным разрешением. Используя этот подход, мы определили морфологию и распределение в 3D трех основных нейронных путей, ответственных за передачу визуальной информации: колбочек и палочек фоторецепторов, биполярных и ганглиозных клеток. Наши результаты проливают больше света на методы визуализации для решения проблемы пространственной организации клеток сетчатки в органоиде.

Введение

Органоиды сетчатки

Органоиды сетчатки представляют собой сложные трехмерные структуры, которые имитируют сетчатку человека, предлагая ценную платформу для изучения развития сетчатки, механизмов заболевания и потенциальных терапевтических^{стратегий}. Они поддерживают естественную 3D-архитектуру сетчатки, демонстрируют транскриптомную точность и функциональную компетентность, воспроизводя фототрансдукцию и синаптическую связь². Кроме того, они близко имитируют развитие in vivo ^3,4, что позволяет получить более реалистичное представление по сравнению с плоскими клеточными культурами. В предыдущих исследованиях Isla-Magrané et al. разработали двухэтапный протокол получения многоглазных органоидов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC), для моделирования клеточных особенностей человеческого глаза в процессе развития ^5,6. Из-за нехватки тканей плода исследования развития человеческого глаза были ограничены анатомическими исследованиями.

Органоиды сетчатки, полученные с помощью этого протокола, продемонстрировали надлежащую слоистость и содержали все основные подтипы клеток сетчатки, такие как фоторецепторы, биполярные клетки, ганглиозные клетки, амакриновые и горизонтальные клетки, а также макроглию, а также ключевые морфологические особенности и правильную пространственную организацию и связи. Органоидные модели, хотя и являются потенциальным решением, демонстрируют значительную изменчивость, что затрудняет достижение согласованных результатов. Таким образом, существует острая необходимость в использовании различных передовых технологий в более надежных человеческих моделях. На сегодняшний день эти органоиды изучались только с использованием гистологических срезов, так как их сложный клеточный состав, плотность и размер препятствуют проникновению света, что приводит к плохим оптическим характеристикам визуализации в более глубоких слоях, что ограничивает всесторонний анализ.

Визуализация всего крепления

Традиционные гистологические методы, которые включают в себя срезы и окрашивание неподвижных тканей, могут предоставить подробную информацию о конкретных областях, но не могут охватить общую архитектуру и пространственные отношения внутри всего органоида. Чтобы преодолеть это ограничение, визуализация всего монтирования становится ценным инструментом для изучения органоидов сетчатки. Визуализация всего монтирования позволяет визуализировать весь органоид в его неповрежденной 3D-форме, сохраняя пространственное распределение типов клеток и компонентов внеклеточного матрикса. Этот подход особенно полезен для исследования клеточного состава внутри и между органоидами, обеспечивая более полное понимание процессов их развития и функциональной организации. Однако из-за их клеточной плотности и уплотнения органоиды сетчатки непрозрачны (рис. 1, неочищенный). Присущая образцам непрозрачность вызывает рассеяние света, что затрудняет детальную визуализацию внутренних структур с помощью микроскопии. В этом случае методы оптической очистки становятся мощным инструментом.

Методы оптической очистки

Оптическая очистка относится к физико-химической обработке, которая делает толстые биологические образцы прозрачными путем гомогенизации градиентов показателя преломления (RI) ткани в соответствии с градиентами очищающего агента и удаления светопоглощающих веществ⁷. Эти методы значительно уменьшают рассеяние света и повышают прозрачность. Эта трансформация позволяет нам видеть сквозь весь органоид сетчатки, что позволяет всесторонне анализировать его сложную клеточную организацию и морфологию с помощью методов визуализации всего монта. На практике это достигается путем пропитки образца веществом с высоким RI и удаления липидов и пигментов.

Существуют различные методы очистки, различающиеся по различным аспектам (например, степень прозрачности, совместимость с микроскопическими методами, образцами и флуоресцентными молекулами, осуществимость, продолжительность), но ни один из них не выделяется как лучший общий протокол⁸. Они классифицируются на четыре основные группы: (1) простые иммерсионные, (2) гидрофобные на основе органических растворителей, (3) основанные на гипергидратации и (4) основанные на трансформации тканей или гидрогеле, как хорошо резюмировали Avilov et al⁷. Все методы включают этап сопоставления RI, обычно путем погружения образца в раствор, который соответствует среднему RI ткани. При гидрофобных методах липиды и вода удаляются путем погружения образца в органический растворитель с возрастающей концентрацией (например, метанол или пропанол).

Представленный протокол представляет собой оптимизированный метод, который объединяет оптическое очищение с иммуномечением для облегчения 3D-визуализации органоидов сетчатки с помощью конфокальной микроскопии, что позволяет получать полнообъемную визуализацию с сохранением структурной целостности. Этот подход позволяет идентифицировать ключевые типы клеток сетчатки в органоиде, предоставляя исследователям мощный инструмент для изучения созревания органоидов сетчатки и пространственной организации в физиологически значимом контексте.

Протокол

1. Получение флуоресцентных вторичных антител на заказ

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот подход служит альтернативой использованию коммерческих флуоресцентных антител (см. обсуждение преимуществ получения флуоресцентных вторичных антител). Кроме того, этот протокол может быть использован для конъюгации флуорофоров с первичными антителами в случае, если необходимо провести прямую иммунофлуоресценцию, а флуоресцентное первичное антитело не является коммерчески доступным. Контроль соотношения флуорофоров и антител путем регулировки количества флуорофора в реакции мечения приводит к образованию более ярких конъюгированных антител. Однако изготовленные на заказ вторичные антитела менее стабильны, а концентрация полученного конъюгата в 10 раз ниже, чем у коммерческих флуоресцентных антител. Этот протокол адаптирован из работы, описанной Bálint et al⁹.

1. Растворите 1 мг флуорофора в безводном ДМСО и аликвоте в пробирках до получения 0,02 мг флуорофора на пробирку. Удалите весь ДМСО с помощью скоростного вакуумного концентратора, работающего в течение 1 часа 30 минут. Хранить аликвоты при температуре -20 ºC в защищенном от света месте. Для Alexa Fluor 405 ультрачистый H₂O является подходящим растворителем для изготовления аликвот.
2. Для проведения реакции мечения растворите одну аликвоту флуорофора в 1-10 мкл ДМСО (или сверхчистого H₂O для Alexa Fluor 405).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точное количество ДМСО определяется с помощью предыдущих тестов на контрольное сопряжение. Эти тесты проводятся, когда необходимо использовать новую партию флуорофора (или когда заканчивается предыдущая партия флуорофора), или когда новый флуорофор используется впервые в конъюгации. Контрольный тест конъюгации включает в себя проведение реакций мечения различными количествами флуорофора для определения оптимального соотношения флуорофора и антитела в конъюгате. В нашем случае оптимальное соотношение обычно находится в пределах от 3 μл до 5 μл.
3. Инкубировать 50 мкл вторичного IgG (или первичного), 6 мкл 1 М NaHCO₃ и 1-5 мкл флуорофора в течение 40 мин при комнатной температуре (ОТ) на качающейся платформе, защищенной от света.
4. Пока реакция продвигается, подготовьте колонны для исключения размера очистки, сняв крышки и пропустив буфер. Уравновесьте колонку (по одной для каждой реакции мечения), пропустив через колонку 3 x 2-3 мл PBS. Если последний этап уравновешивания завершится до окончания инкубации, установите крышки обратно, чтобы они не высохли, и дождитесь окончания реакции маркировки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очистительные колонны для исключения размера работают под действием силы тяжести. Следите за тем, чтобы колонна ни в один момент не пересохла, иначе реакция очистки не будет работать должным образом.
5. Когда реакция завершится (шаг 1.3), добавьте 140 μL PBS в реакцию мечения, чтобы получить объем примерно 200 μL и сделайте его вихревым. Добавьте этот раствор в центр колонки, дайте образцу войти в колонку, и после того, как последняя капля выйдет, надавите, добавив 550 μL PBS. Когда жидкость перестанет падать, вытряхните, добавив 300 мкл PBS, и соберите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
6. Рассчитайте концентрацию антител и коэффициенты мечения, измерив абсорбцию образца при длине волны 280 нм и абсорбцию используемых флуорофоров. Примените закон Бера-Ламберта для определения концентрации (в молярности) следующим образом:
   
   Где A обозначает поглощение, ε — коэффициент молярного затухания, а CF₂₈₀ — это мера поглощения конкретного флуорофора на длине волны 280 нм, которая служит поправочным коэффициентом. Тогда концентрация антитела составляет:
   
   А коэффициент маркировки составляет:
   
7. Храните меченые антитела при температуре 4 ºC в защищенном от света месте до 6 месяцев.

2. Иммунофлуоресцентное мечение

1. Зафиксировать органоиды с 4% параформальдегидом (PFA) в RT на 45 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Инкубируйте органоиды с раствором для извлечения антигена (шаги 2.2 и 2.3) для усиления иммунореактивности антигенов.
2. Приготовьте 40 мл раствора для извлечения антигена, смешав 0,117 мг трехосновного дигидрата цитрата натрия с ультрачистым_H2Oи доведите до pH 9.
3. Инкубировать органоиды с раствором для извлечения антигена с легким встряхиванием (30 об/мин) при 60 °C в течение 1 ч.
4. Пермеабилизируйте органоиды PBST (PBS с 1% Triton X-100) с легким встряхиванием при RT в течение 4 ч.
5. Блокируйте органоиды блокирующим раствором (2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) с 0,1% Triton X-100) в режиме RT на ночь (или в течение 1 дня).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации первичных и вторичных антител зависят от конкретного антитела. Для иммунофлюоресценции цельных образцов мы используем более высокую концентрацию по сравнению с срезанными образцами. Мы инкубируем первичное антитело при концентрации 10 мкг/мл, что в большинстве случаев соответствует 1:100 от запаса (табл. 1). Мы инкубируем наши специально изготовленные вторичные антитела в концентрации 20-50 мкг/мл.
6. Инкубировать органоиды с первичными антителами, разведенными в промывном растворе (0,1% BSA с 0,1% Triton X-100) при 4 °C в течение 2 дней с легким встряхиванием.
7. Промойте органоиды в течение 3 х 15 минут в моющем растворе с легким встряхиванием при RT.
8. Инкубировать органоиды с вторичными антителами, разведенными в моющем растворе при 4 °С, в течение 2 суток с легким встряхиванием.
9. Промойте органоиды в течение 3 х 15 минут в моющем растворе с легким встряхиванием при RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После иммуномечения можно инкубировать флуоресцентные красители по выбору. Обычно мы используем флуоресцентные маркеры ядер, такие как DAPI (1:1000) и DRAQ5 (1:500) или фаллоидин (1:100) для визуализации сети актиновых филаментов.
10. Органоиды инкубировать с флуоресцентными красителями, разведенными в моющем растворе при температуре RT, в течение 1 ч с легким встряхиванием.
11. Промойте органоиды в течение 3 х 15 минут в моющем растворе с легким встряхиванием при RT.

3. Оптическое очищение с помощью FluoClear BABB

ПРИМЕЧАНИЕ: 1-пропанол может повредить пластиковые контейнеры, особенно при длительном воздействии. Чтобы быть в безопасности, используйте стеклянную тару.

1. Этап обезвоживания
   1. Готовьте 1-пропаноловые растворы в ультрачистых_Н2О в заданных процентах (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) и затем доводите до рН 9,5 с помощью триметиламина.
      ВНИМАНИЕ: Триэтиламин токсичен при вдыхании. Работа под вытяжным шкафом. Растворы можно использовать повторно при правильном хранении (в хорошо закрытой таре). Отрегулируйте pH перед использованием.
   2. Образцы инкубируют с возрастающим градиентом растворов 1-пропанола (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) в течение 2 ч каждый при 30 °С с легким встряхиванием.
   3. Инкубируйте образцы со 100% 1-пропанолом в течение ночи при 30 °C с легким встряхиванием.
2. Этап очистки
   ВНИМАНИЕ: BABB - это мощная смесь растворителей, которая известна своей способностью растворять или значительно повреждать многие пластмассы. Чтобы быть в безопасности, используйте стеклянные емкости с совместимыми крышками и работайте внутри вытяжного шкафа.
   1. Приготовьте BABB, смешав бензиловый спирт (BA) и бензилбензоат (BB) в соотношении 1:2.
   2. Погрузите образцы в BABB в RT на ночь.
   3. Перед созданием образа обновите BABB.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для органоидов диаметром ~1 мм BABB вызывает эффект очищения, который проявляется через десятки минут. В зависимости от размера и характера образца степень очистки может быть разной и/или требовать более длительного времени воздействия раствора для очистки. Мы рекомендуем получать изображения до и после погружения BABB, чтобы улучшить протокол очистки.
   4. Храните очищенные от BABB образцы раствором BABB в течение длительного времени при температуре 4 °C. Беречь от света, чтобы сохранить флуоресценцию.

4. Получение изображений с помощью всего крепления

1. С помощью стеклянной пипетки поместите органоид в чашку Петри со стеклянным дном с каплей BABB. Убедитесь, что образец соприкасается с поверхностью покровного стекла.
   ВНИМАНИЕ: Следите за тем, чтобы капля BABB, содержащая образец, не соприкасалась с пластиковыми краями чашки, иначе она расплавит пластик, поставив под угрозу образец и качество изображения.
2. С помощью инвертированного конфокального лазерного сканирующего микроскопа, оснащенного объективами малого и большого увеличения, можно получить изображения Z-стека, чтобы получить полное 3D-представление об образце с клеточной детализацией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования был использован воздушный объектив с 10-кратной числовой апертурой (NA) 0,4 и объектив с 63-кратным числовым отверстием 1,4 с шагом 3,5 мкм и 1 мкм соответственно.

5. Обработка изображений

1. Повторная калибровка шага сбора Z-стека с учетом несоответствия показателя преломления (RI) между очищающим раствором и иммерсионной средой.
   1. Рассчитайте перекалиброванный размер шага следующим образом:
      
      Для образца, встроенного в BABB, полученного с помощью воздушного объектива с шагом 3,5 мкм, он будет выглядеть следующим образом:
      
   2. С помощью ImageJ измените глубину вокселя (нажмите на Image | Свойства...) для пересчитанного размера шага.
2. Создание проекций изображений Z-стека.
   1. Используя ImageJ, внимательно изучите Z-стек (нажмите на Image | Стеки | Ортогональные виды). Появятся изображения органоида сетчатки XY, XZ и YZ.
   2. Сохраните нужные области интереса (нажмите на Файл | Сохранить как...).
3. Создайте анимацию 3D-рендера Z-стека с помощью программного обеспечения для обработки (см. Таблицу материалов).
   1. Выберите каналы для визуализации, установив их флажки.
   2. Настройте Z-плоскости для визуализации внутренней части образца (включите опцию Обрезка в флажке).
   3. Запишите анимацию с помощью Редактора фильмов (включите Редактор фильмов в чекбоксе). Перетаскивайте, увеличивайте и уменьшайте масштаб непосредственно с помощью мыши. Нажмите кнопку Добавить , чтобы добавить другой клип для анимации. Если вы настраиваете Z-плоскости, включите опцию «Отсечь плоскости » (нажмите на «Настройки...» | отметьте флажок «Обрезать плоскости »).

Результаты

Рисунок 1: Сравнение трех методов очистки. Слева: Светлопольные изображения (A) неочищенных и (B-D) очищенных образцов. Справа: Z-стек с ортогональными изображениями xz и yz 90 DIV органоидов сетчатки, окрашенных ядерным маркером DRAQ5 (желтый), полученный с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, оснащенного 10-кратным объективом воздуха (RI = 1,00). (А) Неочищенный органоид сетчатки (N = 3). PFA-фиксированные органоиды сетчатки недостаточно прозрачны для 3D-визуализации. (B) Фруктоза/глицерин-очищенный органоид (N = 3). (C) ECi-очищенный органоид (N = 3). (D) Органоид FluoClear BABB-очищенный (N = 3). Масштабные линейки = 100 μм. Сокращения: BF = светлое поле; CLSM = конфокальный лазерно-сканирующий микроскоп; RI = показатель преломления; PFA = параформальдегид; ECi = этилциннамат; BABB = бензиловый спирт/бензилбензоат; DIV = дни in vitro. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Сравнение методов оптического клиринга для иммунофлуоресцентных исследований в нейроретинальных органоидах

Здесь мы представляем результаты трех методов очистки, чтобы продемонстрировать эффективность FluoClear BABB для придания прозрачности органоидам сетчатки. На рисунке 1 мы наблюдаем органоиды сетчатки, очищенные фруктозой/глицерином (рисунок 1B), ECi (рисунок 1C) и флуоклир BABB (рисунок 1D). Тестируемые методы очистки были выбраны потому, что было доказано^, что все они^{совместимы} с иммунофлуоресцентным окрашиванием и сохраняют флуоресценцию эндогенных белков (например, GFP, присутствующих в GCaMPs).

Фруктоза/глицерин¹² — это нетоксичный, простой, иммерсионный протокол очистки, который не требует обезвоживания, что значительно сокращает время обработки по сравнению с другими методами. Сообщалось, что он эффективен для прозрачности органоидов, полученных из различных тканей: дыхательных путей, почек, печени^{и рака молочной} железы человека.

ECi (Ethyl Cinnamate)¹¹ является одобренным FDA пищевым ароматизатором и добавкой для косметики^13,14, считается безвредным, и зарекомендовал себя как отличный очищающий реагент для тканей млекопитающих. Он известен своей способностью к быстрому очищению и минимальным искажением тканей. Он классифицируется как гидрофобный метод очистки, но по сравнению с растворителями на основе BABB он не токсичен и дольше сохраняет флуоресценцию флуоресцентных белков (до 14 дней). Как и в большинстве протоколов очищения, ЭКи требует предварительного этапа обезвоживания. Для получения оптимальных результатов этот этап достигается путем погружения образца в растворы с постепенно возрастающей концентрацией спирта. Поскольку ЭКи не вреден, после очистки образца его можно безопасно обрабатывать и хранить в пластиковых контейнерах. Тем не менее, этапы обезвоживания выполняются с использованием 1-пропанола, органического растворителя, с которым необходимо работать под вытяжным шкафом и хранить в стеклянных контейнерах.

FluoClear BABB¹⁰ представляет собой вариант гидрофобного протокола, основанного на бензиловом спирте/бензилбензоате (BABB) в качестве раствора для согласования показателя преломления. Известно, что он очень токсичен и коррозичен, поэтому с ним нужно обращаться осторожно. FluoClear BABB был описан как улучшенная версия, которая сохраняет GFP и RFP лучше, чем предыдущие версии, и позволяет использовать либо 1-пропанол, либо трет-бутанол в качестве агентов для обезвоживания.

Чтобы оценить эффективность трех методов очистки, мы визуализировали Z-плоскости с помощью конфокального микроскопа, оснащенного 10-кратным воздушным объективом NA0,4, обеспечивающим большое поле зрения (FoV) 2,5 x 2,5 x 2,56 мм для захвата всего объема органоида сетчатки. Мы использовали органоиды сетчатки на промежуточной стадии созревания (90 дней in vitro (DIV)), которые содержат все нейроны сетчатки (ганглиозные клетки, биполярные клетки и фоторецепторы), достигая клеточной плотности и уплотнения и, таким образом, являясь непрозрачными. Как объяснялось во введении, оптическое очищение достигается, когда RI согласован по всему объекту, который должен быть изображен. Таким образом, иммерсионный носитель, используемый для визуализации, значительно повлияет на достигнутую прозрачность. В таблице 2 подробно описаны RI иммерсионных сред и испытанные решения для очистки.

	Решение	Показатель преломления
Иммерсивные носители	Воздух	1
	Вода	1.33
	Глицерин	1.45
	Масло	1.51
Решения для клиринга	Фруктоза/глицерин	1.468
	Эки	1.558
	ФлуоКлир БАББ	1.56

Таблица 2: Показатель преломления (RI) иммерсионных сред, наиболее часто используемых для световой микроскопии, и методология оптического очищения, протестированная для очистки органоидов сетчатки. Сокращение: RI = показатель преломления.

Сравнивая полученные конфокальные изображения (рис. 1, правая панель), обработка фруктозой/глицерином привела к наименьшему улучшению прозрачности, ограничивая визуализацию слоев сетчатки и препятствуя визуализации органоидного ядра. ECi достиг лучшей прозрачности, что позволило визуализировать слои сетчатки, но все еще ограничивал визуализацию органоидного ядра сетчатки из-за рассеяния света, которое препятствовало обнаружению флуоресценции от внутренних частей образца. FluoClear BABB обеспечил наибольшее улучшение прозрачности, позволив получить четкую визуализацию как ядра, так и коры органоида сетчатки с более высоким разрешением и аналогичной интенсивностью флуоресценции.

Стоит отметить, что протоколы ECi и FluoClear BABB вызывали заметную усадку образца, о чем свидетельствуют соответствующие изображения в светлом поле каждого очищенного органоида сетчатки (рис. 1, левая панель). Усадка образца происходит из-за предыдущих этапов обезвоживания, которые удаляют воду, и именно по этой причине протокол фруктозы/глицерина не уменьшает образец. Это сокращение, однако, предоставляет уникальную возможность для более глубоких исследований. Хотя он сжимает общий размер органоида и потенциально недооценивает внутренние расстояния, он также увеличивает компактность. Эта изотропная компактность, относительно равномерная во всех направлениях, позволяет нам использовать объективы с большим увеличением и превосходной разрешающей способностью (из-за их большего NA), которые в противном случае отображали бы только самый внешний слой ячеек из-за их более коротких рабочих расстояний (WD). Например, воздушный объектив 10x NA 0.4 обеспечивает WD 2,53 мм, в то время как масляный объектив 63x NA 1.4 со значительно лучшим разрешением имеет WD всего 0,14 мм. Используя более компактные органоиды, очищенные от BABB, мы можем эффективно преодолеть это ограничение и получить изображение с высоким разрешением более глубоких структур, таких как слой ганглиозных клеток, расположенный внутри органоида (рис.

Рисунок 2: 3D-реконструкции органоида сетчатки (200 DIV), очищенного с помощью FluoClear BABB, полученного с помощью лазерного сканирующе-конфокального микроскопа. Микроскоп был оснащен (А) 10-кратным воздушным объективом NA 0,4 и (В) 63-кратным масляным объективом NA 1,5. Расчистка и визуализация позволяют визуализировать весь органоид и в то же время получить изображение с мелкими деталями некоторых областей интереса. DRAQ5 (ядра), опсин B+GR (колбочки) и TUJ1 (нейроны). Сокращения: DIV = дни in vitro; BABB = бензиловый спирт/бензилбензоат; NA = числовая апертура. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В заключение, мы выбрали FluoClear BABB, поскольку он обеспечивает превосходную визуализацию всего органоида сетчатки с высоким разрешением и соотношением сигнал/шум. Важно отметить, что BABB-индуцированная усадка, уплотняющая органоид изотропно. Такая компактность позволила нам использовать объективы с большим увеличением для детального исследования более глубоких структур. Наконец, совместимость BABB с масляными иммерсионными объективами обеспечила минимальное рассеяние света и высокое качество изображения при увеличении.

Идентификация и пространственно-временное распределение клеток сетчатки в органоидах по мере созревания

Следуя описанной здесь методике и используя визуализацию всего массива на органоидах, иммунопомеченных специфическими антителами, подробно описанными в таблице 1, мы изучили, как формируется нейросетчатка из органоидов на разных стадиях созревания, от ранних стадий развития (40 DIV) до более зрелых стадий (до 250 DIV), демонстрируя четко определенную трехмерную структуру. Такой подход позволил нам визуализировать формирование и организацию различных компонентов сетчатки, описанных в этом разделе.

Антитело	Специфичность	Цели	Расположение в Retina	[ ]конечный (разбавление)	Хозяин	#RRDI
Анти-GFP	GFP	GFP	GCaMP6s-положительные клетки	10 мкг/мл (1:1 000)	Ч	AB_300798
ЧХ10	Вентромедиальный гипоталамус гомеобокс 2 (Vsx2)	Фактор транскрипции	Нейробласты и биполярные клетки	10 мкг/мл (1:2)	Госпожа	AB_10842442
Опсин Б	Опсин синий	Наружный сегмент голубых шишек	Голубые шишки	10 мкг/мл (1:100)	Рб	AB_177457
Опсин РГ	Опсин зеленый и красный	Наружный сегмент зеленых и красных шишек	Зеленые и красные шишки	10 мкг/мл (1:100)	Ч	AB_11213279
РЕКОВ	Рекаверин	Кальций-связывающий белок	Фоторецепторы	10 мкг/мл (1:100)	Рб	AB_2253622
RHO (RET-P1)	Родопсин	Наружный сегмент стержней	Стержней	63 мкг/мл (1:100)	Госпожа	AB_260838
ТУЙ1	Нейрон-специфичный бета-тубулин класса III	Изоформа тубулина бета-III	Нейронов	50 мкг/мл (1:200)	Госпожа	AB_2315514

Таблица 1: Первичные антитела, протестированные в органоидах сетчатки на разных стадиях созревания. Сокращения: курица = ч; Мышь = мс; Кролик = Rb.

Иммуномечение различными маркерами позволило идентифицировать клетки, соответствующие этой слоистой структуре. TUJ1, специфичный для нейронов бета-тубулин класса III (Таблица 1), обычно используемый в срезанных образцах для маркировки ганглиозных клеток сетчатки (РГК)¹⁵ из-за его распространенности. TUJ1 присутствует во всех нейронах сетчатки¹⁶ и на ранних стадиях нейронной дифференцировки¹⁷. Экспрессия TUJ1 была обнаружена на всех стадиях созревания в коре органоида, что позволило проследить за организацией клеток сетчатки в слоях. На рисунке 3 мы можем видеть, что на ранних стадиях развития (40 DIV) TUJ1 равномерно распределен в едином, тонком и равномерном слое. С 90 DIV апикальная область органоида становится более плотной и компактной, так как она населена гораздо большим количеством клеток, которые накапливаются в апикальной области. При 170 DIV органоид сетчатки приобрел 3D-стратифицированную структуру сетчатки с дискретным апикальным слоем. При 200 DIV мы можем видеть, что есть и другие клеточные тела, простирающиеся в длинные проекции, которые гораздо менее многочисленны и находятся глубже внутри органоида. Наконец, при 250 DIV очевидна структура трех ядерных слоев, соответствующих: (1) внешнему ядерному слою (ONL), состоящему из зрелых фоторецепторов, (2) внутреннему ядерному слою (INL), в основном населенному биполярными клетками, и (3) слое ганглиозных клеток (GCL), образованному RGC, как показано на рисунке 3 (внизу справа).

Рисунок 3: Организация нейронов при созревании органоидов сетчатки в слоистой структуре. Z-стековые проекции конфокальных изображений очищенных от FluoClear BABB органоидов сетчатки, окрашенных TUJ1. На 40 DIV слоистые структуры не образуются. Начиная со 170 DIV, нейросетчатка расслаивается на слои. Обозначены ядерные слои сетчатки: ONL, INL и GCL (желтые стрелки). Масштабные линейки = 25 μм (слева) и 10 μм (справа). Сокращения: BABB = бензиловый спирт/бензилбензоат; DIV = дни in vitro; ONL = внешний ядерный слой, INL = внутренний ядерный слой; GCL = слой ганглиозных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

С помощью этой методологии мы также могли бы сообщать о сборке пучков аксонов. Как видно на увеличенных участках (рис. 4), мы наблюдали пучки волокон, простирающиеся от внутреннего ядра органоида к периферии, проецируемые в области, которые находятся далеко друг от друга (до 1 мм). Интересно, что формирование этих волокон происходило на разных стадиях созревания. По мере роста органоида волокна утолщаются, становятся более сложными и собирают больше клеточных проекций (Рисунок 4 [250 DIV] и Дополнительное видео S1). РГК являются первыми клетками, которые дифференцируются во время развития сетчатки, и, таким образом, они могут организовывать свои проекции с самых ранних стадий развития. РГК могут инициировать удлинение нейритов еще до того, как установятся их окончательное положение в органоиде. Наши результаты согласуются с предыдущими отчетами¹⁸ , которые демонстрируют формирование структуры, подобной зрительному нерву, в кокультурах органоидов сетчатки и мозга.

Рисунок 4: Сборка нейронных проекций на различных стадиях созревания. Волокна простираются от внутренних плоскостей органоида сетчатки к периферии. Формирование этих волокон происходило на разных стадиях созревания, от 40 DIV до самой старой изученной точки созревания (250 DIV). Масштабные линейки = 25 μм (верхний ряд) и 100 μм (нижний ряд). Сокращения: DIV = дни in vitro. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В апикальном участке органоидов сетчатки некоторые фоторецепторы созревают в палочки, которые содержат родопсин во внешних сегментах для обнаружения монохроматического зрения в условиях тусклого освещения, в то время как другие созревают в колбочки, которые экспрессируют синие, зеленые и красные опсины и отвечают за цвет и остроту зрения в условиях яркого освещения. На рисунке 5 (вверху) показана популяция колбочек фоторецепторов в органоиде сетчатки, которые экспрессируют синие и/или зеленые/красные опсины (ОПСИН B и GR, таблица 1). Эти клетки демонстрируют удлиненную морфологию с различными опсинами, распределенными по всему телу клетки, за исключением ядра. Примечательно, что внешний кончик этих клеток кажется более ярким, потенциально напоминая внешний сегмент фоторецептора, содержащего диски. Для визуализации как синих, так и зелено-красных колбочек с использованием одного канала для обнаружения флуоресценции, вторичные антитела против синего опсина (OPSIN B, кролик) и зеленого/красного опсина (OPSIN GR, курица) были помечены одним и тем же флуорофором, что оптимизировало использование канала и упростило процесс визуализации, избегая при этом спектрального перекрытия. Подмножество фоторецепторных клеток на рисунке 5 (внизу) экспрессировало родопсин (RHO, Таблица 1 и Дополнительное видео S2), что недвусмысленно указывает на их принадлежность к палочкам. Эти палочковидные клетки имеют ранее описанную удлиненную морфологию, при этом ядро расположено в центре, а богатое опсинами клеточное тело ориентировано на периферию органоида.

Рисунок 5: Органоиды сетчатки на более поздних стадиях развития. Вверху: зрелые шишки, внизу: прутьям. Z-проекция конфокальных изображений очищенных от FluoClear BABB органоидов сетчатки, окрашенных TUJ1 (нейроны), DRAQ5 (ядра), опсин-B+GR (колбочки) и RHO (палочки). Чертежи со схемами приведены для справки. Масштабные линейки = 100 μм (слева) и 10 μм (справа). Сокращения: DIV = дни in vitro; BABB = бензиловый спирт/бензилбензоат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Биполярные клетки и их пространственно-временное распределение были идентифицированы путем отслеживания экспрессии Chx10 (также известной как Vsx2) на протяжении 250 DIV созревания (рис. 6). Chx10 (табл. 1) является фактором транскрипции, критически важным для пролиферации клеток-предшественников и определения биполярных клеток в развивающейся сетчатке^19,20. Как гомеобоксный ген, он экспрессируется на ранних стадиях развития в нейробластах, а в зрелой сетчатке встречается исключительно в биполярных клетках. На рисунке 6 показано распределение Chx10-положительных клеток в развивающемся органоиде. Первоначально наблюдаются многочисленные Chx10-положительные клетки, распространяющиеся от периферии нейроретинальной области к центру. По мере созревания органоида эти клетки становятся менее распространенными и перемещаются в INL, где находятся биполярные клетки.

Рисунок 6: Экспрессия Chx10 за 250 DIV созревания. Z-проекционные конфокальные изображения очищенного FluoClear BABB органоида сетчатки, окрашенного DRAQ5 (ядра) и Chx10 (нейробласты и зрелые биполярные клетки). Масштабная линейка = 100 мкм. Сокращения: DIV = дни in vitro; BABB = бензиловый спирт/бензилбензоат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Наконец, мы демонстрируем, что эндогенная GFP из маркеров кальция GCaMP сохраняется после очистки с помощью этой методологии. На рисунке 7 мы можем наблюдать нейросетчатку 70 DIV органоидов сетчатки, инфицированных Ad5-CMV-GCaMP6s и иммуномеченных анти-GFP (табл. 1) для усиления флуоресценции после длительной фиксации.

Рисунок 7: Эндогенные GCaMP, сохраненные при использовании метода очистки FluoClear BABB. Органоид сетчатки размером 70 DIV, инфицированный Ad5-CMV-GCaMP6s, иммуномеченный анти-GFP (GCaMP-экспрессирующими клетками), Chx10 (нейробластами и биполярными клетками на ранних стадиях) и DRAQ5 (ядрами). Масштабные линейки = 100 μм (слева) и 25 μм (справа). Сокращения: BABB = бензиловый спирт/бензилбензоат; DIV = дни in vitro. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительное видео S1: 3D-реконструкция органоида сетчатки, представляющего собой совокупность нейронных проекций. Z-проекция конфокальных изображений очищенных FluoClear BABB органоидов сетчатки на расстоянии 250 DIV, окрашенных TUJ1 (нейронами), представленными фиолетовым цветом, и DRAQ5 (ядра) — желтым. Сокращения: BABB = бензиловый спирт/бензилбензоат; DIV = дни in vitro. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительное видео S2: 3D-реконструкция палочек, выровненных по поверхности органоида сетчатки на поздних стадиях развития (200 DIV). Z-проекция конфокальных изображений FluoClear BABB-очищенных органоидов сетчатки при 200 DIV, окрашенных RECOV (фоторецепторами), представленными зеленым цветом, и RHO (палочками) фиолетовым. Сокращения: DIV = дни in vitro; BABB = бензиловый спирт/бензилбензоат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Обсуждение

Описанный здесь протокол облегчает изучение пространственно-временного распределения клеток, образующих органоид сетчатки на разных стадиях созревания, сохраняя его естественную 3D-архитектуру, что является критически важным аспектом для понимания этих моделей в контексте будущей персонализированной медицины. Он обеспечивает детальное представление архитектуры сетчатки на уровне отдельных слоев и отдельных типов клеток, позволяя визуализировать субклеточные структуры, сохраняя при этом глобальный 3D-контекст.

Альтернативой визуализации полного монтирования является постобработка образца для выполнения визуализации на обычных срезах (парафинированных или криоконсервированных). В то время как секционирование дает ценную информацию о локализации белков и структур, эти данные ограничены одной плоскостью, что ограничивает понимание пространственных клеточных связей. В результате, такие особенности, как доля колбочек и палочек или образование аксональных пучков в конкретных областях, могут быть представлены неточно, что усложняет интерпретацию в трех измерениях. Органоиды сетчатки очень неоднородны, с различными областями, потенциально содержащими различные типы клеток и/или проявляющими различную степень сложности и дифференцировки. Визуализация всего монтирования решает эту проблему, поскольку позволяет анализировать градиенты неоднородности глобально, не полагаясь на выбор подмножества сечений, которые могут не представлять всю выборку.

Световая флуоресцентная микроскопия (LSFM)21,22,23 может быть использована в качестве альтернативы лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. В LSFM образец освещается тонким световым листом толщиной в несколько микрон, и вся флуоресценция, генерируемая освещенным оптическим сечением, обнаруживается с помощью камеры. LSFM — это широкопольный метод обнаружения, который представляет собой высокоэффективную стратегию для быстрой визуализации больших объемов (до сантиметровых образцов) с минимальными эффектами фотообесцвечивания и фототоксичности. Тем не менее, органоиды могут проявлять значительную сферическую аберрацию, потому что свет, проходящий через изогнутые поверхности, преломляется по-разному в зависимости от угла падения. В этих экспериментах это искажение приводило к потере фокуса, что приводило к размытию и снижению разрешения более глубоких структур. Для визуализации наших органоидов сетчатки (диаметром около 1 мм) наиболее эффективным методом оказалась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

Этот протокол адаптирован к нашим экспериментальным требованиям. Он может быть использован в качестве отправного руководства для исследователей, решившихся на визуализацию оптически очищенных органоидов сетчатки целиком, и должен быть адаптирован, если они отличаются. В этом разделе подробно описаны критические шаги, модификации и ограничения методологии.

Важнейшим этапом является принятие решения о протоколе клиринга. Необходимо учитывать множество критериев. Во-первых, рассмотрим типологию выборки. Очистка костей — это не то же самое, что очистка мозговой ткани, точно так же, как очистка органоидов сетчатки отличается от очистки органоидов желудка, поскольку каждая из них требует своего подхода. Чтобы визуализировать очищенные органоиды другого типа, важно просмотреть литературу и определить протоколы, которые были оптимизированы специально для интересующего образца. Фруктоза/глицерин является быстрым и нетоксичным методом очистки, который, как было доказано, полезен для очистки органоидов, полученных из различных тканей (органоидов дыхательных путей человека, толстой кишки, почек, печени и молочной железы, а также органоидов молочной железы мыши)¹² , но не подходит для того, чтобы сделать органоиды сетчатки человека прозрачными. Насколько нам известно, ни в одном исследовании не сообщается о применении фруктозы/глицерина в нервной ткани/органоиде. Таким образом, мы делаем вывод, что данный метод очищения не подходит для осветления нервных тканей. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить основные причины этой несовместимости.

Еще одним важным фактором, который следует учитывать, является требуемый коэффициент FoV, поскольку он напрямую влияет на стратегию визуализации и выбор оптических компонентов. Большие оптические помехи обычно достигаются при использовании объективов с малым увеличением, которые часто предназначены для использования без иммерсионных сред (например, воздуха, RI = 1,00). Эти объективы испытывают большее несоответствие RI при визуализации образцов, очищенных BABB (RI = 1,56), что приводит к смещению фокусировки по глубине, которое необходимо корректировать во время постобработки. Напротив, масляные иммерсионные объективы (RI = 1,51) имеют меньшее несоответствие RI с растворами для очистки, такими как BABB (RI = 1,56) и, следовательно, не требуют повторной калибровки.

Простые иммерсионные методы обычно не позволяют добиться высокой прозрачности и не подходят для получения высококачественных изображений образцов с цельным креплением. Протоколы очистки тканей влияют на эффективное разрешение за счет набухания или усадки образцов. В зависимости от цели эксперимента, полезными могут быть как набухание, так и усадка. Протоколы, расширяющие выборку, могут повысить разрешение мелких деталей в той же оптической системе, которая ранее не могла показать те же детали. Усадка может быть желательной для визуализации больших образцов, которые в противном случае не поместились бы в камере для образцов или не подогнались бы под объективные рабочие расстояния. Однако, поскольку усадка сжимает образец и может исказить внутренние расстояния, этот метод не подходит для оценки размеров или точного измерения межклеточных расстояний.

Еще одним важным фактором, который следует учитывать, является совместимость с флуоресцентными белками. В основном протоколы на основе органических растворителей подавляют флуоресцентные белки, поскольку они требуют высоких температур, или разрушают флуоресцентные белки при встраивании в RI-совместимые растворы. К счастью, большинство методов совместимы с методами иммуномаркировки. Однако совместимость каждого эпитопа должна быть подтверждена экспериментально.

Кроме того, проникновение больших молекул IgG через ткань может быть затруднено, что снижает эффективность окрашивания и ограничивает визуализацию целевой структуры на поверхности образца. Окрашивание цельных образцов антителами может занять несколько дней (или даже недель), в зависимости от размера и характера образца, что значительно увеличивает продолжительность протокола.

Наконец, обязательна совместимость с оптическим прибором. Большинство методов на основе органических растворителей (за исключением ECi) очень коррозионны и химически не совместимы с коммерческими камерами для отбора проб и погружными объективами. Кроме того, некоторые решения для расчистки имеют RI, который не соответствует дальности, требуемой доступными целями (обычно водой).

В протоколе есть некоторые шаги, на которые нужно обратить особое внимание. FluoClear BABB, как гидрофобный метод очистки, требует предварительной стадии обезвоживания. pH играет важную роль в сохранении флуоресценции эндогенных белков, таких как GFP. Затем крайне важно убедиться, что pH спиртовых растворов правильно отрегулирован. Обезвоживание является ключом к полному очищению. Оптимальные результаты достигаются путем инкубации образцов с возрастающим градиентом спиртовых растворов.

Размер образца играет важную роль в том, чтобы антитела достигали своих конкретных мишеней. Антитела могут не проникать однородно и удерживаться снаружи образца. Если это произошло, рассмотрите возможность перехода на другой тип моющего средства (Tween-20 или Saponin), увеличив концентрацию и время инкубации моющего средства и антител. Если этих корректировок недостаточно, альтернативные стратегии могут улучшить проникновение антител. Исследователи обнаружили, что для полного иммуномечения больших образцов (в сантиметровом масштабе) SDS может способствовать более глубокому^{проникновению} антител. SDS индуцирует частичную потерю третичной структуры антител, эффективно линеаризуя белок и позволяя ему проникать глубже в ткань. Затем, вымывая SDS, восстанавливаются антигенсвязывающие свойства антител, что позволяет более равномерно окрашивать более толстые ткани и уменьшать обычно наблюдаемый градиент более сильного мечения на поверхности образца.

Приготовление собственных флуоресцентных вторичных антител имеет ряд преимуществ, поскольку оно обеспечивает большую гибкость в дизайне иммуномаркировки, позволяя выбирать конкретную комбинацию флуорофора и вторичного антитела, увеличивая количество цветов, которые могут быть использованы в одном и том же образце. Кроме того, соотношение флуорофоров и антител может быть настроено, поэтому они, как правило, ярче. Тем не менее, некоторые аспекты должны быть учтены. Изготовленные на заказ вторичные антитела, как правило, менее стабильны, чем коммерчески доступные, и их следует использовать в свежем виде. Большинство из них сохраняют свое сродство к лиганду в течение 3-6 месяцев при 4 °C, но стабильность нуждается в экспериментальном определении, так как некоторые комбинации могут деградировать быстрее. Более того, некоторые пары антитело-флуорофор могут изменять аффинность антитела к его эпитопу, что приводит к частичному или полному неспецифическому мечению. Чтобы обеспечить надежность, рекомендуется сначала протестировать специально изготовленные вторичные антитела с использованием контрольных элементов, таких как клетки в культуре, прежде чем применять их к экспериментальным образцам.

Этот оптимизированный протокол объединяет оптическое очищение с иммуномечением для облегчения конфокальной визуализации органоидов сетчатки целиком. Он сохраняет структурную целостность и позволяет идентифицировать ключевые типы клеток сетчатки в органоиде. Таким образом, протокол предоставляет исследователям мощный инструмент для изучения созревания органоидов сетчатки и пространственной организации.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10x объектив NA0.40 DRY	Лейка	HC PL APO CS2	-
63x NA1.40 OIL объектив	Лейка	HC PL APO CS2	-
антитела против GFP	Абкам	АБ13970	-
Бензиловый спирт (БА)	Сигма Олдрич	13162	-
Бензилбензоат (ВВ)	Сигма Олдрич	W213802	-
Нижняя стеклянная чашка Петри	МатТек	П35Г-1.5-14-С	-
Бычья сыворотка альбумин (BSA)	Сигма Олдрич	А7030	-
Антитела Chx10	Ста Круз Биотех	СК-365519	-
Цитива Иллюстра Нап-5 гелевые фильтрующие колонки, Sephadex G-25	Сигма Олдрич	17-0853-02	-
DAPI	Сигма Олдрич	Д9542	-
ДМСО	Сигма Олдрич	Д8418	-
ДРАК5	Термофишер	62251	-
Краситель (карбоновая кислота, сукцинимидиловый эфир)	Invitrogen или Abberior	-	-
ImageJ/Fiji	НИЗ	v1.50i	-
Инвертированный конфокальный лазерно-сканирующий микроскоп	Микросистемы Leica	TCS SP8 ШТИФТ 3X-FALCON	-
Программное обеспечение для 3D-обработки LAS X	Микросистемы Leica	-	-
мQ H2O	-	-	Сверхчистая вода из системы очистки воды Synergy
NaHCO3	Акрос Органик	424270010	-
Немеченый вторичный IgG	Иммуноисследования Джексона	-	-
Антитела Opsin blue	Millipore	АБ5407	-
Антитела Opsin RG	Многородность	АВ5745	-
Параформальдегид (PFA) 4%	Термонаучный	J199943-К2	-
Решение PBS	Gibco	18912-014	-
Зонды для мечения фаллоидином	Термофишер	-	-
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Gibco	10010023	-
Антитела к RECOV	Многородность	AB5585-I	-
Антитела к RHO (RET-P1)	Сигма Олдрич	O4886	-
Цитрат натрия трехосновной дигидрат	Сигма Олдрич	С8532	-
Тритон Х-100	Сигма Олдрич	Т8787	-
Антитело к TUJ1	Covance	ММС-435П	-