Создание тканевых микрочипов на основе клея для исследования опухолей и заболеваний

Summary

Этот протокол описывает недорогое производство и эффективный метод валидации для создания ТМА на основе клея, обеспечивая удобную платформу для патологической диагностики для исследования опухолей и заболеваний.

Abstract

Технология тканевых микрочипов (TMA) — это высокопроизводительная платформа для одновременного обнаружения и анализа нескольких образцов тканей, что способствует эффективному исследованию биомаркеров опухолей и заболеваний. Тем не менее, традиционные методы построения ТМА часто сталкиваются с ограничениями, такими как сложность эксплуатации, трудоемкие процедуры и переменная точность. Для преодоления этих проблем был разработан метод конструирования ТМА на основе клея, обеспечивающий улучшенную фиксацию ядра ткани и повышенную структурную стабильность. Систематическая валидация включала гистологическую оценку (окрашивание HE), иммуногистохимическое профилирование белков-мишеней и анализ флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Результаты показали, что метод на основе клея поддерживает превосходную целостность среза, улучшенное соотношение сигнал/шум и обеспечивает постоянную воспроизводимость от партии к партии. Несмотря на то, что этот подход ограничен ручным управлением, он представляет собой надежный и экономичный вариант для производства TMA с умеренной производительностью. Этот метод особенно подходит для исследовательских сред, в которых гибкость и разнообразие образцов ценятся по сравнению с крупномасштабной автоматизацией, расширяя полезность ТМА в академических и диагностических условиях.

Introduction

Тканевый микрочип (ТМА) — это высокопроизводительный метод анализа образцов тканей ^1,2,3. Получают множественные ядра донорской ткани и переносят донорские парафиновые блоки в блоки тканей реципиента для одновременного дифференциального и сравнительного молекулярного анализа при теоретически одинаковых условиях производительности ^2,4. Классическим способом создания тканевого микрочипа (ТМА) является использование дырокола для извлечения ядер ткани из образца ткани донора и их последовательного расположения в парафиновом блоке реципиента. Этот метод подходит для донорских парафиновых блоков одинаковой глубины и позволяет проводить эффективный анализ нескольких образцов на одном срезе, значительно повышая эффективность исследования и согласованность данных ^5,6,7. Тем не менее, этот метод все еще имеет определенные ограничения, в том числе неадекватное обращение с тканевым ядром в процессе встраивания, что может привести к неравномерному окрашиванию образцов при последующих анализах⁸.

Вторым методом построения ТМА является ленточный метод ^9,10. Этот метод инвертирует процесс строительства путем литья блока вокруг перевернутых вертикальных стержней, которые после завершения находятся на одном уровне с верхней частью TMA, независимо от длины стержня ^11,12. Однако этот метод требует обеспечения правильного размещения тканевого ядра и эффективности ленты, а также ограничивает количество образцов, которые могут быть обработаны по сравнению с традиционными методами.

В данном исследовании предлагается инновационный клеевой метод конструирования ТМА, направленный на решение таких проблем, как недостаточная стабильность тканевых ядер и сложная операция, которые существуют при традиционных методах¹³. Этот метод использует клей для точного фиксации нескольких тканевых ядер вместе и имеет преимущества простоты в эксплуатации и высокой прочности образца. По сравнению с традиционными методами секционирования или ленточного метода, метод клея может увеличить коэффициент удержания тканевых стержней и снизить затраты. Этот метод применим к клиническим исследованиям со средним объемом выборки и особенно подходит для дизайнов исследований, требующих гибкой корректировки плана эксперимента. Однако следует отметить, что вычислительная мощность этого метода не отвечает требованиям сверхвысокой пропускной способности⁹. Между тем, в процессе фактического применения должен быть установлен полный набор стандартизированных рабочих норм и систем контроля качества. Операторы должны проходить систематическое обучение и профессиональную оценку, чтобы обеспечить стандартизацию технических операций и повторяемость результатов. Всесторонний анализ показывает, что эта технология обеспечивает хороший баланс между эксплуатационной гибкостью, экономичностью и технической надежностью и особенно подходит для исследовательских сценариев, где ресурсы ограничены, но контроль качества все еще должен быть гарантирован.

Protocol

Все донорские блоки были получены из архивных патологических образцов, собранных в период с 2016 по 2018 год в Аффилированной народной больнице Хуайань No1 Нанкинского медицинского университета. Образцы были обезличены перед использованием и обработаны в соответствии с утвержденными протоколами (комитет по этике Аффилированной народной больницы Хуайань No1 Нанкинского медицинского университета, KY-2024-250-01).

1. Оценка и маркировка донорской ткани

1. Выбирайте тканевые блоки толщиной ≥5 мм и площадью ≥15 мм × 15 мм. Обеспечьте запас прочности 2 мм по краям и исключите участки с некрозом, кровоизлиянием или кальцинозом для поддержания целостности тканей.
2. Идентификация и маркировка целевой зоны
   1. Оцените окрашенные H&E срезы с помощью оптического микроскопа. Определите местоположение целевой области с помощью сканирования с низким энергопотреблением, а затем переключитесь на высокомощное сканирование, чтобы подтвердить морфологические характеристики клеток. Отметьте на слайдах границы целевой области.
   2. Сопоставьте координаты выделенной области с поверхностью парафинового блока, чтобы завершить преобразование разметки.

2. Экстракция ядра ткани

1. Подготовка к пункции и предварительная обработка образца
   1. Выберите ручной дырокол диаметром 2 мм и убедитесь в гладкости его режущей кромки и простоте эксплуатации.
   2. Поместите донорский парафиновый блок на холодную платформу при температуре 4 °C на 15 минут.
2. Выровняйте иглу вертикально по отмеченной точке и приложите постоянное вращательное давление, чтобы достичь предельной глубины. Избегайте наклона или вибрации во время процесса⁷ (рисунок 1A).
3. Осторожно поверните иглу против часовой стрелки (≤2 оборота/с), чтобы извлечь ее. Осторожно извлеките тканевый стержень из иглы и перенесите его в индивидуальную лунку предварительно охлажденной 96-луночной пластины. Запишите расположение керна в каждой лунке (рисунок 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если нижняя часть тканевого ядра неровная, разровняйте его лезвием. После обрезки повторно проверьте целостность.
4. Предварительно запишите все номера доноров и соответствующие положения лунок планшета ELISA (A1-H12) в регистрационной форме. Во время операции перепроверяйте, чтобы убедиться в строгом соответствии между номерами доноров и позициями скважин.
5. Немедленно осмотрите ядра на целостность. Отбраковывайте сердцевины, которые сломаны, согнуты или имеют отклонения диаметра >0,1 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте постоянство длины сердечника (коэффициент вариации, CV ≤5%) и избегайте царапин на поверхности или артефактов сжатия.

3. Фиксация ядра ткани

1. Используйте водонепроницаемый маркер, чтобы нарисовать сетку непосредственно на поверхности формы, обеспечивая четкие и равномерно расположенные линии.
   1. Используйте стандартную форму с эффективной площадью дна 3,0 см × 2,5 см и резервируйте площадь границы заготовки 1,5 мм с каждой стороны.
   2. Тонким точечным водостойким маркером толщиной 0,5 мм нарисуйте девять параллельных линий на равном расстоянии по горизонтали и вертикали, образуя сетку позиционирования 9 × 9 (всего 81 точка пересечения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем начать, очистите внутреннюю часть формы ватным тампоном, смоченным ксилолом, чтобы удалить остатки парафина, которые могут вызвать расслоение. В процессе рисования используйте стальную линейку, чтобы обеспечить равномерную толщину линий и четко различимые точки пересечения.
2. С помощью пипетки наберите 5 мкл клея и аккуратно поместите его в центр предварительно помеченного предметного стекла, чтобы образовалась одна капля. Сразу же с помощью тонкого пинцета вертикально захватите сердцевину ткани под углом 90° и медленно вдавите ее вертикально в каплю клея (рис. 1C).
3. Вставьте стержни в соответствующие пересечения сетки на форме с помощью пинцета. Приложите мягкое давление в течение 5 с, чтобы обеспечить надежную адгезию (Рисунок 1D).
4. Если тканевый стержень сместился, выполните тонкую настройку и немедленно установите его на место с помощью тонкого пинцета, прежде чем клей застынет (в течение 30 секунд). Отбраковывайте затвердевшие, смещенные стержни, чтобы сохранить качество подготовки и сохранить ценные образцы в максимальной степени.

4. Кассетная установка и заделка парафина

1. Вертикально расположите тканевую кассету над стальной формой, обеспечивая контакт с кончиками стержней без сжатия. Закрепите кассету с помощью магнитных зажимов по всем четырем углам, а швы заклейте расплавленным парафином.
2. Заваривайте расплавленный парафин под углом 45° зигзагообразно, поддерживая расход 1 мл/с. Убедитесь, что уровень парафина превышает кончики сердцевины на 2 мм (Рисунок 1E).
3. Быстро охладите блок на холодной пластине при температуре 4 °C в течение 5 минут, чтобы сформировать жесткий поддерживающий слой. Перенесите блок в среду с температурой 22 °C на 20 минут, чтобы снизить внутреннее напряжение. Наконец, используйте термофен при температуре 40 °C, чтобы мягко сгладить поверхность и устранить следы усадки.
4. Слегка нагрейте парафин, чтобы размягчить его, затем аккуратно разрежьте по краям кассеты, чтобы ослабить блок. Осторожно поднимите кассету и удалите остатки парафина, чтобы обеспечить целостность ядер тканей (Рисунок 1F).

Results

В настоящем исследовании высококачественные тканевые микрочипы были сконструированы с использованием клеевого метода. Чтобы проверить эффективность метода, был проведен ряд экспериментов, включая окрашивание H&E, иммуногистохимическое обнаружение специфических белков и анализ флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Важнейшим компонентом процесса конструирования является наличие точек тканевого ядра в ожидаемых положениях и на расстоянии друг от друга, которое оценивается с помощью визуального осмотра. Ви...

Discussion

Являясь инновационным методом создания тканевых микрочипов (ТМА), метод клея показал значительные преимущества благодаря простоте строительных процедур и экономичности. По сравнению с традиционным методом игольчатой матрицы, который опирается на сложные инструменты^14,15, метод клея позволяет фиксировать образец путем склеивания, что может быть выполнено только с помощью основных инструментов, что значительно снижает технический п...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Набор для обнаружения рака молочной железы HER2	Anbiping	2502001	Набор для обнаружения рака молочной железы HER2 Антитело
CDHR4 Abcam		ab166914	CDHR4 антитело
CDK1 антитело	Abcam	ab265590	CDK1 антитело
CRTAC1 антитело	Abcam	ab254691	CRTAC1 антитело
DNASE1L3 антитело	Abcam	ab203669	DNASE1L3
Машина для встраивания	P.S.J MEDICAL	BM450A	Машина для встраивания
Полностью автоматический дегидратор тканей	Leica Biosystems	ASP3005	Полностью автоматический дегидратор тканей
Предметные стекла для микроскопа	Citotest	250124A1	Предметные стекла для микроскопа
Клей	TIZO	200	Клей
GPR146 антитела	Abcam	ab117104	Антитело GPR146 Антитело
IGSF10 Антитело	Abcam	ab197671	Антитело IGSF10
Антитело ITIH1 Антитело	Abcam	ab233032	Антитело ITIH1
Низкопрофильные лезвия для микротома	Thermo Fisher	3052835	Низкопрофильные лезвия для микротома
Маркерная ручка	Deli	SK109	Маркерная ручка
Microtome	Leica Biosystems	HistoCore BIOCUT	Микротом
Парафин	воск Solarbio	YA0012	Парафин
Антитело SMAD9 Abcam		ab262940	Антитело SMAD9
Антитело TARBP1 Антитело	Abcam	ab15896	Антитело TARBP1
ZCCHC24 антитело	Abcam	ab88756	ZCCHC24 антитело