Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Производство системы частиц вируса SARS-CoV-2 для исследования вирусных жизненных циклов in vitro

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68389

⸱

6 июня 2025 г.

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем оптимизированный протокол in vitro для производства вирусоподобных частиц SARS-CoV-2, которые точно имитируют подлинный вирус. Такой подход позволяет исследовать механизмы вирусной инфекции, сборки и выхода вирусной инфекции без ограничений, связанных с лабораторией уровня биобезопасности 3.

Аннотация

Метод вирусоподобных частиц тяжелого острого респираторного синдрома-коронавируса 2 (SARS-CoV-2) (SC2-VLP) предлагает мощный и доступный инструмент для изучения жизненного цикла SARS-CoV-2 без необходимости использования лабораторий уровня биобезопасности 3 (BSL-3). Эта система эффективно имитирует критические этапы жизненного цикла вируса, включая сборку, упаковку генома и выход, используя репортер люциферазы, слитый с сигналом T20, для чувствительного и точного обнаружения производства вирусных частиц. SC2-VLP генерируются коэкспрессирующими структурными белками SARS-CoV-2, включая мембрану (M), нуклеокапсид (N), оболочку (E) и спайк (S), а также сигналом упаковки РНК в клетках HEK-293T. В отличие от традиционных систем вирусоподобных частиц, метод SC2-VLP обеспечивает точное количественное определение и большую верность естественному жизненному циклу вируса. Кроме того, по сравнению с методами лентивирусного псевдотипирования, которые ограничены изучением проникновения вируса через включение S-белка в лентивирусные частицы на основе ВИЧ, система SC2-VLP обеспечивает более комплексную платформу для изучения нескольких этапов биологии SARS-CoV-2. При этом этот метод обходит риски работы с живым вирусом и расширяет доступность. Метод SC2-VLP представляет собой значительный шаг вперед в противовирусных исследованиях и разработке терапевтических стратегий против SARS-CoV-2.

Введение

Пандемия COVID-19 стала одним из самых разрушительных глобальных кризисов в области здравоохранения в современной истории, приведшим к миллионам смертей во всеммире1. Вирус SARS-CoV-2 проходит сложный жизненный цикл, включающий такие ключевые этапы, как заражение, репликация генома, сборка и выход. Инфекционный процесс начинается, когда вирусный спайковый белок (S) связывается с рецептором клетки-хозяина, ангиотензинпревращающим ферментом 2 (ACE2), способствуя высвобождению вирусного генома в клетку-хозяина 2,3. Вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) затем катализирует репликацию геномной РНК. Эта РНК в комплексе с нуклеокапсидным белком (N) образует стабильную структуру, которая распознается мембранным белком (M). Белок М играет центральную роль в сборке вируса, рекрутируя комплекс РНК-N, S, и белок оболочки (E)4,5. После сборки вирион завершает свой выход по неканоническому лизосом-опосредованному пути транспортировки6.

В ответ на пандемию были мобилизованы значительные глобальные ресурсы для разработки вакцин, нейтрализующих антител и противовирусных препаратов. Оценка этих вмешательств сыграла важную роль в продвижении исследований SARS-CoV-27. Тем не менее, изучение живого вируса сопряжено со значительными логистическими проблемами, поскольку эксперименты с вирусом должны проводиться в лабораториях уровня биобезопасности 3 (BSL-3). Ограниченная доступность установок BSL-3 ограничивает темпы исследований, направленных на понимание SARS-CoV-2 и борьбу с ним.

Для решения этих проблем в исследованиях SARS-CoV-2 широко используются две основные системы — вирусоподобные частицы (VLP) и лентивирусная псевдотипизация, обе из которых не требуют локализации BSL-38. Система VLP включает в себя котрансфекцию клеток с генами, кодирующими вирусные структурные белки, включая M, S, E и N, которые вместе генерируют вирусоподобные частицы. Эти частицы имитируют структурные и функциональные свойства вируса, что делает их ценным инструментом для изучения ключевых процессов в жизненном цикле SARS-CoV-2 и даже эффективным антигеном для разработки вакцины 9,10,11.

И наоборот, система лентивирусного псевдотипирования включает замену белка G вируса везикулярного стоматита (VSV) в лентивирусе на S-белок SARS-CoV-2, что позволяет производить лентивирусные частицы, которые могут включать репортерные гены, такие как люцифераза или GFP. Эта система особенно полезна для исследования нейтрализующих антител, блокирующих взаимодействие S-ACE212. Тем не менее, лентивирусное псевдотипирование не отражает сборку или выход вируса SARS-CoV-2 из-за использования структурных белков ВИЧ, которые опосредуют высвобождение частиц на плазматической мембране.

Чтобы преодолеть эти ограничения, Syed et al. недавно идентифицировали сигнал упаковки SARS-CoV-2 в его геноме РНК, что демонстрирует специфичность белка N к распознаванию вирусного генома13. Путем слияния этого сигнала упаковки с репортерными генами можно эффективно встраивать эти гены в вирусоподобные частицы SARS-CoV-2 (SC2-VLP)13. Эта стратегия не только воспроизводит процессы сборки и выхода SARS-CoV-2, но и позволяет с высокой точностью измерять этапы заражения. В данном исследовании мы представляем экспериментальную методологию использования системы SC2-VLP и выделяем ключевые соображения для применения этого подхода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Генерация SC2-VLP

  1. Семена ~3,0 × 106 клеток HEK-293T в тканевом планшете диаметром 10 см с полной средой DMEM, дополненной 10% v/v FBS и 1% пенициллин-стрептомицином.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения высокой эффективности трансфекции и оптимальной продукции SC2-VLP, клетки HEK-293T должны поддерживаться на низком уровне пассажа ~10.
  2. Культивируйте клетку HEK-293T при 37 °C, 5%CO2 в течение примерно 24 ч и проверьте слитность клеток под микроскопом. Продолжайте, если ~70% сливается.
  3. Разбавьте 60 мкл PEI с 1 мг/мл до 200 мкл средой, не содержащей сыворотки.
  4. Добавьте 6,7 г N-плазмиды, 10 мкг плазмиды Luc-T20, 0,016 мкг S-плазмиды и 3,3 мкг M-IRES-E плазмиды в 200 мкл среды, не содержащей сыворотки (см . Дополнительный файл 1).
  5. Осторожно добавьте разведенный PEI из стадии 1.3 в раствор, содержащий плазмиды, кодирующие белки вирусной структуры из стадии 1.4, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Это решение для трансфекции.
  6. Осторожно капните раствор для трансфекции с шага 1.5 на клетки HEK-293T и осторожно поверните планшет для культуры тканей для тщательного перемешивания.
  7. Через 6 ч после заражения замените среду для культивирования клеток полной средой DMEM и инкубируйте трансфицированные клетки HEK-293T при 37 °C, 5%CO2 в течение 48 ч.
  8. Соберите надосадочную жидкость инфицированных клеток HEK-293T, которая содержит SC2-VLP, а затем отфильтруйте надосадочную жидкость через шприцевой фильтр 0,45 мкм для удаления клеточного мусора. Это среда SC2-VLP.
    Примечание: Мы попытались получить SC2-VLP в клеточных линиях HeLa, Vero E6 и Caco2, но не удалось получить измеримый титр вируса, что указывает на специфичность протокола для клеток HEK-293T.

2. Исследование эффективности SC2-VLP

Клеточная линия HEK-293T, стабильно экспрессирующая ACE2 и TMPRSS2, была создана с использованием подхода лентивирусной трансдукции14,15. Экспрессия белков как ACE2, так и TMPRSS2 была подтверждена вестерн-блоттингом в соответствии с протоколом, аналогичным описанному на этапе 3 (анализ состава SC2-VLP).

  1. Затравить 4.0 × 104 клеток HEK-293T со стабильной экспрессией ACE2 и TMPRSS2 в 96-луночный планшет и добавить 50 мкл среды SC2-VLP с шага 1.8.
  2. Инкубируйте 96-луночный планшет для культивирования тканей при 37 °C с 5%CO2 в течение 24 ч.
  3. Удалите среду из 96-луночного планшета и однократно промойте 100 мкл PBS буфером при 37 °C, содержащим 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4 и 1,8 мМ KH2PO4.
  4. Лизируйте клетки HEK-293T ACE2/TMPRSS2 20 мкл буфера пассивного лизиса, осторожно покачивая образец в течение 15 минут на орбитальном вибростенде при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для лизиса содержит 25 мМ трис-фосфата (pH 7,8), 2 мМ DTT, 2 мМ 1,2-диаминоциклогексан-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту, 1,25 мг/мл лизоцима, 2,5 мг/мл BSA, 10% глицерина и 1% Triton X-100).
  5. Вращайте 96-луночный планшет при температуре 4 000 × г в течение 15 минут при 4 °C в охлаждаемой центрифуге на микропланшетах, а затем немедленно перенесите планшет на ледяную баню.
  6. Возьмите 100 μL восстановленного буфера для анализа люциферазы в непрозрачный белый 96-луночный планшет и добавьте 20 μL лизата, начиная с шага 2.5. Быстро перемешайте их, пипетируя вверх и вниз 2-3 раза.
  7. Измерьте люминесценцию с помощью планшетного ридера со следующими параметрами: Режим обнаружения: Люминесценция; Диапазон длин волн: Полный спектр; Формат планшета: 96-луночный стандартный непрозрачный планшет; Время интеграции: 200 мс.

3. Исследование состава SC2-VLP

  1. Добавьте 1,36 мл раствора PEG 8000, содержащего 50% PEG 8000 и 2,2% NaCl, к 10 мл среды SC2-VLP с шага 1.8.
  2. Держите смесь на орбитальном шейкере, и медленно перемешивайте раствор при 4 °C в течение ночи.
  3. Центрифугируйте раствор при 4 °C, 2 000 × г в течение 30 мин и соберите гранулу SC2-VLP для анализа вестерн-блоттинга16.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа вестерн-блоттинга вся информация об антителах представлена в Таблице материалов.

4. Анализ субклеточной локализации S и его мутантов в клетках, продуцирующих SC2-VLP

  1. Высадите ~3,0 × 106 клеток HEK-293T равномерно в чашке для культуры со стеклянным дном диаметром 15 мм, а затем дайте клеткам прилипнуть и расти до ~70% слияния перед трансфекцией.
  2. Повторите процедуру трансфекции, описанную в шагах с 1.3 по 1.7, и модифицируйте только количество плазмиды следующим образом: N плазмида: 1,3 мкг, Luc-T20 плазмида: 2 мкг, S плазмида: 0,0032 мкг, и M-IRES-E плазмида: 0,66 мкг.
  3. Осторожно дважды промойте чашку с культурой 1 мл ледяного PBS, а затем добавьте 1 мл 4% раствора фиксации параформальдегида (PFA) при комнатной температуре (RT) в течение 15 минут.
  4. Промойте клетки в течение 2 x 5 минут 1 мл PBS при RT, а затем пропитайте клетки, добавив 1 мл 0,25% Triton X-100 при RT в течение 10 минут.
  5. Промойте клетки в течение 2 x 5 мин 1 мл PBS во время ЛТ, а затем добавьте 1 мл 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) во время ЛТ в течение 1 ч для блокирования взаимодействий неспецифических антител.
  6. Добавьте ~200 μL раствора первичного антитела (достаточно, чтобы покрыть стеклянное дно) и инкубируйте при 4 °C в течение ночи.
    Первичные растворы антител получают путем разведения в 5% BSA, растворенном в PBS, в следующих соотношении разведения: мышиное анти-S антитело в соотношении 1:200, кроличье анти-Sec61β антитело в соотношении 1:200, кроличье анти-GM130 антитело в соотношении 1:200 и кроличье анти-ERGIC53 антитело в соотношении 1:200. 5% раствор BSA/PBS служил как разбавителем, так и блокирующим буфером для минимизации неспецифического связывания во время последующих процедур иммунофлуоресцентного окрашивания.
  7. Удалите первичный раствор антитела, а затем промойте клетки в течение 3 x 5 минут 1 мл PBS во время ОТ.
  8. Добавьте флуоресцентно-конъюгированный раствор вторичного антитела в момент ЛТ в течение 1 ч, а затем промойте клетки в течение 3 х 5 мин 1 мл PBS в режиме ЛТ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги должны выполняться в темноте или при минимальном освещении для предотвращения фотообесцвечивания флуоресцентных конъюгатов и сохранения целостности сигнала. Два типа флуоресцентно-конъюгированных вторичных антител, которые получают от мышей или кроликов, используются для окрашивания либо S-белка, либо белков-маркеров клеточных органелл.
  9. Окрашивайте ядра 2,5 мкг/мл раствором Хёхста в режиме РТ в течение 5 минут, а затем промывайте клетки в течение 3 х 5 минут 1 мл PBS в режиме РТ.
  10. Наблюдайте за окрашиванием S-белка или органелл и получайте изображения с помощью конфокального микроскопа со следующими параметрами: режим ФЭУ установлен на VBF (без усреднения, последовательное сканирование линий) с автоконфокальной апертурой. Для канала 1 (FITC) используйте лазер с длиной волны 488 нм при мощности 25% с излучением 500–548 нм, HV 525 В, коэффициентом усиления 1x и смещением 5%. Для канала 2 (Alexa Fluor 594) используйте лазер с длиной волны 594 нм на 25% мощности с излучением 610 - 670 нм, HV 500 В, коэффициент усиления 1x и смещение 5%. Для канала 3 (DAPI) используйте лазер с длиной волны 405 нм при мощности 25% с излучением 430–470 нм, HV 490 В, коэффициентом усиления 1x и смещением 5%.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этапы выхода и сборки жизненного цикла SARS-CoV-2 изучены меньше, чем этапы инфицирования и репликации17,18. До разработки метода SC2-VLP эти процессы можно было исследовать только с использованием живого SARS-CoV-2, что ограничивало исследования лабораториями BSL-313. Рабочий процесс SC2-VLP, показанный на рисунке 1, описывает экспериментальный протокол и иллюстрирует процессы, участвующие в этих этапах жизне...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Простой и эффективный метод моделирования жизненного цикла SARS-CoV-2 в системах клеточных культур без ограничений лабораторий BSL-3 представляет собой ключевой шаг вперед в исследованиях анти-SARS-CoV-2. Метод SC2-VLP удовлетворяет эту потребность, предлагая надежную и доступную платформу. В этом исследовании мы представляем подробный протокол для метода SC2-VLP, в котором изложены важнейшие экспериментальные этапы для производства SC2-VLP. Кроме того, мы подчеркиваем его универсальност...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана программой Startup fund Пекинского университета китайской медицины (BUCM) (90011451310011). Мы выражаем нашу благодарность всем сотрудникам лаборатории доктора Ма в BUCM за неоценимую дискуссию и помощь в проведении экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Технология клеточной сигнализации9998S
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопOlympusFV3000
DMEMCorning10-013-CV
Фетальная бычья сыворотка (FBS)ThermofisherA5670402
козий антимышиный IgG H& L (Alexa Fluor 488) антителаInvitrogenA11001коэффициент разведения: IF 1:1000
Goat Anti-Rabbit IgG H& L (Alexa Fluor 594) антителоAbcamab150080коэффициент разведения: IF 1:1000
Клеточная линия HEK-293TНациональная инфраструктура ресурсов клеточной линии (NICR)NICR-293T-001Для обеспечения высокой эффективности трансфекции и оптимальной продукции SC2-VLP клетки HEK-293T должны поддерживаться на низком уровне пассажа (≤ С10).
Hoechst 33342InvitrogenH1399Рабочая концентрация: 2,5 μ г/мл
Люцифераза Репортерная система анализаPromegaE1500
Luc-T20Addgene177941
Мышиный моноклональный анти-GAPDHProteintech60004-1-Igкоэффициент разведения: WB 1:20 000
Мышиный моноклональный анти-S RBDAbclonalA23771коэффициент разведения: IF 1:200
OptiMEMThermofisher31985070Бессывороточная среда для трансфекции
PEG3350Sigma-AldrichP3635
PEG8000Sigma-AldrichP2139
Пенициллин-стрептомицинThermofisher15140122
Полиэтиленимин (PEI)Thermofisher43896.01
Promega буфер пассивного лизисаPromegaE1941
Кролик поликлональный анти-ACE2Proteintech21115-1-APкоэффициент разведения: WB 1:1000
Кролик поликлональный анти-ERGIC53Proteintech13364-1-APкоэффициент разведения: IF 1:200
Кролик поликлональный анти-GM130Proteintech11308-1-APкоэффициент разведения: IF 1:200
Кролик поликлональный анти-SAbcamab272504коэффициент разведения: WB 1:1000
Кролик поликлональный анти-Sec61&бета;Proteintech15087-1-APкоэффициент разведения: IF 1:200
Rabbit поликлональный анти-TMPRSS2Abcamab109131коэффициент разведения: WB 1:1000
SARS-CoV-2 M-IRES-E плазмидаAddgene177938
SARS-CoV-2 N плазмидаAddgene177959
SARS-CoV-2 Nucleoprotein Rabbit mAbAbclonalA21042коэффициент разведения: WB 1:4000
SARS-CoV-2 S плазмидаAddgene177960
Вторичное антитело, HRP, козий антимышиный IgG (H+L)Invitrogen31460: WB 1:5000
Вторичное антитело, HRP, козий антикролик IgG (H+L)Invitrogen31430: WB 1:5000
Планшетный ридер SpectraMax i3x Молекулярные приборыSpectraMax i3x
Коэффициент разведения Коэффициент разведения

Ссылки

  1. Narayanan, S. A., et al. A comprehensive SARS-CoV-2 and COVID-19 review, Part 2: host extracellular to systemic effects of SARS-CoV-2 infection. Eur J Hum Genet. 32 (1), 10-20 (2024).
  2. Shang, J., et al. Structural basis of receptor recognition by SARS-CoV-2. Nature. 581 (7807), 221-224 (2020).
  3. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  4. Zhang, Z., et al. Structure of SARS-CoV-2 membrane protein essential for virus assembly. Nat Commun. 13 (1), 4399(2022).
  5. Han, Y., et al. SARS-CoV-2 N protein coordinates viral particle assembly through multiple domains. J Virol. 98 (11), e0103624(2024).
  6. Ghosh, S., et al. beta-coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535.e14 (2020).
  7. Andrews, H. S., Herman, J. D., Gandhi, R. T. Treatments for COVID-19. Annu Rev Med. 75, 145-157 (2024).
  8. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513(2020).
  9. Sultana, R., Stahelin, R. V. Strengths and limitations of SARS-CoV-2 virus-like particle systems. Virology. 601, 110285(2025).
  10. Xu, R., Shi, M., Li, J., Song, P., Li, N. Construction of SARS-CoV-2 virus-like particles by mammalian expression system. Front Bioeng Biotechnol. 8, 862(2020).
  11. Plescia, C. B., et al. SARS-CoV-2 viral budding and entry can be modeled using BSL-2 level virus-like particles. J Biol Chem. 296, 100103(2021).
  12. Cruz-Cardenas, J. A., et al. A pseudovirus-based platform to measure neutralizing antibodies in Mexico using SARS-CoV-2 as proof-of-concept. Sci Rep. 12 (1), 17966(2022).
  13. Syed, A. M., et al. Rapid assessment of SARS-CoV-2-evolved variants using virus-like particles. Science. 374 (6575), 1626-1632 (2021).
  14. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  15. Matsuyama, S., et al. Enhanced isolation of SARS-CoV-2 by TMPRSS2-expressing cells. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (13), 7001-7003 (2020).
  16. Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods Enzymol. 463, 573-599 (2009).
  17. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 155-170 (2021).
  18. Yang, H., Rao, Z. Structural biology of SARS-CoV-2 and implications for therapeutic development. Nat Rev Microbiol. 19 (11), 685-700 (2021).
  19. Katiyar, H., Arduini, A., Li, Y., Liang, C. SARS-CoV-2 assembly: Gaining infectivity and beyond. Viruses. 16 (11), 1648(2024).
  20. Klein, S., et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nat Commun. 11 (1), 5885(2020).
  21. Li, Y., et al. SARS-CoV-2 spike host cell surface exposure promoted by a COPI sorting inhibitor. Acta Pharm Sin B. 13 (7), 3043-3053 (2023).
  22. Dey, D., et al. A single C-terminal residue controls SARS-CoV-2 spike trafficking and incorporation into VLPs. Nat Commun. 14 (1), 8358(2023).
  23. Christie, S. M., et al. Single-virus tracking reveals variant SARS-CoV-2 spike proteins induce ACE2-independent membrane interactions. Sci Adv. 8 (49), eabo3977(2022).
  24. Guo, L., et al. Targetable elements in SARS-CoV-2 S2 subunit for the design of pan-coronavirus fusion inhibitors and vaccines. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 197(2023).
  25. Mi, D., Hu, J., Qian, Z. A lentiviral pseudotype system to characterize SARS-CoV-2 glycoprotein. Methods Mol Biol. 2610, 187-199 (2023).
  26. Swann, H., et al. Minimal system for assembly of SARS-CoV-2 virus like particles. Sci Rep. 10 (1), 21877(2020).
  27. Xia, B., et al. Extracellular vesicles mediate antibody-resistant transmission of SARS-CoV-2. Cell Discov. 9 (1), 2(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

VLP SARS-CoV-2вирусоподобные частицыжизненный цикл вирусаклетки HEK-293TS-белоктрансфекция плазмидамивестерн-блоттингконфокальная микроскопияACE2 TMPRSS2люциферазный анализ
Производство системы частиц вируса SARS-CoV-2 для исследования вирусных жизненных циклов in vitro
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.