Система двойной экспрессии на основе комплементации GFP для оценки межклеточного контакта, опосредованного цитонемами в имагинальных дисках крыльев живой дрозофилы

Summary

Мы описываем протокол измерения контактов между клетками в соседних эпителиальных слоях в имагинальных дисках крыльев живой дрозофилы с использованием подхода, основанного на восстановлении GFP.

Abstract

Рост и структура эмбриональных тканей в значительной степени контролируются сигналами, которыми обмениваются местные клеточные популяции внутри самих тканей. Цитонемы — это тип сигнальных филоподий, впервые выявленных у дрозофил, которые соединяют и опосредуют обмен между клетками, производящими и принимающими сигнал. В развивающемся имагинальном диске крыла дрозофилы цитонемы участвуют в обмене сигналами между различными популяциями клеток внутри эпителия собственно диска (DP), который образует взрослое крыло, а также между клетками DP и клетками в соседних тканях, связанных с диском. Цитонемы синапс с клетками-мишенями образуют интимные мембранные контакты.

В данной работе мы представляем протокол количественной оценки цитонем-опосредованного контакта между клетками ДП и клетками эпителия прилегающей периподиальной мембраны (ПМ), который отделен от клеток ДП просветом диска, с использованием подхода восстановления GFP в дисках живых крыльев. С помощью систем GAL4-UAS и LexA-LexAop комплементарные фрагменты расщепленного GFP (spGFP1-10, spGFP11), каждый из которых слитый с трансмембранным доменом CD4, экспрессируются по обе стороны от просвета диска. Визуализация восстановленной флуоресценции GFP в живых препаратах диска крыла с помощью конфокальной микроскопии затем используется для создания стеков изображений, из которых можно локализовать и количественно оценить восстановленную флуоресценцию GFP. С помощью этой системы можно совместно экспрессировать трансгены, кодирующие белки или РНК-интерференции, как в клетках, продуцирующих цитонему, так и в клетках-мишенях, чтобы оценить их влияние на контакты с клетками DP-PerM. Эта система, легко адаптируемая к другим тканям, таким образом, позволяет идентифицировать факторы, важные для образования или функции цитонего.

Introduction

Развитие эмбриональных тканей контролируется клетками, расположенными в «организующих центрах», которые подают сигналы удаленным клеткам внутри ткани, контролируя их решения о пролиферации (т.е. росте и делении) или принятии определенной^{судьбы.} Эта клеточная неавтономная передача сигналов опосредована лигандами, вырабатываемыми центральными клетками, которые формируют градиенты концентрации в тканях и вызывают реакции, зависящие от концентрации. Во многих случаях эти лиганды либо доставляются, либо улавливаются через длинные сигнальные филоподии на основе актина, называемые цитонемами, которые соединяют сигнали....

Protocol

Драйвер nubbin-GAL4 используется для экспрессии CD4-spGFP1-10 конкретно в области крыльевого мешка DP (рис. 1A). Драйвер²¹ PerM-LexA используется для экспрессии CD4-spGFP11 конкретно в PerM (рисунок 1A). Эти две системы экспрессии независимы друг от друга, что позволяет одновременно и специфично экспрессировать различные трансгены в DP и PerM (рис. 1B, C).

Основная генетическая схема предполагает скрещивание мух для получения личинок генотипа nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11<....

Results

Чтобы проверить полезность процедуры GRASP для измерения контактов между клетками DP и PerM, мы исследовали диски крыльев четырех различных генотипов: диски негативного контроля дикого типа (генотип: w¹¹¹⁸), которые будут отображать только фоновые уровни автофлуоресценции в канале GFP; диски, экспрессирующие CD4-spGFP1-10 в слое DP, но не имеющие трансгена CD4-spGFP11, который будет демонстрировать уровень флуоресценции, производимой только GFP1-10 (который, как мы ожидали, будет пренебрежимо малым, т.......

Discussion

Цитонемы играют важную роль в распределении лигандов, контролируя рост и организацию развивающихся тканей. Обмен сигналами происходит при том, что кончики цитонемы вступают в интимные мембранные контакты со своими мишенями. В этом протоколе мы описываем простой метод анализа цитонем-опосредованных контактов между эпителиальными слоями в диске крыла с использованием методики GRASP.

Представленная здесь методика требует, как минимум, четырех компонентов - драйве.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Диссекционный микроскоп Discovery V12	Цейсс		Диссекционный микроскоп
Щипцы Dumont #55, Советы по биологии	Инструменты для точной науки	11255-20	Рассекающие щипцы
EP-Slik (slik20358)	БРСК	Panneton et al. 2015	штамм от мух для сцеживания Slik
ФИДЖИ		Schindelin J. et al. (2012)	Программное обеспечение для анализа изображений
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H3570	Визуализация ядерного пятна в реальном времени
LexAop-CD4-spGFP11	БРСК	93018	штамм мухи
Конфокальный микроскоп LSM 700	Цейсс		Конфокальный микроскоп
nub-GAL4	Блумингтонский фондовый центр дрозофил (BDSC)	86108	штамм мухи
PerM-LexA		Рамбо, Жозеф и др., 2025	штамм мухи
PYREX 9-депрессионная стеклянная точечная пластина	Corning Медико-биологические науки	7220-85	для сбора и промывки личинок
Дрозофила Шнайдера Медиум	ThermoFisher Scientific	21720024	Среда для визуализации в реальном времени
Прокладки для визуализации SecureSeal, 8-луночные, толщина 0,12 мм;	Био-лаборатории Грейс	654008	проставка
Комплект силиконовых эластомеров SYLGARD 184	Сильгард	3097358-1004	для изготовления пластин для препарирования
UAS-CD4-spGFP1-10	БРСК	93017	штамм мухи
Черный дзен	Цейсс		Программное обеспечение для сбора данных