Проточная цитометрия и анализ одиночных клеток для характеристики активации микроглии в раннем постнатальном развитии мозга мышей

Summary

Этот протокол сочетает в себе проточную цитометрию и секвенирование РНК одиночных клеток для выделения и характеристики состояний микроглиальных клеток в мозжечке раннего постнатального мозга мышей. В нем используется ферментативная диссоциация, центрифугирование по методу Перколля и иммуноокрашивание для выявления гетерогенности микроглии и улучшения понимания ее роли в развитии мозжечка и заболеваниях.

Abstract

Микроглия, резидентные иммунные клетки мозга, демонстрируют региональные и контекстно-зависимые транскрипционные профили во время развития и заболевания. В этом протоколе представлены два взаимодополняющих метода изучения микроглиальных популяций в мозжечковой ткани мыши: проточная цитометрия и секвенирование РНК одиночных клеток.

В качестве первого используемого метода протокол на основе проточной цитометрии оптимизирован для раннего постнатального развития мозга, обеспечивая надежную изоляцию клеток и согласованность в экспериментальных условиях. Он начинается с диссоциации тканей с помощью ферментативного расщепления, за которым следует удаление миелина с помощью центрифугирования с градиентом плотности Перколла для получения высококачественной суспензии нервных клеток, а также стратегия гейтирования, основанная на экспрессии CD45 и CD11b. Окрашивание живых/мертвых обеспечивает жизнеспособность клеток, а флюорохром-конъюгированные антитела используются для профилирования экспрессии выбранных поверхностных маркеров на микроглии. Компенсационный контроль выполняется с использованием латексных шариков с валидированными стратегиями стробирования с использованием контроля флуоресценции минус один (FMO).

Второй метод включает в себя секвенирование РНК отдельных клеток с использованием 10X Genomics с использованием тех же этапов выделения, что позволяет транскриптомно профилировать микроглию в разных условиях. Микроглиальные кластеры идентифицируются с помощью анализа экспрессии генов, а между экспериментальными группами проводится дифференциальный анализ экспрессии. Случайный классификатор леса применяется исключительно для различения мужских и женских образцов при мультиплексировании.

Вместе эти воспроизводимые и адаптируемые протоколы обеспечивают надежную основу для исследования микроглиального разнообразия в мозжечке на ранних этапах развития мозга и его потенциальных изменений после экспериментальных возмущений.

Introduction

Ранний постнатальный период является критическим этапом для развития мозга, характеризующимся сложными клеточными и молекулярными процессами, которые закладывают основу когнитивных, эмоциональных и поведенческих функций¹. Тем не менее, этот период также отмечен уязвимостью, поскольку сбои могут изменить траектории развития нервной системы и привести к долгосрочным неврологическим или психическим расстройствам. Микроглии, резидентные иммунные клетки мозга, играют центральную роль в формировании развивающегося мозга посредством синаптической обрезки, фагоцитоза, иммунного надзора и реакции на воздействие окружающей ^среды. Эти клетки демонстрируют замечательную пластичность, принимая транскрипционные профили, которые варьируются в зависимости от области мозга, стадии развития и патологического контекста ^4,5.

Точный анализ активации микроглии в развивающемся мозге требует надежных и воспроизводимых методологий, способных анализировать их динамические фенотипы в контексте незрелых тканей мозга. Проточная цитометрия является надежным решением, позволяющим с высокой пропускной способностью характеризовать клеточные популяции и экспрессию маркеров⁶. Тем не менее, его применение в изучении микроглии из раннего постнатального мозга технически сложно из-за деликатной природы ткани и необходимости эффективных протоколов изоляции и обогащения ^{клеток.}

Представленный здесь протокол сочетает в себе проточную цитометрию и секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq) для выделения и характеристики микроглии из раннего постнатального мозга мышей, уделяя особое внимание мозжечку с постнатального дня 3 (P3) до постнатального дня 30 (P30)⁹, области и стадии развития, для которых подробные методологические ссылки остаются ограниченными.

Этот рабочий процесс включает в себя ферментативную диссоциацию, центрифугирование с градиентом плотности для удаления мусора и обогащения клеток, а также иммуноокрашивание с использованием панели внеклеточных и внутриклеточных маркеров. Чтобы охарактеризовать разнообразие микроглии, используется ряд поверхностных и внутриклеточных маркеров^10,11. Вместо присвоения фиксированных меток (воспалительных или репаративных) протокол определяет субпопуляции на основе профилей экспрессии дискретных маркеров. Например, микроглии, экспрессирующие CD80, CD86 и iNOS, CD206 и Arg1, CD86 и CD64 или CD163 и CD206, идентифицируются и анализируются как молекулярно отличные подмножества. Эти маркеры отражают различные активированные состояния микроглии ^10,11 и представлены в виде профилей экспрессии.

Эта стратегия многопараметрического гейтирования позволяет точно идентифицировать субпопуляции микроглии на основе экспрессии поверхностных маркеров, предлагая оптимизированную основу для анализа иммунной гетерогенности во время постнатального развития мозга. Чтобы расширить фенотипическое профилирование и выявить транскрипционное разнообразие, секвенирование РНК отдельных клеток проводится после выделения клеток. Это исследование устанавливает последовательный и масштабируемый рабочий процесс для улучшения понимания процессов развития нервной системы и долгосрочного влияния активации микроглии. Интегрируя оптимизированную проточную цитометрию и scRNA-seq в структуру, учитывающую особенности развития и региона, этот протокол служит мощным инструментом для изучения биологии микроглии в раннем возрасте и ее влияния на исходы развития нервной системы.

Protocol

Все процедуры на животных были рассмотрены и одобрены этическим комитетом Исследовательского центра Сент-Жюстин CHU и соответствуют рекомендациям и политикам Исследовательского центра Сент-Жюстин и Монреальского университета (Монреаль, Квебек, Канада).

1. Выделение клеток из головного мозга

1. После процедур анестезии/эвтаназии быстро удалите весь мозг из полости черепа и поместите его в пробирку объемом 15 мл, содержащую среду для культивирования микроглиальных клеток (см. Таблицу материалов). Держите трубку на льду. При необходимости повторите ту же процедуру для дополнительных мышей.
   Все мыши, использованные в этом исследовании, были получены из собственных племенных колоний в лаборатории доктора Трембле. Экспериментальные мыши были получены путем скрещивания мышей B6.129-Cx3Cr1^{CreERT2-EYFP/WT} с мышами B6-Rosa26^iDTR/WT , которые первоначально были получены из лабораторий Джексона. Эта стратегия селекции позволила получить потомство, гетерозиготное по аллелю IDTR , что позволило условно истощать клетки, экспрессирующие Cx3Cr1 (в первую очередь микроглию) с помощью тамоксифен-индуцируемой системы Cre-loxP . Перед сбором тканей мышам вводили анестезию с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина (150 мкг/г) и ксилазина (10 мкг/г). Эвтаназия проводилась путем обезглавливания под глубокой анестезией, в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию животных в учреждении.
2. Либо сохраните весь мозг, либо приступайте к вскрытию отдельных областей, если хотите. Проводите диссекцию в небольшой чашке Петри, содержащей микроглиальную среду для культивирования клеток (см. Таблицу материалов) на льду для поддержания жизнеспособности клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был валидирован для всего мозга и мозжечка от P1 до P30.
3. Извлеките микроглиальную клеточную культуру и тонко разрежьте мозговую ткань с помощью скальпеля в чашке Петри.
4. Для ферментативного разложения перенесите гомогенизированную ткань в пробирки объемом 5 мл. Добавьте 2 мл HBSS (1x) с добавлением 2 мг/мл коллагеназы D и 14 мкг/мл DNазы I (см. Таблицу 1). Заклейте крышки трубок парапленкой. Инкубируйте пробирки на водяной бане при температуре 37 °C в течение 15 минут, встряхивая трубку каждые 5 минут. Чтобы остановить пищеварение, поместите трубки на лед.
5. Пропустите гомогенат через фильтр с металлической сеткой 140 мкм (см. Таблицу материалов) для удаления крупного мусора. Используйте стеклянный пестик, чтобы диссоциировать клетки.
6. Несколько раз промойте фильтр средой для культивирования микроглиальных клеток (3 мл на одну промывку).
7. Соберите фильтрат с помощью пипетки объемом 10 мл и переложите его в пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте раствор при 500 г в течение 7 мин при 4 °C.
8. Выбросьте надосадочную жидкость, осторожно перевернув трубку. Снова подвесьте гранулу, аккуратно соскребая на решетке.
9. Добавьте 10 мл 37% раствора коллоидной среды на основе диоксида кремния (см. Таблицу 1) для удаления миелина и мусора. Центрифугируйте раствор при плотности 500 г в течение 10 мин при 4 °C с минимальным тормозным усилием.
10. Аспирируйте слой миелина в верхней части раствора с помощью пипетки объемом 10 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывная аспирация предотвращает повторное смешивание миелина с раствором.
11. Промойте ячейки, добавив 10 мл HBSS (1x) и центрифугируйте при 500 × г в течение 7 минут при 4 °C.
12. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу, осторожно соскоблив с помощью штатива, затем добавьте 10 мл буфера для сортировки флуоресцентных активированных клеток (FACS) (см. Таблицу 1). Центрифугируйте раствор при плотности 500 г в течение 10 мин при 4 °C.
13. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте последнюю гранулу и сохраните клетки. Теперь выделенные клетки готовы к окрашиванию проточной цитометрией или секвенированию РНК отдельных клеток.
14. Для выделения секвенирования РНК одиночных клеток подсчитайте клетки под микроскопом с использованием настольных стабильных флуоресцентных реагентов (см. Таблицу материалов), чтобы различать живые и мертвые ядросодержащие клетки, а также трипановый синий (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что элементы находятся в отличном состоянии, с жизнеспособностью до 90% и достигают концентрации 1000 клеток/мкл). Дальнейшие действия описаны в разделе 9.1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите трубки на льду на протяжении всего протокола. Все этапы центрифугирования должны выполняться при 4 °C с максимальным тормозом, за исключением шага Перколла, где указан минимальный тормоз. Для достижения наилучших результатов выполняйте весь протокол в один и тот же день. Для протокола секвенирования РНК одиночных клеток отфильтруйте все растворы, используемые для выделения, на шаге 1.11 используйте HBSS (1x) для второй промывки, а на шаге 1.12 сохраните 70-100 μл клеточного раствора.

2. Протокол внеклеточного окрашивания методом проточной цитометрии

1. Перенесите все ячейки в 96-луночный планшет с коническим дном (см. Таблицу материалов). Центрифугируйте планшет при 500 г в течение 5 мин при 4 °C.
2. Быстро переверните пластину, чтобы удалить надосадочную жидкость одним движением.
3. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 25 мкл блокирующего раствора (см. таблицу 1). Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре (RT).
4. Для приготовления смеси для окрашивания внеклеточных антител (см. таблицу 2) центрифужную обработку запасов антител в концентрации составляет 10000 × г для удаления потенциальных агрегатов. Не нарушая гранулу, осторожно отасуньте нужный объем из надосадочной жидкости для приготовления красящей смеси и отрегулируйте объем до 25 мкл с помощью буфера FACS.
5. Добавьте 25 мкл смеси внеклеточных антител в каждую лунку. Инкубировать в течение 20 минут при RT.
   Примечание: Перед экспериментальным использованием все антитела титровали на мозжечковых (или мозговых) одиночных клеточных суспензиях для определения оптимальной рабочей концентрации. Титрование проводили путем последовательного разведения для получения кривой насыщения, а для стадирования сигнала выбирали разбавление, соответствующее плато сигнала с минимальным фоном.
6. Не перемешивая, добавьте в лунки 150 мкл буфера FACS. Центрифугируйте планшет при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C. Переверните пластину, чтобы удалить надосадочную жидкость одним движением.
7. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл буфера FACS. Центрифугируйте планшет при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C. Переверните пластину, чтобы удалить надосадочную жидкость одним движением. Повторите промывку еще раз, используя 200 мкл буфера FACS в тех же условиях.

3. Внутриклеточное окрашивание

1. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл буфера сапонин-параформальдегид (ПЖК) (см. Таблицу 1) для фиксации и проникновения клеток. Инкубировать в течение 10 минут при RT, в защищенном от света месте.
2. Не перемешивая, добавьте 100 мкл сапонинового буфера (см. табл. 1). Центрифугируйте планшет при 500 × г в течение 6 мин при 4 °C. Переверните пластину, чтобы удалить надосадочную жидкость одним движением.
3. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл сапонинового буфера. Подготовьте компенсационные регуляторы, добавив 20 μL гранул (см. Таблицу материалов) в 11 пустых лунок. Центрифугируйте планшет при 500 × г в течение 6 мин при 4 °C. Переверните пластину, чтобы удалить надосадочную жидкость одним движением.
4. Для приготовления смеси для окрашивания внутриклеточных антител (см. Таблицу 3) центрифужируют запасы антител в количестве 10000 × г для удаления потенциальных агрегатов. Не тревожа гранулу, осторожно отасуньте нужный объем из надосадочной жидкости для приготовления красящей смеси и отрегулируйте объем до 50 мкл с помощью буфера из сапонина.
5. Ресуспендируйте гранулу в 50 мкл смеси внутриклеточных антител (см. табл. 3). Добавьте по 1 мкл каждого антитела в лунки для шариков. Инкубировать в течение 30 минут при RT.
6. Не смешивая, добавьте 150 мкл сапонинового буфера в каждую лунку для образца клетки и добавьте 100 мкл буфера FACS в каждую лунку, содержащую компенсационные регуляторы для промывки шариков. Центрифугируйте планшет при 500 × г в течение 6 минут при 4 °C. Переверните пластину, чтобы удалить надосадочную жидкость одним движением.
7. Повторно суспендируйте клеточную таблетку в 200 мкл сапонинового буфера и повторно суспендируйте контрольные элементы в 200 мкл буфера FACS. Центрифугируйте планшет при 500 × г в течение 6 мин при 4 °C. Переверните пластину, чтобы удалить надосадочную жидкость одним движением. Повторите промывку еще раз, используя 200 μл буфера из сапонина в тех же условиях.
8. Ресуспендируйте элементы и компенсирующие элементы в 200 мкл буфера FACS. Перенесите суспензию в пробирку FACS и храните при температуре 4 °C до получения данных проточной цитометрии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все этапы с использованием светочувствительных реагентов проводятся в условиях минимальной освещенности. Одна лунка бусин не содержит антител, что соответствует неокрашенной бусинной трубке.

4. Получение данных проточной цитометрии

1. Включите проточный цитометр, а затем компьютер.
2. Откройте программное обеспечение проточного цитометра и запустите гидродинамику, выбрав «Запустить » на вкладке цитометра.
3. Создайте новую папку эксперимента, нажав кнопку Новая папка и назначив ей имя. Затем нажмите кнопку Новый эксперимент , чтобы назвать эксперимент, и выберите Новая пробирка , чтобы добавить образец и пробирку.

5. Настройка элементов управления компенсацией

1. Подготовьте компенсационные бусины с одним пятном для каждого флуорохрома, используемого в панели, вместе с неокрашенным регулятором.
2. Нагрузите компенсационные пробирки на цитометр. Установите напряжение прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) примерно на 250.
3. Отрегулируйте напряжения для каждого флуоресцентного канала таким образом, чтобы отрицательное население находилось в первой декаде оси.
4. Регистрируйтесь не менее чем в 5 000 событий на канале.
5. Используйте матрицу компенсации для корректировки спектрального перекрытия до тех пор, пока все положительные пики не будут четко отделены от отрицательной популяции и центрированы выше 10⁴ на соответствующей оси.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль компенсации должен быть выполнен для каждого эксперимента, так как настройки цитометра или характеристики флуорохрома могут существенно повлиять на спектральное перекрытие. Несмотря на то, что в некоторых случаях в тканях головного мозга рекомендуется использовать клеточный контроль компенсации, в этом протоколе использовались шарики захвата антител из-за меньшего количества микроглии, получаемой из мозжечка мыши P3, что ограничивает возможность клеточной компенсации. Флуоресценция антител была первоначально проверена на клетках мозга и оказалась сопоставимой с сигналами на основе гранул. Включите неокрашенную клеточную суспензию мозга во время первоначальной оптимизации панели, чтобы оценить автофлуоресценцию тканей и установить исходные уровни сигнала. Этот контроль необходим для правильной настройки отрицательных популяций в каждом флуоресцентном канале.

6. Подготовка и приобретение средств управления FMO

1. Для каждого ключевого маркера подготовьте контроль флуоресценции минус один (FMO), который включает все антитела, кроме тестируемого.
2. Запустите элементы управления FMO с теми же настройками сбора данных, что и для полностью окрашенных образцов.
3. Используйте графики FMO для определения пороговых значений стробирования для низких или перекрывающихся популяций и для различения истинно положительных результатов от фонового шума.
   ПРИМЕЧАНИЕ: FMO-контроль должен быть выполнен во время первоначальной оптимизации панели для определения точных и надежных границ стробирования, особенно в тканях с высокой аутофлуоресценцией, таких как мозг. При изменении панели окрашивания, настроек прибора или условий эксперимента необходимо повторить управление FMO. Для последующих экспериментов с использованием тех же проверенных настроек панели и цитометра ранее определенные пороговые значения стробирования могут быть повторно использованы для обеспечения согласованности между биологическими репликами.

7. Подготовка и получение элементов управления изотипом

1. Окрашивают контрольный образец контрольными антителами изотипа, подобранными по флуорохрому и концентрации к исследуемым антителам.
2. Получайте данные с использованием тех же настроек цитометра.
3. Используйте контроль изотипа только для оценки потенциального неспецифического связывания, особенно в случае внутриклеточных маркеров или плохо охарактеризованных антител. Не используйте контроль изотипа для гейтинга, так как они не отражают ту же кинетику связывания, что и специфические антитела.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль изотипов не подходит для гейтирования и не должен использоваться для определения популяций. Их использование является необязательным и должно быть зарезервировано для подтверждения специфичности антител в отдельных случаях.

8. Стратегия гейтирования методом проточной цитометрии

1. Создайте следующие точечные диаграммы для последовательного стробирования:
   FSC-A в сравнении с SSC-A для исключения мусора
   FSC-A в сравнении с FSC-H для выбора синглетов.
   FSC-A в сравнении с амцианом (краситель для обеспечения жизнеспособности) для ворот живых клеток.
2. Определите микроглию как CD11b⁺CD45⁺ с помощью CD11b (FITC) и CD45 (AF700).
   Примечание: Из-за стадии развития (P3-P15), воспалительного контекста и ферментативного переваривания TMEM119 и P2RY12 не были надежными для четкого отделения микроглии от других миелоидных популяций с помощью проточной цитометрии. Поэтому стратегия гейтирования CD11b⁺CD45⁺ , ранее проверенная в постнатальном мозге, была использована для идентификации популяций микроглии при минимизации загрязнения. В контрольных условиях типичный выход колеблется от 30 000 до 200 000 микроглиальных клеток на весь мозг от P3 до P15. Для экспериментов, сосредоточенных конкретно на мозжечке, средний выход составляет примерно 5000 микроглиальных клеток на мозг.
3. Используйте элементы управления FMO для определения пороговых значений стробирования для маркеров активации.
4. Идентификация субпопуляций микроглии на основе экспрессии иммунозависимых маркеров:
   CD80⁺ (Супер Яркий 436)
   CD86⁺ (ПЭ)
   iNOS⁺ (PE-eFluor 610)
5. Далее охарактеризовать подмножества микроглии с помощью комбинаций экспрессии маркеров:
   CD206⁺ (APC)^{затем Arg1+} (PE-Cy7)
   CD86⁺ (PE)^{затем CD64+} (PerCP-eFluor 710)
   CD163⁺ (Super Bright 600)^{затем CD206+} (APC)
   Комбинации маркеров используются для описания молекулярной гетерогенности в микроглиальной популяции. Эти подмножества представлены на основе только экспрессии маркеров и им не отведены конкретные функциональные роли, в соответствии с текущими стандартами, признающими микроглиальную пластичность и контекстно-зависимые фенотипы.
6. Загрузить экспериментальный образец. Установите FSC на 300, а SSC на 200. Используйте низкую скорость потока и записывайте нужное количество событий.
7. После получения информации промойте цитометр и экспортируйте данные как . FSC файлы для анализа.
8. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения проточного цитометра.

9. Образец секвенирования РНК одиночных клеток

1. Используя тот же протокол выделения клеток, который описан для проточной цитометрии (см. шаг 1.14), ресуспендируйте диссоциированные клетки в буфере FACS. Используйте буфер FACS в пробирках для сбора и на всех последующих этапах работы для поддержания стабильности клеток.
2. Не выполняйте флуоресцентно-активируемую сортировку клеток (FACS), если цель состоит в том, чтобы захватить все типы клеток из области мозга. Однако, если эксперимент требует обогащения микроглии, включите этап сортировки FACS перед секвенированием.
3. Немедленно оцените жизнеспособность клеток с помощью стабильных на столе флуоресцентных красителей для обеспечения жизнеспособности и Trypan Blue (см. Таблицу материалов). Подсчитайте клетки под микроскопом с помощью гемоцитометра (см. Таблицу материалов).
4. Убедитесь, что клеточная суспензия демонстрирует жизнеспособность не менее 90%, и отрегулируйте до конечной концентрации приблизительно 1000 клеток/мкл, прежде чем приступать к секвенированию РНК одиночных клеток.
5. Держите все образцы на льду и обрабатывайте сразу после диссоциации, чтобы свести к минимуму клеточный стресс и транскрипционные изменения.
6. Мультиплексируйте образцы попарно, следуя инструкциям производителя.
   Примечание: Один самец и одна самка из одной экспериментальной группы были объединены для снижения затрат на эксперимент.
7. Подготовьте библиотеки scRNAseq (см. Таблицу материалов) и следуйте рекомендациям производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка библиотеки была выполнена Платформой геномики Института исследований в области иммунологии и рака (IRIC) Монреальского университета.
8. Секвенирование библиотек scRNA-seq с использованием системы секвенирования на среднюю глубину 3200 млн прочтений на полосу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование проводилось в Genome Quebec в Монреале.

10. Анализ секвенирования РНК одиночных клеток

1. Выполняйте анализ количества уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) с помощью программного обеспечения Cell Ranger от 10X Genomics (v8.0.0) с референсным геномом мыши GRCm39 2024-A. Используйте пакет Seurat R (v5.1) для последующего анализа.
2. Проводите контроль качества, исключая клетки с митохондриальной РНК, превышающей, например, 30% от общего количества РНК (рисунок 1А), или более строгий порог, выбранный для удаления клеток с потенциальным стрессом. Отфильтруйте клетки низкого качества с помощью log10GenesPerUMI больше 0,75 (рис. 1B), количества уникальных признаков («nUMI») ниже 500 и количества генов, обнаруженных на клетку («nGene») более 300 (рис. 1C). Далее удалите капли с помощью пакета "scDblFinder" в R. Теперь, когда график корреляции nUMI и nGene показывает пороговые значения, эффект фильтрации должен быть виден (рисунок 1D).
3. Смягчите пакетные эффекты, идентифицируя 2000 высоковариабельных генов на образец с помощью функции SelectIntegrationFeatures от Seurat.
4. Интегрируйте наборы данных с помощью канонического корреляционного анализа (CCA) и выполняйте анализ главных компонент (PCA) для снижения размерности. Используйте функцию RunPCA с 50 главными компонентами (ПК), масштабируя данные и регрессируя нежелательные источники вариаций (например, митохондриальное содержимое). Оцените количество удержанных ПК на основе графика локтя и анализа JackStraw.
5. Визуализируйте кластеры с помощью алгоритма равномерной аппроксимации и проекции многообразий (UMAP) с помощью функции Seurat RunUMAP . Определите кластерно-специфичные профили экспрессии генов с помощью функции FindAllMarkers . Аннотирование кластеров на основе транскрипционных сигнатур путем перекрестных ссылок на идентифицированные маркерные гены с курируемыми одноклеточными ресурсами, такими как PanglaoDB и CellMarker (рис. 2). Типы клеток, включая микроглию, выводятся из этих транскриптомных профилей, а не из заранее определенного поверхностного маркера.

11. Разделение клеток по половому признаку

1. Идентификация мужских и женских клеток на основе экспрессии генов, специфичных для пола: четырех женских, специфичных (Xist, Tsix, Usp9x, Eif2s3x) и трех мужских, специфичных (Eif2s3y, Uty, Ddx3y).
2. Классифицируйте мужские и женские популяции путем фильтрации клеток, экспрессирующих нормализованное количество UMI > 1 для любого из этих генов, используя функцию подмножества Сёра.
3. Создавайте объекты Seura путем раздельного подмножества мужских и женских клеток. Храните и анализируйте эти объекты независимо друг от друга для последующего сравнения.
4. Проверяйте классификацию путем визуализации экспрессии генов, специфичных для пола, с помощью функций FeaturePlot и VlnPlot , обеспечивая четкое разделение между мужскими и женскими популяциями клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 12.1 и 12.2 следует выполнять только после того, как образец был мультиплексирован путем смешивания одной самки и одной самки.

12. Классификация микроглии на основе статистического моделирования

1. Постройте пять статистических моделей в R (случайный лес, логистическая регрессия, наивный метод Байеса, метод опорных векторов, дерево решений) с использованием обучающего набора из ~1000 ячеек с известными групповыми метками.
2. Оцените производительность модели с помощью 10-кратной перекрестной проверки и кривых рабочих характеристик приемника (ROC) (рис. 3). Определите ключевые гены, участвующие в классификации, с помощью функции FindAllMarkers в Seurat.
3. Выберите модель с самой высокой площадью под кривой ROC (AUC). Модель случайного леса была выбрана на основе ее превосходного показателя AUC.
4. Примените выбранную модель к неклассифицированным ячейкам с помощью функции predict из пакета RandomForest R. Объедините прогнозируемые классификации с ранее аннотированными наборами данных в Seura с помощью функции «Объединить».
5. Проверяйте классификации, визуализируя экспрессию маркерных генов с помощью FeaturePlot и VlnPlot. Чтобы обеспечить согласованность предсказанных идентичностей клеток, оцените обогащение набора маркерных генов, перекрывающихся до и после добавления классифицированных клеток, с помощью соответствующего статистического теста (например, точного теста Фишера).

13. Анализ дифференциальной экспрессии генов микроглии

1. Выполните анализ дифференциальной экспрессии генов (DEG) между двумя конкретными группами, представляющими интерес, с помощью функции Сёра «FindMarkers», где ident.1 представляет интересующую группу, а ident.2 — референтную группу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На выходе перечислены гены, которые дифференциально экспрессируются в ident.1 относительно ident.2. В этом контексте к повышенным генам относятся гены с более высокой экспрессией в ident.1 по сравнению с ident.2, в то время как в ident.1 гены с подавленной регуляцией демонстрируют более низкую экспрессию.1. Их сравнения используются для построения графиков вулканов и интерпретации транскрипционных изменений, зависящих от условий.
2. Определите дифференциально экспрессируемые гены (DEG) со скорректированным P-значением≤ 0,05. Для сравнения между двумя конкретными группами используйте функцию FindAllMarkers со следующими критериями: гены экспрессируются не менее чем в 10% клеток (min.pct = 0,1) и порог log2-кратного изменения 0,25 (logfc.threshold=0,25). Для сравнения нескольких групп по всем микроглиям используйте функцию FindAllMarkers с одинаковыми параметрами. Гены с скорректированным P-значением ≤ 0,05 считаются значительно дифференциально экспрессированными. Чтобы визуализировать шаблоны выражений DEG, сгенерируйте график вулкана с помощью встроенной функции в пакете EnhancedVolcano (рисунок 4).
3. Сравните результаты проточной цитометрии, сначала изучив маркеры цитометрии, используемые для обнаружения микроглии, в частности CD45⁺ и CD11b⁺, которые соответствуют генам PtprcиItgam. Подтвердите экспрессию генов с помощью функций FeaturePlot в Seurat.
4. Оцените маркеры, обычно связанные с различными микроглиальными состояниями, включая CD80иNOS2, а также Mrc1, Arg1, Fcgr1 и CD163. Используйте функции Сёра FeaturePlot и DotPlot для визуализации их выражения в кластерах ячеек.
5. Сгенерируйте точечную диаграмму с помощью функции DotPlot в Seura для суммирования выражений маркеров и проверки классификации популяций.

Results

Этот протокол эффективно использует проточную цитометрию для характеристики популяций микроглиальных клеток в образцах мозга мышей на основе экспрессии выбранных поверхностных и внутриклеточных маркеров. В следующих разделах подробно описаны результаты, полученные на ключевых этапах рабочего процесса, а также выделено распределение и гетерогенность подмножеств микроглии в ответ на экспериментальные условия.

Валидация стратегии компенсации и стробирования
Компенсационные шарики использовались для калибровки сигналов флуоресценции и коррекции спектрального перекрытия между флуорохромами. Положительная и отрицательная популяции для каждого флуорохрома были четко разделены, что позволило точно построить матрицу компенсации. Пороги стробирования были первоначально проверены с помощью управления флуоресценцией минус один (FMO) во время оптимизации панели, чтобы отличить истинный сигнал от фона, особенно для слабых или перекрывающихся маркеров. Эти пороговые значения впоследствии повторно использовались в экспериментах с использованием той же панели окрашивания и настроек цитометра для обеспечения согласованности. Контроль изотипов был включен для мониторинга потенциального неспецифического связывания, особенно для внутриклеточных маркеров, но не использовался для принятия решений о гейтинге.

Идентификация микроглиальных клеток
Стратегия гейтирования живых и мертвых клеток (Амциан) успешно исключила мертвые клетки. Стратегия гейтирования эффективно изолировала популяции микроглиальных клеток на основе экспрессии CD45 (AF700) и CD11b (FITC). Параметры прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) были оптимизированы (FSC = 300, SSC = 200) для центрирования популяции микроглии в пределах точечной диаграммы (рис. 5).

Фенотипирование микроглиальных клеток
Анализ точечных графиков позволил идентифицировать субпопуляции микроглии на основе дифференциальной экспрессии поверхностных и внутриклеточных маркеров. С помощью специальных стратегий гейтинга в программном обеспечении FlowJo было идентифицировано подмножество микроглиальных клеток, экспрессирующих CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) и iNOS (PE-eFluor 610) (рисунок 6A). Двойное стробирование также использовалось для определения подмножеств, экспрессирующих CD206 (APC) и Arg1 (PE-Cy7) (см. рисунок 6B). Дополнительные популяции характеризовались коэкспрессией CD86 (PE) и CD64 (PerCP-eFluor 710), а также CD163 (Super Bright 600) и CD206 (APC) (рис. 6C,D). Эти фенотипические профили отражают гетерогенность, определяемую маркерами, в популяции микроглии и демонстрируют способность этого протокола различать множественные транскрипционно и иммунологически различные подмножества без вывода о фиксированных функциональных состояниях.

Анализ одиночных клеток на микроглию
Равномерная аппроксимация и проекция многообразия (UMAP) была использована для визуализации клеточной гетерогенности и идентификации кластеров микроглиальных клеток среди других типов клеток мозга. Каждая точка представляет одну клетку, а кластер имеет цветовую кодировку на основе сходства транскрипции (рис. 2).

Дифференциальный анализ экспрессии был проведен в кластере микроглии для идентификации генов, модулированных в экспериментальных условиях. Гены со скорректированным P-значением ≤ 0,05 считались дифференциально экспрессированными.

Для визуализации этих дифференциально экспрессируемых генов клеток микроглии был сгенерирован график вулкана, выделенные из них с высоким изменением кратности и статистической значимостью (рис. 4).

Для сравнения результатов этих одиночных клеток с данными проточной цитометрии была изучена экспрессия маркеров микроглии CD45 и CD11b (Ptprc и Itgam). UMAP показывает их экспрессию в различных клеточных популяциях (рис. 7).

Наконец, была оценена экспрессия выбранных иммунородственных маркеров, чтобы охарактеризовать транскрипционную гетерогенность среди клеток микроглии. График Скрипки показывает экспрессию таких генов, как CD80 и NOS-, а также Mrc1, Arg1, Fcgr1 и CD163 на уровне отдельных клеток (рис. 8). Эти паттерны экспрессии маркеров позволяют сравнивать их с профилированием, основанным на проточной цитометрии, и выделяют молекулярное разнообразие субпопуляций микроглии в разных экспериментальных условиях.

Рисунок 1: Контроль качества транскриптомных данных одиночных клеток. (А) Распределение содержания митохондриальной РНК по клеткам. Клетки с >30% митохондриальной РНК были исключены для удаления потенциально подверженных стрессу или умирающих клеток. (B) Клетки с log10GenesPerUMI > 0,75 были отфильтрованы для обеспечения стабильного соотношения генов к UMI и снижения шума от библиотек низкой сложности. (C) Клетки с менее чем 500 обнаруженными транскриптами (nUMI) или более чем 300 обнаруженными генами (nGENE) также были исключены для устранения некачественных или множественных клеток. (D) График корреляции NUMI и nGene, иллюстрирующий влияние порогов фильтрации. Обнаруженные дублеты были удалены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: UMAP визуализация одноклеточных транскриптомов. График UMAP, показывающий распределение одиночных клеток на основе транскриптомных профилей, полученных от двух отдельных животных. Каждая точка представляет одну ячейку, обозначенную цветом в соответствии с идентификатором кластера. Кластер микроглиальных клеток идентифицируется среди других клеточных популяций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: ROC-кривая классификатора Random Forest, оцененная методом перекрестной проверки. Кривая рабочих характеристик приемника (ROC), иллюстрирующая производительность модели Random Forest, используемой для отличия микроглии от других типов клеток мозга на основе профилей экспрессии генов. Модель была обучена на наборе из ~1000 ячеек с известными метками и оценена с использованием 10-кратной перекрестной проверки. Среди пяти протестированных статистических моделей (случайный лес, логистическая регрессия, наивный метод Байеса, метод опорных векторов и дерево решений) модель случайного леса достигла самой высокой производительности классификации. Площадь под кривой (AUC) отражает точность модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Дифференциальный анализ экспрессии генов в клетках микроглии. Вулканический график, представляющий log2-кратное изменение по сравнению со скорректированным P-значением для генов, дифференциально экспрессирующихся в микроглии между двумя экспериментальными группами (контрольная группа против мозжечкового повреждения головного мозга). Активированный ген более высоко экспрессируется в интересующей группе (ident.1), а подавленные гены демонстрируют сниженную экспрессию по сравнению с референтной группой (ident.2). Ключевые значительно дифференциально экспрессируемые гены помечены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Стратегия стробирования для идентификации микроглии с помощью проточной цитометрии. (A) Стратегия гейтирования, примененная к клеткам мозжечка контрольной мыши на 3-й день (P3). (B) Синглеты были выбраны таким образом, чтобы исключить дублеты. (C) Жизнеспособные клетки были идентифицированы с помощью красителя для жизнеспособности; события с низким FSC-A были исключены для удаления мусора и обеспечения анализа интактных клеток. (D) Микроглия была идентифицирована как CD45⁺ и CD11b⁺ с двумя различными популяциями: CD45^{с низким уровнем} CD11b^int для спокойной микроглии и CD45^int -CD11b^high для активированной микроглии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6. Характеристика профилей экспрессии маркеров микроглии с помощью проточной цитометрии. (A) Последовательное гейтирование CD45⁺ CD11b⁺ клеток на основе экспрессии CD80, CD86 и iNOS. (B) Идентификация подмножества, экспрессирующего CD206, с последующим стробированием на основе экспрессии Arg1. (C) Идентификация подмножества, экспрессирующего CD86, с последующим стробированием на основе экспрессии CD64. (D) Идентификация подмножества, экспрессирующего CD163, с последующим гейтингом на основе экспрессии CD206. Эти стратегии гейтирования иллюстрируют фенотипическую гетерогенность популяций микроглии на основе поверхностной и внутриклеточной экспрессии маркеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7: Подтверждение идентичности микроглии с использованием экспрессии Itgam и Ptprc в данных секвенирования РНК одиночных клеток. UMAP отображает транскрипционный ландшафт клеток мозжечка в точке P15, при этом экспрессия генов Itgam и Ptprc наложена на кластеры. Коэкспрессия этих канонических миелоидных маркеров поддерживает идентификацию популяций микроглии и согласуется с маркерами, используемыми в проточной цитометрии, обеспечивая перекрестную валидацию между транскриптомным анализом и анализом на уровне белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 8: Профили экспрессии выбранных иммунородственных генов в микроглиальных клетках, идентифицированных с помощью секвенирования РНК одиночных клеток. Графики Скрипки отображают распределение экспрессии генов CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 и CD163 по отдельным клеткам микроглии. Эти маркеры обычно связаны с иммунозависимыми процессами и иллюстрируют транскрипционную гетерогенность, наблюдаемую в микроглиальной популяции. Данные приведены как для контрольных состояний, так и для мозжечковой черепно-мозговой травмы (ЧМТ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Состав растворов, используемых для выделения и окрашивания нервных клеток. В этой таблице представлен подробный состав растворов, необходимых для выделения и окрашивания клеток, включая их соответствующие концентрации и компоненты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Концентрации смеси антител для внеклеточного окрашивания. В этой таблице подробно описаны концентрации антител и живого/мертвого раствора, используемого для внеклеточного окрашивания, с указанием требуемых объемов и разведений для каждого антитела в окрашивающей смеси для одного образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Концентрации смеси антител для внутриклеточного окрашивания. В этой таблице подробно описаны концентрации антител, используемых для внутриклеточного окрашивания, с указанием необходимых объемов и разведений для каждого антитела в окрашивающей смеси для одного образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Discussion

В этом исследовании представлен подробный и оптимизированный протокол, сочетающий проточную цитометрию и секвенирование РНК отдельных клеток (scRNA-seq) для выделения и характеристики микроглиальных клеток во время раннего постнатального развития мозга. В то время как проточная цитометрия остается экономически эффективным и доступным методом, ее интеграция с транскриптомикой одиночных клеток обеспечивает дополнительную информацию, связывая экспрессию маркеров на уровне белка с транскрипционными профилями на уровне генов. Протокол решает технические проблемы, характерные для незрелой ткани мозга, включая эффективную диссоциацию, удаление мусора и миелина, а также оптимизированные стратегии иммуноокрашивания, чтобы обеспечить воспроизводимость и надежность при анализе микроглиальных популяций в ключевые моменты развития.

С помощью проточной цитометрии идентифицировали субпопуляции микроглии на основе экспрессии выбранных поверхностных и внутриклеточных маркеров. Вместо того, чтобы выводить функциональные состояния, подмножества различались по профилям экспрессии маркеров, таким как CD80⁺/CD86⁺/iNOS⁺; CD206⁺/Arg1⁺ ; Фенотипы CD86⁺/CD64⁺ или CD163⁺/CD206⁺. Эти популяции, определяемые маркерами, отражают молекулярную гетерогенность в компартменте микроглии и обеспечивают практический подход к характеристике с высокой пропускной способностью. Несмотря на то, что эти классификации на основе поверхностных маркеров могут не охватывать всю сложность разнообразия микроглии, они остаются информативными, особенно в условиях, когда многомерные молекулярные инструменты могут быть недоступны. Бинарные классификации, такие как парадигма М1/М2, намеренно избегаются, признавая спектроподобную, контекстно-зависимую природу микроглиальных фенотипов, как описано в недавней литературе^.

Эти наблюдения согласуются с предыдущими исследованиями, подчеркивающими роль микроглии как в нормальном созревании мозга, так и в ответе на экологические или патологические стимулы^13,14. Способность дифференцировать гетерогенность микроглии дает ценную информацию о том, как поляризация клеток микроглии может способствовать нарушениям развития нервной системы^15,16.

Несмотря на то, что секвенирование РНК одиночных клеток обеспечивает более высокое разрешение и позволяет идентифицировать транскрипционно различные субпопуляции микроглиальных клеток, его стоимость и аналитическая сложность ограничивают его доступность. В текущем наборе данных, собранном на 15-й день после перинатального повреждения, пик воспалительной реакции в значительной степени устраняется, что приводит к низкому количеству активированных микроглий. Следовательно, методы уменьшения размерности, такие как UMAP, не восстановили хорошо разделенные микроглиальные субкластеры, и транскрипционный анализ на уровне кластера не был включен в эту рукопись протокола.

Важным новшеством этого протокола является его оптимизация для выделения и характеристики клеток микроглии из мозжечка на ранних постнатальных стадиях (от P3 до P30). Этот регион и возрастной контекст создают определенные проблемы, включая низкий выход клеток, содержание миелина и повышенную хрупкость тканей. Чтобы устранить эти ограничения, протокол включает в себя адаптированный рабочий процесс диссоциации, эффективное удаление мусора и миелина, а также тщательно настроенные условия иммуноокрашивания, подходящие для небольших объемов мозжечковой ткани. Несмотря на растущее признание микроглии мозжечка как функционально и транскрипционно отличной от микроглии в других областях мозга, подробные протоколы их выделения и анализа остаются ограниченными. Современный метод обеспечивает надежный и доступный рабочий процесс, особенно адаптированный для исследований развития микроглии мозжечка.

Основная цель данной рукописи – обеспечить воспроизводимую и адаптируемую методологическую основу, а не сообщать о конкретных биологических открытиях. Рабочий процесс подходит для адаптации к другим стадиям развития или экспериментальным моделям, в которых транскрипционно различные состояния микроглии могут быть более заметными. В таких условиях проточная цитометрия остается ценным инструментом, особенно в сочетании с комплементарными анализами.

Одним из ключевых преимуществ этого протокола является его адаптивность на различных этапах развития, начиная от 3-го дня после рождения (P3) до 30-го дня после рождения (P30). Это позволяет проводить лонгитюдный анализ фенотипа микроглии по мере созревания мозга. Совместное использование проточной цитометрии и scRNA-seq позволяет изучать не только поверхностные маркеры, но и внутриклеточные сигнальные пути и факторы транскрипции, участвующие в микроглиальных клетках.

Тем не менее, ферментативное расщепление может влиять на экспрессию некоторых поверхностных маркеров, что требует тщательной оптимизации условий расщепления для конкретных экспериментальных целей^17,18. Кроме того, ни проточная цитометрия, ни секвенирование одиночных клеток не позволяют получить данные на популяционном уровне, которые могут не полностью отражать пространственные и функциональные нюансы взаимодействий микроглиальных клеток в их естественной среде. Включение пространственных методов для отдельных клеток может помочь устранить это ограничение, сохранив пространственный контекст микроглиальных клеток. Будущие исследования, сочетающие этот протокол с методами визуализации, такими как иммуногистохимия, визуализация in vivo, вестерн-блот или пространственная транскриптомика отдельных клеток, могут дать дополнительное представление о динамике микроглиальных клеток.

Этот метод открывает новые возможности для изучения того, как повреждения в раннем возрасте, такие как воспаление, гипоксия или стрессоры окружающей среды, влияют на фенотипы клеток микроглии и способствуют долгосрочным результатам развития нервной системы. Обеспечивая точную и надежную характеристику состояний активации микроглиальных клеток, он облегчает идентификацию терапевтических мишеней для модуляции микроглиальных реакций в раннем возрасте, с целью предотвращения или смягчения нарушений развития нервной системы.

В заключение следует отметить, что этот протокол предлагает надежную и доступную основу для изучения разнообразия микроглиальных клеток на ранних этапах развития мозга. Комбинация проточной цитометрии и секвенирования РНК отдельных клеток обеспечивает гибкое применение на различных стадиях развития и экспериментальных моделях, способствуя более глубокому изучению биологии микроглии как в физиологическом, так и в патологическом контексте.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 & микро; m металлическая сетка фильтр	Сигма-Олдрич	С3895
Тюбик 15 мл	Сарштедт	62.554.205
Тюбик 5 мл	Сарштедт	55.526.006
96-луночная пластина с коническим дном	Сарштедт	82.1583.001
Аргиназа 1 - Конъюгат Pecy7 - Клон: A1exF5	Thermo Fisher Scientific	25-3697-82
Настольные стабильные флуоресцентные реагенты	Инвитроген	А49905
CD11b - Конъюгированный фитк - Клон: M1/70	BD Pharmingen	553310
CD163 - Конъюгат SB600 - Клон : TNKUPJ	Thermo Fisher Scientific	63-1631-82
CD206 - Конъюгированный APC - Клон: C068C2	Биолегенда	141708
CD45 - Сопряженный A700 - Клон: 30-F11	BD Pharmingen	560510
CD64 - Конъюгат  PerCP-eF710 - Клон: X54-5/7.1	Thermo Fisher Scientific	46-0641-82
CD80 - Сопряженный SB436 - Клон: 16-10A1	Thermo Fisher Scientific	62-0801-82
CD86 - Конъюгированный Pe - Клон: GL-1	Биолегенда	105008
Коллагеназа D	Сигма&nдаш; Олдрич	11088866001
ДНКаза I	Сигма&nдаш; Олдрич	10104159001
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Сигма&nдаш; Олдрич	Ф1051
HBSS (сбалансированный солевой раствор Хэнка) 10x	Wisent Bioproducts	311506CL
Гемоцитометр	ВВР Интернэшнл	82030-470
ХЕПЕС	Wisent Bioproducts	330.050.ЭЛ
iNOS - Конъюгат PE- eF610 - Клон: CXNFT	Thermo Fisher Scientific	61-5920-82
KCl	Thermo Fisher Scientific	БП366-500
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	БП362-500
Живой/Мертвый Амциан	Thermo Fisher Scientific	Л34957
Среды для культивирования микроглиальных клеток	Технологии Life	А12475-01
Na2HPO4	Thermo Fisher Scientific	БП332-500
NaCl	Thermo Fisher Scientific	БП358-212
Параформальдегид	Сигма&nдаш; Олдрич	П6148
Крысиная антимышь CD16/CD32	BD Biosciences	553142
Сапонин	Сигма&nдаш; Олдрич	С7900
Библиотеки scRNAseq	10-кратная геномика	1000121
Коллоидная среда на основе диоксида кремния	Thermo Fisher Scientific	45001747
Азид натрия	Thermo Fisher Scientific	БП922И-500
Трипан синий	Gibco	1525006