Методическая статья

Пошаговое руководство по выделению и анализу поверхности листа и апопластической РНК с использованием розеток Arabidopsis

DOI:

10.3791/68406

⸱

8 августа 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем простой, но в то же время легко воспроизводимый метод выделения внеклеточной РНК из листовой поверхности и апопластов растений Arabidopsis.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поверхность листьев растений и межклеточное пространство внутри листьев (апопласт) служат ключевыми интерфейсами для молекулярного обмена между растениями и взаимодействующими с ними микробами. В предыдущей работе мы продемонстрировали присутствие разнообразного ряда видов РНК в апопласте розеток Arabidopsis. Совсем недавно наши результаты показали, что растения Arabidopsis также активно выделяют РНК на поверхности своих листьев. Чтобы исследовать это, мы разработали высоковоспроизводимый метод сбора как смывочной жидкости с поверхности листьев (LSW), так и апопластической промывочной жидкости (AWF) из одного и того же набора растений Arabidopsis. Кроме того, мы изучили неинвазивную технику с использованием тампона с поверхности листа (LSS), которая позволила нам собрать РНК путем аккуратного мазка с поверхности листа стерильными палочками с ватным наконечником. Чтобы свести к минимуму риск микробного загрязнения, мы фильтровали фракции LSW, AWF и LSS перед выделением внеклеточной РНК (эксРНК). После анализа очищенной эксРНК с помощью гель-электрофореза с денатурирующей РНК мы наблюдали разнообразный массив длинных и малых видов РНК в образцах РНК LSW, LSS и AWF. Дальнейшая количественная оценка и сравнительный анализ образцов эксРНК с экспериментальными условиями были выполнены с помощью свободно доступного программного обеспечения ImageJ. Этот протокол обеспечивает эффективный, экономичный подход к выделению и анализу небольших количеств эксРНК из листьев растений. Эти препараты РНК могут быть дополнительно охарактеризованы с помощью секвенирования и других молекулярных анализов, что позволяет получить представление о динамической роли эксРНК во взаимодействиях растений и микробов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Листья колонизируются различными микробами, включая бактерии, грибы, оомицеты и простейшие, которые могут помочь защитить растения от биотических и абиотических стрессоров, в конечном итоге способствуя росту и развитию растений 1,2,3,4. Лист растения имеет два основных отсека для размещения взаимодействующих микробов: эпифитный (поверхность листа) и эндофитный (апопласт)2. Поверхность листа защищена гидрофобным слоем кутикулы, который предотвращает потерю воды и включает в себя такие компоненты, как воск и кутин. Верхняя (адаксиальная) поверхность листа часто содержит специализированные волосовидные эпидермальные клетки, называемые трихомами, которые защищают от ультрафиолета, регулируют температуру и служат отпугивающими факторами для травоядных. Напротив, апопласт способствует газо- и водообмену для фотосинтеза и обеспечивает влажную среду, способствующуюколонизации микробов. Несмотря на эти различия, оба отделения листьев благоприятствуют определенным микробам, при этом эпифитные микробные сети являются более сложными с точки зрения разнообразия по сравнению с эндофитными микробными сетями5. Как регулируется состав этих микробных сообществ в каждом внеклеточном компартменте, остается малоизученным. Мы предполагаем, что структура микробного сообщества может быть частично определена внеклеточными РНК (эксРНК), секретируемыми растением-хозяином.

В нашем недавнем исследовании мы сообщили о присутствии на поверхности листа различных видов РНК, которые отличаются от РНК в апопласте или клеточных лизатах6. В то время как большинство исследований эксРНК у растений было сосредоточено на малых некодирующих РНК, таких как микроРНК (микроРНК) и малые интерферирующие РНК (миРНК), меньше внимания уделялось другим видам РНК, таким как фрагменты, полученные из рРНК и тРНК, которые потенциально могут регулировать клеточные процессы независимо от комплементарности последовательностей, особенно у видов, лишенных механизмов интерференции РНК 7,8. 9.

Метод, который мы описываем здесь, позволяет последовательно выделять РНК как из промывочной поверхности листьев (LSW), так и из апопластической промывочной жидкости (AWF) с использованием одного и того же набора растений Arabidopsis. Кроме того, мы описываем неинвазивный ортогональный метод с использованием тампона с поверхности листа (LSS), который позволяет собирать РНК путем аккуратного мазка с поверхности листа стерильными палочками с ватными наконечниками6. Чтобы свести к минимуму риск микробного загрязнения, мы фильтруем фракции LSW и AWF перед выделением внеклеточной РНК. Для оценки количества и распределения образцов эксРНК по размерам описан протокол, в котором используется денатурирующий электрофорез полиакриламидного геля в сочетании с анализом изображений с помощью свободно доступного программного обеспечения ImageJ. Этот протокол обеспечивает эффективный и экономичный подход к выделению и анализу небольших количеств эксРНК. Эти препараты РНК могут быть дополнительно охарактеризованы с помощью секвенирования и молекулярного анализа, что позволяет получить представление о динамической роли внеклеточной РНК во взаимодействиях растений и микробов.

Описанный ниже протокол отличается от описанного нами ранее протокола выделения РНК из внеклеточных везикулрастений 10. Текущий протокол не требует каких-либо этапов ультрацентрифугирования и позволяет изолировать РНК от общей внеклеточной жидкости для промывки, а не только от внеклеточных везикул. Наиболее важным является то, что он предоставляет два ортогональных метода выделения РНК с поверхности листа. Насколько нам известно, выделение РНК с поверхности листьев не было описано до нашей недавней публикации6.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка буфера и стерилизация

  1. В 1 л дистиллированной воды готовят буфер для изоляции везикул (VIB), содержащий 20 мМ 2-(N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES), pH 6,0, 2 мМ CaCl2 и 0,01 М NaCl.
    Примечание: Незначительные корректировки концентрации NaCl в VIB были сделаны с 0,1 М до 0,01 М, чтобы имитировать ионную концентрацию апопласта листа.
  2. Автоклав VIB в течение 20 мин при 121 °C, жидкостный цикл. В качестве альтернативы можно простерилизовать VIB с помощью вакуумного фильтра 0,45 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг направлен на то, чтобы убедиться, что буфер стерилен, так как любое микробное загрязнение может привести к выявлению растений и, в свою очередь, к изменчивости результатов. Этот буфер можно хранить при комнатной температуре (без вскрытия крышки после стерилизации) при кратковременном хранении или при температуре 4 °C при длительном хранении.

2. Растительный материал и условия роста

  1. Посейте семена Arabidopsis thaliana Col-0 дикого типа (WT) в 4-дюймовые круглые пластиковые горшки, содержащие стандартную почвенную смесь. После посева замочите семена биологическим фунгицидом (600 мг/л), накройте их прозрачным пластиковым куполом и держите при температуре 4 °C в темноте в течение 3 дней, чтобы вызвать синхронное прорастание.
  2. Перенесите горшки с семенами в камеру для выращивания короткого дня с регулируемой температурой, установленную при температуре 24 °C при свете/15 ч темном фотопериоде 9 ч и плотности потока фотосинтетических фотонов 150 мкм·м−2·с-1 на уровне растений (смесь 3500 и 5000 К спектра 32-ваттных люминесцентных ламп 50:50).
  3. Примерно через 10 дней пересадите отдельные сеянцы в 36-ячеистые лотки, содержащие почвенную смесь, и накройте прозрачным пластиковым куполом на 1-2 недели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный эксперимент требует ~12-24 здоровых растений для каждого генотипа/лечения. Было отмечено, что 6-7-недельные растения дают оптимальное количество РНК LSW и AWF с наименьшим риском клеточного загрязнения.
  4. В зависимости от используемой почвенной смеси поливайте растения каждые 10-15 дней, чтобы избежать стресса от засухи или наводнения.

3. Сбор РНК листовой поверхности

  1. Метод, основанный на центрифугировании (Leaf Surface Wash; ЛСВ)
    1. Для каждой репликации используйте 6-7-недельные растения арабидопсиса.
    2. Добавьте Silwet-L77 (далее именуемый смачивающим агентом) в стерильный VIB в конечной концентрации 0,001% (1 мкл на 100 мл VIB) перед началом выделения LSW.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Silwet-L77 является смачивающим агентом, который снижает поверхностное натяжение и позволяет буферу покрывать поверхности листьев.
    3. Перелейте 100 мл VIB в бутылку с распылителем объемом 500 мл.
    4. Аккуратно отделите розетки арабидопсиса от корней с помощью тонких ножниц.
    5. Удалите лишнюю почву с черешка с помощью мягкой щетки.
    6. Поместите розетки на плоский поднос абаксиальной поверхностью вверх.
    7. Распылите на абаксиальную поверхность VIB + смачивающий агент с помощью пяти насосов пульверизатора.
    8. Осторожно переверните розетки и пять раз распылите на адаксиальную поверхность средство VIB + смачивающее средство.
    9. Чтобы восстановить LSW, осторожно поместите распыленные розетки внутрь безыгольных шприцев объемом 60 мл с отверстиями на дне (максимум две розетки 6-недельной давности могут поместиться на один шприц), помещенных внутрь центрифужных бутылок объемом 250 мл. Оберните шприц парапленкой вокруг горлышка, чтобы подвесить кончик шприца над дном флакона (для справки см. рисунок 1 ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о подготовке шприцев объемом 60 мл с отверстиями обратитесь к ранее опубликованному протоколу11.
    10. Центрифугируйте загруженные бутылки при 100 г в течение 10 мин при 4 °C (ротор JA-14).
    11. Отфильтруйте LSW через шприцевой фильтр 0,22 мкм и соберите фильтрат в центрифужную пробирку объемом 50 мл, помещенную на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 12 растений дают около 30 мл LSW в конечном итоге, используя этот протокол. Однако это всего лишь оценка, основанная на количестве распылений, выполняемых на каждом этапе. Этот объем обычно меньше распыляемого объема, так как часть распыляемого буфера теряется во время работы.
  2. Метод тампона с поверхности листа (LSS)
    1. Опрыскайте отделенные розетки средством VIB + смачивающим средством, как описано в предыдущем разделе (шаги 3.1.1-3.1.7).
    2. Чтобы восстановить LSS, промокните адаксиальную и абаксиальную поверхности с помощью стерильных палочек с ватными наконечниками и прижмите пропитанные кончики к внутренней стенке центрифужной пробирки объемом 15 мл, чтобы выдавить жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Адаксиальные и абаксиальные образцы LSS могут быть собраны в отдельные пробирки в зависимости от экспериментальной установки и ожидаемого результата.
    3. Отфильтруйте образцы LSS через шприцевой фильтр 0,22 мкм в центрифужную пробирку объемом 15 мл, помещенную на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества промазанных растений, в одном эксперименте могут быть собраны различные объемы LSS.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Инструменты, используемые для промывки поверхности листьев и выделения апопластической промывочной жидкости. (A) Для сбора LSW и AWF две целые розетки Arabidopsis thaliana помещаются в шприц объемом 60 мл с восемью дополнительными отверстиями, которые вплавляются в конец шприца с помощью нагретых щипцов для создания каналов для промывки. (B) Затем этот шприц без иглы оборачивается парапленкой в области горлышка, как показано на рисунке. (C) Этот шаг позволяет поместить шприц в центрифугу объемом 250 мл, не касаясь дна бутылки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

4. Сбор апопластической промывочной жидкости (AWF)

  1. Поместите в стакан тот же набор растений, который используется для выделения LSW или LSS, и аккуратно промойте их дважды дистиллированной водой.
  2. Вакуумную инфильтрацию розеток с помощью VIB в течение 20 с можно выполнить следующим образом:
    Примечание: Несмотря на то, что процесс вакуумной инфильтрации хорошо описан в ранее опубликованном протоколе11, он был воспроизведен здесь, чтобы сделать настоящий протокол более понятным.
    1. Осторожно поместите розетки во френч-пресс с 300-500 мл VIB. Закройте френч-пресс крышкой и осторожно опустите поршень до полного погружения растений.
    2. Поместите френч-пресс с растениями и буфером в вакуумную камеру. Подайте вакуум на 20 с с помощью вакуумного насоса. Буфер должен только начать кипеть.
    3. Отпустите вакуум и выньте френч-пресс из вакуумной камеры, снимите крышку и вылейте VIB в отдельную пластиковую чашку объемом 500 мл. Снимите розетки с френч-пресса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: VIB может быть повторно использован несколько раз в один и тот же день для одного генотипа, но после использования для вакуумной инфильтрации, VIB не должен храниться для использования в другой день.
    4. Удалите излишки VIB с растений, осторожно встряхивая, а затем смахивая листья бумажным полотенцем.
  3. Удалите излишки буфера с поверхности листьев путем аккуратной промокательной бумаги.
  4. Для сбора апопластической промывочной жидкости (AWF) поместите розетки внутрь безыгольных шприцев объемом 60 мл, помещенных внутрь флаконов центрифуги объемом 250 мл, как описано для сбора LSW, и центрифуги при 4 °C в течение 30 мин при 600 × г с медленным ускорением.
  5. Отфильтруйте объединенный AWF через шприцевой фильтр 0,22 мкм и соберите фильтрат в центрифужную пробирку объемом 15 мл, помещенную на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 12 растений дают около 6 мл AWF в конечном итоге, используя этот протокол. Отфильтрованные LSW, AWF и LSS можно использовать сразу или хранить при температуре -80 °C до дальнейшего использования.
  6. Запишите исходный вес (FW) растений, используемых для каждой реплики после выделения AWF. Впоследствии используйте это показание для нормализации количества РНК в каждом образце (рис. 2).

figure-protocol-2
Рисунок 2: Схематические иллюстрации протокола и метода мазка с поверхности листа. (A) Схематическое изображение пошагового протокола выделения промывочной жидкости с поверхности листа и апопластической промывочной жидкости с использованием розеток Arabidopsis. (B) Схематическая иллюстрация метода тампона с поверхности листа (LSS) для выделения РНК поверхности листа. Рисунки адаптированы с рисунка S1 и рисунка S4 Borniego et al., 20256. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

5. Осаждение РНК

  1. Осаждение РНК путем смешивания необходимого объема AWF, LSW или LSS с 0,1 объема 3 М ацетата натрия (pH 5,2) и 1,0 объема холодного изопропанола в центрифужной пробирке объемом 15 мл.
  2. Добавьте гликоген (20 мг/мл бульона) до конечной концентрации 20 мкг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что центрифужные пробирки, используемые для осаждения РНК, могут центрифугироваться с высокой скоростью 13 000 × г. Разрыв пробирок на этом этапе может привести к потере образцов РНК.
  3. Инкубируйте смесь при температуре -20 °C в течение минимум 1 часа или в течение ночи.
  4. Центрифугируйте пробирки при 13 000 × г в течение 30 мин при 4 °C (ротор JA-25.50).
  5. Дважды промойте гранулу ледяным 70% EtOH и дайте ей высохнуть на воздухе не более 10 минут.
  6. Повторно суспендируйте гранулы в 100 мкл ультрачистой воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы или VIB, и перенесите РНК в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага осажденная РНК может храниться при температуре -80 °C до 2 недель.

6. Выделение РНК на основе тризола

  1. Добавьте 1 мл реагента TRIzol в каждую пробирку и перемешайте, встряхивая на ротаторе.
    ВНИМАНИЕ: Для работы с TRIzol используйте его в вытяжном шкафу, надевайте перчатки и защитите глаза.
  2. Поместите трубки на настольный вращатель на 10 минут при комнатной температуре (RT).
  3. Добавьте 200 мкл хлороформа в каждую пробирку, после чего следует короткий, но энергичный этап вортекса.
    ВНИМАНИЕ: Для работы с хлороформом используйте его в вытяжном шкафу, надевайте перчатки и защитные очки.
  4. Дайте пробиркам постоять при температуре RT около 3 минут, а затем центрифугируйте при 13 000 × г в течение 15 минут при 4 °C.
  5. Перенесите водную фазу в меченые центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и добавьте 10 г гликогена, не содержащего РНКазы, и один объем холодного изопропанола.
    ВНИМАНИЕ: Для образующихся биологически опасных отходов (таких как фенольные отходы) собирайте органические растворители в специально отведенных контейнерах для отходов в соответствии с организационными рекомендациями.
  6. Инкубируйте пробирки не более 1 ч при температуре -20 °С.
    Примечание: Осаждение РНК в течение более 1 часа на этом этапе снижает эффективность выделения РНК и приводит к очень низкой концентрации РНК.
  7. Чтобы гранулировать РНК, центрифугируйте пробирки при 13 000 × г в течение 20 минут при 4 °C.
  8. Дважды промойте гранулы РНК с помощью ледяного 70% EtOH и дайте им высохнуть на воздухе перед тем, как снова суспендировать в 10-20 мкл сверхчистой воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы.
  9. Храните ресуспендированную РНК при температуре -20 °C или -80 °C для кратковременного или долгосрочного хранения соответственно.

7. Удаление загрязнений фенолом или гуанидином

  1. Чтобы удалить фенол или гуанидин из образцов РНК, проведите одно или два последовательных осаждения 96% EtOH и ацетата аммония.
  2. Добавьте 1 г гликогена к 10 μл образцов РНК и смешайте с 0,5 объемом 7,5 М ацетата аммония перед добавлением 2,5 объемов 96-100% EtOH.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация EtOH должна составлять 70-75% во всем объеме на этом этапе.
  3. Смесь инкубировать при -80 °C в течение 30 мин и центрифугировать при 13 000 × г в течение 20 мин при 4 °C.
  4. Дважды промойте гранулу РНК 70% EtOH и повторно суспендируйте в 10 мкл сверхчистой воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы.

8. Электрофорез в РНК-геле для количественного определения и сравнения

  1. Приготовьте мини-гель (7,2 см x 8,6 см x 0,75 мм), содержащий 10% или 15% полиакриламида и 7 М мочевины в 1x Трис-борная кислота ЭДТА (TBE, pH 8,4), используя 40% раствор акриламида/Bis, 37,5:1. В качестве альтернативы, для обработки образцов РНК можно использовать коммерческий денатурирующий мини-гель (15% геля TBE-мочевины).
  2. Смешайте образцы РНК (1:1) с 2x денатурирующим буфером (95% формамид, 10 мМ ЭДТА, 0,02% SDS, 0,02% бромфенольного синего и 0,01% ксилолацианола), денатурируйте при 65 °C в течение 5 минут и немедленно положите на лед.
  3. Разрешите образцы РНК в 0,5x TBE в рабочем буфере при ОТ при напряжении 220 В в течение примерно 1 ч 15 мин.
  4. Для стандартов размера используйте смесь низкодиверсионных ssRNA в соотношении 1:1 и лестничных маркеров 14-30 nt ssRNA.
  5. Окрасьте гель 1x SYBR золотыми нуклеиновыми кислотами в 0,5x TBE в течение 10 минут, дважды промойте дистиллированной водой и сделайте изображение с помощью системы визуализации (Рисунок 3).
  6. Чтобы количественно определить РНК, разрешенную в каждой полосе, используйте метод анализа геля, описанный в документации ImageJ в подзаголовке «Анализ геля»: https://imagej.net/ij/docs/menus/analyze.html
  7. Поскольку 100 нг/мкл РНК CL загружается каждый раз, для сравнения структуры полос между образцами CL и эксРНК оцените концентрацию образцов эксРНК относительно РНК CL (рис. 4).

figure-protocol-3
100 нг РНК из лизата клеток листа (CL) и 2 мкл РНК, выделенных из AWF и LSW, были разделены на 15% денатурирующем полиакриламидном геле и окрашены красителем нуклеиновой кислоты SYBR Gold для визуализации и сравнения паттернов полосчатости РНК. Стандарты размера РНК показаны в крайней левой полосе. Измерения денситометрии, полученные с помощью гелевого анализа ImageJ, указаны в нижней части каждой полосы и указывают на количество РНК относительно РНК в общей полосе лизата клеток листа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-4
Рисунок 4: Повторная экстракция РНК LSW. LSW был впервые выделен с использованием VIB без Silwet L-77 или различных концентраций Silwet L-77 (0,001% или 0,01%). Повторное выделение LSW с использованием одного и того же набора растений Arabidopsis может быть использовано для обогащения РНК LSW с использованием VIB + Silwet L-77 (0,001%). L1, L2 и L3 обозначают образцы РНК, выделенные с помощью LSW, собранные в ходе трех последовательных циклов центрифугирования после опрыскивания одного и того же набора растений. Увеличение концентрации смачивающего агента с 0,001% до 0,01% не способствовало выделению РНК LSW. Измерения денситометрии, полученные с помощью гелевого анализа ImageJ, указаны в нижней части каждой полосы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

9. Альтернативный метод количественного определения РНК с использованием метода на основе микротитровых пластин

  1. Готовьте стандартные растворы РНК с использованием CL РНК в воде, не содержащей РНКазы/ДНКазы. Определите подходящий диапазон концентраций для стандартов на основе ожидаемой концентрации образцов. Используйте следующие концентрации РНК: 0, 6,75, 12,5, 25, 50, 100, 200 нг/мкл и приготовьте достаточный объем каждого стандарта, чтобы обеспечить две технические репликации.
  2. Приготовьте 1,5x SYBR Gold гелевый краситель для нуклеиновых кислот в 500 мМ Tris HCl pH = 8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SYBR Gold является pH-зависимым и имеет оптимальную чувствительность окрашивания в диапазоне pH = 7,0 до 8,0.
  3. Настройка микропланшетов:
    1. Добавьте 99 мкл dH2O в каждую лунку.
    2. Добавьте по 1 мкл РНК в каждую лунку. Используйте 1 мкл как для образцов РНК, так и для стандартов РНК.
    3. Добавьте 50 μL 1,5x SYBR Gold в каждую лунку.
  4. Установите параметры на считывателе микропланшетов следующим образом:
    Встряхивание — линейное или орбитальное: 0:03 (MM:SS)
    Read - Конечная точка флуоресценции с длиной волны возбуждения 496 нм и длиной волны излучения 540 нм.
  5. Постройте калибровочную линию, используя значения эталонов. Используя уравнение калибровочной линии, рассчитайте концентрацию РНК в образцах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные красители могут быть использованы для количественного определения РНК в образцах, выделенных с помощью тризола. Аналогичные результаты были получены с реагентом для количественного определения РНК Ribo488. Подробная инструкция предоставляется компанией для этого красителя. Кратковременно разбавьте краситель в 1000 раз (от 1 до 1000) с помощью 200 мМ Tris pH = 8. Затем для проведения измерений добавьте 99 мкл автоклавированного dH2O в каждую лунку + 1 мкл РНК (образца или стандарта) + 100 мкл разведения Ribo488, инкубируйте 5 минут и количественно оцените флуоресценцию с помощью планшетного ридера с использованием возбуждения 480 нм и излучения 520 нм. Стандартные кривые, полученные с использованием двух РНК-красителей, показаны на рисунке 5.

figure-protocol-5
Рисунок 5: Стандартные кривые, полученные с помощью метода количественного определения РНК на основе микротитровых пластин. Два разных красителя на основе РНК, SYBR Gold (слева) и Ribo488 (справа) дают стабильные результаты с двумя техническими повторами на образец. Любой из этих методов может быть использован для количественного определения РНК. Тем не менее, стандартная кривая должна быть получена каждый раз, когда необходимо количественно определить РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематический обзор описанного выше пошагового протокола выделения фракций промывки листовой поверхности (LSW) и апопластических фракций смыва (AWF) из растений Arabidopsis представлен на рисунке 2A. Этот метод позволяет извлекать как LSW, так и AWF всего из трех-шести растений на репликацию, при этом стабильно получая эквивалентное количество РНК из обеих фракций. Для измерения концентрации РНК в клеточных лизатах мы используем спектрофотометрию NanoDrop. Однако для образцов РНК, полученных из LSW, LSS и AWF, мы полагаемся на денситометрическое количественное определение полиакриламидных гелей, окрашенных золотом SYBR. Этот этап количественного определения необходим, потому что внеклеточные фракции содержат неизвестное загрязнение — вероятно, полисахариды, которые иногда могут очищать и мешать методам количественного определения РНК, основанным на абсорбции, что приводит к завышению концентрации РНК. Чтобы преодолеть это ограничение, мы планируем использовать в нашей дальнейшей работе методы очистки РНК без фенола.

Анализ геля денатурирующей РНК выявил присутствие широкого спектра видов РНК в LSW и AWF, включая как длинные, так и малые РНК (рис. 3). Примечательно, что эквивалентные количества РНК были успешно выделены как из листовой поверхности, так и из апопластических фракций, при этом количество РНК нормализовалось для расчета на свежий вес растения (FW). Удивительно, но профили размеров РНК фракций LSW и AWF значительно отличались друг от друга и от профиля РНК общего клеточного лизата (CL). Эти различия позволяют предположить, что фракции эксРНК не загрязнены клеточной РНК. Среди трех фракций апопластическая РНК (AWF) продемонстрировала наибольшее разнообразие в распределении по размерам, что позволяет предположить, что апопластическая РНК более деградирована, чем РНК поверхности листа.

Для дальнейшего изучения наличия РНК на поверхности листьев арабидопсиса мы использовали ватные палочки. Этот метод позволил нам раздельно и последовательно собирать РНК с адаксиальной (верхней) и абаксиальной (нижней) поверхностей листьев6. Эти анализы показали, что обе поверхности листьев содержат одинаковое количество РНК. Более того, возможность собирать РНК путем простого поглощения буфера с поверхности листа без необходимости центрифугирования еще больше подтверждает вывод о том, что РНК действительно находится на поверхности листа, а не экстрагируется через устьица во время центрифугирования.

Одной из основных корректировок, которая позволила нам извлечь большое количество РНК поверхности листа, было добавление смачивающего агента. Мы восстановили почти в два раза больше РНК при добавлении смачивающего агента (в очень низкой концентрации 0,001%) в VIB. Эта разница в концентрации РНК, полученной с Silwet L-77 и без него, указывает на то, что использование смачивающего агента улучшает растворение РНК на поверхности листа. Однако увеличение концентрации смачивающего агента с 0,001% до 0,01% не привело к увеличению выделения РНК LSW (рис. 4). Примечательно, что повторное выделение РНК LSW из одних и тех же листьев дало дополнительную РНК (примерно 63% от восстановления, полученного при первом смывке), что говорит о том, что листья постоянно выделяют РНК на поверхность, причем почти две трети ее заменяются в течение примерно 30 минут, необходимых для обработки листьев. Таким образом, чтобы увеличить общий выход LSW РНК при ограниченном растительном материале, можно мыть одни и те же листья несколько раз подряд. Тем не менее, мы не рекомендуем проводить более трех стирок, так как работа с ними может привести к кумулятивному повреждению листового материала, о чем свидетельствует зеленый цвет промывочной жидкости. Для этих экспериментов концентрацию РНК оценивали с помощью денситометрического анализа на основе геля РНК. Тем не менее, описанный выше метод количественного определения РНК на основе микротитровых пластин может быть использован для точного количественного определения РНК при одновременной оценке нескольких образцов (рис. 5).

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описано, как изолировать промывку поверхности листа (LSW), мазок с поверхности листа (LSS) и апопластическую жидкость для промывки (AWF) из здоровых розеток Arabidopsis с последующей экстракцией РНК. Важнейшие этапы включают подготовку и стерилизацию VIB перед проведением эксперимента, выращивание растений в контролируемых условиях и использование Silwet-L77 для обеспечения надлежащего покрытия поверхности листьев VIB. Эти процедуры должны дать равное количество РНК как из LSW, так и из AWF, нормализованное по весу свежего листа. Извлечение РНК из этих внеклеточных фракций требует осторожного обращения, особенно в отношении гранул РНК после стадий осаждения.

Несмотря на то, что вышеуказанный протокол был оптимизирован для листьев арабидопсиса, мы также успешно использовали его на других видах растений с незначительными изменениями. Извлечение РНК с поверхности листа может быть оптимизировано путем реализации двух основных корректировок: во-первых, путем проведения нескольких раундов выделения LSW, а во-вторых, путем увеличения концентрации смачивающего агента. Виды растений с очень гидрофобной поверхностью листьев, такие как рис12,13, могут требовать более высоких концентраций смачивающего агента.

Кроме того, мы описали неинвазивный метод сбора РНК поверхности листа с помощью тампонов с ватным наконечником. С помощью этого метода выделения РНК поверхности листа мы гарантируем, что пробирка для сбора будет помещена в ведро со льдом. Учитывая, что РНК на поверхности листа выделяется и накапливается при комнатной температуре, мы предполагаем, что она будет оставаться стабильной даже в процессе сбора. Мы также сравнили паттерны полосатости РНК LSW и LSS, и они не показали большой разницы с точки зрения деградации.

В приведенном выше протоколе используется реагент TRIzol для очистки РНК от LSW, LSS или AWF. Этот реагент использует фенол для удаления белков. Однако мы обнаружили, что очистка на основе тризола не удаляет полисахариды, такие как пектин, которые в изобилии присутствуют в LSW и AWF6. Такие коочищающие молекулы могут вызвать проблемы с количественной оценкой РНК с помощью спектрофотометрии или флуориметрии. Поэтому мы полагаемся на денситометрический анализ на основе геля РНК для оценки концентраций эксРНК. В настоящее время мы исследуем методы очистки на основе колонок, которые должны обеспечить лучшее отделение РНК от полисахаридов. Тем не менее, эти методы часто ограничивают восстановление малых РНК, поскольку мембрана из диоксида кремния оптимизирована для связывания молекул РНК размером более ~200 нуклеотидов. Малые РНК могут проходить через мембрану во время связывания или теряться на этапах промывки. Таким образом, до сих пор мы полагались только на метод на основе ТРИЗОЛа для более полного восстановления всех размеров РНК, включая малые РНК, хотя он требует осторожного обращения и разделения фаз.

Кроме того, при проведении анализа РНК-геля мы не видим фрагментов размером менее 80 нт для общих образцов клеточной РНК по сравнению с РНК AWF и LSW, в основном из-за низкой распространенности по сравнению с большим количеством рРНК и тРНК. Наличие меньших полос в AWF и LSW связано с деградацией обильных рРНК и тРНК, которая происходит естественным образом после секреции РНК во внеклеточном компартменте растений, и это не артефакт, внесенный во время сбора и обработки растений, что подтверждено секвенированием и анализом северного блоттинга6.

Наш метод изоляции промывки поверхности листьев является универсальным инструментом со значительным потенциалом для широкого спектра исследовательских применений. Он должен обеспечивать выделение биомолекул с поверхности листа, таких как РНК, белки и другие метаболиты, которые могут играть центральную роль в понимании взаимодействий между растениями и микробами. Если требуется идентификация микробов, присутствующих в AWF и LSW, это может быть достигнуто путем исключения фильтрации через фильтр 0,22 мкм.

Растения взаимодействуют с широким спектром микробов, включая бактерии, грибы и вирусы, которые образуют сложные сообщества на их поверхности1. Эти микробные сообщества могут оказывать глубокое влияние на рост растений, устойчивость к болезням и усвоение питательных веществ 2,3,4. Выделяя и анализируя смыв поверхности листьев с помощью этого метода, исследователи могут выделить эксРНК, микробные метаболиты, идентифицировать микробные сообщества, присутствующие на поверхности листа, и исследовать, как эти сообщества регулируются на молекулярном уровне.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана двумя грантами от Национального научного фонда США,

IOS-2243531 и IOS-2141969 в R.W.I.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
14-30 nt ssRNA лестничный маркерТакара3416
Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 млВВР20170-038
Безыгольный шприц 10 млБД303347
Соколиные пробирки объемом 15 млВВР89039-668
15% гель мочевины Mini-PROTEAN TBE-мочевины, 10 лунок/12 лунок, 30 и микро; L/20 & микро; LБио-Рад4566053 / 4566055
Вкладыши лотков на 36 ячеекРынок True Leaf
40% раствор акриламида и бис-акриламида, 37,5:1Био-Рад1610148
4-дюймовые круглые горшкиРынок True Leaf
Соколиные пробирки объемом 50 млВВР89039-656
Безыгольный шприц 50 млБД309653
96-луночная пластина с черным дномГренье655090
Акродиск 0.22 μ Шприцевой фильтр МПокрывать4192
Акродиск 0,45 μ Шприцевой фильтр МПокрывать4454
Персульфат аммония (АФС) Сигма-ОлдричА3678
Хлорид кальция Сигма-ОлдричС1016
Хлороформ (без РНКазы)Макрон Файн КемикалсMK444110
Прозрачные пластиковые куполаХаммерт Интернэшнл11 3348Любой пластиковый купол можно использовать для укрытия растений и поддержания влажности
Палочка с ватным наконечником медицинского классаУлинеС-21102
Этанол (без РНАЗа)Decon Laboratories, Inc.2716GEA
Кофеварка во френч-прессе, 24 жидких унцииСнежный пикКС-111
Лоток для выращивания без отверстий 10 х 20Рынок True Leaf
Ведро для льда Шутт-Биотех, Губка3-680 052
ИзопропанолТермо Сайентиал149320050
Ротор JA-14 с фиксированным углом наклонаБекман Коултер; модель: JA-14339247
КимвайпсKCWW, Кимберли-Кларк34120
Lader с низким диапазоном ssRNAКЛЮВН0364С
MES гидратСигма-ОлдричМ8250
Считыватель микропланшетовБиоТек  Синергия H1
Чудо-ГроЧудо-Гро24-8-16Это универсальная растительная пища. В зависимости от источника почвы, используемого для выращивания растений, применение может быть скорректировано.
Nalgene centifuge флакон 250 мл (без крышки)Налген3120
Бумажные полотенца
ПараФильм  Пленка М ЛабПарафильмС-25929
Пластиковый стакан (500 мл)УлинеС-21658
Гликоген без РНКазы (20 мг/мл)Термо СайентиалР0561
RootShield Plus WP Биологический фунгицидБиоВоркс68539-9
Ножницы
Силвет Л-77Лаборатории фитотехаС7777Можно использовать Silwet L-77 любой марки. Тем не менее, Silwet теряет свою эффективность с течением времени. Идеально заменять его раз в год.
Хлорид натрияСигма-ОлдричС7653
Кисть для рисования из мягкого нейлонаНАС. Арт-снабжениеNo 6
РаспылительУлинеС-7272Можно использовать любую бутылку с распылителем, но настройки распыления должны быть на душе.
Sungro Professional Микс для выращиванияСангро
Смесь для размножения SungroСангро
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10 000x концентрат в ДМСО)Термо СайентиалС11494
ТЕМЕДТермо Сайентиал17919
Реагент ТРИзолИнвитроген15596026
Сверхчистая вода, не содержащая Dnase/RnaseИнвитроген10977015
МочевинаСигма-ОлдричУ5378
Вакуумная камера, 0,20 куб. футаSP Scienceware - Продукция Бел-Арт - H-B InstrumentФ42031-0000
Вакуумный насос, 3,5 кубических футов в минутуИдеальные вакуумные продуктыP101532
ВесыЭскалиWBB480535Это всего лишь пример. Можно использовать любые весы.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vorholt, J. A. Microbial life in the phyllosphere. Nat Rev Microbiol. 10 (12), 828-840 (2012).
  2. Ritpitakphong, U., Falquet, L., Vimoltust, A., Berger, A., M'etraux, J., L'Haridon, F. The microbiome of the leaf surface of Arabidopsis protects against a fungal pathogen. New Phytol. 210 (3), 1033-1043 (2016).
  3. Chaudhry, V., Runge, P., Sengupta, P., Doehlemann, G., Parker, J. E., Kemen, E. Shaping the leaf microbiota: plant-microbe-microbe interactions. J Exp Bot. 72 (1), 36-56 (2021).
  4. Vacher, C., Hampe, A., Port'e, A. J., Sauer, U., Compant, S., Morris, C. E. The phyllosphere: microbial jungle at the plant-climate interface. Ann Rev Ecol Evol Syst. 47, 1-24 (2016).
  5. Mahmoudi, M., Almario, J., Lutap, K., Nieselt, K., Kemen, E. Microbial communities living inside plant leaves or on the leaf surface are differently shaped by environmental cues. ISME Commun. 4 (1), ycae103(2024).
  6. Borniego, M. L., et al. Diverse plant RNAs coat Arabidopsis leaves and are distinct from apoplastic RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2409090121(2025).
  7. Ren, B., Wang, X., Duan, J., Ma, J. Rhizobial tRNA-derived small RNAs are signal molecules regulating plant nodulation. Science. 365 (6456), 919-922 (2019).
  8. Chery, M., Drouard, L. Plant tRNA functions beyond their major role in translation. J Exp Bot. 74 (7), 2352-2363 (2022).
  9. Panstruga, R., Spanu, P. Transfer RNA and ribosomal RNA fragments-Emerging players in plant-microbe interactions. New Phytol. 241 (2), 567-577 (2024).
  10. Baldrich, P., Rutter, B. D., Karimi, H. Z., Podicheti, R., Meyers, B. C., Innes, R. W. Plant extracellular vesicles contain diverse small RNA species and are enriched in 10- to 17-nucleotide "Tiny" RNAs. Plant Cell. 31 (2), 315-324 (2019).
  11. Rutter, B. D., Rutter, K. L., Innes, R. W. Isolation and quantification of plant extracellular vesicles. Bio Protoc. 7 (17), e2533(2017).
  12. Zhang, Z., et al. OsHSD1, a hydroxysteroid dehydrogenase, is involved in cuticle formation and lipid homeostasis in rice. Plant Sci. 249, 35-45 (2016).
  13. Zhou, L., Ni, E., Yang, J., Zhou, H., Liang, H., Li, J., Jiang, D., Wang, Z., Liu, Z., Zhuang, C. Rice OsGL1-6 is involved in leaf cuticular wax accumulation and drought resistance. PLoS One. 8 (5), e65139(2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Leaf Surface RNAExtracellular RNARNA IsolationLeaf Surface WashApoplastic Wash FluidRNA Gel ElectrophoresisImageJ AnalysisPlant Microbe Interactions

Похожие статьи