Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модель отторжения трансплантата крысы при трансплантации кишечника с наружной илеостомой для оценки лонгитюдного прогноза

775 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68412

⸱

10 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, Graduation School of Medicine, The University of Osaka, 2Department of Stem Cell Therapy Science, Graduate School of Medicine, The University of Osaka

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описана модель трансплантации кишечника на крысах с илеостомой для оценки временного хода лекарственного вмешательства при отторжении трансплантата.

Аннотация

На сегодняшний день трансплантация органов остается основным методом лечения органной недостаточности. Среди различных солидных органов прогноз пациента после трансплантации кишечника остается неудовлетворительным, в первую очередь из-за отторжения трансплантата. Эта проблема требует дальнейшего совершенствования хирургических техник или разработки новых послеоперационных фармакологических вмешательств. В данной статье представлена модель отторжения трансплантата кишечника на крысах, которая послужит платформой для таких исследований. Сегмент подвздошной кишки, выделенный из штамма Fischer 344 (F344), был аллопривит крысе Льюиса (LEW) с последующим введением такролимуса в определенной дозе и по определенной схеме. Была сконструирована внешняя илеостома для обеспечения неинвазивного продольного мониторинга состояния тканей аллотрансплантата. Модель трихроматической линейной регрессии была обучена с использованием изображений илеостомы и использована для построения схемы оценки на основе изображений, способной оценить статус илеостомы по шкале от 0 до 10. Оценка показала ухудшение здоровья аллотрансплантата, начиная с третьей недели после трансплантации. Гистологические анализы аллотрансплантата подтвердили признаки хронического отторжения, начиная с 28-го дня после операции (POD) и далее, аналогичные тем, которые наблюдались у людей, и подтвердили результаты неинвазивной оценки изображений илеостомы. Ожидается, что модель кишечного аллотрансплантата и связанные с ней методы оценки, представленные здесь, облегчат разработку лечения для трансплантации кишечника.

Введение

Органная недостаточность – это состояние, при котором один или несколько жизненно важных органов функционируют неоптимально и не могут поддерживать здоровье. Несвоевременная медицинская помощь часто приводит к летальному исходу или связана с вторичными осложнениями, такими как инфекции1. Для большинства органов замена неисправного органа является единственным жизнеспособным вариантом для длительного восстановления. С момента открытия возможности повторного обретения стволовыхклеток соматическими клетками было высказано предположение, что эти индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут обеспечить полный органогенез и обеспечить практически неограниченный источник органов для замены. Сочетая знания об эмбриональном развитии с тщательным контролем сигнальных сигналов, был достигнут успех в создании нескольких тканей в масштабе органоидов. Что касается полномасштабного производства органов, то, несмотря на то, что в последнее время был достигнут значительный прогресс в отношении конкретных органов, таких как глаза, аллотрансплантация от доноров остается основным подходом для большинства жизненно важных органов.

Среди внутренних органов трансплантация кишечника продолжает демонстрировать неудовлетворительные прогностические результаты и требует дальнейшей хирургической доработки или медикаментозного вмешательства5. Новые вмешательства редко тестируются непосредственно на людях и часто оцениваются сначала на животных моделях трансплантации кишечника. В данной статье подробно описывается модель отторжения кишечного трансплантата на крысе, которая послужит платформой для оценки этих потенциальных терапевтических достижений.

Чтобы имитировать тонкое несоответствие человеческого лейкоцитарного антигена (HLA), наблюдаемое у людей, крысе Льюиса (LEW) был пересажен сегмент подвздошной кишки соответствующего пола (мужской), выделенный у крысы Fischer 344 (F344), с последующим введением субоптимальных доз иммунодепрессанта такролимуса во время острой фазы, чтобы вызвать отторжение трансплантата в хронической фазе. Эта пара донор-реципиент имеет одни и те же основные локусы комплекса гистосовместимости, но отличается малыми антигенами гистосовместимости6. В этом методе часть трансплантированной слизистой оболочки была экстериоризирована в виде илеостомы, чтобы обеспечить визуальный временной мониторинг прогноза трансплантации и статуса отторжения. Кроме того, представлен комплементарный метод визуализации илеостомии для количественной оценки состояния отторжения, подтвержденный соответствующими гистологическими изменениями в трансплантированном трансплантате.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Высшей школы медицины Университета Осаки под номером 04-018-003 и выполнялись в соответствии с рекомендациями Университета Осаки. Использовали самцов крыс-реципиента Льюиса (LEW) (массой тела 200-250 г, возраст 7-9 недель) и самца крыс-донора Fischer 344 (F344) (массой 200-250 г, возраст 10-12 недель). Перед операцией область живота была выбрита и стерилизована 70% этанолом. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Донорская хирургия

  1. Голодайте на крысе-доноре в течение 12 часов до операции.
  2. Обезболите крысу-донора ингаляционным изофлураном (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Расположите крысу перпендикулярно оператору. Во время процедуры установите стереомикроскоп на 5-кратное увеличение. Используйте шелк 5-0 для перевязки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока изофлурана составляла 1,5 л/мин. Изофлуран доставлялся в дозе 2,5% во время первоначального разреза брюшной полости и поддерживался на уровне 1,5% во время операции. Адекватная анестезия подтверждалась отсутствием рефлекса на схватку пальца ноги. При необходимости нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость после подтверждающей анестезии.
  3. Выполните разрез по средней линии длиной 8 см, чтобы открыть брюшную полость. Продлите верхний разрез до мечевидного отростка, чтобы обеспечить четкую визуализацию воротной вены (ПВ).
  4. Рассеките связку Трейца и поверните тонкую кишку на 180 градусов по часовой стрелке, чтобы повернуть кишечник вспять.
  5. Осмотрите петли брыжеечных сосудов и выберите хорошо васкуляризированное место для трансплантата, примерно 10 см в длину от подвздошной кишки (рис. 1A1).
  6. Рассеките дистальный отдел брыжейки и переложите верхнюю брыжеечную артерию (СМА) и верхнюю брыжеечную вену (СМВ) дистального отдела подвздошной кишки. Убедитесь, что СМА/СМВ отрезаны от проксимального лигирования. Неправильное перевязка может вызвать кровотечение и нарушить перфузию трансплантата.
  7. Сместите желудок и селезенку краниально, чтобы четко обнажить ФВ.
  8. Рассеките и переложите среднюю толстую артерию/вену и правую толстую артерию/вену, расположенные с левой стороны СМА/СМВ.
  9. Рассеките брыжейку с правой стороны SMA/SMV и перевяжите ветвь тощей кишки. Избегайте лигирования слишком близко к SMV, чтобы предотвратить перегиб (Рисунок 1A2).
  10. Аккуратно отделите основание СМА с помощью ватного тампона и перевяжите брыжейку между аортой над СМА и ФВ. В этой области находятся верхние брыжеечные лимфатические узлы и многочисленные лимфатические сосуды.
  11. Определите и переложите правую почечную артерию, расположенную с правой стороны аорты (рисунок 1A3).
  12. Ввести гепаринизированный физиологический раствор (200 ЕД/2 мл) в вену полового члена.
  13. Определите окончательную длину прививки и перевяжите лишние ветви брыжейки. Перевязать прямые артерии как на проксимальном, так и на дистальном концах трансплантата.
  14. Перевязать аорту ниже СМА, затем перевязать аорту выше СМА и иссечь основание СМА вместе с круглым участком аорты. Разрежьте воротную вену в области печеночного отверстия, обеспечив косой разрез для создания большого отверстия анастомоза.
    1. Приступайте к разрезанию проксимальных и дистальных сосудистых петель и кишечника. Поместите извлеченный трансплантат в холодный физиологический раствор (4 °C) (Рисунок 1A4).
  15. Удалите проксимальную перевязку аорты, чтобы вызвать обескровливание и усыпить донорскую крысу (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).

2. Обработка прививки

  1. Определите верхнюю брыжеечную артерию (СМА) и воротную вену (ЛВ).
  2. Аккуратно перфузируйте трансплантат 15 мл холодного физиологического раствора через СМА (Рисунок 1B1). Убедитесь, что вся кровь заменена и цвет трансплантата становится бледным или белым.
  3. Промойте просвет кишечного трансплантата и удалите каловое содержимое.
  4. Держите привой погруженным в свежий холодный солевой раствор до пересадки.

3. Реципиентная хирургия

  1. Обезболить крысу-реципиента ингаляционным изофлураном (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Расположите крысу перпендикулярно оператору.
    1. Установите стереомикроскоп на 5× для общих процедур и на 12,5× во время сосудистого анастомоза. Используйте шелк 5-0 для перевязки и 8-0 Синтетический полипропиленовый шовный материал для сосудистого анастомоза. Положите крысу на грелку, чтобы предотвратить переохлаждение во время операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока изофлурана составляла 1,5 л/мин. Изофлуран вводили в дозе 2,5% во время первоначального разреза брюшной полости и снижали до 1,5% во время операции. Анестезия была подтверждена отсутствием рефлекса на пальцы стопы после защемления пальца ноги. При необходимости нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость после подтверждения анестезии.
  2. Перед операцией внутримышечно ввести 0,5 мг/кг такролимуса. Сделайте разрез по средней линии (~5 см) и откройте брюшную полость.
  3. Двигайте кишечник и толстую кишку краниально и рассеките связку Трейца. Оберните кишечник и толстую кишку во влажную марлю и положите их на тело крысы.
  4. Рассеките брюшину над нижней полой веной (НПВ) и аортой (Рисунок 1B2). Определить и перевязать правую гонадную артерию и вену. Найдите нужный мочеточник.
  5. Поверните крысу на 90° против часовой стрелки так, чтобы голова была обращена влево от оператора. Зажмите IVC над правой почечной веной с помощью изогнутого сосудистого зажима Bulldog.
  6. Разрежьте стенку IVC ножницами, чтобы создать овальный проем. Промойте солевым раствором и наложите шов на каудальный край НПВ (Рисунок 1B3-1). Убедитесь, что отверстие венозного анастомоза большое (~1 см), и достаточно растяните стенку ФВ в месте анастомоза.
  7. Поместите трансплантат с левой стороны крысы, расположив ЛВ и СМА рядом с НПВ и аортой. Ориентируйте дистальный отдел подвздошной кишки по направлению к голове. Заверните привой в холодную влажную марлю и приложите лед для поддержания низкой температуры.
  8. Проведите иглу для наложения швов (синтетический полипропиленовый шовный материал 8-0) через каудальный край PV. Используйте противомоскитный зажим для контроля натяжения швов.
  9. Зашить и привязать краниальный край ПВ к НПВ (ПВ к НПВ). Анастомоз задней стенки ЛВ (НПВ - ЛВ) (Рисунок 1B3-2). Завяжите шов на стойке по правому краю ПВ. Далее анастомозируйте переднюю стенку ФВ (от ПВ до НПВ).
    1. Перед завершением проведения анастомоза необходимо зажать трансплантат ПВ и ввести гепаринизированный физиологический раствор. Завяжите шов и отпустите зажим IVC (Рисунок 1B3-3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальное кровотечение может возникать в месте анастомоза, но обычно контролируется спонтанно.
  10. Зажмите аорту над бифуркацией подвздошной артерии изогнутым зажимом Бульдога.
  11. Надрезать стенку аорты. Наложите шов (синтетический полипропиленовый шов 8-0) на краниальный край аорты и СМА (~4-5 мм) (Рисунок 1B4-1). Удерживайте шов с помощью противомоскитного зажима, чтобы контролировать натяжение.
  12. Пас еще 8-0 игла через каудальный край СМА и аорты. Завяжите и начните анастомоз с правой стороны крысы (рисунок 1B4-2). Завяжите шов на стойке.
  13. Поверните крысу на 180° так, чтобы голова была обращена вправо от оператора. Завершите анастомоз SMA-аорты с левой стороны. Перед окончательным наложением шва зажмите трансплантат ПВ и введите гепаринизированный физиологический раствор. Завяжите шов (Рисунок 1B4-3).
  14. Освободите аортальный и PV-зажимы для реперфузии (рис. 1B5). Может возникнуть первоначальное кровотечение, но его можно контролировать с помощью легкого надавливания с помощью ватного тампона. Слизистая оболочка трансплантата должна стать розовой в течение нескольких минут (рисунок 1B6).
  15. Поверните крысу на 90° так, чтобы голова была обращена в противоположную сторону. Сделайте два разреза кожи по 8 мм на правой брюшной полости и обработайте проксимальный и дистальный концы подвздошного трансплантата.
    1. Сшить кожу и серозу трансплантата с использованием полидиоксанона 5-0 (PDS) (Рисунок 1B7). Закройте разрез по средней линии с помощью 5-0 PDS, чтобы завершить операцию.
      Примечание: Послеоперационные крысы должны находиться под тщательным наблюдением до полного восстановления сознания. Не возвращайтесь в клетку до тех пор, пока не будет достигнуто лежачее положение на грудине.

4. Послеоперационное управление

  1. Для сохранения трансплантата в острой фазе внутримышечно вводят такролимус в дозе 0,5 мг/кг в послеоперационные дни (POD) 1-13, 20 и 277.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите последовательные инъекции на чередующиеся ноги. В качестве альтернативы такролимус может быть введен подкожно.
  2. Введите мелоксикам в дозе 0,4 мг/кг подкожно на POD 1-3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы-реципиенты обычно теряют вес до POD 7, с восстановлением к POD 14. Подкожные инъекции физиологического раствора могут быть введены для смягчения обезвоживания из-за потери жидкости из-за илеостомы. Неожиданная смертность происходит примерно в 20% случаев до POD 7. Выживаемость и общее состояние здоровья, как правило, стабильны после этого.

5. Визуальная оценка состояния здоровья кишечного трансплантата

  1. Откройте изображение илеостомы в программе ImageJ. Преобразуйте изображение в стек RGB, выбрав Тип изображения > > Стек RGB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если изображение еще не в формате RGB, сначала преобразуйте его в цвет RGB с помощью Тип изображения > > Цвет RGB.
  2. Выберите область интереса (ROI), которая включает только видимую область слизистой оболочки илеостомы.
  3. Измерьте интенсивность каждого канала (красного, зеленого и синего) в пределах выбранного ROI.
  4. Рассчитайте показатель здоровья трансплантата по следующей формуле:
    Балл = figure-protocol-1
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализуйте итоговый балл таким образом, чтобы: Если балл > 10, присвойте значение 10; Если Score < 0, присвойте значение 0.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Репрезентативные изображения ключевых хирургических контрольных точек показаны на рисунке 1. Успешность реперфузии составила почти 100%, а послеоперационная выживаемость – 80,0% (20 из 25 операций). Когда процедуры были выполнены правильно и такролимус был введен в указанной дозировке и по графику, наружная илеостома обычно становилась белесой, что является признаком отторжения трансплантата, начиная с третьей недели после операции (рис. 2A, B)....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В то время как исследования на животных имеют важное значение для разработки улучшенных хирургических и фармакологических вмешательств для улучшения краткосрочных и долгосрочных результатов трансплантации кишечника, эмпирически было трудно установить технику хирургии трансплантации кишечника у крыс. Здесь подробно описаны хирургические процедуры гетеротопической трансплантации кишечника. В этом методе время операции донора и реципиента составляло примерно 35 минут и 90 минут соответствен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

К.Т. является научным основателем, акционером и источником финансирования исследований от StemRIM Inc. Все остальные авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Центр медицинских исследований и образования Высшей школы медицины Университета Осаки предоставил необходимые инструменты для конфокальной микроскопической визуализации аллотрансплантатов. Работа была поддержана исследовательским фондом от StemRIM до Ka.T.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5-0 шелковая плетенка 40см черная Альфреса Фарма62-9965-34
5-0 шелковая плетенка 40см белая Альфреса Фарма62-9964-99
8-0 ПРОЛЕН BV130-5 45смETHICONEP8730H
Alexa Fluor 594 козий антимышиный IgG (H+L)ИнвитрогенА11005Рабочая конц.: 2 мкг/мл
Alexa Fluor 647 козий антикролиацкий IgG (H+L)ИнвитрогенА21245Рабочая конц.: 2 мкг/мл
Иглодержатель Barraquer Micro, губка CVD 8 мм, 6 дюймов
Сосудистый зажим Bulldog 35ммНацумэС-42-С-2
Fischer 344 (F344)   Япония SLC (Сидзуока, Япония)донор, мужчина, от 10 до 12 недель
Льюис (LEW) крысы Япония SLC (Сидзуока, Япония)Реципиенты, мужчины, от 7 до 9 недель
МикроножницыYDMCC06C
Шовные щипцы для микрохирургии - изогнутые, платформы, круглые ручки: 15 см / 6 дюймов
Ms mAb к коллагену IАБКАМAB90395рабочий конц: 1000x разбавление
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ РАСТВОР 500 млОЦУКА 3311401А8024
Пластиковый сосудистый двойной зажимООО «Обучение микрохирургии»
Програф для инъекций 5 мгАстеллас Фарма3999416А1028
Rb pAb в LamininАБКАМAB11575Рабочая конц.: 2 мкг/мл
Обезболивание мелких животныхМуромати-кикайМК-А100
Хирургический микроскоп OPMI-1FRКарл ЦейссОПМИ-1ФР
ШОВНЫЙ МАТЕРИАЛ, 5/0 18 PDS II CLR MONO P, VAETHICONZ493G

Ссылки

  1. Pedersen, P. B., Henriksen, D. P., Brabrand, M., Lassen, A. T. Organ failure, aetiology and 7-day all-cause mortality among acute adult patients on arrival to an emergency department: A hospital-based cohort study. Eur J Emerg Med. 28 (6), 448-455 (2021).
  2. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
  3. Hayashi, R., et al. Co-ordinated ocular development from human iPS cells and recovery of corneal function. Nature. 531 (7594), 376-380 (2016).
  4. Soma, T., et al. Induced pluripotent stem-cell-derived corneal epithelium for transplant surgery: a single-arm, open-label, first-in-human interventional study in Japan. Lancet. 404 (10466), 1929-1939 (2024).
  5. Parizhskaya, M., et al. Chronic rejection of small bowel grafts: Pediatric and adult study of risk factors and morphologic progression. Pediatr Dev Pathol. 6 (3), 240-250 (2003).
  6. Isono, M., Poltorak, M., Kulaga, H., Adams, A. J., Freed, W. J. Certain host-donor strain combinations do not reject brain allografts after systemic sensitization. Exp Neurol. 122 (1), 48-56 (1993).
  7. Li, Y., et al. Long-term comparison of rat model of chronic allograft rejection of orthotopic small bowel transplantation induced by cyclosporine versus tacrolimus. Transplant Proc. 45 (5), 1811-1815 (2013).
  8. Kitamura, K., et al. Orthotopic small bowel transplantation in rats. J Vis Exp. (69), e4102(2012).
  9. Kitamura, K., et al. Chronic rejection after intestinal transplantation: A systematic review of experimental models. Transplant Rev. 33 (3), 173-181 (2019).
  10. Pech, T., et al. Combination therapy of tacrolimus and infliximab reduces inflammatory response and dysmotility in experimental small bowel transplantation in rats. Transplantation. 93 (3), 249-256 (2012).
  11. Stringa, P., et al. Small bowel transplantation in rats: A multicenter experience summarizing the pitfalls to be overcome. Trends Transplant. 10 (1), 1-7 (2017).
  12. Gerlach, U. A., et al. Intragraft and systemic immune parameters discriminating between rejection and long-term graft function in a preclinical model of intestinal transplantation. Transplantation. 101 (5), 1036-1045 (2017).
  13. Pech, T., et al. Intestinal regeneration, residual function and immunological priming following rescue therapy after rat small bowel transplantation. Am J Transplant. 12 (Suppl 4), S9-S17 (2012).
  14. Swenson, S. M., Roberts, J. P., Rhee, S., Perito, E. R. Impact of the Pediatric End-Stage Liver Disease (PELD) growth failure thresholds on mortality among pediatric liver transplant candidates. Am J Transplant. 19 (12), 3308-3318 (2019).
  15. Kimura, K., Money, S. R., Jaffe, B. M. The effects of size and site of origin of intestinal grafts on small-bowel transplantation in the rat. Surgery. 101 (5), 618-622 (1987).
  16. Abu-Elmagd, K. M., et al. Preformed and de novo donor-specific antibodies in visceral transplantation: Long-term outcome with special reference to the liver. Am J Transplant. 12 (11), 3047-3060 (2012).
  17. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  18. Stakenborg, M., et al. Enteric glial cells favor accumulation of anti-inflammatory macrophages during the resolution of muscularis inflammation. Mucosal Immunol. 15 (6), 1296-1308 (2022).
  19. Li, Y. -T., Takaki, E., Ouchi, Y., Tamai, K. Guided monocyte fate to FRβ/CD163+ S1 macrophage antagonises atopic dermatitis via fibroblastic matrices in mouse hypodermis. Cell Mol Life Sci. 82 (1), 14(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Модель отторжения трансплантата крысы при трансплантации кишечника с наружной илеостомой для оценки лонгитюдного прогноза
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.