Судорожная активность, индуцированная электрошоком у личинок дрозофил

Краткое содержание

В этом протоколе подробно описывается использование личинок дрозофилы для идентификации уникальных противосудорожных соединений для лечения эпилепсии.

Аннотация

Эпилепсия представляет собой значительную нагрузку на здоровье, которая усугубляется большим числом людей, не поддающихся лечению. В то время как некоторые пациенты с лекарственной резистентностью реагируют на немедикаментозное лечение (например, стимуляцию блуждающего нерва, кетогенную диету и т. д.), последним средством для многих является сложная и дорогостоящая хирургия для облегчения судорог. Хотя общепризнано, что требуются противосудорожные препараты с более широким диапазоном мишеней, препятствием на пути к достижению этой цели является идентификация новых мишеней для лекарств. Генетически податливые модельные животные являются многообещающими в этом отношении. Плодовая муха, Drosophila melanogaster, стала мощной моделью для исследования механистической основы судорог и их более эффективного лечения. Многие выявленные мутации мух приводят к тому, что личинки и взрослые особи проявляют судорожную активность в ответ на сильную стимуляцию (электрическую, механическую и/или термическую). Многие из этих мутаций находятся в генах, гомологичных тем, которые способствуют генетической эпилепсии человека (например, потенциал-зависимый канал Na⁺ ). Кроме того, теперь можно заменить ген мухи его человеческим эквивалентом, который также несет мутацию, связанную с заболеванием. Таким образом, скромная муха стала аватаром для моделирования человеческой болезни. В этом исследовании описан подходящий метод использования личинок дрозофилы для скрининга лекарств с низкой и средней пропускной способностью с целью выявления уникальных соединений и их мишеней, обладающих противосудорожным потенциалом.

Введение

Эпилепсия остается значительным бременем для здоровья, затрагивая примерно 1% населения мира. Несмотря на то, что в настоящее время существует более 30 противосудорожных препаратов (ПКМ) для клинического лечения, около трети людей с эпилепсией остаются лекарственно-рефрактерными, что означает, что они плохо реагируют на^{медикаментозное лечение.} Имеющиеся препараты также являются только паллиативными и, как таковые, не препятствуют эпилептогенезу и не обеспечивают излечения³. Таким образом, существует острая необходимость в определении более эффективных методов лечения эпилепсии. Препятствием на пути разработки более эффективных методов лечения является идентификация новых мишеней для лекарств. Действительно, почти все современные АСМ воздействуют на аналогичные мишени: ионные каналы, в том числе потенциал-зависимый натриевый канал (Na_v), и тормозную нейротрансмиссию, опосредованную γ-аминомасляной кислотой (ГАМК)^4,5. Общепризнано, что дальнейшее использование традиционных методов разработки лекарств вряд ли радикально изменит этот сценарий.

Лабораторные модельные животные, включая, но не ограничиваясь, плодовую муху Drosophila melanogaster и данио-рерио Danio rerio, полезны для идентификации новых ASM ^6,7,8. Действительно, поиск в PubMed по запросу «дрозофила + судорога» дает 342 результата, в то время как тот же поиск по данио-рерио дает 578 результатов (оба поиска были проведены 29^января 2025 года). Несмотря на то, что количество подобных исследований на мышах (~15 000) незначительно, количество исследований с использованием модельных систем продолжает расти. Эти исследования возможны благодаря механистическому сохранению функции ЦНС во всех типах. Более того, индуцированные судороги у мух и рыб эффективно лечатся с помощью клинически используемых АСМ, показывая, что, хотя нюансы судорожного поведения могут внешне казаться различными, лежащие в их основе механизмы имеют^{много общего.}

Плодовая муха, дрозофила, внесла большой вклад в понимание биологии человека. Что касается эпилепсии, то эта модельная система предоставляет беспрецедентный генетический инструментарий в сочетании с идентифицируемыми и экспериментально доступными^{нейронами.} Кроме того, в настоящее время опубликованы коннектомы как для личинки, так и для взрослой ЦНС, и^{были идентифицированы} многочисленные клеточно-специфические генетические движущие линии. Важно отметить, что по счастливой случайности был идентифицирован класс мутаций, при которых взрослые мухи реагируют на сильную механическую стимуляцию потерей осанки и судорожной активностью (например, жужжанием крыльев, тряской ног и т. д.). Этот класс мутаций был назван «чувствительными к взрыву»13,14,15,16. С тех пор был идентифицирован второй класс судорожной мутации, которая реагирует на повышение температуры, отражая фебрильные судороги человека^17,18. Тем не менее, экспериментальная податливость взрослых мух несколько снижена по сравнению с личиночной стадией этой же модели насекомых. Например, может быть трудно кормить взрослых мух лекарствами, а более инвазивные методы, такие как электрофизиология и оптогенетика, могут быть более сложными. Напротив, личинка дрозофилы постоянно ест, чтобы увеличить объем своего тела в ~100 раз всего за 5 дней, чтобы обеспечить окукливание. Поэтому мы можем быть уверены в адекватном кормлении препаратами на личиночных стадиях. Эмбриогенез хорошо задокументирован и может быть точно спрогнозирован, а он, в свою очередь, определил ключевые вехи в развитии ЦНС, включая первое приобретение электрических свойств нейронов вплоть до формирования цепи¹⁹. После вылупления личинка проходит через 3 линьки (или стадии), пока на 5-й день она не становится «блуждающей», после чего она покидает пищу, чтобы найти безопасное место для окукливания. Через ~100 часов после окукливания появляется взрослая муха с новым телом и ЦНС (Рисунок 1).

Методы индуцирования судорог у взрослых особей не очень хорошо подходят для личиночных стадий. У личинок отсутствуют сенсорные волоски, синхронная активация которых при механической стимуляции может привести к припадку. Таким образом, для преодоления этих трудностей была разработана техника электрошока, позволяющая вызывать судороги на стадии блуждающей личинки. Последующий сравнительный анализ методов индукции судорог как у личинок, так и у взрослых особей показывает, что электрошок личинок гораздо меньше зависит от типа мутации (например, чувствительность к взрыву в зависимости от температуры). Таким образом, мы полагаем, что этот метод должен быть предпочтительным методом для тестирования новых мутаций, где оптимальный метод индукции судорог неизвестен^. Техника электрошока личинками проста, быстра и требует минимального оборудования. Этот метод обеспечивает эффективные средства для скрининга новых соединений или генетической терапии на предмет противосудорожной эффективности в отношении ряда мутаций, которые отражают генетическое разнообразие эпилепсии человека.

Протокол

В этом исследовании используется плодовая муха, Drosophila melanogaster (подробности см. в разделе «Результаты»). Этот метод лучше всего подходит для блуждающих личинок третьего возраста (L3). Протокол эксперимента относительно прост, но требует практики для совершенствования. По нашему опыту, новым студентам требуется около 2 недель, чтобы освоить анализ, и они получают большую пользу от наблюдения за тем, как другие, более опытные исследователи выполняют анализ в режиме реального времени с использованием микроскопа для препарирования с камерой или аналогичного микроскопа. Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Выбор личинок

1. Соберите личинок с боковых сторон флаконов/бутылок от мух, содержащих стандартный корм (5 л воды, 390 г глюкозы, 360 г кукурузы, 250 г дрожжей, 40 г агара, 135 мл нипагина, 15 мл пропионовой кислоты).
2. Используйте только личинок, которые активно двигаются и покинули пищу, чтобы ползти вверх по стенкам контейнера (блуждающие третьи возрасты, L3). Не отбирайте предкуколок, у которых наблюдается значительно сниженная локомоция.

2. Процедура электрошока

1. Удалите одну блуждающую L3 и переложите ее в маленькую пластиковую чашку Петри (размер не имеет значения) и аккуратно вымойте ее с помощью ddH₂O, чтобы удалить остатки пищи. Для этого подойдет маленькая (000) кисть.
2. Переложите однократно промытую личинку, с помощью кисти, в пустую пластиковую посуду (опять же, размер значения не имеет). Обсушите личинку небольшим фрагментом бумажного полотенца, проведенным щипцами. Удалите излишки ddH₂O, но не высушивайте личинки полностью, чтобы избежать их прилипания к пластиковой посуде.
3. Дайте личинке восстановиться в течение 30 с. Это облегчит размещение электрошокового щупа (см. ниже).
4. Рассмотрите личинок под маломощным микроскопом для препарирования (15-20x) и, как только нормальное ползание возобновится, осторожно поместите электрошоковый зонд (см. шаг 3 для подробностей и рисунок 2A) на переднюю дорсальную поверхность личинки над приблизительным положением ЦНС (см. рисунок 2C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, необходимо приложить достаточное давление, чтобы обеспечить хорошую проводимость между проволокой зонда и кутикулой, но будьте осторожны, чтобы не повредить личинки. Таким образом, раздавите личинку примерно на одну треть или половину ее глубины.
5. Подайте импульс постоянного напряжения длительностью 2 с, сила которого была заранее определена с помощью кривой титрования (рис. 3). Здесь подойдет любой изолированный стимулятор напряжения. Тот, который используется здесь, показан на рисунке 2B.
6. После поражения электрическим током запустите таймер. В ответ на шок личинки инициируют преходящий паралич, за которым следуют периодические спазмы мышечной активности стенок тела и перекатывания, останавливающие нормальное ползание.
7. Останавливайте таймер, когда личинка явно отошла от своего первоначального места на блюде. Продолжительность припадка, или время восстановления (ЛТ), определяется как период между возникновением стимула и возобновлением нормального ползающего поведения (например, полной перистальтической волны вперед, которая приводит к движению вперед).
8. В конце каждого дня тщательно очищайте провода зонда, сначала промыв их в 100% этаноле, а затем ddH₂O. Внимательно осмотрите провода под увеличением и, при необходимости, с помощью щипцов аккуратно соскребите остатки с проводов. При этом будьте очень осторожны, чтобы не изменить расстояние между двумя проводами.

3. Конструкция электрошокового щупа

1. Потребуется отрезок электрического провода 2 x 1 м (должен быть тонким и гибким, т.е. рассчитанным на ~3 А). К концу каждого провода припаяйте вольфрамовый провод длиной 5 см (чтобы максимизировать контакт, перед пайкой намотайте вольфрамовый провод на открытый конец электрического провода). Припаяйте быстроразъемные разъемы (например, вилки типа «банан») к другому концу проводов, подходящие для удобного подключения к стимулятору напряжения.
2. Закрепите оба вольфрамовых провода на держателе электрода так, чтобы провода были параллельны друг другу (Рисунок 2). Небольшие участки стеклянных капилляров (~2 см в длину) используются для удержания проводов на месте под стопорным винтом зонда.
3. С помощью щипцов согните провода таким образом, чтобы они подходили на расстояние 1-2 мм к тому месту, где они выходят из держателя провода. Сгибать вольфрамовые провода непросто, потому что провода сохраняют «память» - поэтому требуется настойчивость. Советы, которые помогут в этом процессе, включают использование электрической изоляционной ленты и/или blu-tack (или аналогичной шпаклевки) для поддержания проводов в правильной ориентации/расстоянии.

4. Калибровка щупа

1. Убедитесь в наличии запасов блуждающего L3 подходящего дикого типа (отрицательный контроль) и судорожного мутанта (положительный контроль). Потребуется ~100 штук каждого.
2. Подготавливайте личинок, по одной, как описано выше.
3. С помощью зонда можно подать диапазон напряжений на достаточное количество личинок каждого генотипа для каждого тестируемого напряжения. Рекомендуется применять напряжение 0 В, 2 В, 4 В, 6 В, 8 В, 10 В и 12 В в течение 2 с в диапазоне 10-15 личинок на напряжение. Ударяйте током каждую личинку только один раз.
4. Измерьте время восстановления для каждой личинки и рассчитайте среднее значение для каждого шага напряжения, применяемого для обоих генотипов.
5. Нанесите средние значения на график и подогнайте данные под прямую линию.
6. Выберите напряжение с четкой и существенной разницей между контрольным и судорожным мутантом. Будьте осторожны и не выбирайте напряжение, которое дает слишком долгое время восстановления; В противном случае производительность пострадает из-за длительного ожидания восстановления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании часто использовалось напряжение стимуляции, которое приводит к времени восстановления 50-100 с для дикого типа и 200-300 с для ^{пара-бсс.} Примеры кривых калибровки показаны на рисунке 3. Важно использовать 0 В для учета акта нажатия зонда на спинную поверхность личинки. Это вызовет некоторую степень паралича, который, вероятно, является защитным механизмом личинки.

5. Проведение экспериментов

1. Электрошоковая личинка желаемого генотипа (генотипов) или воздействия лекарственного препарата и измерение времени восстановления после судорог.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для испытуемых личинок обычно достаточно n = 20, но расчет мощности, основанный на экспериментальном анализе, даст более точное число n.
2. Всегда проводите отрицательный (например, дикий тип) и положительный (например, para^bss) контроль во время каждого эксперимента. Число n не обязательно должно быть большим; n = 5 достаточно. Это обеспечит уверенность в том, что анализ сработал должным образом (например, нет проблем с зондом или стимулятором).
3. Применяйте пороговое значение (например, 300 с), чтобы избежать слишком длительного времени восстановления, и рассматривайте количественные судороги только как те, у которых время восстановления превышает 30 с.

6. Скрининг на наркотики

1. Добавляйте препараты, растворенные в соответствующем растворителе, непосредственно на поверхность пищи и дайте впитаться (а при использовании этанола – время для испарения растворителя). Или, в качестве альтернативы, можно добавить лекарство (в соответствующем растворителе) в растопленный корм от мух. Подробности см. в разделе «Результаты».
2. Чтобы добавить препарат к растопленной пище, выньте пищу из флаконов, повторно расплавьте и, когда пища остынет до 40 °C, добавьте препарат, перемешайте с помощью вихревого миксера, а затем снова разложите 5 мл растопленной пищи по флаконам и дайте остыть перед использованием.
3. Запустите градиент концентрации, чтобы определить оптимальную концентрацию препарата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошей отправной точкой является добавление 3 мМ раствора препарата либо непосредственно на поверхность пищи (200 μл на стандартный флакон дрозофилы ), либо до концентрации 3 мМ в расплавленной пище. Взрослым самкам можно позволить откладывать яйца непосредственно в этот корм или добавлять личинки на выбранных этапах по мере необходимости. Используемый растворитель (растворители) должен быть добавлен отдельно в выбранные флаконы в качестве контроля транспортного средства.

Результаты

Многочисленные мутации дрозофилы демонстрируют усиленное судорожное поведение ^7,20. Генетическая основа этих мутаций разнообразна, что выгодно имитирует столь же разнообразные генетические причины эпилепсии человека. Три наиболее изученные мутации дрозофилы — это para^{bangsenseless} (para^bss), julius seizure (jus) и easy-shocked (eas). Мутация para^bss п...

Обсуждение

Метод электрошока для индуцирования судорог у личинок дрозофилы обеспечивает простой, но эффективный скрининг для идентификации новых противосудорожных соединений или генетических манипуляций. Однако, поскольку это качественный анализ, его основным ограничением является то, что метод не может легко идентифицировать малые размеры эффекта. Тем не менее, средняя пропускная способность, которую он позволяет, поддаваясь скринингу до ~5 соединений в неделю на одного исследователя, обе...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Держатель электродов	Мировые прецизионные приборы	М3301
Стеклянные капилляры	Инструменты Гарварда	ГК100Ф-10
Вольфрамовая проволока (99,95%)	Гудфеллоу Кембридж, Великобритания		Диаметр 0,1 мм
Стимулятор напряжения	Digitimer Ltd, Великобритания	DS2A mkII	Изолированный стимулятор постоянного напряжения