Method Article

Просвечивающая электронная микроскопия как метод визуализации для анализа циркадной синаптической пластичности в коре ствола головного мозга мыши

DOI:

10.3791/68385

⸱

August 19th, 2025

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный протокол описывает использование просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) для количественной оценки циркадных изменений в коре ствола головного мозга мыши, в основном с акцентом на количество синапсов и морфологию дендритных шипиков.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение циркадной синаптической пластичности требует содержания мышей в различных условиях освещения (цикл свет/темнота, LD 12:12 и постоянная темнота, DD), обеспечения доступа к беговым колесам и принесения их в жертву в четыре определенные точки времени в течение 24 часов — в начале и середине дня/субъективного дня и в начале и середине ночи/субъективной ночи. Затем мозг должным образом фиксируется для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Бочкообразная кора головного мозга с ее точной соматотопической организацией представляет собой идеальную модель для такого анализа. Чтобы получить необходимую область мозга, мозги тангенциально разрезаются вибратомом, а затем выбираются участки, содержащие кору головного мозга, и встраиваются в смолу Polybed. Из подготовленных блоков, содержащих выбранные бочки, вырезаются последовательные ультратонкие секции. Синаптическая плотность, возбуждающая и тормозная, анализируется по электронным микрофотографиям с использованием метода стереологического диссектора. Кроме того, изображения ПЭМ используются для 3D-реконструкции дендритных шипиков. Изменения формы дендритных шипиков указывают на ремоделирование нейронов в течение дня. Количество возбуждающих синапсов достигает пика во время сна (днем) у мышей, в то время как тормозные синапсы достигают пика во время фазы их активности (посреди ночи).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Циркадные ритмы генерируются циркадными часами почти во всех процессах в организме. У животных и человека они были обнаружены на молекулярном, клеточном и общеорганизменном уровнях, а также в их поведении. Циркадная система организма состоит из основных циркадных часов (кардиостимулятора) и периферических часов. Все циркадные часы генерируют циркадные колебания благодаря циклической экспрессии генов часов, которые контролируются их белками. Молекулярный механизм часов генерирует циркадные ритмы с периодом ~1 день (дольше или короче 24 ч), но в условиях день/ночь период эндогенных ритмов синхронизирован с 24 ч. В физиологии нервной системы беспозвоночных и позвоночных обнаружено множество циркадных ритмов; Однако некоторые исследования показали, что они также присутствуют в синаптической и нейрональной пластичности, то есть в изменениях в количестве и структуре синапсов и дендритов 1,2,3,4.

Соматосенсорная кора головного мозга мыши обеспечивает прекрасную площадку для изучения синаптической пластичности в течение дня благодаря ее четко определенной организации и прямой связи с локомоторной активностью животных 5,6,7,8,9. В IV слое соматосенсорной коры имеются отчетливые нейронные структуры (бочонки), которые весьма заметны даже в неокрашенном мозге 10,11. Их расположение отражает морфологию и организацию усов на морде животного, что позволяет точно отображать сенсорные стимулы. Большие бочки организованы в пять правильных рядов, каждый из которых содержит от четырех до семи бочек. Ряды бочонков, которые соответствуют крупным усам, обозначены заглавными буквами от А до Е и представляют собой усы, расположенные от области глаз вниз вдоль рыла. Каждая бочка состоит из двух основных зон: полой, центральная часть которой заполнена нейропилем, и стенки, называемой боковой, в которой доминируют тела звездчатых клеток. Бочки отделены друг от друга областями с более низкой плотностью клеток, называемыми перегородками. Каждый ствол получает импульсы от определенного уса, расположенного на контралатеральной стороне морды животного10,12.

Деление на конкретные бочки, расположенные в правильные ряды, позволяет быстро и легко идентифицировать выбранный участок10,13. Выбор бочонков из строки В для анализа циркадных изменений основан на исследованиях пластичности, зависящей от активности 14,15,16,17. Строка B характеризуется четко определенными соматотопическими границами и содержит только четыре отдельных больших бочки, что упрощает ее расположение в образцах. Благодаря своему центральному положению, нейронная активность ряда B коррелирует с естественным поведением мышей, таким как исследование окружающей среды и локомоторная активность. Для подсчета синапсов на дендритных шипах и стволах важно выбрать центральные части стволов, где тела клеток разрежены 12,15,18.

Иммуногистохимия в сочетании с конфокальной микроскопической визуализацией является методом, который сыграл решающую роль в выяснении ключевых механизмов синаптической пластичности у мышей. В то время как использование конфокальной микроскопии позволяет получать изображения с высоким разрешением со сниженной флуоресценцией фона и улучшенной четкостью клеточной структуры, она подвержена фотообесцвечиванию и требует сложной пробоподготовки, что может изменить состояние биологических тканей. Его зависимость от флуоресцентных маркеров может ограничивать типы белков, которые могут быть изучены одновременно, из-за их перекрытия. Конфокальная иммунофлуоресцентная микроскопия позволяет мечать специфические белки, уровни их экспрессии и локализацию, связанную с синаптической активностью, с помощью антител для обнаружения целевых антигенов в фиксированных срезах ткани. Несмотря на то, что этот метод обеспечивает специфичность и гибкость для изучения различных белков, участвующих в нейротрансмиссии, он ограничен своей неспособностью предоставлять данные о динамических процессах в режиме реального времени из-за задействованного этапа фиксации. Непоследовательность в связывании антител также может привести к ненадежным результатам 19,20,21.

Использование электронной микроскопии вместо иммунофлуоресцентных методов со световой микроскопией позволяет добиться значительно более высокого разрешения и большей точности как в выборе локализации, так и в различении нейронных структур. Срезы последовательной просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) помогают визуализировать синаптическую структуру на ультраструктурном уровне и имеют преимущество в том, что они используются для изучения формирования или уничтожения синапсов. ПЭМ позволяет исследователям анализировать физические свойства синапсов и изменения в плотности и структуре, которые называются пластичностью синапсов. Несмотря на то, что подготовка образцов и визуализация являются трудоемкими процессами, ПЭМ обеспечивает более детальное понимание изменений, происходящих во время обучения, формирования памяти и обработки сенсорной информации, а также в течение суток, года и возраста животных.

Наш метод направлен на исследование циркадной динамики синаптической плотности и морфологии с использованием подхода, основанного минимум на четырех временных точках, в сочетании со стереологическим методом диссектора, основанным на серийных изображениях ПЭМ. Метод стереологической диссекторологии позволяет достоверно оценить количество синапсов даже при использовании всего нескольких ультратонких последовательных участков 22,23,24,25,26. Четко выраженная соматотопическая организация коры головного мозга обеспечивает точный анатомический выбор мест исследования, в то время как серийная ПЭМ позволяет дифференцировать типы синапсов (возбуждающие и тормозящие) и их расположение (на дендритных шипах и валах). Этот метод является ценным инструментом для исследователей, изучающих суточную и циркадную нейропластичность, позволяя изучить, как факторы окружающей среды и внутренние факторы влияют на синаптическую динамику. Отдельные компоненты нашего метода позволяют применять его для анализа изменений нейропластичности в гораздо более широком спектре исследований, не обязательно ограничиваясь изменениями, связанными с циркади.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры с участием животных были одобрены соответствующим институциональным комитетом по этике и проведены в соответствии с Директивой 2010/63/ЕС Европейского парламента и Совета о защите животных, используемых в научных целях, а также с национальными правилами. Были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных и сократить количество используемых животных.

1. Подготовка тканей головного мозга

  1. Жертвуйте мышей в четыре разных временных момента каждые 6 часов в течение 24-часового цикла, как в условиях света/темноты (LD 12:12), так и в условиях постоянной темноты (DD) (рис. 1). В условиях LD 12:12 обратитесь к времени Zeitgeber (ZT), где ZT0 соответствует началу светлой фазы, а ZT12 — началу темной фазы. В постоянной темноте обратитесь к циркадному времени (CT), где CT0 представляет начало субъективного дня, а CT12 обозначает начало субъективной ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Временные точки следующие: ZT0/CT0 (начало дня, субъективный день), ZT6/CT6 (середина дня, субъективный день), ZT12/CT12 (начало ночи, субъективная ночь) и ZT18/CT18 (середина ночи, субъективная ночь).
  2. Перфузируйте и фиксируйте мозг мышей с помощью 2,5% глутаральдегида и 2% параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4).
  3. Удалите каждый мозг из черепа и оставьте его в фиксирующем растворе (2,5% глутаральдегида и 2% параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,4) на 24 ч при 4 °C.
  4. Чтобы подготовить мозг к разделению, отрежьте мозжечок и разделите мозг на два полушария (рисунок 2А, В).
  5. Выберите одно полушарие (правое или левое) и сориентируйте его так, чтобы участки были разрезаны по касательной к коре головного мозга. Закрепите выбранную полусферу на вибропатроне и плотно приклейте ее (рисунок 2С).
  6. Срезать срезы толщиной 60 мкм (скорость вибратомной секции: 7,10 и частота: 5,00) (рис. 2D) и затем перевести срезы на смесь 0,1 М фосфатного буфера и фиксирующего раствора (соотношение 1:5).
  7. Рассмотрите срезы под световым микроскопом с 4-кратным увеличением и соберите только те, у которых видна кора бочкообразного поля для следующего шага (рис. 2E). Используйте вогнутое ползуно, чтобы секция постоянно оставалась в жидкости.

2. Фиксация и секция мозга

  1. С помощью кисти аккуратно переложите салфетки в маленькую стеклянную чашку Петри. Затем промойте участки мозга в 0,1 М какодилатном буфере (BC, pH 7,4) в течение 3 x 5 минут.
  2. Зафиксируйте срезы в 1% тетраоксиде осмия (OsO4) в 0,1 М до н.э. с 1,5% феррицианидом калия и оставьте при +4 °С на 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор OsO4 непосредственно перед использованием, так какOsO4 нестабилен и его активность со временем снижается.
  3. Постфиксированные срезы в 1% OsO4 в 0,1 М растворе ВС в течение 1 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все эти действия в защитных перчатках и под вытяжным шкафом с хорошо функционирующей вентиляцией, так как OsO4 очень токсичен.
    Отходы следует хранить в отдельной бутылке с плотной крышкой. Нельзя допускать попадания продукта в канализацию.
  4. После фиксации срезы промыть в дистиллированной воде в течение 2 х 5 мин.
  5. На следующем этапе инкубируйте участки мозга в течение 40 минут в растворе 70% этанола, содержащего 1% уранилацетата. После перемешивания используйте шприц с фильтром (25 мм) и медленно влейте по 2 мл раствора в каждую чашку Петри с салфетками.
  6. Обезвоживайте ткани в возрастающих концентрациях алкоголя: 70%, 80% и 90% этанола в течение 5 мин каждый и 100% этанола 3 х 5 мин каждый.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно оставить салфетки в 70% этаноле на ночь при температуре +4 °C.
  7. Простирайте салфетки в пропиленоксиде 2 х 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оксид пропилена является высококоррозионным химическим веществом; Используйте его с осторожностью, надев защитные перчатки и работая под вытяжным шкафом. Использование стеклянной емкости (стеклянной чашки Петри) имеет решающее значение для этого этапа.
    Оксид пропилена является чрезвычайно легковоспламеняющейся жидкостью и паром. Отходы необходимо хранить в отдельной плотно закрытой стеклянной таре. Не допускайте попадания изделия в стоки, есть опасность взрыва.
  8. Замените оксид пропилена смесью смолы Polybed и оксида пропилена (соотношение 1:1). В каждую чашку Петри с секциями налить не менее 2 мл раствора, накрыть крышкой и выдерживать 40 минут.
  9. Наконец, встройте срезы мозга в смесь смолы Polybed и оксида пропилена (соотношение 3:1). Используйте не менее 2 мл смеси на одну чашку Петри, накройте крышкой и оставьте на 1,5 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ткани полностью погружены в воду, и убедитесь, что они не плавают над жидкостью.
  10. Разрежьте пленку Aclar на кусочки, соответствующие размеру предметного стекла. С помощью пластиковой пипетки нанесите небольшой объем смолы на пленку Aclar и перенесите участки мозга из чашки Петри на смолу с помощью кисти. Поместите каждую секцию между двумя пленками Aclar и инкубируйте в течение 48 часов в печи при температуре 65 °C для полимеризации.

3. Визуализация и срез коры головного мозга

  1. Сфотографируйте срезы мозга с 2-кратным увеличением объектива с помощью светового микроскопа (рис. 2F).
  2. Соберите все изображения и импортируйте их в графическое программное обеспечение.
    1. Чтобы открыть изображения, нажмите Файл |Откройте и выберите изображения с помощью клавиш Shift |Открыть. Изображения будут открываться в отдельных окнах.
    2. Начните складывать изображения из коры головного мозга (самого маленького кусочка) и продолжайте до тех пор, пока все участки не будут правильно выровнены.
    3. Щелкните правой кнопкой мыши по Слою 1 |Продублируйте слой на каждом изображении. В диалоговом окне введите номер изображения в качестве имени, выберите одно изображение в качестве конечного файла и нажмите OK. Повторите эти шаги для всех изображений, дублируя их в один и тот же файл назначения.
    4. Выровняйте изображения, чтобы реконструировать поле бочки, обеспечив правильный анатомический порядок. С помощью инструмента «Перемещение » расположите каждый слой вручную, затем нажмите «Редактировать» |Трансформация |Инструмент «Поворот» или «Отразить » для корректировки ориентации, если это необходимо. Чтобы точно настроить выравнивание, используйте Правка | Трансформация | Искажайте и перемещайте углы изображения, чтобы они соответствовали анатомическим структурам независимо друг от друга. Чтобы облегчить выравнивание, установите режим наложения верхнего слоя на Перекрытие на панели слоёв .
    5. Сравните анатомические ориентиры, такие как контуры бочонка и кровеносные сосуды, чтобы убедиться в правильном расположении. Чтобы сохранить стопку, нажмите на Файл |Сохраните как, назовите файл и выберите его формат (PSD или TIFF); затем нажмите OK.
  3. Последовательно просмотрите несколько разделов, содержащих поле бочки, определив видимые бочки в каждой секции.
  4. Вручную наметьте каждую видимую бочку на дополнительном общем слое, обеспечив реконструкцию всего поля бочки. Чтобы создать дополнительный слой, нажмите Слой |Новое |Слой, назовите слой и нажмите OK. Выберите инструмент «Кисть » на панели инструментов и на новом слое вручную нарисуйте каждую видимую бочку.
    1. Для большей точности используйте масштабирование и отрегулируйте размер кисти по мере необходимости. Чтобы увеличить и уменьшить изображение, используйте инструмент « Масштаб » или нажмите Ctrl + «+» / Ctrl + «-». Чтобы изменить размер кисти, щелкните правой кнопкой мыши по холсту при активном инструменте «Кисть » и переместите ползунок «Размер ».
  5. Определите выбранный ствол на основе этой реконструкции.
  6. Найдите выбранный бочонок под световым микроскопом на основе рисунка бочкообразного поля (пять рядов, в каждом от четырех до семи бочонков) и расположения кровеносных сосудов, указывающих на его расположение в пределах бочкообразного поля.
  7. На каждом срезе с видимой корой ствола определите выбранный ствол под стереомикроскопом и вырежьте его вместе с соседним с помощью лезвия бритвы.
  8. Извлеките небольшой кусочек из секции, приклейте его на смоляной брусок и отложите сушиться. Позже обрежьте излишки смолы, окружающей ткань.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что кусок ткани лежит ровно на поверхности смолы.
  9. С помощью ультрамикротома и алмазного ножа вырежьте ультратонкие последовательные секции (3-6 секций, толщина 65 нм) (рис. 3A) и соберите их на никелевые сетки с однощелевым покрытием (2 x 0,75 мм) с формварным покрытием.
  10. После высыхания сравните образцы с 2% уранилацетата в течение 3 минут и 0,03% цитрата свинца в течение 1,5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для контраста важно несколько раз промыть решетки и оставлять их полностью высыхать после каждого шага. Используйте шприцы с фильтрами для уранилацетата и цитрата свинца.
  11. Сделайте последовательные снимки из полости выбранного цилиндра (например, В2) под ПЭМ (ускоряющее напряжение 80 кВ при увеличении 4К или 8К, в зависимости от площади и объема, необходимых для анализа).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно анализируется общий объем не менее 100мкм3 на одно животное.

4. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Создание и выравнивание стеков изображений TEM может быть выполнено одним и тем же способом, используя как бесплатное программное обеспечение (например, GIMP), так и коммерческое (например, Photoshop). Реконструкции также могут быть выполнены таким же образом с помощью как коммерческого программного обеспечения (например, 3D Studio Max), так и полностью бесплатных программ, таких как Blender.

  1. Чтобы оценить плотность синапсов, сложите как минимум три TEM-изображения в графическом программном обеспечении (рис. 6). Чем больше серийных изображений, тем выше точность расчетов.
    1. Чтобы открыть изображения, нажмите Файл |Откройте и выберите изображения с помощью клавиш Shift |Открытый; Изображения будут открываться в отдельных окнах.
    2. Для каждого изображения щелкните правой кнопкой мыши по слою 1 |Дубликат слоя. В диалоговом окне введите номер изображения в качестве имени, выберите одно изображение в качестве места назначения и нажмите OK. Повторите те же шаги для всех изображений и скопируйте их в том же месте.
    3. Чтобы сохранить стопку, нажмите Файл |Сохраните как, назовите файл, выберите его формат (PSD или TIFF) и нажмите OK.
  2. Чтобы выровнять изображения TEM, выделите верхний слой изображения и установите режим наложения на Перекрытие на панели слоев . Использовать Правка |Трансформация |Поверните или используйте инструмент «Отразить », чтобы настроить ориентацию изображения. Используйте инструмент «Перемещение » для выравнивания конструкций.
    1. Для более точной настройки используйте Правка |Трансформация | Искажите для перемещения углов изображения независимо друг от друга. Чтобы повысить точность, удерживайте клавишу Ctrl и перетаскивайте отдельные угловые точки. Используйте изменения размера и формы митохондрий и оболочек аксональных миелинов между последовательными изображениями ПЭМ, чтобы проверить правильную последовательность изображений.
  3. Используйте метод dissector для подсчета синапсов.
    1. Добавьте слой в стек EM изображений, нажав Слой |Новое |Слой |Хорошо. Убедитесь, что новый слой прозрачный (без заливки фона).
    2. Чтобы определить область анализа, щелкните Слой |Новое |Слой |ОК; затем выберите инструмент Прямоугольник , перейдите в Слой |Стиль слоя |Обводите, задайте цвет обводки, толщину (Размер) и положение (рекомендуется внутри), нажмите OK и нарисуйте прямоугольник. Выберите Заливка: 0%. Отметьте все синапсы, присутствующие на изображениях ПЭМ, которые не пересекают два смежных выбранных края прямоугольника (например, правый и нижний или верхний и левый).
    3. Добавьте новый слой для аннотаций, нажав кнопку Слой |Новое |Слой |Хорошо. С помощью инструмента «Кисть » выделите синапсы на новом слое. Используйте инструменты «Масштаб » и «Рука » для точной маркировки.
    4. Выберите один цвет для обозначения возбуждающих синапсов и другой для тормозных синапсов. Чтобы изменить цвет, нажмите на поле цвета переднего плана на панели инструментов, выберите цвет в окне «Палитра цветов» и нажмите кнопку «ОК».
  4. Если изображения ПЭМ содержат большие структуры (например, миелинизированные нервные волокна, крупные дендриты или части тела клетки), используйте сетку с несколькими квадратами. Это позволяет исключить любые квадраты, которые полностью заняты большими конструкциями.
    1. Добавьте новый прозрачный слой, нажав Слой |Новое |Слой |Хорошо. Включите представление сетки , нажав на Вид |Показать |Grid и включите привязку к сетке, нажав на View |Привязка к |Сетка.
    2. Установите расстояние между сетками, нажав на Редактировать |Настройки |Направляющие, сетка и срезы. Выберите инструмент «Линия », установите режим на Форму или Пиксели, установите толщину линии (например, 1 пиксель) и нарисуйте вертикальные и горизонтальные линии вдоль видимой сетки, чтобы покрыть всю область изображения.
  5. Определите разделы "верхний" и "нижний" для каждого стека изображений. Подсчитывайте только те синапсы, которые отсутствуют на последнем изображении, но присутствуют на предыдущих изображениях. Это позволяет точно идентифицировать синапсы без завышения их количества.
  6. Используйте шкалу на изображении и рассчитайте объем образца (стопка изображений ПЭМ). Измерьте площадь, в которой подсчитываются синапсы, и умножьте на количество изображений ПЭМ в стеке и толщину ультратонких участков.
  7. Разделите количество синапсов на объем, чтобы определить плотность синапсов на единицу объема.
  8. Используйте все ПЭМ-изображения, содержащие дендритный шипик (обычно 10-12 последовательных электронных микрофотографий), чтобы реконструировать дендритный шипик и синапсы, которые он образует.
    1. Откройте стек изображений в графической программе. Выберите инструмент «Обрезка », отметьте область, содержащую дендритный шип в стопке, и нажмите Enter. Выделенная область будет обрезана во всех видимых слоях. Сделайте видимым только один слой за раз, скройте остальные слои с помощью значка глаза на панели слоев .
    2. Сохраните каждое обрезанное изображение отдельно, нажав на Файл |Сохраните как, присвойте файлу имя, выберите формат (рекомендуется JPG) и нажмите OK. Повторите то же самое для каждого слоя в стопке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед передачей изображений в программное обеспечение для 3D-реконструкции лучше всего сначала отметить цветами элементы, которые реконструируются.
    3. Добавьте новый слой для аннотации, нажав на Слой | Новое |Слой | Хорошо.
    4. Установите непрозрачность слоя на 30-50% на панели слоёв .
    5. Выберите инструмент «Кисть », выберите разные цвета для каждой структуры (например, дендритный шип, синапс) и отметьте элементы. Работайте только с новым слоем, чтобы сохранить исходное изображение. Когда закончите, объедините слой аннотаций с изображением, щелкните правой кнопкой мыши по верхнему слою и объедините Вниз. Повторите эти шаги для каждого изображения ПЭМ, содержащего поперечное сечение дендритного отростка.
  9. Перенос изображений ПЭМ с видимыми сечениями дендритного отростка в программное обеспечение для 3D-реконструкции. Чтобы удалить объект Cube по умолчанию, щелкните его правой кнопкой мыши и удалите. Чтобы выровнять перспективу видового экрана перед загрузкой изображений, нажмите Z на навигационном гизмо или нажмите Numpad 7. Чтобы загрузить изображения, нажмите Добавить |Изображение |Reference, выберите первое изображение и дважды кликните по нему для подтверждения. Повторите эти действия для каждого изображения, убедившись, что перспектива видового экрана остается одинаковой по всему изображению.1
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы повернуть вид, удерживайте среднюю кнопку мыши и перемещайте мышь или используйте навигационный гизмот. Чтобы переместить вид, удерживайте нажатой клавишу Shift + средняя кнопка мыши, переместите мышь или используйте команду Переместить вид.
  10. Расположите ПЭМ-изображения на соответствующем расстоянии с учетом толщины ультратонких участков (рис. 4А). Чтобы расположить последнее изображение TEM по оси Z, щелкните по изображению, нажмите «Свойства объекта » (правая боковая панель) и введите значение в поле «Местоположение Z». Теперь изображения могут быть распределены между первым и последним изображением. Чтобы распределить их, выделите все изображения, нажмите N , чтобы открыть N-панель, и нажмите на вкладку Редактировать (в N-панели) | Район Z.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед внесением каких-либо корректировок выровняйте перспективу видового экрана и нажмите Z на гизмо навигации или нажмите Numpad 7.
    Для распространения изображений должен быть включен инструмент Распространить . Чтобы активировать его, перейдите в раздел Правка | Настройки | Получите расширения, выполните поиск по запросу «Распространить» и нажмите «Установить». После включения инструмент «Распространить» остается активным между сеансами и не требует повторной активации, если используется одна и та же версия программы.
  11. Вручную наметьте форму дендритного шипика на каждом изображении, используя одну кривую на каждом изображении ПЭМ (рис. 4B, C).
    1. Убедитесь, что видно только первое изображение ПЭМ. В коллекции сцен скройте все остальные объекты с помощью значка глаза . Чтобы создать базовую кривую для контура, нажмите кнопку Добавить |Кривая |Круг. Переместите объект BézierCircle, удерживайте G, переместите мышь и щелкните, чтобы принять изменения.
    2. Чтобы соответствовать размеру профиля дендритного шипа, масштабируйте объект, удерживая S, перемещайте мышь и щелкайте. Перейдите на вкладку Моделирование с выбранным объектом BézierCircle. Снова выровняйте перспективу видового экрана и нажмите Z на навигационном гизмо или нажмите Numpad 7.
    3. Чтобы настроить форму кривой, выберите контрольную точку, удерживайте клавишу G, переместите мышь и щелкните мышью.
    4. Чтобы настроить направление и силу маркеров, выберите точку маркера, нажмите G для перемещения или S для масштабирования и щелкните для подтверждения. Повторите для каждого пункта.
    5. Чтобы добавить новую контрольную точку, выберите две существующие контрольные точки, удерживая клавишу Shift , щелкните каждую точку, щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Разделить». Когда кривая достаточно соответствует границе профиля дендритного шипа, перейдите на вкладку «Макет », щелкните правой кнопкой мыши на объекте BézierCircle и объекте «Дубликат» и щелкните мышью, не перемещая мышь. Создайте столько же копий BézierCircle, сколько изображений TEM используется для реконструкции. Выровняйте их по расположенным изображениям TEM с помощью инструмента Распределить , как показано на шаге 4.10.
    6. Настройте каждую кривую BézierCircle на вкладке Моделирование в соответствии с профилем дендритного шипа на каждом изображении. Убедитесь, что в данный момент времени видны только отредактированный объект BézierCircle и соответствующее изображение TEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все действия по щелчку правой кнопкой мыши, необходимые для определенных шагов, должны быть выполнены в пределах сцены. Последовательные кривые должны соответствовать границам последовательных участков дендритного шипика и содержать одинаковое количество контрольных точек.
  12. Соедините смежные линии с помощью функции 3D-реконструкции, чтобы сформировать непрерывную поверхность и создать окончательную 3D-форму (Рисунок 4D).
    1. Убедитесь, что видны только объекты BézierCircle. В коллекции сцен скройте все остальные объекты с помощью значка глаза на боковой панели.
    2. Чтобы создать объект дендритного шипа, перейдите на вкладку Макет , выберите все объекты BézierCircle, щелкните правой кнопкой мыши и выберите Соединить. Преобразуйте соединенный объект в сетку, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав Convert To |Сетка.
    3. Чтобы соединить ребра соединяемого объекта, перейдите на вкладку Моделирование , нажмите 2 , чтобы войти в режим выбора ребер |Выбрать |Все |правый клик |Петли для кромок моста.
    4. Чтобы заполнить зазор в верхней части объекта, отмените выделение всего, щелкнув рядом с объектом, удерживайте Alt и щелкните одну часть края верхнего выступа, щелкните правой кнопкой мыши, выберите «Выдавить края», перетащите вверх по оси Z, нажмите S и переместите мышь, чтобы уменьшить новую петлю края, щелкните, чтобы принять изменение. Пока новая петля ребер все еще выбрана, щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Новая грань из ребер». Заполните нижний зазор тем же методом.
    5. Чтобы сгладить объект, перейдите на вкладку «Макет », щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Сгладить затенение». Чтобы еще больше сгладить форму, перейдите в раздел Модификаторы (правая боковая панель) |Добавить модификатор |Генерировать |Разбивка поверхности. Установите одинаковые значения для уровней Viewport и Render (рекомендуется 1).
  13. Повторите шаги 4.11-4.12 для реконструкции синапсов (рисунок 4E, F).
  14. Назначьте цвет каждой структуре и используйте функцию рендеринга для подготовки окончательного изображения (Рисунок 4G, H). Перейдите в меню «Затенение видового экрана » и выберите «Рендеринг » для предварительного просмотра изменений материала. Выберите объект, который нужно раскрасить, и нажмите «Материал » (правая боковая панель) |Новый |настройка базового цвета.
    1. Чтобы улучшить внешний вид материала, при необходимости отрегулируйте ползунки «Шероховатость» или «Металлический ». Используйте этот метод, чтобы назначить определенный цвет каждой структуре.
    2. Чтобы настроить освещение сцены, нажмите на объект «Свет», удерживайте клавишу G и переместите мышь, чтобы изменить его положение. Чтобы изменить интенсивность света, перейдите в раздел «Данные » (правая боковая панель) и отрегулируйте значение «Мощность ».
    3. Чтобы расположить камеру, сориентировать окно просмотра так, чтобы он был обращен к восстановленному позвоночнику, как он должен выглядеть на итоговом изображении, нажмите Ctrl + Alt + Numpad 0. Выберите видимую рамку камеры, удерживайте клавишу G и при необходимости переместите мышь, чтобы изменить ее положение.
    4. Чтобы подготовиться к рендерингу, перейдите в раздел Вывод (правая боковая панель), измените значения Разрешения X и Y в соответствии с нужным изображением. Чтобы улучшить качество изображения, перейдите в раздел «Рендеринг » (правая боковая панель) |Рендеринг, установите значение Сэмплов в диапазоне от 120 до 250. Чтобы получить прозрачный фон, перейдите в раздел Рендеринг |Фильм |отметьте галочкой Прозрачный. Чтобы отобразить изображение, нажмите F12 или перейдите в раздел Рендеринг (верхнее меню) |Рендеринг изображения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы правильно применить наш метод к анализу циркадных синаптических изменений, необходимо начать с выбора не менее четырех временных точек через равные промежутки времени, по две точки для каждой фазы активности животных (каждые 6 часов). В эти назначенные моменты времени животных приносят в жертву, а их мозги собирают. Этот подход позволяет идентифицировать суточные или циркадные паттерны синаптической пластичности и связывает их с изменениями в локомоторной активности животных (рис. 1). ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы представили методологию, используемую для изучения циркадной пластичности синапсов и реконструкции дендритных шипиков в коре ствола головного мозга мышей. Чтобы обеспечить надежные результаты, исследование циркадной пластичности должно включать не менее четырех временных точек. Наше исследование показало, что данные из двух временных точек - одной во время фазы покоя (днем) и одной во время фазы активности (ночью) - предоставили информацию о суточных различиях между фа...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа поддержана грантами Национального научного центра в Польше, NCN OPUS20 nr UMO-2020/39/B/NZ7/03366 EP и Медицинского колледжа Ягеллонского университета, nr N41/DBS/001129 MJ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Пленка «Аклар»Агар научныйAGL4458
Программное обеспечение для блендера Версия: v. 2.91.2
Какодиловая кислота, тригидрат соли натрияПолинауки01131-100
Вогнутая горкаМенцель9.161 151
Алмазный нож Диатом15-СШАУгол наклона ножа: Ultra 45°  
Цифровой фотоаппарат Nikon ДХМ 1200 Ф
ди-натрия гидрофосфат додекагидратПОЧ799280115
Встраивание смолыПолинауки08792-1Рецептура Luft 
ЭтанолПоль-АураПА-11-0004
Программное обеспечение GIMPВерсия: v 3.0.4
Цитрат свинцаТААБЛ018
Световая микроскопия Nikon Оптифот
Тетраоксид осмия Полинауки0223С-10Кристаллический (99.95%)
Кисть
Программное обеспечение Photoshopверсия: CS5
Феррицианид калияЗигмалдричП8131
Оксид пропилена Зигмалдрич82320Puriss. p.a., ≥ 99,5% (GC)
Сетки с одним слотомАгар научныйAGG25252 x 0,75 мм или 2 x 1 мм
Хлорид натрия Чемпур117941206
Дигидрат дигидрофосфата натрияЧемпур117991808
СтереомикроскопПЗО
Фильтр для спринцевания БиосенсBS25PES045
ТЭМ ИоильДЖЕМ-2100
УльтрамикротомЛейкаUC7
УранилацетатЛахема
ВибратомЛейкаВТ1000 С

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jasinska, M., Pyza, E. Circadian plasticity of mammalian inhibitory interneurons. Neural Plast. 2017, 1-12 (2017).
  2. Krzeptowski, W., Hess, G., Pyza, E. Circadian plasticity in the brain of insects and rodents. Front Neural Circuits. 12, 32(2018).
  3. Mansilla, A., et al. Molecular mechanisms that change synapse number. J Neurogenet. 32 (3), 155-170 (2018).
  4. Frank, M. G. Renormalizing synapses in sleep: the clock is ticking. Biochem Pharmacol. 191, 114533(2021).
  5. Jasinska, M., et al. Daily rhythm of synapse turnover in mouse somatosensory cortex. Acta Neurobiol Exp. 74 (1), 104-110 (2014).
  6. Jasinska, M., et al. Circadian rhythmicity of synapses in mouse somatosensory cortex. Eur J Neurosci. 42 (8), 2585-2594 (2015).
  7. Jasinska, M., et al. Circadian clock regulates the shape and content of dendritic spines in mouse barrel cortex. PLOS ONE. 14 (11), e0225394(2019).
  8. Jasinska, M., et al. Circadian changes of dendritic spine geometry in mouse barrel cortex. Front Neurosci. 14, 578881(2020).
  9. Jasinska, M., et al. Light-modulated circadian synaptic plasticity in the somatosensory cortex: link to locomotor activity. Int J Mol Sci. 25 (23), 12870(2024).
  10. Woolsey, T. A., Vander Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
  11. Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the Sml-face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
  12. Armstrong-James, M., Fox, K. Spatiotemporal convergence and divergence in the rat SI barrel cortex. J Comp Neurol. 263 (2), 265-281 (1987).
  13. Barrel cortex. Fox, K. , Cambridge University Press. (2008).
  14. Jasinska, M., et al. Rapid, learning-induced inhibitory synaptogenesis in murine barrel field. J Neurosci. 30 (3), 1176-1184 (2010).
  15. Knott, G. W., Quairiaux, C., Genoud, C., Welker, E. Formation of dendritic spines with GABAergic synapses induced by whisker stimulation in adult mice. Neuron. 34 (2), 265-273 (2002).
  16. Jasinska, M., et al. Effect of associative learning on memory spine formation in mouse barrel cortex. Neural Plast. 2016, 1-11 (2015).
  17. Jasinska, M., et al. Fear learning increases the number of polyribosomes associated with excitatory and inhibitory synapses in the barrel cortex. PLOS ONE. 8 (2), e54301(2013).
  18. White, E. L. Ultrastructure and synaptic contacts in barrels of mouse SI cortex. Brain Res. 105 (2), 229-251 (1976).
  19. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing whole-brain activity and development at the single-cell level using light-sheet microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
  20. Serrano, M. E., Kim, E., Petrinovic, M. M., Turkheimer, F., Cash, D. Imaging synaptic density: the next holy grail of neuroscience. Front Neurosci. 16, 796129(2022).
  21. Woelfle, S., et al. CLARITY increases sensitivity and specificity of fluorescence immunostaining in long-term archived human brain tissue. BMC Biol. 21 (1), 113(2023).
  22. Weibel, E. R. Stereological methods. Vol. 1: practical methods for biological morphometry. , Academic Press. London. (1979).
  23. Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134 (2), 127-136 (1984).
  24. Gundersen, H. J. G. Stereology of arbitrary particles. J Microsc. 143 (1), 3-45 (1986).
  25. Fiala, J. C., Harris, K. M. Cylindrical diameters method for calibrating section thickness in serial electron microscopy. J Microsc. 202 (3), 468-472 (2001).
  26. Napper, R. M. A. Total number is important: using the disector method in design-based stereology to understand the structure of the rodent brain. Front Neuroanat. 12, 16(2018).
  27. Perez-Cruz, C., Simon, M., Czéh, B., Flügge, G., Fuchs, E. Hemispheric differences in basilar dendrites and spines of pyramidal neurons in the rat prelimbic cortex: activity- and stress-induced changes. Eur J Neurosci. 29 (4), 738-747 (2009).
  28. Kasthuri, N., et al. Saturated reconstruction of a volume of neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
  29. Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nat Methods. 9 (12), 1198-1201 (2012).
  30. Videnovic, A., Zee, P. C. Consequences of circadian disruption on neurologic health. Sleep Med Clin. 10 (4), 469-480 (2015).
  31. Logan, R. W., McClung, C. A. Rhythms of life: circadian disruption and brain disorders across the lifespan. Nat Rev Neurosci. 20 (1), 49-65 (2018).
  32. Nassan, M., Videnovic, A. Circadian rhythms in neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurol. 18 (1), 7-24 (2021).
  33. Shen, Y., et al. Circadian disruption and sleep disorders in neurodegeneration. Transl Neurodegener. 12 (1), 8(2023).
  34. Dufort-Gervais, J., Mongrain, V., Brouillette, J. Bidirectional relationships between sleep and amyloid-beta in the hippocampus. Neurobiol Learn Mem. 160, 108-117 (2019).
  35. Adler, P., et al. Aging disrupts the circadian patterns of protein expression in the murine hippocampus. Front Aging Neurosci. 11, 368(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transmission Electron MicroscopyCircadian Synaptic PlasticityBarrel CortexMouse BrainSynaptic DensityDendritic Spine ReconstructionExcitatory SynapsesInhibitory SynapsesStereological Dissector MethodTangential Brain Sectioning

Related Articles