Методическая статья

Биопечать гидрогелевых срезов опухоли в качестве 3D-модели мантийноклеточной лимфомы

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68417

⸱

12 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dr. Margarete Fischer-Bosch Institute of Clinical Pharmacology and University of Tuebingen, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institute, 3Department of Clinical Pathology, Robert Bosch Hospital, 4Robert Bosch Hospital, 5Departments of Clinical Pharmacology, Pharmacy and Biochemistry, University of Tuebingen, 6iFIT Cluster of Excellence (EXC 2180), Image-guided and Functionally Instructed Tumor Therapies, University of Tuebingen, 7German Cancer Consortium (DKTK) and German Cancer Research Center (DKFZ), Partner Site Tuebingen, 8National Center for Tumor Diseases (NCT), NCT South-West, a partnership between DKFZ, University Hospital Tuebingen, University of Tuebingen, Tuebingen, Bosch Health Campus, Stuttgart, Robert Bosch Hospital, Stuttgart, University Hospital Ulm, and Ulm University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол содержит подробное описание генерации, культивирования и анализа мантийноклеточной лимфомы в гидрогелевых срезах опухоли, напечатанных на 3D-принтере.

Аннотация

Мантийноклеточная лимфома (МКЛ) является редким агрессивным В-клеточным новообразованием, которое часто рецидивирует и проявляет лишь ограниченный ответ на обычную химиотерапию. Основной проблемой в исследованиях MCL является культивирование первичных клеток MCL ex vivo, поскольку клетки имеют тенденцию подвергаться спонтанному апоптозу при культивировании в 2D-суспензионной культуре. Хотя известно, что 3D-модели лучше повторяют ситуацию с солидными опухолями in vivo , их применение все еще плохо изучено при лимфомах. Разработка 3D-моделей, которые воспроизводят in vivo условия MCL в лимфатическом узле, может повысить их выживаемость, облегчить изучение перекрестных помех микроокружения MCL-опухоли и имитировать реакцию на лекарственные препараты in vivo . Здесь была создана 3D-печатная модель MCL в виде гидрогелевых срезов опухоли, а также оптимизированный метод культивирования. Стандартизированный процесс был разработан с использованием клеточных линий MCL или первичных клеток MCL, в котором клетки погружаются в гидрогель, содержащий альгинат, коллаген I типа и матрицу базальной мембраны, путем биопечати в желатиновой подложке. Полученные срезы гидрогелевых опухолей MCL культивируются на фильтрующей подложке для поддержания их стабильности в течение всего периода культивирования. К системе можно применять медикаментозное лечение. Реакцию отдельных клеток внутри гидрогелевого среза опухоли можно отследить с помощью четырехцветной 3D-флуоресцентной визуализации в реальном времени. Первичные клетки MCL продемонстрировали стабильную жизнеспособность при культивировании в гидрогелевых срезах опухоли. Этот протокол содержит подробное описание получения, культивирования и анализа клеток MCL в срезах гидрогелевых опухолей. За счет точной имитации микроокружения опухоли и использования культуры на границе раздела воздух-жидкость представленная модель повышает физиологическую значимость по сравнению с традиционной 2D-культурой. Он предлагает значительный потенциал для продвижения как биологических, так и терапевтических исследований MCL.

Введение

Мантийноклеточная лимфома (МКЛ) — редкая и агрессивная В-клеточная неходжкинская лимфома, происходящая из мантийной зоны лимфатических узлов1. Мантийная зона состоит из кольца мелких лимфоцитов, окружающих зародышевый центр фолликула В-клеток. Как правило, MCL показывает агрессивное клиническое течение, с частыми рецидивами после начальной химиотерапии. Благодаря лучшему пониманию формирования заболевания1 и разработке новых методов лечения, включая иммунохимиотерапию2, ингибиторы тирозинкиназы Брутона3 или конъюгаты антитело-лекарство4, варианты лечения пациентов с MCL привели к улучшению показателей ответа и увеличению выживаемости без прогрессирования. Тем не менее, устойчивость к лекарствам и рецидивы по-прежнему делают болезнь неизлечимой5. Отчасти это является следствием ее гетерогенности и влияния микроокружения опухоли на развитие опухоли и лекарственную устойчивость6. Проблемой в изучении MCL является сложность культивирования первичных клеток MCL в суспензионной культуре7, поскольку клетки подвергаются спонтанному апоптозу ex vivo 4,5. Это подчеркивает необходимость альтернативных подходов для лучшего моделирования MCL в доклинических моделях.

В естественных условиях опухоли представляют собой трехмерные (3D) структуры, состоящие из различных клеточных компонентов, включая опухолевые клетки, иммунные клетки и стромальные клетки, а также неклеточных компонентов, таких как внеклеточный матрикс (ВКМ). ВКМ, который состоит из макромолекул, таких как коллаген и ламинин, образует сложную волокнистую сеть из эластичных волокон, которая обладает высокой гидрофильностью, создавая гелеобразную среду 2,8,9,10. Чтобы лучше воспроизвести эти in vivo состояния опухолей ex vivo, были разработаны различные 3D-модели. В последние годы эти модели стали иметь решающее значение для изучения фармакологии и биологии рака, в основном сосредоточившись насолидных опухолях.

На сегодняшний день эта область остается малоизученной при лимфомах, поскольку гематологические раковые клетки обладают способностью расти как во взвешенном состоянии, так и в стромальном окружении, таком как лимфатические узлы, костный мозг иливторичные лимфоидные ткани. In vivo клетки MCL диссессируются из мантийной зоны лимфатических узлов в кровь или костный мозг, хотя они в основном пролиферируют в лимфатических узлах, из которых они происходят13,14. В лимфатических узлах клетки MCL окружены Т-клетками, макрофагами и мезенхимальными стромальными клетками, которые, как было показано, контролируют выживаемость или реакцию на лекарственные препараты клеток MCL 14,15,16,17,18. Кроме того, перекрестные помехи микроокружения опухоли MCL, а также пористость и механические свойства являются важными факторами, которые могут влиять на реакцию на лекарства и резистентность 6,14. Таким образом, для изучения первичной МКЛ требуются стандартизированные и воспроизводимые 3D-модели опухолей МКЛ, имитирующие нативное микроокружение. До сих пор были созданы в основном клеточные модели, такие как сфероиды или органоиды первичных клеток MCL 6,19. Они успешно повышают жизнеспособность и долгосрочное культивирование первичных клеток MCL. Тем не менее, внеклеточный матрикс недостаточно представлен в этих моделях. В этом контексте перспективным подходом является передовая 3D-биопечать. Путем непосредственной сборки живых клеток и гидрогелей эта технология позволяет создавать физиологически релевантные 3D-модели лимфатических узлов на основе гидрогеля.

Здесь была создана 3D-биопечатная модель MCL в виде гидрогелевых срезов опухоли, а также оптимизирован метод культивирования. Клетки встраиваются в гидрогели на основе коллагена I-, альгинат- и матригеля путем произвольной обратимой встраивания суспензионных гидрогелей (FRESH) биопечать20. Гидрогелевые срезы опухоли культивируются на фильтрующей основе, что позволяет клеткам MCL расти в условиях, которые точно повторяют условия in vivo в лимфатических узлах.

Этот протокол содержит подробное описание генерации, культивирования и анализа клеток MCL в гидрогелевых срезах опухоли. Используя четырехцветную 3D-флуоресцентную визуализацию в реальном времени, можно отслеживать жизнеспособность или реакцию на лекарственные препараты отдельных клеток внутри гидрогелевого среза опухоли. Первичные клетки MCL продемонстрировали улучшенную выживаемость при культивировании в срезах гидрогелевых опухолей. Эта модель предоставляет инструмент для изучения биологии MCL и реакции на лечение, прокладывая путь к пониманию влияния микросреды и вариабельности пациентов с MCL.

Протокол

Работа с первичными клетками MCL должна быть одобрена местным этическим комитетом. В этом исследовании комиссия по этике медицинского факультета Университета Эберхарда-Карла и университетской клиники Тюбингена одобрила сбор и обследование образцов пациентов и здоровых доноров (проект No 159/2011BO2), а также было получено информированное письменное согласие пациентов в соответствии с Хельсинкской декларацией. Использованные здесь первичные клетки MCL были выделены из целых лимфатических узлов пациента с MCL и, таким образом, включали не только клетки MCL, но и другие клетки, такие как иммунные клетки и фибробласты.

1. Приготовление желатиновой суспензии для поддерживающей ванны

ПРИМЕЧАНИЕ: Желатиновая суспензия будет служить в качестве поддерживающей ванны в процессе 3D-биопечати. Он индуцирует сшивание биочернил, что позволяет формировать 3D-структуру. Приготовление желатиновой суспензии должно проводиться в стерильных условиях в колпаке для клеточных культур.

  1. Приготовьте 4,5% (масс./об.) раствор желатина в 10 мМ HEPES и 11 мМ CaCl2 , растворив 6,75 г желатинового порошка в 1,5 мл 1 М HEPES, 15 мл 110 мМ CaCl2 и 133,5 мл стерильного H2O в стерильной банке Мейсона с крышкой. Убедитесь, что банка Mason подходит для смешивания в высокопроизводительном миксере.
  2. Инкубировать раствор при 37°С в течение 4 ч или до тех пор, пока при перемешивании раствора не будет видно масел, указывающих на полное растворение желатина. Охладите желатин до 4°C в течение ночи или не менее 12 часов.
  3. Приготовьте стерильный промывочный буфер, состоящий из 10 мМ HEPES и 14,4 мМ CaCl2. Предварительно охладите буфер для стирки до 4°C.
  4. Застывший 4,5% желатин разломать на несколько частей с помощью стерильной ложки.
  5. Полностью заполните банку Мейсона, содержащую 4,5% желатина, предварительно охлажденным буфером для промывки, гарантируя, что буфер останется холодным на протяжении всего процесса приготовления желатиновой суспензии.
  6. Заморозьте желатиносодержащую банку Мейсона при -20°С на 45-60 мин, пока желатиновая суспензия не достигнет 0°С, но еще не начнет образовывать кристаллы льда. Используйте термометр для контроля температуры.
  7. Прикрепите крышку и лезвие миксера к банке Mason, затем установите банку Mason на миксер. Взбивайте желатиновую суспензию в течение 120 с, используя импульсную настройку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании другого типа блендера может потребоваться корректировка настроек блендера.
  8. Переложите смешанную суспензию в предварительно охлажденные пробирки объемом 50 мл. Центрифугируйте при давлении 3 800 x g в течение 2 минут при 4°C. Убедитесь, что суспензия разделена на твердую желатиновую суспензию внизу и буфер для промывки жидкости наверху.
  9. Выполните следующий шаг на льду: Промойте желатиновую кашицу. Отсадите верхний слой жидкости, стараясь удалить пузырьки, видимые на верхней части буфера для стирки. Добавьте в тюбик 20 мл свежего буфера для стирки при температуре 4°C. Закрутите трубку, чтобы смешать желатиновую кашицу с промывочным буфером.
  10. Повторите процесс центрифугирования и промывки не менее 3 раз или до тех пор, пока в верхней части буфера для промывки не будут видны пузырьки. После окончательной промывки удалите остатки буфера для промывки с помощью аспирации. Желатиновая суспензия может храниться при температуре 4°C в течение нескольких недель.

2. Приготовление биочернил, загруженных клетками

  1. Приготовьте стерильный 5% раствор альгината за 1-2 дня до печати. Добавьте 1 г альгината к 20 мл стерильного PBS в пробирке объемом 50 мл. Чтобы предотвратить высыхание остатков порошка альгината, добавляйте PBS небольшими шагами, вихревыми между добавлениями. Инкубируйте раствор либо на водяной бане при температуре 37 °C в течение нескольких часов, либо в течение ночи на трубчатом валике при комнатной температуре. Как только альгинат полностью растворится, храните раствор при температуре 4 °C до тех пор, пока он не понадобится.
  2. При работе с клеточной линией MCL культивируйте клетки в суспензии в колбе T75. В день печати убедитесь в наличии 1,4 х10 7 клеток для приготовления 1 мл биочернил, что даст 9-10 гидрогелевых срезов опухоли.
  3. При работе с первичными клетками MCL клетки не нужно культивировать в суспензионной культуре перед биопечатью. Разморозьте криоконсервированные первичные клетки MCL непосредственно перед биопечатью. Перенесите первичные клетки MCL в пробирку объемом 50 мл с питательной средой. Чтобы удалить остатки замораживающей среды, немедленно центрифугируйте пробирку при 340 x g в течение 5 минут, затем удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 20 мл свежей среды для подсчета клеток.
  4. В день печати приготовьте биочернила, адаптированные для интересующих клеток. Для клеток Jeko-1 приготовьте биочернила, состоящие из 0,5% (v/v) альгината, 20% (v/v) коллагена I типа, 1x RPMI и 2 mM HEPES. Смешайте 100 мкл 5% альгината, 200 мкл коллагена I типа, 100 мкл 10x RPMI, 200 мкл 10 мМ HEPES и 350 мкл PBS на 1 мл биочернил. Ячейки будут добавлены на шаге 2.6.
  5. Для первичных клеток MCL приготовьте биочернила, состоящие из 0,5% (v/v) альгината, 20% (v/v) коллагена I типа, 1x RPMI и 0,5 мМ HEPES. Смешайте 100 мкл 5% альгината, 200 мкл коллагена I типа, 100 мкл 10x RPMI, 50 мкл 10 мл 10 мМ HEPES и 500 мкл матрицы базальной мембраны для получения 1 мл биочернил. Ячейки будут добавлены на шаге 2.6. При работе с клеточной линией MCL перенесите клеточную суспензию из колбы для культур в пробирку объемом 50 мл.
  6. Смешайте ячейки с 0,4% трипановым синим в соотношении 1:1. Подсчитайте жизнеспособные клетки (неокрашенные) с помощью счетчика клеток или камеры Нейбауэра. Рассчитайте объем клеточной суспензии на 1 мл биочернил, что равняется 1,4х107 клеток. Перенесите рассчитанный объем в новую пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте при 340 х г в течение 5 минут, затем удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в приготовленных биочернилах для получения окончательных биочернил, насыщенных клетками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Было подсчитано, что клеточная гранула имеет объем среды 50 мкл. Вместе с биочернилами, приготовленными на шаге 2.4, получится 1 мл биочернил.

3. Биопечать в ванне

ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, проводите процесс 3D-печати в стерильной среде, например, под колпаком для клеточных культур. Используемый 3D-принтер был модифицирован для FRESH печати путем добавления удлинителя шприцевого насоса, как описано в Hinton et al.20.

  1. Включите биопринтер и подключите его к программному обеспечению 3D-принтера. Откройте файл .stl, содержащий схему гидрогелевых срезов опухоли. Одновременно можно печатать до 5 срезов. Убедитесь, что каждый гидрогелевый срез опухоли имеет диаметр 8 мм и высоту 1,5 мм. Установите плотность заполнения на 85%. Поместите головку принтера в дом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файл STL был разработан с помощью Fusion 360 и может быть найден в файле дополнительного кодирования 1. Для 3D-печати использовалось программное обеспечение Cura Version 15.04.5.
  2. Переложите ранее приготовленную желатиновую кашицу в чашку Петри диаметром 35 мм, пока она не заполнится наполовину. Убедитесь, что в желатиновой суспензии не осталось воздушных зазоров. Удалите лишнюю воду из каши с помощью одноразовых прецизионных салфеток, чтобы создать желатиновую ванну для поддержки, которая является пастообразной и сохраняет форму до тех пор, пока не будет приложено достаточное усилие.
  3. Перелейте наполненные клетками биочернила в стеклянный шприц объемом 2,5 мл и подсоедините его к тупой насадке диаметром 0,8 мм. Переверните шприц и осторожно удалите лишний воздух и пузырьки воздуха. Как только шприц будет подготовлен, вставьте его в биопринтер. С помощью программного обеспечения 3D-принтера выдавливайте биочернила до тех пор, пока они не начнут выбрасываться из сопла. Сотрите выброшенную каплю биочернил с помощью одноразовой научной прецизионной салфетки, чтобы предотвратить засорение сопла.
  4. Поместите желатиновую ванночку прямо под насадку для шприца. Опустите головку принтера до тех пор, пока сопло не окажется внутри желатиновой суспензии, на 2 мм выше дна опорной ванны.
  5. Начните процесс печати с помощью программного обеспечения для 3D-принтера.
  6. После завершения процесса печати удалите излишки желатиновой суспензии из сопла, чтобы предотвратить засорение. Выньте поддерживающую ванну, содержащую гидрогелевые срезы опухоли, и накройте ее крышкой для поддержания стерильности.
  7. Инкубируйте поддерживающую ванну, содержащую напечатанные гидрогелевые срезы опухоли, при температуре 37 °C, чтобы желатин расплавился. На этом этапе напечатанные гидрогелевые срезы опухоли будут освобождены от поддерживающей ванны.
  8. Предварительно подогрейте промывочный буфер и среду для клеточных культур до 37 °C. Пока желатин тает, подготовьте 6-луночную пластину для промывки гидрогелевых срезов опухоли. Заполните две лунки промывочным буфером 10 мМ HEPES, 14,4 мМ промывочным буфером CaCl2 (тот же буфер, который используется для промывки желатиновой суспензии) и две лунки средой для клеточных культур.
  9. После того, как желатин растает, используйте стерильный шпатель для переноса гидрогелевых кусочков опухоли в буфер для промывки. Промойте ломтики в течение 1 минуты каждая, сначала в двух промывочных буферных лунках, затем в двух средних. Насыщенные клетками гидрогелевые срезы опухоли теперь готовы к культивированию.
  10. Сохраните оставшиеся биочернила, чтобы повторить процесс печати.

4. Бактериологическое исследование и лечение гидрогелевых срезов опухолей

  1. Чтобы культивировать срезы гидрогеля, перенесите их на фильтрующую подложку (размер пор 0,4 мкм), помещенную внутрь 6-луночного планшета. Культивируйте до 5 гидрогелевых срезов на одной подложке фильтра. Добавьте 1,5 мл среды для клеточных культур ниже подложки фильтра. Добавьте каплю медиума поверх гидрогелевых ломтиков опухоли, чтобы предотвратить их пересыхание.
  2. Для медикаментозного лечения гидрогелевых срезов опухоли добавьте нужное количество препарата в среду для культивирования клеток. Здесь гидрогелевые срезы опухоли обрабатывали 0,33 мкМ-27 мкМ доксорубицином в течение 48 ч или 72 ч. Всегда культивируйте набор срезов без обработки в качестве контроля.
  3. Поместите 6-луночный планшет с гидрогелевыми срезами опухоли в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 °C и 5%CO2 на желаемый период культивирования.

5. Анализ жизнеспособности клеток методом исключения трипанового синего

  1. Чтобы оценить жизнеспособность клеток после культивирования или лечения, растворите гидрогелевые срезы опухоли. Перенесите гидрогелевый срез опухоли в пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 500 мкл на срез растворимого буфера, содержащего 30 мМ ЭДТА, 55 мМ цитрата натрия и 150 мМ хлорида натрия (pH 6,8). Пипеткой вверх и вниз до полного растворения гидрогеля.
  2. Центрифугируйте раствор при 340 х г в течение 5 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клетки в 500 мкл среды на каждый срез растворенного гидрогеля.
  3. Смешайте клеточную суспензию в соотношении 1:1 с 0,4% трипановым синим. Подсчитайте жизнеспособные (неокрашенные) и мертвые клетки (окрашенные) с помощью счетчика клеток или камеры Нейбауэра. Запишите количество живых и мертвых клеток для дальнейшего анализа.

6. Четырехцветная 3D флуоресцентная визуализация в реальном времени

ПРИМЕЧАНИЕ: Четырехцветное окрашивание, используемое здесь, позволяет дифференцировать живые клетки (TMRM-положительные), апоптотические клетки (субстрат Fluorogenic Casspase-3) и мертвые клетки (PicoGreen-положительные)21,22,23. Ядра обнаруживаются с помощью DRAQ5. Тем не менее, этот протокол может быть адаптирован к любому другому фотостационарному, специфическому флуоресцентному красителю для обнаружения биомаркеров, клеточных структур или типов клеток по выбору. Перед окрашиванием убедитесь, что микроскоп способен обнаруживать длины волн флуорофоров, используемых для окрашивания.

  1. Для четырехцветного окрашивания гидрогелевого среза опухоли готовят окрашивающий раствор, добавляя TMRM, DRAQ5 и флуорогенный субстрат Casspase-3 в 1 мл среды для клеточных культур в конечной концентрации 0,5 мкМ, 5 мкМ и 2 мкМ соответственно.
  2. С помощью стерильного шпателя перенесите гидрогелевый срез опухоли на камерный стеклянный покровный листок. Добавьте приготовленный раствор для окрашивания поверх гидрогелевого ломтика до полного его покрытия. Инкубируйте образец в течение 20 минут при температуре 37 °C в темноте.
  3. После первичной инкубации соберите окрашивающий раствор, покрывающий гидрогелевый срез опухоли, и добавьте 0,7 мкл/мл PicoGreen. Нанесите раствор для окрашивания обратно в гидрогелевый срез и инкубируйте еще 10 минут при температуре 37 °C в темноте.
  4. После инкубации осторожно удалите лишнюю среду, оставив при этом достаточное количество раствора для окрашивания, чтобы гидрогелевый ломтик оставался влажным.
  5. Немедленно проанализируйте срез с помощью конфокального микроскопа. Для предотвращения фототоксичности и фотообесцвечивания минимизируйте применяемую дозу фотонов за счет уменьшения интенсивности лазера и времени возбуждения. Спектры возбуждения/излучения описанных выше пятен можно найти в таблице 1.
  6. Чтобы получить общее представление о клеточном распределении клетки в гидрогеле, захватите z-срезы. Если во время визуализации были сделаны z-срезы, создайте 3D-реконструкцию гидрогелевых срезов опухоли с помощью соответствующего программного обеспечения. Эти реконструкции позволят провести тщательный анализ пространственного распределения и клеточного статуса клеток в срезах гидрогелевых опухолей.
  7. Следуйте инструкциям и скрипту, приведенным в Дополнительном файле 1 и Дополнительном файле 2 , чтобы выполнить сегментацию и реконструкцию клеток.

Результаты

Гидрогелевые срезы опухоли, содержащие клетки MCL, были сгенерированы по описанному выше протоколу. Этапы рабочего процесса для 3D-печати и культивирования гидрогелевых срезов опухоли показаны на рисунке 1A. Используемый 3D-принтер был модифицирован для FRESH печати путем добавления удлинителя шприцевого насоса, как описано в Hinton et al.20 (рис. 1B). Одновременно печаталось до пяти срезов (рис. 1C) и культивировалось на одной подложке фильтра (рис. 1D). Под опорой фильтра была добавлена среда для обеспечения снабжения питательными веществами гидрогелевых срезов опухоли. Капля среды добавлялась поверх каждого гидрогелевого среза опухоли, чтобы предотвратить их высыхание. На рисунке 1Е показан обзор пяти гидрогелевых срезов опухоли, культивируемых на одном фильтрующем носителе, а также изображения среза гидрогеля крупным планом. В течение периода культивирования в течение 3 дней гидрогелевые срезы опухоли были стабильны и сохраняли свою структуру (рис. 2А). Сразу после печати в срезах гидрогелевой опухоли присутствовали пузырьки воздуха, но они исчезли во время культивирования (рис. 2А).

Жизнеспособность клеточной линии MCL Jeko-1, культивируемой в гидрогелевых срезах опухоли (3D), по сравнению с клетками Jeko-1, культивируемыми в культуре суспензии (2D), оценивали с помощью анализа исключения трипанового синего (рис. 2B). После 3 дней культивирования 80% клеток стали жизнеспособными, по сравнению с первоначальной жизнеспособностью 88% клеток Jeko-1 до печати. Клетки Jeko-1, культивируемые в 2D, сохраняли исходную жизнеспособность на уровне 88%. Существенной разницы между клетками Jeko-1, культивируемыми в 2D и 3D, не выявлено. Чтобы оценить, пролиферируют ли клетки Jeko-1 в срезах гидрогеля, было определено среднее количество клеток Jeko-1 на срез гидрогеля (рис. 2C). В то время как 5x105 Jeko-1 клеток содержались в каждом срезе сразу после печати (d0), это число почти удвоилось до 9,3x105 клеток после 3 дней культивирования.

Распределение и состояние клеток Jeko-1, культивируемых в гидрогелевых срезах, оценивали с помощью четырехцветной живой флуоресцентной визуализации (рисунок 2D) сразу после печати или через 3 дня культивирования. После печати 3D-реконструкции срезов гидрогеля Jeko-1 показали однородное распределение клеток. Большинство клеток были положительными на TMRM, маркер потенциала митохондриальной мембраны22. Меньшинство клеток было положительным на активность каспазы-3, маркера индукции апоптоза23, а также на маркер мертвых клеток PicoGreen21. Через 3 дня культивирования наблюдалось увеличение количества клеток наряду с формированием клеточных кластеров. Большинство клеток оставались TMRM-положительными, в то время как только несколько клеток были окрашены положительно на активность каспазы-3 или PicoGreen (рис. 2C).

Чтобы проанализировать, реагируют ли клетки MCL в гидрогелевых срезах на химиотерапию, клетки Jeko-1, культивируемые либо в культуре суспензии (2D), либо в гидрогелевых срезах (3D), обрабатывали химиотерапевтическим препаратом доксорубицином, который является частью стандартного лечения пациентов с MCL24. Общая структура гидрогелевых срезов сохранялась во время лечения доксорубицином (рис. 3А). Жизнеспособность клеток Jeko-1, культивируемых в гидрогелевых срезах, снижалась дозозависимо в ответ на лечение доксорубицином. IC50 доксорубицина в клетках Jeko-1 увеличивался при культивировании клеток в гидрогелевых срезах (IC50=5,8 мкМ) по сравнению с клетками Jeko-1, культивируемыми в 2D суспензионной культуре (IC50=2,0μM; Рисунок 3В). Четырехцветная флуоресцентная визуализация в реальном времени показала снижение TMRM- и повышенный сигнал PicoGreen в клетках Jeko-1, культивируемых в срезах гидрогеля в ответ на лечение доксорубицином, что подтверждает индуцированное лечением снижение жизнеспособности. Изображения, полученные с помощью четырехцветной флуоресцентной визуализации в реальном времени, были реконструированы в 3D, сегментированы на основе сигнала ядер DRAQ5 и проанализированы с помощью скрипта Python, описанного в дополнительном файле 1. Пример маски сегментации показан на дополнительном рисунке 1. Номер ячейки, идентифицированный по сигналу DRAQ5, использовался для определения общего номера ячейки. Количество клеток, положительное на активность TMRM, PicoGreen и Casspase-3, использовалось для определения процента жизнеспособных, мертвых или апоптотических клеток соответственно. Количественное определение четырехцветного живого флуоресцентного окрашивания клеток Jeko-1, культивируемых в гидрогелевых срезах в течение 3 дней с 9 мкМ Доксорубицином или без него, показало сопоставимую жизнеспособность с методом исключения трипанового синего (Таблица 2).

В дополнение к установленным клеточным линиям MCL, первичные клетки MCL трех разных пациентов с MCL культивировали либо в культуре 2D-суспензии, либо в 3D-срезах гидрогеля (рис. 4, дополнительный рисунок 2). По данным патологоанатома, все три МКЛ (пациент 1-3) имели классическую/общую морфологию с индексами Ki67 20%-50%. Первичные клетки MCL включали все типы клеток, выделенных из лимфатических узлов пациента с MCL, и, таким образом, содержали не только клетки MCL, но и другие типы иммунных клеток или стромальных клеток. Жизнеспособность первичных гидрогелевых срезов MCL оценивали с помощью теста исключения трипанового синего. После 4 дней культивирования первичные MCL-клетки в гидрогелевых срезах сохраняли жизнеспособность 43,6% (45,7% на 3-й день) по сравнению с исходной жизнеспособностью 71,0% до печати (рис. 4A). Это представляет собой повышенную жизнеспособность по сравнению с клетками, культивируемыми в суспензии (2D), которые имели выживаемость 19,6% после четырех дней культивирования (28,4% на 3-й день). Эта жизнеспособность была визуализирована с помощью четырехцветной флуоресцентной визуализации в реальном времени, в которой большинство клеток были TMRM-положительными и жизнеспособными, в то время как субпопуляция была положительной на активность Casspase-3 и PicoGreen, что указывает на апоптоз и гибель клеток, соответственно (рис. 4B). Данные количественной оценки на рисунке 4B приведены в таблице 2. Первичные клетки еще двух пациентов с MCL показали повышенную выживаемость клеток при культивировании в гидрогелевых срезах (3D) по сравнению с соответствующей культурой 2D-суспензии (дополнительный рисунок 1).

figure-results-1
Рисунок 1: Рабочий процесс 3D-печати гидрогелевых срезов опухоли.(А) Рабочий процесс 3D-печати и культивирования клеток в срезах гидрогелевых опухолей. (B) Принтер используется для 3D-биопечати гидрогелевых срезов в желатиновой подложке. (C) Печать чертежа в программном обеспечении 3D-принтера. Одновременно печаталось до пяти гидрогелевых срезов. (D) Схематическое изображение культуры гидрогелевых срезов. Гидрогелевые срезы культивировали на фильтрующей подложке в 6-луночной пластине. Капля среды добавлялась поверх каждого ломтика гидрогеля для поддержания их влажности. На одной подложке фильтра можно культивировать до пяти ломтиков гидрогеля. (E) Напечатанные на 3D-принтере гидрогелевые ломтики, культивируемые на подложке фильтра, как показано на обзорном изображении или на изображениях крупным планом. Масштабные линейки представляют собой 5 мм, 1 мм или 200 мкм, как показано на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Культивирование клеточной линии мантийноклеточной лимфомы (MCL) в 3D-печатных срезах гидрогеля. (A) Крупный план репрезентативного гидрогелевого среза, содержащего клеточную линию MCL Jeko-1, после печати (d0) или после 3 дней культивирования (d3). Масштабная линейка представляет 1 мм. (B) Жизнеспособность клеток Jeko-1, культивируемых в суспензии (2D) или в срезах гидрогеля (3D) в течение 2 дней, оцененных с помощью анализа исключения трипанового синего. Показано среднее ± SD трех независимых экспериментов по биопечати. (C) Номер клеток Jeko-1, содержащийся в каждом гидрогелевом срезе непосредственно после печати (d0) или после культивирования в течение 3 дней (d1-d3). Показано среднее ± SD трех независимых экспериментов по биопечати. Статистически значимой разницы не наблюдалось (n.s., p > 0,05, критерий Манна-Уитни). (D) Трехмерная реконструкция срезов гидрогеля Jeko-1 в день печати (d0) или через 3 дня культивирования (d3). Модель была сгенерирована из z-стеков четырехцветной 3D-флуоресцентной визуализации в реальном времени. Живые клетки показаны красным цветом (TMRM), апоптотические клетки — желтым (ферментативная активность каспазы-3), мертвые клетки — зеленым (PicoGreen), а ядра — синим (DRAQ5). Масштабная линейка представляет собой 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Медикаментозное лечение клеточной линии мантийноклеточной лимфомы (MCL) в срезах гидрогеля. (A) Крупный план репрезентативного гидрогелевого среза, содержащего клеточную линию MCL Jeko-1, обработанного 3 мкМ доксорубицином в течение 3 дней (d3). Масштабная линейка представляет 1 мм. (B) Клетки Jeko-1, культивируемые в суспензии (2D) или в гидрогелевых срезах (3D), обрабатывали возрастающими концентрациями химиотерапевтического агента доксорубицина в течение 2 дней. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью метода исключения трипанового синего. Показано среднее ± SD четырех независимых экспериментов по биопечати. (C) Трехмерная реконструкция срезов гидрогеля Jeko-1, обработанных 9 мкМ доксорубицином (Doxo) в течение 3 дней (d3). Модель была сгенерирована из z-стеков четырехцветной 3D-флуоресцентной визуализации в реальном времени. Живые клетки показаны красным цветом (TMRM), апоптотические клетки — желтым (ферментативная активность каспазы-3), мертвые клетки — зеленым (PicoGreen), а ядра — синим (DRAQ5). Масштабная линейка представляет собой 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Культивирование первичных клеток MCL в гидрогелевых срезах, напечатанных на 3D-принтере. (А) Жизнеспособность первичных клеток MCL, культивируемых в суспензии (2D) или в гидрогелевых срезах (3D) в течение 4 дней, по результатам анализа исключения трипанового синего. Показана средняя жизнеспособность одного эксперимента. (B) Трехмерная реконструкция первичных клеток MCL, культивируемых в гидрогелевых срезах (3D) в течение 3 дней. Z-стеки были получены из гидрогелевых срезов, окрашенных четырехцветным живым окрашиванием, и проанализированы с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM). Живые клетки показаны красным цветом (TMRM), апоптотические клетки — желтым (ферментативная активность каспазы-3), мертвые клетки — зеленым (PicoGreen), а ядра — синим (DRAQ5). Масштабная линейка представляет собой 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ПятноТМРМДРАК5Субстрат NucView405 Каспаза-3ПикоГрин
Возбуждение/излучение548 нм/574 нм647 нм/681 нм429 нм/ 469 нм488 нм/ 520 нм

Таблица 1: Максимумы возбуждения/излучения красителей, используемых для четырехцветной 3D флуоресцентной визуализации в реальном времени.

Образец% ячеек
TMRM (жизнеспособные клетки)PicoGreen (Мертвые клетки)Каспаза-3 (Апоптотические клетки)
Jeko-1 Ctrl8323.618.3
Jeko-1 Doxo 9 мкМ27.681.386.6
Первичный пациент 1 ЛКМ75.231.133.1

Таблица 2: Количественная оценка 3D-реконструкций четырехцветного живого окрашивания гидрогелевых срезов опухолей, культивируемых. Гидрогелевые срезы опухолей культивировали в течение 3 дней и содержали либо клетки Jeko-1, культивируемые с обработкой 9 мкМ доксорубицином, либо без нее (пациент 1).

Дополнительный рисунок 1: Идентификация клеток с помощью 3D-реконструкций четырехцветного живого окрашивания. 3D-реконструкции конфокального изображения, меченного с помощью DRAQ5, получены из (А) четырехцветного окрашивания в реальном времени и (Б) сегментированного изображения на этом канале, сгенерированного с помощью конвейера анализа изображений Python. Масштабная линейка представляет собой 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.

Дополнение Figure 2: Культивирование первичных клеток MCL пациентов 2 и 3 в гидрогелевых срезах опухоли . Жизнеспособность первичных клеток MCL пациента (А) 2 или (В) пациента 3, культивируемых в суспензии (2D) или в гидрогелевых срезах (3D), в течение 4 дней по результатам анализа исключения трипанового синего. Показана средняя жизнеспособность одного эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту цифру.

Дополнительный файл 1: Инструкции по анализу 3D-реконструкций, полученных в результате четырехцветного окрашивания в реальном времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Скрипт Python для анализа 3D-реконструкций, полученных в результате четырехцветного окрашивания в реальном времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное кодирование File 1: Stl. файл, содержащий схему гидрогелевых срезов опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Гидрогелевые срезы опухоли, описанные в этом протоколе, представляют собой модель MCL, которая имитирует структуру лимфатических узлов, что позволяет изучать выживаемость клеток MCL и реакцию на лекарственные препараты в 3D-микроокружении опухоли, созданном с помощью биопечати.

Наиболее широко используемые методы биопечати основаны на экструзии, при которой биочернила выбрасываются через систему дозирования. При струйной печати, например, биочернила быстро сшиваются после осаждения с образованием 3D-структур25. Однако этот подход имеет ограничения, особенно с точки зрения вязкости используемых материалов и возможности укладки слоев. В отличие от этого, при 3D-биопечати на основе встроенного шприца, такой как биопечать FRESH, используемая в этом протоколе, применяется подход «геле в геле». Это позволяет печатать биочернила с низкой вязкостью, такие как коллаген, в стабильные конструкции, что позволяет имитировать сложное микроокружение опухоли20,26. В то время как 3D-принтеры, специально разработанные для биопечати, могут быть дорогими, метод, представленный здесь, предлагает более доступную точку входа. Он может быть адаптирован к стандартным экструзионным принтерам с относительно простыми модификациями. Эти модификации могут быть напечатаны на 3D-принтере с помощью доступных нитей, а проекты доступны в виде ресурсов с открытым исходным кодом, например, Hinton et al.20. Однако важно отметить, что приготовление гидрогелевой ванны для биопечати FRESH очень чувствительно к температуре и требует тщательного внимания во время приготовления суспензии.

Часто напечатанные на 3D-принтере модели опухолей культивируются в плавающих системах, в которых отсутствует градиент кислорода in vivo 25, или в микрофлюидных чип-культурах27, которые обладают высокой степенью сложности, но имеют низкую пропускную способность и требуют интенсивного обслуживания. Эти препятствия можно преодолеть с помощью описанных здесь гидрогелевых срезов опухоли. Установка культивирования до пяти гидрогелевых срезов опухоли на границе раздела воздух-жидкость получена из культивирования прецизионно разрезанных срезов солидных опухолей28. Мембрана фильтрующего носителя, используемая в этом протоколе, состоит из политетрафторэтиленовой мембраны (ПФТЭ) с размером пор 0,4 мкм, которая обеспечивает обмен питательных веществ, но предотвращает прикрепление клеток или миграцию клеток29. Культура на мембране из ПТФЭ обеспечивает физическую поддержку срезам для поддержания их стабильности и предотвращения их разрыва или распада. Кроме того, они обеспечивают взаимодействие воздух-жидкость, обеспечивая кислород в основном из воздуха выше и питательные вещества из среды, расположенной ниже фильтра30. Таким образом, система включает в себя пространственно-временные изменения в поступлении питательных веществ, пролиферации клеток и насыщении кислородом, поскольку они могут происходить in vivo25. Культивируемые в гидрогелевых срезах опухоли на фильтрующей основе, первичные клетки MCL сохраняли жизнеспособность более 40% в течение 4 дней, что превышало жизнеспособность, наблюдаемую в культуре 2D-суспензии (рис. 3A, дополнительный рис. 2). Дальнейшие исследования должны выяснить, может ли быть достигнута пролонгированная жизнеспособность путем добавления цитокинов или совместного культивирования с CD40L-экспрессирующими фибробластами, как это было описано в сфероидах и органоидах первичной опухоли В-клеточной лимфомы 6,19,30 или в кокультурах первичных клеток MCL с CD40L-экспрессирующими фибробластами L-клеток14. Включение таких подходов в гидрогелевые срезы опухоли следует рассматривать для улучшения культуры первичных клеток MCL, а также сходства с нативным микроокружением.

Лимфатические узлы содержат хорошо развитую сеть волокон внеклеточного матрикса. Из-за своего рисунка они известны как сетчатые волокна. В основном, эти волокна состоят из коллагена и компонентов, специфичных для базальной мембраны 31,32,33. Для создания матрицы, напоминающей ситуацию in vivo в лимфатических узлах, биочернила, используемые для создания гидрогелевых срезов опухоли, состоят из коллагена I типа и Матригеля, который состоит из четырех основных белков ЭКМ базальной мембраны: ламинина, коллагена IV, энтактина и перлекана34. Кроме того, альгинат добавляется в биочернила для стабилизации гидрогелевых срезов опухоли, что позволяет проводить длительное культивирование и транспортировку из одного сосуда в другой с помощью шпателя. Тестирование различных гидрогелей, содержащих коллаген и альгинат, показало наивысшую клеточную жизнеспособность в сочетании со стабильным и долговечным срезом гидрогеля при использовании биочернил с 0,5% альгината и 20% коллагена (данные не показаны). Помимо компонентов, диаметр гидрогелевого среза опухоли 0,8 см еще больше напоминает средний диаметр лимфатических узлов 1 см35. Живая 3D-визуализация гидрогелевых срезов опухоли также показала равномерное распределение клеток (Рисунок 2C).

При этом способность обрабатывать срезы гидрогеля лекарственными препаратами была продемонстрирована при лечении доксорубицином, который является частью терапии R-CHOP (ритуксимаб, циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, преднизолон), стандартной терапии для пожилых пациентов подгруппыMCL подгруппы 24. По сравнению с 2D-культурами, влияние микроокружения опухоли на эффекты лечения может быть изучено в срезах гидрогелевой опухоли. Как показано на рисунке 3, клетки Jeko-1, культивируемые в срезах гидрогеля, были более устойчивы к обработке доксорубицином, чем клетки, культивируемые 2D. Это согласуется с наблюдениями о том, что внеклеточный матрикс может влиять на реакцию на лекарственные препараты и часто усиливать лекарственную устойчивость за счет модуляции жесткости опухоли36, межклеточной коммуникации37 и доставки лекарств38. Кроме того, проточный цитометрический анализ, а также иммуногистохимическое или мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание могут дать более глубокое представление об ответе на лечение отдельных клеток в срезах гидрогелевых опухолей.

В заключение, этот протокол описывает генерацию и культивирование гидрогелевых срезов опухоли, которые представляют собой 3D-модель лимфатических узлов, имитирующую нативную трехмерную структуру лимфатических узлов. Он обладает потенциалом для расширения применения от клеток MCL до других первичных показаний к лимфоме.

Раскрытие информации

Это исследование было поддержано Фондом Роберта-Боша и Министерством науки, исследований и искусств Баден-Вюртемберга (3R-Network BW).

Благодарности

Мы благодарим Керстин Виллеке за ее превосходную техническую помощь и Ян Чжана за его ценную помощь в анализе 3D-изображений.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
&микро;-слайд 8 лунок со стеклянным дномibidi GmbH80827Предметные стекла со стеклянным дном используются для визуализации гидрогелевых срезов в реальном времени
10x PBSCarl Roth GmbH + Co.KG9150.1Компонент Bioink
10X RPMI-1640 СреднийСигма-ОлдричР1145Компонент Bioink
Газонепроницаемый шприц 2,5 мл модель 1002 TLLГамильтон81420Шприц для биопечати
3D экструзионный принтер, PrintrBot SimplePrintrbotСамомодифицированные для печати биочернил
6-луночный планшетTh. Geyer GmbH & Co.KG7696790Культура гидрогелевых срезов
Вакуумные фильтрующие системы, мембрана PES, 500 мл, 0.22 и микро; m размер пор, 70  мембрана диаметром ммCorning Inc.513-3355Стерильная фильтрация буферов
Дегидрат хлорида кальцияCarl Roth GmbH + Co.KGТ885.2Компонент промывочного буфера и желатиновой суспензии
Коллаген I из крысыCorning Inc.CLS354249Компонент Bioink
Программное обеспечение Cura Version 15.04.5 для 3D-печатиУльтимейкерПрограммное обеспечение, используемое для 3D-печати
ДРАК5ООО «Биостатус»DR50050Морилка для визуализации гидрогелевых срезов в реальном времени
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) дигидрат динатриевой солиСигма-ОлдричЕ5134Компонент альгинатного растворимого буфера
Автоматический счетчик ячеек EVEНано ЭнТек Инк.10027-452Счетчик ячеек
Бактериологические чашки Петри Falcon с крышкой, диаметр 35 ммСокол351008Заполнен желатиновой суспензией для формирования опорной ванны для биопечати
Пробирки Falcon, 50 млSarstedt AG & Co.KG62.547.254
Эмбриональная сыворотка для теленкаСигма-ОлдричС0615Добавка к среде для клеточных культур
Желатин из свиной кожиСигма-ОлдричГ1890Основной компонент желатиновой суспензии
HEPES, свободная кислота, класс молекулярной биологииMerck KGaAКАС 7365-45-9Компонент промывочного буфера и желатиновой суспензии
Клеточная линия Jeko-1 MCLАТКСЦРЛ-3006Клеточная линия MCL
Салфетки KIMTECH Science PrecisionКорпорация «Кимберли Кларк»7551Используется для забора лишней воды из желатиновой суспензии и для удаления капель из сопла 3D-принтера
Версия программного обеспечения LAS X 3.5.7.23225ЛейкаПрограммное обеспечение, используемое для 3D-реконструкций
Leica TCS SP8 Конфокальный лазерный сканирующий микроскопЛейкаТКС SP8Конфокальный микроскоп для визуализации в реальном времени
Mason Баночка обычная пинта 16 унцийБолл КорпорейшнГ001Банка, в которой готовится желатиновая кашица
Матрица базальной мембраны с уменьшенным фактором роста (СКФ) МатригелCorning Inc.356231Компонент Bioink
Вкладыш для культивирования милликлеточных клеток, 0,4 &; м размер порMerck KGaAПИКМОРГ 50Поддержка фильтра для ломтиков гидрогеля
Подложка NucView 405 Каспаза-3, 1 мМ в 1x PBSБиотиум10405Морилка для визуализации гидрогелевых срезов в реальном времени
Блендер серии Oster ProfessionalОстерБПСТ02-Б00Блендер для получения желатиновой суспензии
Пенициллин/стрептамицинGibco15140163Добавка к среде для культивирования клеток MCL
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kits und dsDNA-ReagenzienИнвитрогенП7589Морилка для визуализации гидрогелевых срезов в реальном времени
Ротина 35 РХеттих24573Центрифугирование клеток
Центрифуга ROTINA 38/38RХеттихZ720109Центрифугирование желатиновой суспензии
RPMI-1640+GlutaMAXGibco61870036Основа питательной среды для клеток MCL
Альгинат натрияСотрудничество с FMCGQ9109901Компонент Bioink
Хлорид натрияMerck KGaA1.06404Компонент альгинатного растворимого буфера
Цитрат натрияCarl Roth GmbH + Co.KG3580.1Компонент альгинатного растворимого буфера
Канюли для тупой аппликации Sterican 21G 0,8x22 ммБ.Браун9180109Сопло для 3D-печати
Тетраметилродамин-метилэфирперхлорат (ТМРМ)Сигма-ОлдричТ5428Морилка для визуализации гидрогелевых срезов в реальном времени
Трипан синий, 0,4%Сигма-ОлдричТ8154Морилка для анализа жизнеспособности
Водонепроницаемый термометрВВР620-2099Термометр для контроля температуры желатиновой суспензии

Ссылки

  1. Jain, P., Wang, M. L. Mantle cell lymphoma in 2022-a comprehensive update on molecular pathogenesis, risk stratification, clinical approach, and current and novel treatments. Am J Hematol. 97 (5), 638-656 (2022).
  2. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
  3. Wen, T., Wang, J., Shi, Y., Qian, H., Liu, P. Inhibitors targeting Bruton's tyrosine kinase in cancers: Drug development advances. Leukemia. 35 (2), 312-332 (2021).
  4. Lee, H. J., et al. Phase 1/2 study of zilovertamab and ibrutinib in mantle cell lymphoma (mcl) or chronic lymphocytic leukemia (cll). J Clin Oncol. 40 (16_suppl), 7520(2022).
  5. Roué, G., Sola, B. Management of drug resistance in mantle cell lymphoma. Cancers. 12 (6), 1565(2020).
  6. Araujo-Ayala, F., et al. A novel patient-derived 3d model recapitulates mantle cell lymphoma lymph node signaling, immune profile, and in vivo ibrutinib responses. Leukemia. 37 (6), 1311-1323 (2023).
  7. Bryant, J., et al. Development of intermediate-grade (mantle cell) and low-grade (small lymphocytic and marginal zone) human non-Hodgkin's lymphomas xenotransplanted in severe combined immunodeficiency mouse models. Lab Invest. 80 (4), 557-573 (2000).
  8. Andersen, T., Auk-Emblem, P., Dornish, M. 3d cell culture in alginate hydrogels. Microarrays. 4 (2), 133-161 (2015).
  9. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  10. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12 (1), 155(2022).
  11. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnol J. 9 (9), 1115-1128 (2014).
  12. Rossi, M., Alviano, F., Righi, S., Sabattini, E., Agostinelli, C. Three-dimensional models: A novel approach for lymphoma research. J Cancer Res Clin Oncol. 148 (4), 753-765 (2022).
  13. Saba, N. S., et al. Pathogenic role of B-cell receptor signaling and canonical nf-κb activation in mantle cell lymphoma. Blood. 128 (1), 82-92 (2016).
  14. Chiron, D., et al. Rational targeted therapies to overcome microenvironment-dependent expansion of mantle cell lymphoma. Blood. 128 (24), 2808-2818 (2016).
  15. Nylund, P., Nikkarinen, A., Ek, S., Glimelius, I. Empowering macrophages: The cancer fighters within the tumour microenvironment in mantle cell lymphoma. Front Immunol. 15, 1373269(2024).
  16. Nygren, L., et al. T-cell levels are prognostic in mantle cell lymphoma. Clin Cancer Res. 20 (23), 6096-6104 (2014).
  17. Medina, D. J., et al. Mesenchymal stromal cells protect mantle cell lymphoma cells from spontaneous and drug-induced apoptosis through secretion of b-cell activating factor and activation of the canonical and non-canonical nuclear factor κb pathways. Haematologica. 97 (8), 1255-1263 (2012).
  18. Jindal, U., et al. Targeting cers6-as1/fgfr1 axis as synthetic vulnerability to constrain stromal cells supported proliferation in mantle cell lymphoma. Leukemia. 38 (10), 2196-2209 (2024).
  19. Nie, L., et al. Establishment of a patient-derived organoid culture platform for mantle cell lymphoma drug sensitivity and car t cell anti-tumor activity assay. Blood. 140 (Supplement 1), 9219-9220 (2022).
  20. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).
  21. Van Der Kuip, H., et al. Short-term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug Taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6 (1), 86(2006).
  22. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76 (1), 469-477 (1999).
  23. Porter, A. G., Jänicke, R. U. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differentiat. 6 (2), 99-104 (1999).
  24. Huseynov, V. Treatment of mantle cell lymphoma in transplant non-eligible patients. Hematol Transfus Cell Ther. 44, S2-S3 (2022).
  25. Augustine, R., et al. 3d bioprinted cancer models: Revolutionizing personalized cancer therapy. Transl Oncol. 14 (4), 101015(2021).
  26. Budharaju, H., Sundaramurthi, D., Sethuraman, S. Embedded 3d bioprinting – an emerging strategy to fabricate biomimetic & large vascularized tissue constructs. Bioact Mater. 32, 356-384 (2024).
  27. Seaman, K., Sun, Y., You, L. Recent advances in cancer-on-a-chip tissue models to dissect the tumour microenvironment. Med-X. 1 (1), 11(2023).
  28. Davies, E. J., et al. Capturing complex tumour biology in vitro: Histological and molecular characterisation of precision cut slices. Sci Rep. 5 (1), 17187(2015).
  29. Millipore PICM03050: Millicell Standing Cell Culture Inserts Data Sheet. , Merck KGaA. Darmstadt, Germany. (2025).
  30. Lamaison, C., et al. A novel 3d culture model recapitulates primary fl b-cell features and promotes their survival. Blood Adv. 5 (23), 5372-5386 (2021).
  31. Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell Tissue Res. 252 (2), 367-375 (1988).
  32. Kaldjian, E. P., Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shi, Y., Shaw, S. Spatial and molecular organization of lymph node T cell cortex: A labyrinthine cavity bounded by an epithelium-like monolayer of fibroblastic reticular cells anchored to basement membrane-like extracellular matrix. Int Immunol. 13 (10), 1243-1253 (2001).
  33. German, S. V., et al. Plug-and-play lymph node-on-chip: Secondary tumor modeling by the combination of cell spheroid, collagen sponge, and T-cells. Int J Mol Sci. 24 (4), 3183(2023).
  34. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: From discovery and ecm mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliver Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  35. Ogassavara, B., Tucunduva Neto, R. R., De Souza, R. R., Tucunduva, M. J. Ultrasound evaluation of the morphometric patterns of lymph nodes of the head and neck in young and middle-aged individuals. Radiol Brasileira. 49 (4), 225-228 (2016).
  36. Huang, J., et al. Extracellular matrix and its therapeutic potential for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
  37. Subrahmanyam, N., Ghandehari, H. Harnessing extracellular matrix biology for tumor drug delivery. J Personalized Med. 11 (2), 88(2021).
  38. Ahmad, V. Prospective of extracellular matrix and drug correlations in disease management. Asian J Pharma Sci. 16 (2), 147-160 (2021).

Перепечатки и разрешения

Теги

3D
Биопечать гидрогелевых срезов опухоли в качестве 3D-модели мантийноклеточной лимфомы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.