В этом исследовании представлен основанный на везикулах метод визуализации с использованием одной молекулы, который сохраняет нативную организацию рецепторов, обеспечивая точную количественную оценку стехиометрии и широкое применение в сборке, функции рецепторов и исследованиях заболеваний.
Методическая статья
Ex Vivo Одномолекулярный анализ сборки рецептора 2 рианодина в сердечной и нейрональной ткани
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Понимание сборки рецепторов имеет решающее значение для выяснения механизмов, лежащих в основе их функции и регуляции в физиологических процессах. В то время как традиционные исследования одной молекулы in vitro основаны на выделении белков из гетерологичных систем экспрессии, они часто не в состоянии охватить in vivo физиологическую сложность, связанную с организацией и сборкой белков клеточной поверхности. В этом протоколе используется флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRFM) для изучения молекул рецептора рианодина 2 (RyR2), меченных GFP, инкапсулированных в наноразмерные везикулы. Эти везикулы, полученные из органов, быстро извлеченных из животного, эффективно обеспечивают моментальный снимок состояния сборки рецептора во время экстракции, что позволяет проводить детальный анализ стехиометрии субъединиц и организации рецепторов в ответ на изменения в физиологической среде животного. Этот подход использует TIRFM и ступенчатый анализ фотообесцвечивания для получения показаний стехиометрии рецепторов. Визуализация рецепторов на уровне одной молекулы облегчает обнаружение гетерогенности в популяциях рецепторов, собранных в живом животном, и позволяет отслеживать изменения сборки, связанные с болезненными состояниями. В результате этот метод предлагает мощный инструмент для определения распределения рецепторных сборок и их корреляции с изменениями в их физиологическом окружении.
Введение
Мембранные рецепторы играют решающую роль в физиологических процессах во всем организме человека1. Основная функция состоит в том, чтобы опосредовать коммуникацию между клетками посредством передачи внеклеточных стимулов для инициирования внутриклеточных сигнальных событий. Из-за их фундаментальной роли в передаче сигналов почти 70% существующих терапевтических средств нацелены на мембранныерецепторы. Они часто представляют собой олигомерные структуры, состоящие из множества субъединиц, собранных в гетеромерные формы с множественными стехиометриями 3,4<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка образцов
- Транскардиальная перфузия и экстракция органов
- Обезболивайте мышь с помощью CO₂ до тех пор, пока дыхание не прекратится.
- Расположите мышь в положении лежа на спине и закрепите конечности.
- Сделайте разрез по средней линии вдоль живота и протяните в сторону грудной клетки, чтобы обнажить грудную полость.
- Осторожно введите иглу в левый желудочек и пересеките правое предсердие, чтобы обеспечить дренаж перфузата.
- Для приготовления везикул следует проводить холодную обработку 1x PBS до тех пор, пока кровеносная система не очистится от крови.
- Дл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы подтвердить применимость данного метода, мы сначала верифицировали экспрессию и локализацию GFP-RyR2 с помощью конфокальной визуализации криосекций сердечной и нейрональной ткани (рис. 1). Сигнал флуоресценции в сердечной ткани демонстрировал поперечно-полосатый рисунок, соответствующий ожидаемой локализации RyR2 в кардиомиоцитах, но демонстрировал высокую интенсивность в определенных областях мозга, а именно в коре, гиппокампе и мозжечке, что указывает.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Это исследование устанавливает подробный и воспроизводимый протокол для инкапсуляции ex vivo и визуализации мембранных рецепторов с использованием RyR2 с тегом GFP в качестве модельной системы. Протокол значительно продвинул вперед существующие методы, позволив проводить стехиометрический анализ рецепторных комплексов непосредственно из нативной ткани, сохраняя физиологический контекст мембранных белков. По сравнению с традиционными системами экспрессии in vitro, этот подход сво.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Благодарности
Мы хотели бы выразить признательность ядру микроскопии UKY Light и Центру биоэлектроники и наномедицины за использование их оборудования. Поддержку этой работе оказали NIH (GM138837 и GM138882). Рисунок 2 (https://BioRender.com/s69w811) и Рисунок 3 (https://BioRender.com/y54b47) были созданы в BioRender.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Тарелка 35 мм | No 1.5 Покровное покрытие | Диаметр стекла 14 мм | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Andwin Scientific Ткани-тек криомолд формы/адаптеры | Fisher Scientific | NC9542860 | |
| APTES | Millipore Sigma | 440140-100ML | (3-Аминопропил)триэтоксисилан |
| Bio-Gen PRO200 Лабораторный гомогенизатор | Pro Scientific | 1204B59 | |
| cellSENS | Olympus Scientific Solutions | н/а | |
| EMCCD камера | Andor | n/a | iXon Ultra 897 |
| Абсолют этанола ≥ 100% (v/v) USP для молекулярной биологии (200 пруф) | VWR | 71006-012 | |
| Leica CM1860 | Leica | n/a | cryostat |
| MetaMorph Advanced | Molecular Devices | n/a | |
| Nanosight NS300 (с программным обеспечением Nanosight NTA) | Malvern Panalytical | n/a | |
| Nikon AXR Инвертированный конфокальный микроскоп Nikon | н/д | ||
| Olympus IX83 Моторизованный автофокусный инвертированный флуоресцентный микроскоп | Olympus | n/a | TIRFM |
| Параформальдегид 4% в PBS готовый к использованию фиксирующий реагент | VWR | 76221-378 | |
| Фосфатный буферный раствор (PBS) 20x, ультрачистый класс | VWR | 97062-950 | |
| Гидроксид натрия, гранулы, реагент класса | VWR | 97064-526 | |
| SUNBRIGHT OE-020CS + | NOF Америка Корпорейшн | н/д | Олеил-О(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | M71484 | |
| VectaMount AQ Водный монтаж Medium | Vector Laboratories | H-5501-60 |
Ссылки
- Taur, Y., Frishman, W. H. The cardiac ryanodine receptor (RyR2) and its role in heart disease. Card Rev. 13 (3), 142-146 (2005).
- Lundstrom, K. Structural genomics and drug discovery. J Cell Mol Med. 11 (2), 224-238 (2007).
- Levitz, J., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешениеТеги
