Method Article

Живое изображение и характеристика динамики микроглии и взаимодействия с синапсами в заболевшей сетчатке мыши

DOI:

10.3791/68420

⸱

January 16th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of California, San Francisco, 2Jules Stein Eye Institute, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье демонстрируется метод визуализации и количественной оценки подвижности микроглии и контакта с постсинаптической пункткой в сетчатке с помощью вращающейся дисковой конфокальной микроскопии.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроглия — это резидентные макрофаги центральной нервной системы (ЦНС), которые реагируют на инфекции и повреждения тканей. Помимо роли в воспалении, микроглия играет роль в развитии цепей посредством синаптической обрезки. Однако механизмы синаптической обрезки при нейровоспалении и нейродегенерации остаются неизвестными. В этом протоколе мы используем модель сетчатки мыши explant для изучения динамики микроглии ex vivo. Для изучения подвижности микроглий и их взаимодействия с постсинаптическими белками мы маркируем синапсы AAV-PSD95-RFP и записываем таймлапс-видео подвижных микроглий, колокализованных с постсинаптическими белками, с помощью вращающейся дисковой конфокальной микроскопии. Затем мы создаём поверхностные и пятнистые реконструкции микроглии и PSD95 с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Данные, такие как длина смещения микроглии, скорость процесса и контакт с постсинаптическими пунктами, можно извлечь из этих поверхностей для понимания поведения микроглии как в гомеостатических состояниях, так и после повреждения нейронов. Этот протокол может быть полезен при изучении роли микроглии в синаптической обрезке при нейродегенеративных заболеваниях сетчатки.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Функция цепей и гомеостаз зависят от сильно регулируемого сжигания синапсов и других уникальных взаимодействий между различными типамиклеток 1. Являясь резидентными макрофагами центральной нервной системы (ЦНС), микроглия — это ненейронная популяция сетчатки, играющая уникальную роль в синаптической обрезке. В процессе развития ЦНС микроглии обрезают нефункциональные или слабые синапсы для уточнения нейронныхцепей 2. Микроглия в развивающемся мозге изучает окружающую среду и готова к нейропротективной роли в критическиепериоды 3. В развитии зрительной системы микроглии являются ключевыми регуляторами в развитии корковых нейронов и интернейронов, а также проявляют морфологические изменения в критические периоды синаптическойремоделирования 4. Аналогично, в развивающейся сетчатке микроглия очищает апоптотические клетки, чтобы освободить место для новых синаптических связей, что подтверждается повышением гомеостатического маркера P2Ry12 во время этих процессовочищения 5. Однако недавние данные показывают, что микроглия может не играть окончательной роли в совершенствовании нейронных цепей развивающейсязрительной системы 6, подчёркивая споры относительно роли микроглии в развитии зрительных цепей.

В контексте травм микроглия меняет морфологию в активное состояние и может играть нейродегенеративную роль. Например, микроглия в моделях болезни Альцгеймера показала повышенное поглощение амилоидно-бета-бляшек7 и синаптических маркеров, таких как SPH и PSD958. При нейродегенерации сетчатки многие исследовательские группы обнаружили микроглию с поглощённым синаптическим материалом, но нет явных доказательств активного поглощения целыхсинапсов 9,10,11,12,13. Например, Хэ и соавт. обнаружили, что микроглия увеличивается в численности и увеличивает объём поглощённого синаптического материала в модели ретинитапигментоза 9, но неясно, был ли фагоцитоз целостных синапсов или очищение обломков. Кроме того, традиционные микроглиальные классификации — такие как «в состоянии покоя против активированного» или «M1 против M2» — упрощённы и всё менее точны с учётом современных взглядов. Микроглии существуют в градиенте состояний, а не в дискретныхкатегориях 12. Поэтому Паоличелли и др. призвали к переходу от устаревших бинарных классификаций к более тонким, строго определённым терминологическим обозначениям для микроглиальных состояний для лучшего понимания и определения морфологии и активностимикроглий 12. Таким образом, стратегии оценки функции микроглии ex vivo и in vivo повысят способность области различать состояния и активность микроглии как в контексте развития, так и заболевания.

Хотя существуют стратегии для изучения функции микроглии как ex vivo, так и in vivo, экс виво живые визуализации имеет ряд преимуществ. Во-первых, ясность роговицы или развитие катаракты не будут мешать визуализации сетчатки, создавая чёткую визуализацию мельчайших процессов и синаптических пунктов. Кроме того, для установки изображения in vivo требуется больше технических навыков, что делает ex vivo подготовку с большей пропускной способностью, что приводит к увеличению количества животных в каждом эксперименте. Несмотря на теоретические преимущества, которые может предоставить in vivo-визуализация, для зафиксирования подвижности микроглии для продольной съёмки14,15 требуется высокая мощность лазера (100–230 мкВт). Однако ex vivo визуализация микроглии с меньшей мощностью лазера и достаточным содержанием может обеспечить такое же качество изображения, как и in vivo при правильной подготовке, хотя ткань уже не находится на месте.

Мы продемонстрировали, что микроглия увеличивается в численности, сложности и движении процесса после переходного усиления внутриглазногодавления (ВГД) 10. В фиксированной ткани этот микроглиоз приводит к увеличению колокализации с синаптическимибелками 10. Предыдущие исследования также демонстрировали раннюю потерю синапса и дегенерацию дендритов ганглионных клеток сетчатки (RGC) в модели глазной гипертензии, индуцированной лазером у мышей (LIOH), а также в других нейродегенеративныхмоделях 10,16,17,18,19,20. Однако до сих пор неизвестно, играют ли они активную роль в обрезке синапсов или более пассивную роль в очищении клеточного мусора, включая разобранные синапсы. Поскольку дизассемблирование синапсов является ранней отличительной чертой нейродегенерации, понимание динамики микроглии и её роли в демонтаже синапса крайневажно. 8,10. Здесь мы используем живую визуализацию для понимания динамики микроглии и её взаимодействия с возбуждающим постсинаптическим белком плотности-95 (PSD95) на дендритах RGC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Животных содержали в Калифорнийском университете в Сан-Франциско при световых циклах 12 часов света и 12 часов темноты, им предоставляли воду и стандартный рацион ad libitum, если не указано. Все процедуры были одобрены Институциональными комитетами по уходу и использованию животных Калифорнийского университета в Сан-Франциско. См. таблицу материалов и инструментов, используемых в этом протоколе. Обзор экспериментальной процедуры — от интравитреального инъекции до визуализации и анализа — приведён на рисунке 1.

1. Производство и эффективность вирусов AAV-PSD95-TagRFP

  1. Постройте AAV-PSD95-tagRFP, взяв последовательность PSD-95pTagRFP (плазмид Addgene #52671; RRID:Addgene_52671) и вставляли его ниже по течению промотора CMV в AAV-CMV-GFP после удаления GFP (плазмида Addgene #67634; RRID: Addgene_67634).
  2. Приготовьте вирус с помощью тройной трансфекции HEK293T, очищенного с помощью PEG/хлороформ и концентрированного до титра 1012 ip/mL (как описано в Negrini и др.)21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод производства вируса обычно даёт более низкий титр, чем ультрацентрифугирование, но для таких экспериментов желательно иметь редко инфицированныеклетки 21. Капсид/серотипная версия, использовавшаяся в этих экспериментах, составляла 7 м8 (плазмида Addgene # 64839; RRID: Addgene_64839).
    1. Проверьте эффективность AAV перед полным протоколом визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Читатели, внедряющие этот протокол, должны стремиться к редкой маркировке RGC, поскольку цель — выявить и изолировать отдельные дендриты RGC.
  3. Проверьте успешную трансфекцию, а затем исправьте сетчатку с 2% PFA в 1x ACSF. Для синаптических белков проверьте сигнал под конфокальным микроскопом на 63x, чтобы убедиться в четком разрешении флуоресцентной маркировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Меньшая концентрация фиксации помогает сохранить маркировку для синаптических белков. Если используемый AAV не предназначен для синаптических компонентов, считыватели могут выбрать 4% PFA.

2. Содержание мышей и инъекции AAV-PSD95-TagRFP внутривитреальных инъекций

  1. Скрещивание самцов и самок мышей CD-1 альбиносов (штамм 022) с B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J (штамм 005582) для получения CD-1-альбиносных мышей с микроглией, экспрессирующей EGFP. Подождите минимум четыре поколения обратного скрещивания, чтобы использовать самцов и самок гетерозиготных мышей Cx3cr1 в экспериментах. Поддерживайте и обновляйте штамм через 10 поколений обратно на фон CD-1, чтобы предотвратить генетический дрейф.
  2. Анестезируйте животных (P30-P60) с использованием изофлурановой анестезии через индукционную камеру с 3-5% анестетиком в кислороде с расходом 1 л/мин кислорода. Поместите животное под стереомикроскоп, при этом следите за непрерывным введением изофлурана через носовой конус. Чтобы убедиться, что животное под наркозом, защипните палец не менее 3 раз для подтверждения.
  3. Добавьте каплю 0,5% пропаракаина перед введением AAV. Введите 2 мкл AAV-PSD95-RFP медленно внутривитруально в оба глаза в сверхвисочном лимбе с помощью шприца 26s G 10 мкл. Медленно убирайте иглу, чтобы предотвратить обратный поток AAV через место инъекции. Нанесите антибиотиковую мазь на глаза после инъекции.
  4. ПРИМЕЧАНИЕ: Игла не должна проходить дальше половины окружности стекловидной камеры. При этом сетчатка и хрусталик могут быть повреждены кончиком иглы, что приведёт к пятнистой или даже неудачной трансфекции. Развитие или кровоизлияние катаракты свидетельствуют о неправильной технике инъекций.
  5. После инъекции убедитесь, что животные насторожены, прежде чем вернуть их в исходные клетки и помещения для содержания. Если у животного появляется боль после инъекции, вводите бупренорфин через внутрибрюшинную инъекцию. Подождите 3 недели для выражения AAV. Если для повышения внутриглазного давления (или проведения других манипуляций) используется индуцируемая модель, подождите 3 недели, прежде чем вызвать повышенное внутриглазное давление в одном глазу, используя контралатеральный глаз или глаза наивного животного в качестве контроля.

3. Эвтаназия и монтаж сетчатки

  1. Приготовьте свежий 1x раствор искусственной спинномозговой жидкости (ACSF, pH 7,4) в 1x PBS, содержащие следующие компоненты в мМ: 119 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 MgCl2,6H 2O, 2,5 CaCl2·2H2O, 1NaHPO 4, 11 глюкозы и 20 HEPES).
  2. Насыщайте раствор кислородом минимум 15 минут перед использованием для острого вскрытия. Подключите трубку к кислородному баллону и поставьте крышку с отверстием в центре, чтобы газ не выходил.
  3. Эвтаназии мыши не менее 1 мл анестезии с изофлураном в небольшой индукционной камере, затем вывихнуть шейку матки. Отметьте носовую сторону роговицы маркером перед энуклеацией, чтобы можно было отслеживать расположение сетчатки на протяжении всего эксперимента.
    1. Для энуклеации глаз с микробусинами или лазером проведите ограниченную конъюнктивальную перитомию и разместите ножницы за глазом, чтобы вскрыть глаз у основания зрительного нерва. Это позволяет нежному глазу оставаться целым.
  4. С помощью диссекционного микроскопа проткните небольшое отверстие иглой 23 G или 25 G в роговице, что позволит оксигенированному ACSF проникнуть в глаз. Вставьте ножницы в это отверстие, чтобы сделать фидуциарный разрез на носовом конце.
  5. Отрежьте остальную роговицу и радужку в лимбусе.
  6. Удалите радужку и хрусталицу. Если сетчатка прилипает к хрусталу, разделите её щипцем.
  7. Отдельте сетчатку от склеры, используя щипцы для аккуратного рассечения между RPE и нейронной сетчаткой.
  8. Разместите сетчатку на несетчатой стороне мембранного фильтра из смешанных целлюлозных эфиров (MCE) для чёткой визуализации и визуализации.
  9. Сделайте небольшие расслабляющие порезы на сетчатке в остальных трёх квадрантах, при этом самый длинный разрез — в носовой сетчатке, чтобы отслеживать расположение сетчатки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: сетчатка должна выглядеть как четырёхлистный клевер.
  10. Перенесите сетчатку с фильтрующей бумаги на лабораторную салфетку. Используйте одну каплю ACSF, чтобы увлажнить сетчатку, а затем салфеткой высушите фильтрующую бумагу. Повторяйте минимум 8-10 капель, чтобы сетчатка прилипла к фильтрующей бумаге.
  11. Поместите сетчатку в оксигенационную камеру при вскрытии контралатерального глаза.
  12. Когда вы готовы к снимку, высушите фильтрующую бумагу, как указано в шаге 3.10, и инвертируйте сетчатку на чашу Matek Petri. Утяжелите сетчатку либо металлическими бусинами, либо кольцом. Добавьте 3-5 капель ACSF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мелкие металлические шарики, такие как из металлической ванны или кольца, имеют достаточный размер и вес, чтобы предотвратить дрейф, не нарушая целостность сетчатки.
  13. Создайте кольцо, взяв стальную проволоку и натянутые нейлоновые нити, приклеив и добавив груз, чтобы получить кольцо с фиксированными, натянутыми параллельными нитками.
    1. Обмотайте проволоку вокруг цилиндра диаметром 1/2 дюйма и натяните плоскогубцами. Вырежьте каждое кольцо из цилиндра и расплющите между тисками.
    2. Отшлифуйте кольцо на одной стороне, чтобы сторона получилась грубой, плоской стороной. Натяните нейлоновые нити поверх отверстия бутылки диаметром 1-2 дюйма и фиксируйте их резинками.
    3. Положите кольцо поверх нейлоновых нит и аккуратно приклейте его к нейлоновым нитям, нанеся небольшое количество клея по внутреннему периметру кольца. После этого положите на кольцо лёгкий груз, например, монету или тонкую металлическую проволоку, чтобы удерживать кольцо на месте.
    4. После высыхания отрежьте нейлоновые нити с внешнего края кольца с помощью точных ножниц. В результате получаются неподвижные параллельные струны, напряжённо расширяющие диаметр кольца.
    5. Если плотность нейлоновых струн внутри кольца слишком высока, отдельные струны разрежьте с помощью пружинных ножниц с микродиссекцияцией, чтобы соответствовать потребностям эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс вскрытия и монтажа займёт всего ~5 минут. Чем быстрее ткань помещается в уравновешенные физиологические условия ex vivo, тем здоровее она становится.

4. Вращение дискового конфокального захвата

ПРИМЕЧАНИЕ: Включите увлажняющую камеру при 5%CO2 и запустите её минимум 1 час перед визуализацией. Достижение теплового равновесия системе и образцу поможет снизить дрейф.

  1. Начните сканировать окуляр с частотой 10x, чтобы сосредоточиться на микроглии. При сканировании ткани в поиске участков для изображения используйте канал микроглии в качестве ориентира и сосредотачивайтесь только на микроглиях с яркими синаптическими пунктами колокализованными (в пределах 10-20 мкм). Поскольку маркировка AAV не является однородной по всей ткани, сканируйте области, где и микроглия, и пункта колокализованы в одной плоскости. После того как область, соответствующая этим критериям, переключитесь на 60x для фокусировки и переключитесь в режим камеры, нажав кнопку камеры .
    1. Используя программное обеспечение системы обработки изображений, кликните правой кнопкой мыши по экрану, чтобы найти xy-навигацию. Появится экран предварительного просмотра, который сможет сканировать ткань, сделав кадр 3 x 3, 5 x 5 или индивидуальный размер для оптимальных участков. Используйте размер кадра 3 x 3 или 5 x 5 и экран с одним опорным каналом, чтобы предотвратить непрерывное фотоотбеливание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола мы использовали канал микроглии.
  2. Сфотографируйте установленную сетчатку с помощью вращающегося дискового конфокального микроскопа с объективом 60x (NA 1.49).
  3. Чтобы просмотреть образец, кликните правой кнопкой мыши на экране, выберите Live и кнопку автонастройки , чтобы система могла настраивать просмотр на основе текущих LUT. Для настройки настроек лазера сначала выберите каждый канал отдельно и регулируйте мощность и экспозицию лазера по мере необходимости. Затем кликните правой кнопкой мыши по флуорофору, чтобы назначить настройки микроскопу и сохранить пользовательские настройки, так как программа не сохраняет их при переключении на другой канал.
    1. Переключайтесь на следующий канал и корректируйте по мере необходимости. Кликните правой кнопкой мыши по флюорофору, чтобы сохранить настройки. Если вы получаете несколько каналов в одном кадре, введите те же значения, которые используются после предварительного просмотра каждого канала отдельно. Кликните правой кнопкой мыши по флуорофору, чтобы сохранить настройки.
    2. Для многоканального приобретения выберите интересующие каналы во вкладке Lambda . Для живой съёмки объедините все каналы в один канал для быстрого захвата мелких движений от интересующей ячейки, чтобы каждый канал можно было получать одновременно, а не отдельно, что может привести к задержке таймлапса в зависимости от скорости ячейки.
  4. Приступайте к получению таймлапса на нужное время.
    1. В вкладке времени внизу слева введите таймлапс на 5-10 минут с интервалом 20 секунд.
    2. В вкладке настроек получения справа установите разрешение изображения на 608 x 832 с размером пикселя 0,12 мкм.
    3. Собирайте изображения в размере 10–20 мкм с шагом 0,3 мкм для обеспечения приемлемого разрешения мелких микроглиальных процессов и синаптических пунктов вдоль оси z. Для успешного отслеживания ячеек поддерживайте интервал между кадрами на уровне 20–30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за хрупкости ткани ex vivo рекомендуется сначала снимать экспериментальную сетчатку и не более одного часа. Это необходимо для нормализации состояния контралатерального контрольного глаза, который должен находиться в насыщенной кислородом камере во время визуализации первой сетчатки.
  5. Используйте этот протокол для изображения более поверхностных слоёв сетчатки. При получении временных интервалов больше 20 мкм становится сложнее фиксировать тонкое движение процесса в течение 20-секундных интервалов. Поэтому микроглии изображения помещаются только в стек размером 20 мкм.

5. Анализ отслеживания и экспорт данных

  1. Поверхностное рендеринг для микроглии
    1. Конвертируйте таймлапс-файл в IMS с помощью программного обеспечения конвертера файлов. Введите следующие размеры вокселей на основе свойств изображения, полученных на шаге 4.2: x = 0.1272423 микрон, y = 0.1272423 микрон, z = 0.3 микрон.
    2. После запуска аналитическое программное обеспечение начнёт работу в Arena. Нажмите на папку «Наблюдать », чтобы открыть ранее конвертированный файл. Убедитесь, что изображение находится в 3D-виде.
    3. Чтобы обнаружить целую отдельную микроглию, нажмите на синюю иконку поверхности в панели инструментов объектов . Выберите последние три опции в настройках алгоритма : Отслеживание поверхностей (со временем), Классифицировать поверхности и Статистика объект-объект. Нажмите на синюю кнопку воспроизведения , чтобы перейти к следующему шагу.
      1. В случае множественных микроглий выберите Сегмент только область интереса (ROI ), чтобы гарантировать наличие отдельных микроглий внутри одного объекта поверхности. Задайте параметры x, y и z соответственно так, чтобы получить поверхность отдельной интересующей микроглии.
    4. Выберите канал, для которого будет создано рендеринг поверхности. Если хотите, выберите Smooth, чтобы сгладить создание поверхности, и используйте соотношение 1:1 - 1.25 к размеру вокселя изображения. Например, если изображение имеет размер вокселей 0,12 x 0,12 x 0,3 мкм, установить детализацию поверхности на 0,15 - 0,16 мкм. В разделе порогового значения выберите сегментацию машинного обучения, чтобы обучить программное обеспечение обнаружению интересующих ячеек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий шаг заключается в подаче обучающих данных в Imaris AI с помощью сегментации машинного обучения.
    5. В разделе Обучающие данные обратите внимание на два инструмента кисти: Фон (для обнаружения фона) и Передний план (для обнаружения истинного сигнала образца). Рисуйте мазки кистью, выбрав нужную кисть и используя Shift + Левый клик. Убедитесь, что Interpolate Display выбран в разделе Настройки. Выберите Train и Predict , чтобы ввести обучающие данные по выполненным мазкам кисти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подача более шести ударов приводит к увеличению времени обработки ИИ и неточному захвату клетки.
      1. Используйте жёлтый указатель посередине, чтобы перемещаться по z-стеку. Нарисуйте несколько мазков кисти по плоскостям x, y и z, а также в нескольких (не всех) временных промежутках таймлапса. Делайте 3-5 коротких мазков кистью за запись, так как ИИ лучше всего учится с небольшими кусочками информации за раз. Корректируйте этот шаг итеративно с каждым элементом, пока не получите точную поверхность ячейки.
      2. Выберите жёлтый прямоугольник , чтобы переключиться между тренировочным дисплеем и реальной поверхностью, созданной в качестве финальной проверки. Также проверьте на протяжении таймлапса, точно ли поверхность соответствует ячейке.
    6. Когда будет достигнуто точного рендеринга поверхности, переходите к следующему этапу. Отменить выделение разделённых объектов.
    7. Отрегулировать количество вокселей в гистограмме. Сдвините порог так, чтобы он убрал мелкие объекты, не связанные с основной поверхностью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг используется для удаления мелких нежелательных поверхностей, возникших из-за фонового шума. Цель — удалить любые поверхности, не связанные с основным объектом интересующей ячейки.
    8. Далее редактируйте поверхность по мере необходимости. Вручную очищайте все объекты, не входящие в основную поверхность, или срезайте края, используя ножницы по мере необходимости.
    9. Если желаете, установите порог допустимых промежутков, которые всё равно могут быть связаны с объектом. Выберите алгоритм отслеживания движущейся ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Авторегрессивное движение — самый часто используемый инструмент для отслеживания клеток, так как он отслеживает непрерывное движение на протяжении всего таймлапса.
      1. Максимальное расстояние и размер максимального зазора — это пользовательские значения, которые задают значимые точки, от которых поверхность может отклоняться. Установите максимальное расстояние зазора 0,96 мкм и максимальный размер зазора 3 (настройки по умолчанию).
    10. Аналогично тому, как поверхностные объекты фильтровались в шаге 5.1.7, фильтруются треки, не связанные с основной поверхностью. Это также корректируется гистограммой. Определите, где установить порог, найдя моменты, когда из фильтров удаляются небольшие спот-треки, которые длятся не более пяти таймфреймов.
    11. Далее, если хотите, настройте классификации. Например, классифицировать длину смещения между 0 - 1 мкм и 1+ мкм , чтобы определить небольшое движение процесса или значительно большое смещение процесса или ячеек.
    12. Наконец, наместите правильные метки на определённые события, используя классификации предыдущего шага.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг лучше всего использовать после создания пятен для постсинаптического сигнала.
  2. Спотовая классификация для PSD95
    1. Чтобы обнаружить целую отдельную микроглию, нажмите на синюю иконку поверхности в панели инструментов объектов . Выберите последние три опции в настройках алгоритма : Отслеживание поверхностей (со временем), Классифицировать поверхности и Статистика объект-объект. Нажмите на синюю кнопку воспроизведения , чтобы перейти к следующему шагу.
    2. Выберите исходный канал для синаптического маркера. Выключите слайсер и другие каналы, чтобы визуализировать только PSD95. Используйте кнопку ctrl и инструмент выбора указателя , чтобы оценить диаметр пункты xy.
      1. Выберите несколько ярких пунктов, которые сохраняются на протяжении всего таймлапса (размер варьируется от 0,6 мкм до 1,2 мкм).
      2. Отключите фоновый вычитание. Если изображение требует фонового вычитания, используйте инструмент фонового вычитания в разделе «Обработка изображения » перед обработкой таймлапса.
    3. Далее добавьте фильтр по качеству пятна. Перетащите гистограмму так, чтобы все пункты PSD95 были точно зафиксированы на протяжении всего таймлапса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Качество зависит от интенсивности центра точки9. Этот фильтр наиболее точно фиксирует фактический сигнал PSD95 по сравнению с количеством фильтров вокселей или диаметра.
    4. Далее удалите все пятна, возникающие шумом, на этапе редактирования. Переключайтесь между курсором куба и кругом, чтобы удалить отдельные или несколько точек соответственно, которые появляются только 1-2 промежутка времени из-за шума.
    5. Если желаете, установите порог допустимых промежутков, которые всё равно могут быть связаны с объектом. Выберите подходящий алгоритм отслеживания для синаптического маркера.
      1. Максимальное расстояние и максимальный размер зазора — это пользовательские значения, которые задают значительные точки, от которых точки могут отклоняться. Установите максимальное расстояние зазора 14,6 мкм и максимальный размер зазора 3 (настройки по умолчанию).
    6. Подобно тому, как точечные объекты фильтровались в шаге 5.2.3, фильтруются дорожки, не связанные с отдельными пунктами. Это также корректируется гистограммой. Чтобы определить, где установить порог, обратите внимание, когда удаляются дорожки малых объектов.
    7. Если хотите, настройте классификации. Например, различайте поглощённые, контактируемые или неконтактные пункты, используя классификацию Shortest Distance to Surface. Поглощается как любая пункта < 0 мкм внутри поверхности, контактирует на расстоянии от 0 до 0,5 мкм от поверхности или не контактирует с 0,5+ мкм от поверхности.
    8. Наконец, наместите правильные метки на определённые события, используя классификации предыдущего шага.
  3. Когда поверхности и пятна точно отражают интересующие микроглии и пункты, экспортируйте всю статистику с каждого объекта во вкладку статистики . Убедитесь, что подробная статистика будет извлечена, включая длину водоизмещения, скорость и засекреченные события контакта.
    1. Многие статистические данные, такие как площадь, объём, длина перемещения и скорость, являются результатами Imaris. Экспортировать длину и скорость смещения поверхности для определения динамики микроглии в эксперименте.
      1. Определим длину смещения как расстояние между начальным положением поверхности и конечным положением, измеряемое вμm 22.
      2. Определим скорость как мгновенную скорость поверхности от одного временного интервала к другому, измеренную в мкм/с 22.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Контактные события — это явление, описываемое авторами как целые постсинаптические пункты, разделяющие расстояние 0 мкм между отдельными микроглиями как минимум на протяжении пяти последовательных временных интервалов в течение таймлапса.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроглии сетчатки мышей CX3CR1-GFP были снимены с использованием описанного протокола. На момент инъекции мышей составляли от P30 до P60, и для экспрессии AAV-PSD95-RFP прошло как минимум 21 день. Репрезентативные изображения микроглии и их взаимодействия с пунктами PSD95 до и после анализа показаны на рисунке 2. Для индуцирования активации микроглии мы использовали модель глазной гипертензии, индуцированной лазером у мышей ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол позволяет визуализировать и отслеживать взаимодействие отдельных микроглий с постсинаптическими участками вдоль дендритов RGC. При нейродегенеративном заболевании, таком как глаукома, микроглии колокализируются с синапсами во внутреннем плексиформном слое (IPL) сетчатки. Роль микроглии в разборке синапсов недостаточно изучена. Однако микроглия может вносить вклад через несколько возможных механизмов, включая аномальное поглощение синапсов, пассивное очищение мусора из апопт...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PSD-95pTagRFP был подарком от Йоханнеса Хелла (плазмида Addgene #52671; RRID: Addgene_52671), а капсидная версия, 7 м8, была подарена Джоном Фланнери и Дэвидом Шаффером (плазмида Addgene #64839; RRID: Addgene_64839). Мы хотели бы поблагодарить Апарну Лаккараджу за разрешение использовать вращающийся дисковый микроскоп их лаборатории и Нильсу Ла Кунсу за рекомендации в области живой визуализации. Мы также хотели бы поблагодарить Фелис Данн, Аннику Балрадж и Луку Делла Сантину за полезные обсуждения и комментарии к этой рукописи. Мы благодарим Сулинга Вана за помощь в анализе данных по Имарису. Эта работа была профинансирована NIH-NEI EY028148 и EY034973 Y.O., премия ARVO David L. Epstein для Y.O., а NIH-NEI EY034973-S1 — C.F.. Это исследование также было частично поддержано совместным ресурсом UCSF Vision Core для NIH-NEI P30 EY002162/EY037668 и неограниченным грантом от Research to Prevent Blindness, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк. Рисунок 1 был создан biorender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Игла 25 калибраAlcon8065420920
26-секундный калибр 10 и микро; L ШприцГамильтон701RNWG
7м8Addgene64839http://n2t.net/addgene:64839
Многофункциональная проволока 304 из нержавеющей стали с погибанием и фиксациейСтэнфордские передовые материалыSS3368Стальная проволока для изготовления колец
Гексагидрат хлорида кальцияСигма-ОлдричC5080-500G
Микроскоп для рассеченияAmscopeДля вскрытия и установки сетчатки
Ножницы для вскрытияFST15024-10
D-(+)-глюкозаСигма-ОлдричG7528-250G
ЩипцыДюмон11252-21
HEPESСигма-ОлдричH3375-500G
Imaris 10.0.2Oxford InstrumentsПрограммное обеспечение для анализа
Конвертер файлов ImarisOxford Instruments
Loctite Super Glue Ultra Gel ControlЛоктайт1363589Клей для изготовления колец
Гексагидрат хлорида магнияСигма-ОлдричM9272-100G
Мембранная фильтрационная бумага MCE (13 мм)МиллипорHABG013000,45 и мю; m Размер пор
Микроэкологическая камераТокай ХитSTXG-TIZBX-SET
Инвертированный микроскоп Nikon Eclipse Ti2-ENikon
Элементы NISNikon
Мазь с офталамичным раствором неомицина и полимиксина B и бацитрацином цинком, USPБауш + Ломб24208-780-55
Кисть размера 00Amazon
Prism 8.0GraphPad
Пропаракаин гидрохлорид Офтальмологический раствор USP, 0,5%Сандоз61314-0016-01
Чашка Петри с покрытием PDL (35 мм)МатекP35GC-1.5-14-CNo 1.5 Coverslip
PSD95_pTagRFPAddgene52671http://n2t.net/addgene:52671
Хлорид калияСигма-ОлдричP9333-500G
Хлорид натрияСигма-ОлдричS7653-1KG
Монобазисный моногидрат натрия фосфатаСигма-ОлдричS9638-25G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, Y. K., Hengen, K. B., Turrigiano, G. G., Gjorgjieva, J. Homeostatic mechanisms regulate distinct aspects of cortical circuit dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (39), 24514-24525 (2020).
  2. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  3. Rosin, J. M., et al. Embryonic microglia interact with hypothalamic radial glia during development and upregulate the TAM receptors MERTK and AXL following an insult. Cell Rep. 34 (1), 108587(2021).
  4. Wang, X., Li, K., Guo, L., Liu, X., Guo, Y., Zhang, W. The influence of changes in microglia development on the plasticity of the developing visual cortex circuit in juvenile mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (4), 45(2025).
  5. Blume, Z. I., Lambert, J. M., Lovel, A. G., Mitchell, D. M. Microglia in the developing retina couple phagocytosis with the progression of apoptosis via P2RY12 signaling. Dev Dyn. 249 (6), 723-740 (2020).
  6. Brown, T. C., et al. Microglia are dispensable for experience-dependent refinement of mouse visual circuitry. Nat Neurosci. 27 (8), 1462-1467 (2024).
  7. Huang, Y., et al. Microglia use TAM receptors to detect and engulf amyloid β plaques. Nat Immunol. 22 (5), 586-594 (2021).
  8. Ding, X., et al. Loss of microglial SIRPα promotes synaptic pruning in preclinical models of neurodegeneration. Nat Commun. 12 (1), 2030(2021).
  9. He, J., et al. Microglia mediate synaptic material clearance at the early stage of rats with retinitis pigmentosa. Front Immunol. 10, 912(2019).
  10. Yu, A., Fang, C., Tan, L. X., Lakkaraju, A., Della Santina, L., Ou, Y. Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration. iScience. 28 (4), 112201(2025).
  11. Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
  12. Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: a field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  13. Yu, Z., Gutu, A., Kim, N., O'Shea, E. K. Synapse weakening-induced caspase-3 activity confers specificity to microglia-mediated synapse elimination. bioRxiv. , (2024).
  14. Miller, E. B., Zhang, P., Ching, K., Pugh, E. N., Burns, M. E. In vivo imaging reveals transient microglia recruitment and functional recovery of photoreceptor signaling after injury. Proc Natl Acad Sci USA. 116 (33), 16603-16612 (2019).
  15. Wahl, D. J., Ng, R., Ju, M. J., Jian, Y., Sarunic, M. V. Sensorless adaptive optics multimodal en-face small animal retinal imaging. Biomed Opt Express. 10 (1), 252(2019).
  16. Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective vulnerability of specific retinal ganglion cell types and synapses after transient ocular hypertension. J Neurosci. 36 (35), 9240-9252 (2016).
  17. Della Santina, L., et al. Disassembly and rewiring of a mature converging excitatory circuit following injury. Cell Rep. 36 (5), 109463(2021).
  18. Ramírez, A. I., et al. Microglial changes in the early aging stage in a healthy retina and an experimental glaucoma model. Prog Brain Res. 256, 125-149 (2020).
  19. de Hoz, R., et al. Bilateral early activation of retinal microglial cells in a mouse model of unilateral laser-induced experimental ocular hypertension. Exp Eye Res. 171, 12-29 (2018).
  20. Soliño, M., Yu, A., Della Santina, L., Ou, Y. Large-scale survey of excitatory synapses reveals sublamina-specific and asymmetric synapse disassembly in a neurodegenerative circuit. iScience. 26 (8), 107262(2023).
  21. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house AAV vector production based on chloroform extraction. Curr Protoc Neurosci. 93 (1), e103(2020).
  22. Imaris reference manual. , https://lims.gzzoc.com/files/instrument/20240722/2024072212391299299_ImarisManual.pdf (2024).
  23. Joseph, A., Power, D., Schallek, J. Imaging the dynamics of individual processes of microglia in the living retina in vivo. Biomed Opt Express. 12 (10), 6157(2021).
  24. Wu, W., et al. In vivo imaging in mouse spinal cord reveals that microglia prevent degeneration of injured axons. Nat Commun. 15 (1), 8837(2024).
  25. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microglia DynamicsSynaptic PruningRetinal ExplantSpinning Disk MicroscopyMicroglia MotilityPSD95 LabelingTime Lapse ImagingSynapse InteractionNeuroinflammationSurface Rendering

Related Articles