Методическая статья

Ex Vivo Одномолекулярный анализ сборки рецептора 2 рианодина в сердечной и нейрональной ткани

385 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68408

⸱

15 июля 2025 г.

 , 
1Department of Chemistry, University of Kentucky

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании представлен основанный на везикулах метод визуализации с использованием одной молекулы, который сохраняет нативную организацию рецепторов, обеспечивая точную количественную оценку стехиометрии и широкое применение в сборке, функции рецепторов и исследованиях заболеваний.

Аннотация

Понимание сборки рецепторов имеет решающее значение для выяснения механизмов, лежащих в основе их функции и регуляции в физиологических процессах. В то время как традиционные исследования одной молекулы in vitro основаны на выделении белков из гетерологичных систем экспрессии, они часто не в состоянии охватить in vivo физиологическую сложность, связанную с организацией и сборкой белков клеточной поверхности. В этом протоколе используется флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRFM) для изучения молекул рецептора рианодина 2 (RyR2), меченных GFP, инкапсулированных в наноразмерные везикулы. Эти везикулы, полученные из органов, быстро извлеченных из животного, эффективно обеспечивают моментальный снимок состояния сборки рецептора во время экстракции, что позволяет проводить детальный анализ стехиометрии субъединиц и организации рецепторов в ответ на изменения в физиологической среде животного. Этот подход использует TIRFM и ступенчатый анализ фотообесцвечивания для получения показаний стехиометрии рецепторов. Визуализация рецепторов на уровне одной молекулы облегчает обнаружение гетерогенности в популяциях рецепторов, собранных в живом животном, и позволяет отслеживать изменения сборки, связанные с болезненными состояниями. В результате этот метод предлагает мощный инструмент для определения распределения рецепторных сборок и их корреляции с изменениями в их физиологическом окружении.

Введение

Мембранные рецепторы играют решающую роль в физиологических процессах во всем организме человека1. Основная функция состоит в том, чтобы опосредовать коммуникацию между клетками посредством передачи внеклеточных стимулов для инициирования внутриклеточных сигнальных событий. Из-за их фундаментальной роли в передаче сигналов почти 70% существующих терапевтических средств нацелены на мембранныерецепторы. Они часто представляют собой олигомерные структуры, состоящие из множества субъединиц, собранных в гетеромерные формы с множественными стехиометриями 3,4. Понимание того, как рецепторы организуются в функциональные комплексы, имеет решающее значение для выяснения их роли в здоровье и болезнях 5,6. Традиционные биохимические методы, такие как иммунопреципитация и вестерн-блоттинг, позволяют получить усредненные ансамблевые измерения, которые скрывают гетерогенность в субпопуляциях рецепторов7. В отличие от этого, одномолекулярные методы позволяют проводить прямое наблюдение за отдельными рецепторами, что позволяет количественно оценить гетерогенность в популяциях рецепторов 8,9,10. Методы с использованием одной молекулы стали стандартом для количественной оценки сборки мембранных рецепторов, стехиометрии и олигомеризации 11,12. Этот подход был широко применен ко многим физиологически значимым мембранным рецепторам с использованием изолированного белка или условий клеточной культуры. Исследования одиночных молекул в первую очередь опираются на системы экспрессии in vitro, где белки могут быть выделены из клеточной среды. Тем не менее, сложность внутри живой системы не полностью отражается в этих типах гетерологичных систем экспрессии.

Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали подход, который изолирует и визуализирует мембранные рецепторы в физиологически значимом состоянии, захватывая их в нановезикулах, полученных непосредственно из сердечных и нейронных тканей. Этот метод эффективно сохраняет состояние сборки рецептора в момент формирования везикулы, позволяя непосредственно визуализировать стехиометрию субъединицы рецептора, которая является ключевым индикатором реакции рецептора в различных физиологических средах. Этот подход позволяет нам исследовать стехиометрическую сборку мембранных рецепторов, которые происходят в сложной биологической среде у живых животных, не требуя гетерологичной экспрессии или восстановления. Используя флуоресцентную микроскопию с полным внутренним отражением (TIRFM), мы получаем визуализацию рецепторов, инкапсулированных в везикулы, с разрешением одной молекулы и извлекаем следы фотообесцвечивания для определения состава субъединиц.

TIRFM хорошо подходит для визуализации одномолекулярных мембранных белков, поскольку он избирательно возбуждает флуорофоры в пределах ~150 нм от поверхности стекла, снижая фоновую флуоресценцию от молекул в растворе 3,10. Такое удержание значительно повышает соотношение сигнал/шум, позволяя точно обнаруживать отдельные мембранные рецепторные комплексы. Анализируя ступенчатое фотообесцвечивание флуоресцентно меченых рецепторов, мы можем непосредственно определить стехиометрию субъединиц и оценить потенциальную гетерогенность впопуляциях рецепторов. Это особенно актуально для рецептора 2 рианодина (RyR2), большого внутриклеточного канала высвобождения Ca²⁺, который играет решающую роль в связи возбуждения и сокращения в сердце, где он собирается только как гомо-тетрамер, и в синаптической функции в мозге, где его сборка ещене установлена.. Учитывая наличие множественных изоформ RyR в нейрональных тканях, остается неясным, образует ли RyR2 в мозге чисто гомомерные тетрамерные комплексы, состоящие из четырех идентичных субъединиц, как это происходит в сердце, или же гетеромерные сборки с RyR1 или RyR3 встречаются in vivo 15,16,17,18.

Изолируя везикулы из определенных областей сердца и мозга, этот метод позволяет исследовать потенциальные тканеспецифичные различия в организации RyR2. Мы используем свойства RyR2 в сердечной ткани, где он может образовывать только гомотетрамеры, чтобы обеспечить статистически надежную основу для стехиометрии одномолекулярной субъединицы ex vivo, а известная сборка тетрамеров служит в качестве контроля для исследования неизвестных сборок в других органах. Способность визуализировать рецепторы в их естественном состоянии, сохраняя при этом их физиологические взаимодействия, обеспечивает надежную основу для изучения сборки рецепторов в различных органах и в различных физиологических условиях. Этот протокол описывает рабочий процесс выделения везикул, иммобилизации и визуализации одномолекулярной визуализации GFP-меченного RyR2, что позволяет точно охарактеризовать стехиометрию рецепторов. Этот метод не только углубляет наше понимание организации RyR2 в сердечных и нейрональных тканях, но и предлагает более широкие приложения для изучения сборки и регуляции рецепторов в различных физиологических и патологических контекстах 19,20,21.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка образцов

  1. Транскардиальная перфузия и экстракция органов
    1. Обезболивайте мышь с помощью CO₂ до тех пор, пока дыхание не прекратится.
    2. Расположите мышь в положении лежа на спине и закрепите конечности.
    3. Сделайте разрез по средней линии вдоль живота и протяните в сторону грудной клетки, чтобы обнажить грудную полость.
    4. Осторожно введите иглу в левый желудочек и пересеките правое предсердие, чтобы обеспечить дренаж перфузата.
    5. Для приготовления везикул следует проводить холодную обработку 1x PBS до тех пор, пока кровеносная система не очистится от крови.
    6. Для криосекции, после перфузии PBS, продолжайте перфузию 4% параформальдегидом (PFA) для фиксации тканей.
    7. Осторожно извлеките сердце и сразу же положите его на лед.
    8. С помощью тонких ножниц аккуратно разрежьте по средней линии кожи головы и снимите кожу, чтобы обнажить череп.
    9. Сделайте надрез у основания черепа возле большого затылочного отверстия.
    10. С помощью тонких щипцов осторожно подденьте череп вдоль продольной щели, удаляя костные отломки, чтобы обнажить мозг.
    11. Аккуратно поднимите мозг с помощью изогнутых щипцов, разрезая черепно-мозговые нервы, чтобы полностью извлечь его в целости и сохранности.
    12. При использовании для криосекции необходимо зафиксировать мозг в 4% PFA при температуре 4 °C в течение 24 часов.
    13. При использовании для подготовки везикул следует немедленно поместить мозг на лед без фиксации для дальнейшей обработки.
  2. Криосекция
    1. Удалите из мозга или сердца 4% PFA и промокните насухо.
    2. Встройте весь орган в ОКТ-соединение в криоформу.
    3. Заморозьте встроенную ткань, поместив форму в морозильную камеру при температуре -80 °C до полного застывания.
    4. Перед срезом уравновесьте криостатную камеру и напор образца до -20 °C.
    5. Перенесите замороженный блок OCT из морозильной камеры при температуре -80 °C в камеру криостата и дайте ему уравновеситься в течение 10 минут.
    6. Очистите патрон для образцов 70% этанолом, высушите его и нанесите тонкий слой OCT в качестве клея.
    7. Закрепите замороженный блок OCT на патроне, обеспечив правильную ориентацию.
    8. Вставьте патрон в держатель для образцов из криостата и отрегулируйте положение лезвия.
    9. Удаляйте излишки ОКТ до тех пор, пока поверхность ткани не обнажится.
    10. Разрез ткани на толщину 10 мкм, собирая срезы на предметные стекла.
    11. После сушки срезов на воздухе при комнатной температуре в течение 1 ч нанесите на них монтажную среду и установите покровное стекло для герметизации образца.
    12. Дайте монтажному материалу застыть, прежде чем хранить предметные стекла при температуре 4 °C для визуализации.
  3. Подготовка везикул
    1. Подготовка сердечных пузырьков
      1. Извлеките сердце после транскардиальной перфузии с помощью 1x PBS и положите его на лед.
      2. С помощью стерильного скальпеля рассеките примерно 30 мг желудочковой мышцы со дна сердца.
      3. Перенесите ткань в центрифужную пробирку, содержащую 4-5 мл 10 мМ NaHCO₃ с 5 мМ NaN₃ для поддержания целостности везикулы.
      4. Гомогенизируйте ткань с помощью гомогенизатора до полного лизиса.
      5. Центрифугируйте гомогенат при давлении 10 000 × г в течение 20 минут, чтобы удалить крупный мусор и собрать надосадочную жидкость.
      6. Проведите ультрацентрифугирование при 37 000 × г в течение 65 мин, затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 3-4 мл 20 мМ трис-малеатного буфера (pH 6,8) с 0,6 М KCl.
      7. Повторите ультрацентрифугирование при 37 000 × г в течение еще 65 мин для удаления растворенного актомиозина.
      8. Ресуспендируйте конечную гранулу в 0,5 мл 20 мМ трис-малеатного буфера (pH 6,8) с 50 мМ KCl для получения раствора сердечного везикулы и храните его при -80 °C.
    2. Подготовка мозговых пузырьков
      1. Извлеките мозг после транскардиальной перфузии с помощью 1x PBS и положите его на лед.
      2. Разрежьте мозг на участки по 1 мм с помощью корональной матрицы мозга мыши диаметром 1 мм.
      3. Определите третий и четвертый отделы от обонятельной луковицы и тщательно рассеките: 1) самый внешний слой коры головного мозга с обоих полушарий; 2) гиппокамп, расположенный в центральной области разреза.
      4. С заднего конца изолируйте мозжечок, сделав поперечный разрез у его основания.
      5. Объедините те же области мозга пяти мышей, чтобы обеспечить достаточный выход везикул.
      6. Немедленно гомогенизируйте ткань с помощью гомогенизатора Dounce в 2 мл буфера для холодной гомогенизации (0,32 М сахарозы, 10 мМ HEPES, 2 мМ ЭДТА, ингибитор протеазы, pH 7,4).
      7. Добавьте 3 мл дополнительного гомогенизационного буфера и центрифугируйте при 200 × г в течение 15 мин для удаления крупных фрагментов тканей.
      8. Соберите надосадочную жидкость и центрифугуйте при 1000 × г в течение 15 мин при 4 °C для удаления ядерной фракции.
      9. Далее центрифугировать надосадочную жидкость при 10 000 × г в течение 20 мин при 4 °C для удаления митохондрий.
      10. Ультрацентрифугирование полученного надосадочной жидкости при 100 000 × г в течение 2 ч при 4 °C для гранулирования везикул.
      11. Ресуспендируйте конечную гранулу везикулы в 1x PBS для получения раствора мозгового везикулы и храните его при -80 °C.
  4. Определение характеристик нановезикул с помощью анализа слежения за наночастицами (NTA)
    1. Соберите ячейку обнаружения, следуя инструкциям производителя.
    2. Включите прибор и запустите совместимое программное обеспечение.
    3. Загрузите шприц объемом 1 мл с деионизированной (DI) водой и вручную промойте трубку системы, пока фон не очистится от загрязнений.
    4. Приготовьте образец нановезикулы, разбавив его в 1x PBS.
    5. Загрузите ~1 мл разведенного образца нановезикул в чистый шприц объемом 1 мл, следя за отсутствием пузырьков воздуха.
    6. Вручную введите образец в ячейку обнаружения и отрегулируйте фокус до тех пор, пока не станут четко видны везикулы.
    7. Закрепите шприц на шприцевом насосе и установите скорость потока на 200 мкл/с на аппаратной панели.
    8. На панели СОП установите продолжительность измерения на 60 с, количество циклов на 5 и убедитесь, что контроль температуры включен и установлен на 25 °C. Сохраните настройки как новую СОП, нажав «Сохранить СОП » и назвав файл соответствующим образом (например, «nanovesicle_standard.sop»).
    9. На панели «Захват» настройте параметры прибора, выбрав уровень камеры 13 и начальный порог обнаружения 3.
    10. Нажмите «Выполнить» и выберите ранее сохраненную СОП. Программное обеспечение автоматически выполнит измерение в соответствии с настройками.
    11. После завершения нажмите «Анализ», чтобы обработать каждое видео. Отрегулируйте порог обнаружения, чтобы убедиться, что все частицы хорошо видны, и нажмите «Готово» после завершения анализа партии. Экспортируйте результат, нажав Экспорт данных | Все измерения и сохраните в формате CSV для последующего использования.
    12. После завершения эксперимента промойте систему ~ 2 мл деионизионной воды до тех пор, пока не останутся остаточные пузырьки.
    13. Нагнетайте воздух через трубку, чтобы удалить остатки жидкости, убедившись, что система сухая для следующего использования.

2. Визуализация

  1. Конфокальная визуализация криорезов тканей
    1. Включите лазерный сканирующий конфокальный микроскоп и откройте связанное программное обеспечение.
    2. Выберите подходящий объектив (20-кратный воздушный или 60-кратный масляный) и загрузите подготовленное предметное стекло для криосекции на предметный столик микроскопа.
    3. Настройте параметры лазера для возбуждения GFP с помощью лазерной линии 488 нм с фильтром излучения 535/70 нм.
    4. Оптимизируйте параметры визуализации, включая размер точечного отверстия (28,9 мкм), интенсивность лазера (17%) и коэффициент усиления детектора (15,3), для улучшения отношения сигнал/шум при минимизации фотообесцвечивания.
    5. При необходимости получите Z-стек, установив верхнюю и нижнюю фокальные плоскости и определив соответствующий размер шага (0,275 мкм).
    6. Включите автоматическую сшивку изображений с перекрытием изображения 15% при получении изображений большой площади.
    7. Отрегулируйте разрешение изображения и при необходимости примените усреднение кадров, чтобы уменьшить фоновый шум.
    8. Захватите изображения и сохраните их в формате '.nd2' для дальнейшего анализа.
  2. Визуализация с помощью флуоресценции полного внутреннего отражения (TIRF)
    1. Иммобилизация везикул с помощью биосовместимого анкера для мембраны (BAM) метод22
      1. Очистите посуду со стеклянным дном диаметром 35 мм, проверив ее ультразвуком при температуре 5 М NaOH в течение 1 часа при 45 °C, после чего следует три тщательных полоскания водой DI.
      2. Обработайте посуду ультразвуком в 0,1 М HCl в течение еще 1 часа при 45 °C, после чего проведите три дополнительных полоскания водой DI.
      3. Очищенную стеклянную поверхность обработать 2% 3-аминопропилтриэтоксисиланом (APTES) в этаноле в течение 30 мин при комнатной температуре для введения функциональных групп аминов.
      4. Ополосните форму 3 раза деионизированной водой и этанолом, чтобы удалить излишки АСТЭС и дать ей высохнуть.
      5. Инкубируйте чашку со 100 μM Oleyl-O(CH₂CH₂)nCO-CH₂CH₂-COO-NHS (Sunbright OE-020CS) в 1x PBS в течение 10 минут.
      6. Вымойте посуду с помощью PBS, чтобы удалить непрореагировавший реагент.
      7. Введите везикулы в желаемой концентрации и инкубируйте в течение 15 минут, чтобы обеспечить связывание везикул.
      8. Аккуратно промойте чашку PBS, чтобы удалить несвязанные пузырьки, убедившись, что обездвиженные пузырьки остаются прикрепленными.
    2. Настройка и получение изображений TIRF
      1. Питание от инвертированного флуоресцентного микроскопа, лазерного источника 488 нм и камеры EMCCD.
      2. Запустите программное обеспечение Metamorph и CellSens для инициализации управления визуализацией.
      3. Очистите объектив для погружения в масло 60x (1,49 NA APO) метанолом, чтобы удалить пыль и остатки масла.
      4. Нанесите на линзу объектива небольшую каплю подходящего иммерсионного масла (RI) с соответствующим показателем преломления (RI).
      5. Поместите подготовленную чашку для везикул на предметный столик микроскопа, убедившись, что она отцентрирована для оптимального выравнивания.
      6. Отрегулируйте фокусировку лазерного луча, центрировав луч возбуждения в центре задней апертуры объектива в режиме эпифлуоресценции.
      7. Используйте шаговый двигатель для регулировки угла падения лазера до тех пор, пока не будет достигнут критический угол, обеспечивая полное внутреннее отражение на поверхности стекла.
      8. Определите фокальную плоскость путем сканирования по оси Z, различая: 1) первую фокальную плоскость, соответствующую поверхности стекла-дна; 2) вторая фокусная плоскость, соответствующая везикуле-иммобилизованной поверхности.
      9. Когда везикулы окажутся в фокусе, примените автофокусировку в CellSens, чтобы зафиксировать положение объектива в этой плоскости, предотвращая дрейф во время визуализации.
      10. Временно выключите лазер и переместите предметный столик микроскопа в свежее поле зрения, которое еще не подвергалось воздействию возбуждающего света.
      11. Начните запись при одновременном включении лазера, обеспечив захват полного процесса фотообесцвечивания без предварительного облучения.
      12. Получение изображений со следующими параметрами: Время экспозиции: 100 мс на кадр, Режим съемки: 900 непрерывных кадров на поле зрения, Настройка усиления: 1 400.
      13. Повторите этот процесс для нескольких полей просмотра, чтобы обеспечить достаточный сбор данных.
      14. Сохраняйте стопки изображений в формате TIFF для дальнейшей обработки.

3. Обработка изображений и анализ данных

  1. Конфокальная обработка изображений
    1. Откройте полученные конфокальные изображения в связанном программном обеспечении.
    2. Настройте параметры таблицы преобразования (LUT) для оптимизации яркости и контрастности.
    3. Применяйте одинаковые настройки LUT равномерно ко всем изображениям, чтобы сохранить визуальную согласованность.
  2. Обработка видео TIRF и анализ интенсивности флуоресценции
    1. Обработка видео для визуализации
      1. Откройте полученные стеки изображений TIRF (формат TIFF) в ImageJ для визуализации.
      2. Отрегулируйте яркость и контрастность для повышения четкости сигнала, чтобы флуоресцентные везикулы были легко различимы на фоне.
      3. Экспортируйте скорректированные изображения для представления или дальнейшего качественного анализа.
    2. Поэтапный анализ фотоотбеливания
      1. Извлечение временных трассировок
        1. Откройте сценарий MATLAB (см. Дополнительный файл 1) с именем "getTimeTraces.m" и запустите его. В графическом интерфейсе пользователя нажмите «Загрузить фильм» и выберите файл .tiff изображений TIRF, чтобы импортировать стек фильмов везикул.
        2. Нажмите кнопку «Найти пики» для автоматической идентификации сигналов флуоресценции на основе одной молекулы. Сигнальные регионы будут отмечены кружками в окне предварительного просмотра.
        3. Нажмите кнопку Заполнить данные. Это приведет к экспорту кривой интенсивности времени для каждого пятна в файл .xlsx для последующего анализа.
      2. Ручной подсчет шагов
        1. Запустите скрипт "simpleGraph.m" (см. Дополнительный файл 1) для запуска графического интерфейса, нажмите "Загрузить файлы данных " и выберите файл .xlsx, сгенерированный на шаге 3.2.2.1.3.
        2. Проверьте этапы отбеливания каждой временной кривой, отображаемой на левой панели. Убедитесь, что для анализа принимаются только трассы, отвечающие следующим критериям: 1) временная трассировка содержит по крайней мере один отдельный этап отбеливания. 2) Продолжительность одного шага составляет не менее 1 с. 3) Разница интенсивности между ступенчатыми уровнями составляет не менее 3-кратного стандартного отклонения от интенсивности после отбеливания.
        3. Справа найдите поле Шаг # и с помощью кнопок + или - введите количество этапов фотообесцвечивания для каждой трассировки.
        4. После завершения каждой записи нажмите кнопку Далее , чтобы перейти к следующей трассировке. После обработки всех трассировок программное обеспечение автоматически сгенерирует и сохранит файл .txt, в котором будет записано количество шагов каждой трассировки.
      3. Сводка по количеству шагов
        1. Запустите скрипт "CombinedFiles.m" (см. Дополнительный файл 1), чтобы открыть графический интерфейс.
        2. Введите желаемое имя для вывода сводки в текстовое поле.
        3. Нажмите кнопку Объединить несколько результатов simpleGraph в один файл. В файловом браузере выберите один или несколько нужных .txt файлов, сгенерированных на шаге 3.2.2.2.3. Скрипт автоматически скомпилирует все данные о количестве шагов и сгенерирует объединенный файл .xlsx, обобщающий частоту 1-шаговых, 2-шаговых,... Следы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы подтвердить применимость данного метода, мы сначала верифицировали экспрессию и локализацию GFP-RyR2 с помощью конфокальной визуализации криосекций сердечной и нейрональной ткани (рис. 1). Сигнал флуоресценции в сердечной ткани демонстрировал поперечно-полосатый рисунок, соответствующий ожидаемой локализации RyR2 в кардиомиоцитах, но демонстрировал высокую интенсивность в определенных областях мозга, а именно в коре, гиппокампе и мозжечке, что указывает...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это исследование устанавливает подробный и воспроизводимый протокол для инкапсуляции ex vivo и визуализации мембранных рецепторов с использованием RyR2 с тегом GFP в качестве модельной системы. Протокол значительно продвинул вперед существующие методы, позволив проводить стехиометрический анализ рецепторных комплексов непосредственно из нативной ткани, сохраняя физиологический контекст мембранных белков. По сравнению с традиционными системами экспрессии in vitro, этот подход сво...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Мы хотели бы выразить признательность ядру микроскопии UKY Light и Центру биоэлектроники и наномедицины за использование их оборудования. Поддержку этой работе оказали NIH (GM138837 и GM138882). Рисунок 2 (https://BioRender.com/s69w811) и Рисунок 3 (https://BioRender.com/y54b47) были созданы в BioRender.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Тарелка 35 мм | No 1.5 Покровное покрытие | Диаметр стекла 14 ммMattekP35G-1.5-14-C
Andwin Scientific  Ткани-тек криомолд формы/адаптерыFisher ScientificNC9542860
APTESMillipore Sigma440140-100ML(3-Аминопропил)триэтоксисилан
Bio-Gen PRO200 Лабораторный гомогенизаторPro Scientific1204B59
cellSENSOlympus Scientific Solutionsн/а
EMCCD камераAndorn/aiXon Ultra 897
Абсолют этанола ≥ 100% (v/v) USP для молекулярной биологии (200 пруф)VWR71006-012
Leica CM1860Leican/acryostat
MetaMorph AdvancedMolecular Devicesn/a
Nanosight NS300 (с программным обеспечением Nanosight NTA)Malvern Panalyticaln/a
Nikon AXR Инвертированный конфокальный микроскоп Nikonн/д
Olympus IX83 Моторизованный автофокусный инвертированный флуоресцентный микроскопOlympusn/aTIRFM
Параформальдегид 4% в PBS готовый к использованию фиксирующий реагентVWR76221-378
Фосфатный буферный раствор (PBS) 20x, ультрачистый классVWR97062-950
Гидроксид натрия, гранулы, реагент классаVWR97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +NOF Америка Корпорейшнн/дОлеил-О(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakuraM71484
VectaMount AQ Водный монтаж MediumVector LaboratoriesH-5501-60

Ссылки

  1. Taur, Y., Frishman, W. H. The cardiac ryanodine receptor (RyR2) and its role in heart disease. Card Rev. 13 (3), 142-146 (2005).
  2. Lundstrom, K. Structural genomics and drug discovery. J Cell Mol Med. 11 (2), 224-238 (2007).
  3. Levitz, J., et al. Mechanism of assembly and cooperativity of homomeric and heteromeric metabotropic glutamate receptors. Neuron. 92 (1), 143-159 (2016).
  4. Fox-Loe, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. Organelle-specific single-molecule imaging of α4β2 nicotinic receptors reveals the effect of nicotine on receptor assembly and cell-surface trafficking. J Bio Chem. 292 (51), 21159-21169 (2017).
  5. Degani-Katzav, N., Gortler, R., Gorodetzki, L., Paas, Y. Subunit stoichiometry and arrangement in a heteromeric glutamate-gated chloride channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E644-E653 (2016).
  6. Aryal, S. P., Fu, X., Masud, A. A., Neupane, K. R., Richards, C. I. Single-molecule studies of membrane receptors from brain region specific nanovesicles. Bio-protocol. 11 (10), e4018(2021).
  7. Schneeweis, L. A., et al. Comparison of ensemble and single molecule methods for particle characterization and binding analysis of a pegylated single-domain antibody. J Pharm Sci. 104 (12), 4015-4024 (2015).
  8. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. J Gen Phys. 141 (6), 737-746 (2013).
  9. Lee, J., Lee, T. H. Single-molecule investigations on histone h2a-h2b dynamics in the nucleosome. Biochem. 56 (7), 977-985 (2017).
  10. Aggarwal, V., Ha, T. Single-molecule pull-down (SiMPull) for new-age biochemistry: methodology and biochemical applications of single-molecule pull-down (SiMPull) for probing biomolecular interactions in crude cell extracts. Bioessays. 36 (11), 1109-1119 (2014).
  11. Sungkaworn, T., et al. Single-molecule imaging reveals receptor-g protein interactions at cell surface hot spots. Nature. 550 (7677), 543-547 (2017).
  12. Fu, X., et al. Brain region specific single-molecule fluorescence imaging. Anal Chem. 91 (15), 10125-10131 (2019).
  13. Anderson, K., et al. Structural and functional characterization of the purified cardiac ryanodine receptor-Ca2+ release channel complex. J Bio Chem. 264 (2), 1329-1335 (1989).
  14. Waddell, H. M. M., Mereacre, V., Alvarado, F. J., Munro, M. L. Clustering properties of the cardiac ryanodine receptor in health and heart failure. J Mol Cell Card. 185, 38-49 (2023).
  15. Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor ryr2. Science. 354 (6310), aah5324(2016).
  16. Xiao, B., et al. Isoform-dependent formation of heteromeric Ca2+ release channels (ryanodine receptors). J Bio Chem. 277 (44), 41778-41785 (2002).
  17. Xu, L., Wang, Y., Yamaguchi, N., Pasek, D. A., Meissner, G. Single channel properties of heterotetrameric mutant ryr1 ion channels linked to core myopathies. J Biol Chem. 283 (10), 6321-6329 (2008).
  18. Chagovetz, A. A., Klatt Shaw, D., Ritchie, E., Hoshijima, K., Grunwald, D. J. Interactions among ryanodine receptor isotypes contribute to muscle fiber type development and function. Dis Model Mech. 13 (2), dmm038844(2019).
  19. Yao, J., et al. Limiting RyR2 open time prevents Alzheimer's disease-related neuronal hyperactivity and memory loss but not β-amyloid accumulation. Cell Rep. 32 (12), 108169(2020).
  20. Hiess, F., et al. Subcellular localization of hippocampal ryanodine receptor 2 and its role in neuronal excitability and memory. Comm Biol. 5 (1), 183(2022).
  21. Clowsley, A. H., et al. Analysis of RyR2 distribution in HEK293 cells and mouse cardiac myocytes using 3D MINIFLUX microscopy. bioRxiv. , (2023).
  22. Kato, K., et al. Immobilized culture of nonadherent cells on an oleyl poly(ethylene glycol) ether-modified surface. Biotech. 35 (5), 1014-1021 (2003).
  23. Yin, Q., Aryal, S. P., Song, Y., Fu, X., Richards, C. I. Quantitative single-molecule analysis of ryanodine receptor 2 subunit assembly in cardiac and neuronal tissues. Anal Chem. 96 (41), 16298-16306 (2024).
  24. Moonschi, F. H., et al. Cell-derived vesicles for single-molecule imaging of membrane proteins. Angew Chem Int Ed. 54 (2), 481-484 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFP
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи