Методическая статья

Измерение циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) в твердых тканях с помощью конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА)

DOI:

10.3791/68432

⸱

3 июля 2025 г.

 ,  ,  , 
1Molecular Biology and Genetics Section, Molecular Medicine Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол измеряет концентрации циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) в твердых тканях с помощью конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). В протоколе описывается, как обрабатывать твердую ткань, проводить конкурентный ИФА, преобразовывать абсорбции в концентрации цГМФ в пикомолах на миллилитр и рассчитывать конечные концентрации в виде наномолей цГМФ на грамм ткани.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основным путем, который производит циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ), является путь оксида азота (NO)-цГМФ. В этом пути NO стимулирует каталитическую активность растворимой гуанилилциклазы (sGC), которая превращает гуанозинтрифосфат в цГМФ. NO представляет интерес, потому что у млекопитающих он действует как основной сосудорасширяющий фактор, ингибитор агрегации тромбоцитов, медиатор иммунной функции, нейромедиатор и для повышения выносливости во время физической активности, среди других физиологических ролей. Измерение концентрации оксида азота в различных тканях может помочь выяснить его функции. Тем не менее, NO не может быть измерен напрямую из-за его периода полураспада менее нескольких секунд. Как правило, метаболиты NO, нитраты и нитриты, измеряются для оценки содержания NO. Это связано с тем, что эти молекулы могут быть взаимопревращены in vivo посредством окислительно-восстановительных реакций. Менее распространенный метод оценки концентрации NO требует измерения концентрации цГМФ, сигнальной молекулы после NO. Тем не менее, измерение цГМФ в тканях проводится редко, несмотря на то, что это дает возможность лучше понять функции цГМФ в органах. В связи с этим существует потребность в протоколе для измерения концентраций цГМФ в солидных органах и тканях. В этом протоколе собранные ткани свиньи были гомогенизированы, на обработанных образцах был проведен конкурентный ИФА, а абсорбции были преобразованы в наномоли цГМФ на грамм исходной ткани. Короче говоря, этот протокол описывает упрощенный метод измерения концентраций цГМФ в твердых тканях с использованием набора циклического GMP ELISA.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ) представляет собой сигнальную молекулу, способную вызывать физиологические изменения по пути оксида азота (NO)-цГМФ. В пути NO-цГМФ NO связывается с растворимой гуанилилциклазой, цитозольным ферментом, который превращает гуанозинтрифосфат в цГМФ, повышая его каталитическую активность 1,2. Последующее повышение концентраций цГМФ активирует сигнальные пути, способствующие вазодилатации3, что приводит к снижению артериального давления 4,5, основной физиологической реакции, характерной для присутствия NO in vivo. Кроме того, известно, что NO влияет на иммунную функцию6, повышает выносливость во время физической активности4 и предотвращает свертывание крови путем ингибирования агрегации тромбоцитов7.

Прямое измерение NO затруднено из-за его периода полураспада in vivo8 менее нескольких секунд в большинстве биологических тканей. Следовательно, для выяснения физиологических эффектов NO требуется метод измерения его распространенности ex vivo. Таким образом, пригодные для использования количественные методы позволяют избежать прямого измерения NO. Распространенным методом оценки концентрации NO в тканях является измерение более стабильных метаболитов NO: нитритов и нитратов 4,5,9,10,11. Основная сложность использования концентраций нитритов и нитратов в качестве меры распространенности NO заключается в том, что оба метаболита также служат предшественником NO и молекулой-накопителем соответственно. Метаболиты NO, особенно нитраты, в изобилии содержатся в некоторых продуктах. Таким образом, изменения концентраций цГМФ, когда цГМФ находится после NO, полезны для оценки количества активного NO, а содержание NO может быть определено без вмешательства ранее присутствовавших нитритов и нитратов.

Предыдущие исследования основывались на измерении концентраций цГМФ в плазме12 и тромбоцитах13, но реже наблюдается измерение концентраций цГМФ в твердых тканях. Возможность измерения концентраций цГМФ в твердых тканях позволит охарактеризовать активность NO в конкретных органах. Цель исследования состояла в том, чтобы определить упрощенный метод измерения цГМФ в солидных тканях с использованием конкурентного ИФА. Одним из преимуществ использования конкурентного ИФА является то, что для него требуется оборудование, обычно встречающееся в большинстве лабораторий, заинтересованных в ИФА, например, считыватель микропланшетов, часто используемый для других целей. Для сравнения, некоторые другие методы измерения требуют оборудования, редко используемого во время экспериментов, ориентированных на NO, например, микроскопы14,15, сцинтилляционный счетчик16 или лазер17. Помимо доступности, измерение цГМФ с помощью конкурентного ИФА является чувствительным; Концентрации цГМФ могут быть обнаружены с точностью до 0,1 пикомола (пмоль) от цГМФ/мл18. С незначительными изменениями протокола18 набора cGMP ELISA (Table of Materials) был разработан метод измерения cGMP в солидных тканях с использованием конкурентного метода ELISA.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на животных выполнялись в соответствии с протоколом исследования на животных отделения молекулярной медицины, утвержденным Комитетом по уходу за животными и их использованию NIDDK (ASP K049-MMB-23). Сбор тканей проводился в соответствии с рекомендациями, установленными Комитетом по уходу за животными и их использованию Научно-исследовательского института здоровья MedStar (номер протокола: 2006001373 2020-017). В исследовании использовались молодые взрослые йоркширские кроссовые свиньи (два самца и две самки) в возрасте 3 месяцев и весом от 30 до 35 кг. На рисунке 1 показана схема, показывающая этапы протокола набора cGMP ELISA. Реагенты и оборудование, использованные в исследовании, перечислены в Таблице материалов.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схема протокола. Схема, иллюстрирующая этапы протокола набора cGMP ELISA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Подготовка образца ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед сбором ткани перфузировали раствором гепарина натрия, а затем хранили при температуре -80 °C перед использованием. Обратитесь к Park et al.19 для получения подробной информации о сборе образцов тканей.

  1. Обработка образцов тканей
    1. Охладите тканевый измельчитель, пинцет и ложку на сухом льду в течение 10 минут перед началом процедуры.
    2. Отвесьте избыток ткани, так как часть может быть потеряна во время измельчения (выход около 90%).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее превышение 170 мг давало успешные результаты. Масса может быть увеличена или уменьшена, при желании. Убедитесь, что тканевая масса приводит к достаточному объему образца для этапов ацетилирования образца ткани и разведения образца ткани.
    3. Добавьте салфетку в пульверизатор на сухой лед.
    4. Мгновенно заморозьте ткань жидким азотом и дайте жидкому азоту полностью испариться.
    5. Установите на место крышку пульверизатора и ударьте по ней молотком 15 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если измельчитель недоступен или не может быть использован, образец необходимо разрезать на как можно более мелкие кусочки с помощью ножниц или скальпеля при хранении в замороженном виде или, по крайней мере, в холодильнике со льдом. Этот этап обеспечивает хорошую гомогенизацию и имеет решающее значение, особенно для более твердых тканей.
    6. Поместите шарики в трубку гомогенизатора и перенесите измельченную ткань в трубку с помощью охлажденной ложки и пинцета.
    7. Запишите массу ткани, добавленной в трубку гомогенизатора шариков, чтобы позже преобразовать концентрации из молярности в моли на массу. Держите образец на льду.
    8. В пробирку гомогенизации добавьте объем в микролитрах 0,1 Н соляной кислоты, равный кратной массе ткани в миллиграммах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие разведения приводят к тому, что измеренные образцы попадают на стандартную кривую. Эти разведения обнаруживаются для различных типов тканей методом проб и ошибок. В предыдущих экспериментах соотношение разведения 1:10 для скелетной мышечной ткани и соотношение разведения 1:5 для ткани печени дали успешные результаты. Для справки, если разбавлять 100 мг ткани, то для разведения 1:10 потребуется 1000 мкл 0,1 Н соляной кислоты, а для разведения 1:5 потребуется 500 мкл.
    9. Гомогенизируйте образцы тканей с помощью бисерной мельницы, гомогенизатора или аналогичной техники.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время от времени охлаждайте образец во время гомогенизации с помощью льда. Если гомогенизатор бисерной мельницы недоступен, можно заменить его другими методами гомогенизации, которые эффективно разрушают клетки и создают гомогенат тканей, в том числе использование ротационного гомогенизатора или ультразвукового гомогенизатора.
    10. Центрифуга гомогенирует в течение 30 мин со скоростью 17 000 x g при поддержании температуры образца 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Недостаточно разбавленные гомогенаты скелетной мышечной ткани становятся чрезмерно вязкими и гелеобразными. Лучше всего это видно после центрифугирования.
    11. Перенесите надосадочную жидкость в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте надосадочную жидкость в течение 10 минут при температуре 17 000 x g при поддержании температуры 4 °C.
    12. Перенесите аликвоту надосадочной жидкости в микроцентрифужную пробирку и держите образец на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ацетилирование 250 мкл надосадочной жидкости дало успешные результаты. Чтобы приостановить протокол, заморозьте эти образцы при температуре -80 °C и храните до 48 часов. Рекомендуется измерять объем надосадочной жидкости для процесса ацетилирования в день ацетилирования.

2. Стандартная подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте стандарты в день подготовки микропланшетов методом ИФА.

  1. Получение буфера методом ИФА
    1. Добавьте размороженный 10-кратный буферный концентрат ИФА в стеклянную бутылку, содержащую 90 мл сверхчистой воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно смойте остатки 10-кратного буферного концентрата ИФА приготовленным буфером ИФА и верните буфер в стеклянную бутылку. Хранить при температуре 4 °C до 2 месяцев.
  2. Стандартная подготовка массы
    1. Добавьте 1 мл буфера ИФА в стандартный флакон и встряхните до растворения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить при температуре 4 °C до 6 недель.
  3. Стандартное серийное разведение
    1. Промаркируйте пробирку стандарта В и девять трубок стандарта от 0 до стандарта 8.
    2. Добавьте 9,9 мл буфера ИФА в пробирку с маркировкой стандарта В.
    3. Перелейте 100 μL стандартного материала (300 пмоль/мл cGMP) в стандартную В-пробирку и тщательно перемешайте.
    4. Переведите 1 000 μл раствора из стандартной пробирки B в стандартную пробирку 1.
    5. Добавьте 500 мкл буфера ИФА в пробирку с маркировкой стандарта 0 и пробирки с маркировкой стандарта 2 по стандарт 8.
    6. Вихревой стандарт 1 и затем переведите 500 мкл раствора из стандарта 1 в стандарт 2.
    7. Вихревой стандарт 2 и затем переведите 500 мкл раствора из стандарта 2 в стандарт 3.
    8. Продолжайте переливать 500 μL из стандарта n-1 в стандарт n, тщательно перебрасывая стандарты после каждого добавления.
    9. Сбросить 500 мкл раствора из стандарта 8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно используйте стандарты вихря там, где они указаны, для получения оптимальной стандартной кривой. Стандарты от 0 до 8 имеют объем 500 μл. Храните стандарты при температуре 4 °C до использования. Используйте стандарты в день их разведения.

3. Ацетилирование

Примечание: В ходе реакции ацетилирования к 2'-гидроксильной группе молекулы цГМФ добавляется ацетильная группа, которая изменяет структуру цГМФ и приводит к увеличению аффинности связывания антител, повышая чувствительность анализа в ~10 раз. В образцах, содержащих более 1,0 пмоль/мл цГМФ, измерения можно проводить без ацетилирования, и этот этап можно пропустить. Потребность в ацетилировании должна определяться экспериментально, в каждом конкретном случае.

  1. Препарат гидроксида калия
    1. Добавьте 10 мл сверхчистой воды в бутылку с гидроксидом калия, чтобы получить 4 М раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не закрывайте бутылку крышкой, так как гидроксид калия растворится. Хранить в течение нескольких месяцев при комнатной температуре.
  2. Ацетилирование образца ткани
    1. К аликвоте образца объемом 250 мкл добавьте 50 мкл (5:1) 4 М гидроксида калия и сразу же добавьте 12,5 мкл (20:1) ангидрида уксусной кислоты.
    2. Вихрь за 15 с.
    3. Добавьте в образец 12,5 мкл 4 М гидроксида калия и кратковременно перемешайте.
    4. Дополнительно: Если образцы скелетных мышц затвердевают после этапов ацетилирования, центрифугируйте образцы при давлении 17 000 x g в течение 10 минут.
  3. Ацетилирование стандартов
    1. В пробирку с маркировкой стандарта 0 добавьте 100 мкл 4 М гидроксида калия, а затем 25 мкл уксусного ангидрида.
    2. Вихревой стандарт за 15 с.
    3. Добавьте 25 мкл 4 М гидроксида калия к стандарту и быстро перемешайте.
    4. Повторите эти действия для остальных пронумерованных стандартов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте вихревую обработку всех образцов и стандартов в течение одинакового времени для обеспечения стабильных результатов.

4. Разведение образца ткани

  1. Добавьте в микроцентрифужную пробирку заданные соотношения буфера ИФА и аликвоту ацетилированного образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца требуется два разных разведения. Коэффициенты разбавления, которые приводят к тому, что измеренные концентрации цГМФ падают на стандартную кривую, были найдены методом проб и ошибок. Разведения должны быть определены экспериментально для каждого типа тканей, чтобы процент figure-protocol-2 составлял от 20% до 80%. В предыдущих экспериментах по измерению тканей печени коэффициенты разведения 1:2 и 1:3 дали успешные результаты с соответствующими процентными figure-protocol-3 значениями. Эти соотношения также дали успешные результаты для скелетных мышц. Тем не менее, изменения в скелетной мышечной ткани могут потребовать более разбавленных образцов.
  2. Необязательно: Если при добавлении образца ткани в буфер ИФА образуется осадок, центрифугируйте образец в течение 10 мин при 17 000 x g.

5. Подготовка микропланшетов методом ИФА

  1. Препарат индикатора ацетилхолинэстеразы (АХЭ)
    1. Добавьте 6 мл буфера ИФА во флакон с индикатором AChE и осторожно встряхните до растворения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образец при температуре 4 °C до 2 недель. Не делайте вихрей.
  2. Антисывороточный препарат
    1. Добавьте 6 мл буфера ИФА во флакон с антисывороткой и осторожно встряхните до растворения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить при температуре 4 °C не менее 4 недель. Не делайте вихрей.
  3. Пробная и стандартная инкубация
    1. Вихревой стандарт 0.
    2. В микропланшет ИФА добавьте 50 мкл аликвот стандарта 0-5 лунок (NSB и B0; Рисунок 2).
    3. К двум скважинам (NSB; Рисунок 2) содержащий стандарт 0, добавить 50 мкл буфера ИФА.
    4. Используйте один наконечник для дозатора для добавления 50 μL аликвот стандартов от 1 до 8 на микропланшет ELISA в двух экземплярах. Начните с самого разбавленного стандарта (стандарт 8), а затем переходите к следующему наиболее разбавленному стандарту, пока не будут добавлены все стандарты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирируйте и дозируйте каждый стандарт несколько раз, прежде чем добавить его в лунку. Вихревые эталоны перед добавлением их в скважины.
    5. Сделайте вихревой анализ каждого образца перед добавлением 50 μL аликвот в лунки в двух или трех экземплярах.
    6. Добавьте 50 мкл индикатора AChE в каждую NSB, B0, стандартную и выборочную лунку (рис. 2).
    7. Добавьте 50 мкл антисыворотки в каждуюB0, стандартную и лунку образца (рис. 2).
    8. Накройте микропланшет методом ИФА и инкубируйте при температуре 4 °C в течение 18 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно делайте вихри всякий раз, когда это указано, чтобы получить стабильные результаты.
  4. Подготовка промывочного буфера
    1. В стеклянную бутылку добавьте 200 мл сверхчистой воды и 500 μл концентрата буфера для мытья 400x.
    2. С помощью шприца добавьте в стеклянный флакон 100 мкл полисорбата 20.
    3. Аккуратно встряхните бутылку, чтобы перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните буфер для стирки при температуре 4 °C до 2 месяцев. Удвойте объемы сверхчистой воды, концентрата буфера промывки в 400 раз и полисорбата 20 для полного 96-луночного микропланшета образцов.
    4. Перед использованием переложите буфер для стирки во флакон для стирки.
  5. Препарат реагента Эллмана
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьтесь ко дню разработки микропланшетов методом ИФА.
    1. В защищенную от света емкость добавьте 20 мл сверхчистой воды.
    2. Используйте аликвоту сверхчистой воды, чтобы растворить реагент Эллмана.
    3. Переложите реагент Эллмана в светозащищенный контейнер.
    4. Используйте реагент Эллмана, чтобы промыть флакон, в котором он был доставлен.
    5. Перелейте весь раствор обратно в светозащищенный контейнер с помощью пипетки.
  6. Промывка микропланшетов ELISA
    1. Утилизируйте содержимое микропланшета ИФА, перевернув его. Убедитесь, что лунки опорожнены, постучав перевернутой микропластиной ИФА по бумажному полотенцу.
    2. Наполните лунки буфером для промывки с помощью бутылки для промывки.
    3. Осторожно перемешайте микропланшет ELISA в течение 5 секунд, а затем слейте буфер для стирки и выложите остатки жидкости на бумажное полотенце.
    4. Заполните микропланшет ELISA промывочным буфером, аккуратно перемешайте микропланшет ELISA в течение 30 секунд и слейте его содержимое. Повторите это четыре раза, постукивая микропланшетом ИФА по бумажному полотенцу после каждого сброса, чтобы удалить остатки жидкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предотвратите неточные показания поглощения, тщательно промойте микропланшет ELISA.
  7. Разработка и чтение микропланшетов методом ИФА
    1. Перенесите реагент Эллмана в резервуар.
    2. Работая быстро, используйте многоканальную пипетку для аквотирования 200 мкл реагента Эллмана в пустую, NSB, B0, TA, стандартную лунки и лунки для проб.
    3. Добавьте 5 мкл индикатора AChE в лунку TA.
    4. Микропланшет ИФА накрыть парапленкой, поместить в светозащищенный контейнер и выдерживать при комнатной температуре в течение 60-90 мин при перемешивании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте лунки B0 в качестве индикаторов соответствующего времени инкубации. Идеальные лунки B0 выглядят заметно желтыми, но не темными.
    5. Снимите парафиновую пленку и считайте показания микропланшета ИФА с оптической плотностью 412 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лунки B0 с абсорбцией от 0,3 а.е. до 1,0 а.е., за вычетом заготовок, указывают на то, что микропланшет ELISA достаточно развит.
    6. Необязательный: Если микропланшет ИФА недопроявлен, замените парафиновую пленку и дайте ему поинкубироваться в защищенном от света контейнере в течение дополнительного периода. Если микропланшет ИФА чрезмерно проявлен, сбросьте реагент Эллмана, промойте один раз промывочным буфером и повторно проявите микропланшет ИФА с помощью реагента Эллмана.

figure-protocol-4
Рисунок 2: Схема расположения микропланшетов. Пример компоновки микропланшета для соревновательного ИФА. NSB указывает на неспецифическую связующую лунку. B0 указывает на максимальную лунку привязки. ТА хорошо указывает на общую активность. Std. указывает на стандартную лунку с соответствующим ее номером. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

6. Преобразование в концентрацию

  1. Расчеты связанного трассировщика AChE
    1. Усредните поглощения двух заготовок и вычтите среднее значение из поглощения каждой лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте вычтенные из пробелов поглощения для остальных расчетов.
    2. Рассчитайте средние коэффициенты поглощения в скважинах NSB, B0 и глухих скважинах.
    3. Используйте следующее уравнение для расчета скорректированного поглощения B0 :
      figure-protocol-5
      ПРИМЕЧАНИЕ: Корр. означает скорректированный, Abs. означает поглощение, а Avg. означает среднее. Если среднее поглощение глухих лунок (за вычетом среднего значения пустого колодца) является отрицательным числом, используйте ноль для расчета.
    4. Рассчитайте figure-protocol-6 соотношение для каждого стандарта и образца с помощью следующей формулы:
      figure-protocol-7
    5. Умножьте figure-protocol-8 отношение каждой выборки на 100, чтобы вычислить процент figure-protocol-9 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы от 20% до 80% попадают на стандартную кривую.
  2. Расчет стандартных кривых
    1. Усреднить figure-protocol-10 соотношение дублирующих лунок каждого стандарта (1 к 8).
    2. Рассчитайте логит усредненного figure-protocol-11 коэффициента каждого стандарта с помощью следующей формулы:
      figure-protocol-12
    3. Используя известные концентрации каждого стандарта (таблица 1) в качестве значений X и logit figure-protocol-13 каждого стандарта в качестве значений Y, рассчитают наклон и точку пересечения с осью Y.
    4. Рассчитайте коэффициент детерминации, используя log10 известных концентраций стандарта cGMP в качестве значений X и logitfigure-protocol-14 каждого стандарта в качестве значений Y.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что коэффициент детерминации близок к 1.
  3. Расчет концентрации цГМФ в пмоль/мл
    1. Рассчитайте logit figure-protocol-15 каждой выборки с помощью следующего уравнения:
      figure-protocol-16
    2. Для расчета концентрации цГМФ в каждом образце (в пикомолах цГМФ на миллилитр образца) используют следующее уравнение:
      figure-protocol-17
      ПРИМЕЧАНИЕ: D.R. расшифровывается как коэффициент разбавления. Сумма гомогената D.R. для образцов печени, разбавленных соляной кислотой в соотношении 1:5, равна 6. Сумма D.R. буфера для образцов печени, разведенных в соотношении разведения буфера ELISA в соотношении 1:2, равна 3. Поэтому сгруппированные по скобкам термины умножаются на 18.
  4. Расчеты концентрации цГМФ в нмоль/г
    1. Рассчитайте наномоли цГМФ на лунку с помощью следующего уравнения:
      figure-protocol-18
    2. Рассчитайте граммы ткани в каждом ацетилированном образце с помощью следующего уравнения:
      figure-protocol-19
      ПРИМЕЧАНИЕ: «мг ткани» — это масса ткани, добавляемой в гомогенизационную трубку в миллиграммах. «объем используемой HCl» означает объем 0,1 Н соляной кислоты, использованный для разбавления образцов для гомогенизации.
    3. Рассчитайте количество граммов ткани в каждом образце, разбавленном буфером ИФА, используя следующее уравнение:
      figure-protocol-20
      ПРИМЕЧАНИЕ: «объем разбавленного образца» – это объем образца, разбавленного буфером методом ИФА. «250 μл» — объем ацетилированного образца. Упомянутыми «реагентами» являются реагенты ацетилирования 4 М KOH и ангидрид уксусной кислоты.
    4. Рассчитайте граммы ткани на лунку по следующему уравнению:
      figure-protocol-21
      ПРИМЕЧАНИЕ: «Объем буфера» — это объем буфера ИФА, используемый для разбавления образцов тканей перед добавлением образцов в лунки.
    5. Разделите наномоли цГМФ в лунке на граммы ткани в лунке, чтобы рассчитать концентрацию цГМФ в нмоль/г.
Стандартный номерКонцентрации цГМФ (пмоль/мл)
Стандарт 13.0
Стандарт 21.5
Стандарт 30.75
Стандарт 40.375
Стандарт 50.1875
Стандарт 60.09375
Стандарт 70.046875
Стандарт 80.0234375

Таблица 1: Стандартные концентрации. Известные концентрации стандартов от 1 до 8.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Йоркширских домашних свиней, получавших диетический хлорид натрия (0,15 ммоль/кг) или 15N-меченых нитратов (0,15 ммоль/кг), вводимых один раз в сутки в течение пяти дней подряд, перфузировали раствором гепарина натрия (0,9% натрия хлорида) перед сбором тканей; Все подробности сборника были ранее опубликованы19. Концентрации цГМФ в ягодичных мышцах и печени четырех йоркширских домашних свиней измеряли в соответствии с описанным протоколом ИФА. Ткани печени разбавляли в соотношении 1:5, а ягодичные мышцы в соотношении 1:10 с 0,1 N соляной кислотой (HCl) для осаждения белков. Разбавленные HCl гомогенаты ацетилировали, а затем разбавляли буфером ИФА в соотношении разведения 1:2 и 1:3 для образцов печени и ягодичных мышц. Концентрации цГМФ измеряли, как описано выше. Абсорбции преобразовывали в пикомоль цГМФ на миллилитр подготовленного образца, а затем в наномоли цГМФ на грамм ткани (нмоль/г ткани), как указано в вышеуказанном протоколе.

Концентрации цГМФ, измеренные в тканях печени, дали оптимальные экспериментальные результаты в вышеуказанных условиях. Концентрации цГМФ в контрольной группе и в группе, получавшей нитраты, в печени свиней составляют 0,0202 нмоль/г ± 0,003 нмоль/г ткани и 0,0364 нмоль/г ± 0,011 нмоль/г ткани соответственно (рис. 3). Несколько значений подтверждают достоверность результатов. Поглощения лунок B0 с вычитанием заготовок, которые варьируются от 0,466 до 0,475, находятся в диапазоне от 0,3 до 1,0 а.е., что подтверждает достаточное развитие микропланшетов с помощью реагента Эллмана. Высокое качество стандартной кривой проявляется как в постепенном увеличении поглощений от стандарта 1 до стандарта 8, так и в линейности стандартной кривой, что подтверждается коэффициентом детерминации 0,99. Процент figure-results-1 для каждой измеренной скважины (31,5%-71,2%) составляет от 20% до 80%, подтверждая, что все образцы попадают в стандартную кривую. К интерпретации пригодны образцы, обладающие заявленными характеристиками.

Концентрации цГМФ, измеренные в ягодичных мышечных тканях, дали неоптимальные экспериментальные результаты. Субоптимальная метка присваивается результатам по ягодичным мышцам, потому что большинство процентных figure-results-2 значений лунок ягодичных мышц (3,69%-27,3%) упали ниже 20%, что указывает на то, что для того, чтобы абсорбционные свойства упали на стандартную кривую, потребовалось больше разбавленных образцов. Концентрации цГМФ в контрольной группе и в группе, получавшей нитраты, в ягодичных мышцах свиньи составляют 1,22 нмоль/г ± 0,49 нмоль/г ткани и 0,732 нмоль/г ± 0,18 нмоль/г ткани соответственно (график не показан). Образцы ягодичных мышц имеют общую абсорбцию из образцов печениB0 и стандартов. Использование этих неоптимальных выборок может привести к неверным выводам; В связи с этим необходимо готовить более разбавленные образцы и повторно измерять концентрации цГМФ.

figure-results-3
Рисунок 3: Концентрация цГМФ в тканях печени. Средняя концентрация цГМФ печени свиней, обработанной хлоридом натрия (0,15 ммоль/кг) или 15N-меченым нитратом (0,15 ммоль/кг) в нмоль/г ткани. n = 4; полосы погрешности указывают на стандартное отклонение; данные были проанализированы с помощью t-критерия Уэлча; ns не означает никакой значимости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол содержит инструкции по шагам, необходимым для измерения концентраций цГМФ в твердых тканях с помощью конкурентного ИФА. Колебания концентраций цГМФ могут указывать на различия в распространенности NO в тканях. Исследуя эти различия в солидных тканях, можно получить информацию о NO в различных органах.

В протоколе образцы тканей сначала были гомогенизированы в рамках подготовки к ИФА. Это начиналось с мгновенного замораживания массы твердой ткани и последующего ее измельчения. Разрушение тканей перед этапом гомогенизации призвано помочь гомогенизатору гранул лизировать клетки. Ткани гомогенизировали в 0,1 Н соляной кислоты для осаждения белков, метод, используемый в других методах20,21. Наконец, твердые вещества и осадок отделяли от растворимых компонентов с помощью центрифугирования. Чтобы построить стандартную кривую, запас cGMP (300 пмоль cGMP/мл) был последовательно разбавлен для получения восьми различных стандартов. Стандарты и образцы ацетилировали для повышения чувствительности анализа путем обнаружения концентраций до 0,1 пмоль цГМФ/мл. Это увеличение чувствительности достигается, когда ацетильная группа образует связь с цГМФ, улучшая способность каждого антитела (присутствующего в антисыворотке) связываться с ацетилированным цГМФ18. Ацетилирование как стандартов, так и образцов обеспечивает однородность связывания cGMP между лунками. Стадия ацетилирования может быть опущена как для стандартов, так и для образцов, если ожидается, что концентрация цГМФ в микропланшетных лунках превысит1,0 пмоль/мл 18.

При подготовке к добавлению проб в лунки образцы дополнительно разбавляли буфером ИФА. Дополнительное разбавление позволило образцам попасть на стандартную кривую и больше напоминать содержимое NSB, B0 и стандартных лунок, создавая однородность. Наряду с образцами и стандартами в скважинах смешивают несколько других растворов. В лунках NSB буфер ИФА (с реагентами ацетилирования и без них) добавляется при одновременном удержании антисыворотки. Это необходимо для определения количества индикатора AChE (ацетилхолинэстераза, связанного с цГМФ), который связывается с мышиным IgG, прилипшим к лунке, в отсутствие специфического антитела, содержащего антисыворотку. В0 лунок содержался буфер ИФА (с реагентами ацетилирования), индикатор АХЭ и антисыворотка; таким образом, лункиB0 демонстрируют связывающую способность индикатора AChE без конкуренции со стороны cGMP. После того как все лунки будут заполнены соответствующим образом, микропластина инкубируется, а затем промывается. В скважины был добавлен реагент Эллмана. Наконец, индикатор AChE был добавлен в TA задолго до того, как был добавлен реагент Эллмана. Это хорошо отражает каталитическую активность индикатора AChE независимо от того, сколько индикатора было связано с микропланшетом антителами. Микропланшет был разработан при комнатной температуре, что позволило индикатору AChE катализировать колориметрическую реакцию.

Несколько этапов в протоколе могут изменить результаты анализа; Для достижения оптимальных результатов необходимо проявлять особую осторожность при выполнении следующих шагов. Идентификация соответствующих разведений для каждого типа тканей на стадии гомогенизации и после ацетилирования необходима для того, чтобы гарантировать, что образцы попадают на стандартную кривую. При составлении стандартов растворы должны быть тщательно перемешаны или перемешаны перед удалением аликвоты или после добавления аликвоты. Этот шаг важен для достижения ожидаемых концентраций cGMP для каждого стандарта. На этапах ацетилирования каждый стандарт и образец должны подвергаться вихревому воздействию в течение одинаковой продолжительности для достижения стабильных показателей поглощения. Стандарты и образцы также должны быть заперты непосредственно перед добавлением аликвоты в соответствующую лунку. Эта практика приводит к более точным концентрациям цГМФ. Тщательная промывка микропланшета также повышает точность значений абсорбции, так как удаляет весь несвязанный индикатор AChE из лунки. После добавления реагента Эллмана следует дать достаточно времени для проявления микропланшета, уделяя внимание цвету и, что наиболее важно, абсорбционным свойствам лунок B0 . Важно понимать, что концентрация цГМФ между дубликатами или тройками может больше варьироваться в образцах с более низкими уровнями цГМФ по сравнению с образцами с более высокими концентрациями. Измерение более концентрированной пробы может помочь решить эту проблему. Кроме того, чтобы учесть любую вариабельность между микропланшетами, образцы одного и того же типа ткани должны быть измерены на одном и том же планшете, когда это возможно. Ожидается, что следование этим рекомендациям улучшит качество полученных данных анализа.

Вышеуказанный протокол может быть экстраполирован на другие мягкие, твердые ткани. Дальнейшая разработка подраздела «Препарирование тканей» вышеуказанного протокола может привести к созданию метода, пригодного для обработки твердых тканей, в том числе и костных, которые могут представлять интерес из-за своей васкулярности. Дальнейшее развитие этого метода может привести к созданию метода, пригодного для измерения концентраций цГМФ в широком спектре твердых тканей, что приведет к полезному методу сбора дополнительной информации о распространенности NO практически в любой ткани. Несмотря на то, что протокол конкурентного ИФА, указанный выше, является полезным методом для измерения цГМФ и оценки содержания NO, он имеет два заметных ограничения: (1) Этот анализ не делает различий между цГМФ, синтезированной растворимой гуанилилциклазой, и цГМФ, синтезированной дисперсной гуанилилциклазой (pGC). Натрийуретические пептиды стимулируют активность pGC22 , и, таким образом, изменения цГМФ через этот путь не указывают на изменения в распространенности NO; (2) Кроме того, ферменты фосфодиэстеразы (ФДЭ) влияют на результаты анализа ИФА. Некоторые ФДЭ гидролизуют цГМФ, снижая его концентрацию после стимуляции sGC с помощью NO23. Таким образом, каталитическая активность ФДЭ может скрывать связь между концентрациями цГМФ и распространенностью NO. Добавление ингибитора ФДЭ5, такого как силденафил, для предотвращения потери цГМФ целесообразно для экспериментов, направленных в первую очередь на получение точных концентраций цГМФ, в отличие от получения измерений для наблюдения за тенденциями концентраций цГМФ. Ингибиторы ФДЭ5 можно вводить в виде силденафила животным примерно за 1 ч до сбора проб (эффекты длятся до 4 ч24) или, если такое введение невозможно, силденафил может быть добавлен к собранным пробам. При ингибировании ФДЭ после забора тканей добавьте силденафил в 0,1 Н соляной кислоты, чтобы ткани были гомогенизированы в присутствии силденафила. Измерения с силденафилом и без него необходимо проводить, чтобы убедиться в отсутствии перекрестных помех между лечением животных и силденафилом.

Несмотря на свои ограничения, этот анализ используется в качестве информативного материала о нисходящей передаче сигнала NO. В заключение следует отметить, что сочетание измерения концентраций цГМФ в твердых тканях с другими методами измерения NO позволяет лучше понять эффекты NO в органах.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом 1ZIADK025104-18, присужденным Алану Н. Шехтеру от NIDDK/NIH.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл прозрачного шприца для полости рта BDБектон Дикинсон50382903052177
14 мл Пробирка с круглым дномСокол352059
2,0 мл Микропробирки, АссортиOlympus Plastics24-283А
30-300 & микро; L многоканальный пипетка Эппендорф3125000052
Ангидрид уксусной кислоты (в наборе cGMP)Каймановы химические компании40003198% чистый<бр/> <сильный>Опасный: Легковоспламеняющийся, Коррозионный: сильно обжигает кожу, повреждает глаза, Острый токсит<бр/> <сильный>Безопасное обращение: Хранить вдали от источников возгорания, работать в проветриваемом помещении, надевать перчатки
Индикатор ацетилхолинэстеразы cGMP (в наборе cGMP)Каймановы химические компании481020калия фосфат двухосновный, натрия хлорид,  фосфат калия моноосновный, бычий альбумин, азид натрия, ЭДТА, cGMP AChE tracer
Hazard: Опасность для здоровья: токсичность для органов при повторном воздействии,
Коррозионный: повреждение глаз,
Раздражитель кожи и дыхательных путей
Безопасное обращение: Работа в проветриваемом помещении, Надевайте перчатки
Антисыворотка cGMP ELISA (в наборе cGMP)Каймановы химические компании481022калия фосфат двухосновный, натрия хлорид,  калийфосфат моноосновный, бычий альбумин,  азид натрия, ЭДТА, кролик анти-цГМФ поликлональный Антисыворотка
<сильный>Опасность: Опасность для здоровья: токсичность для органов при повторном воздействии,
Коррозионный: повреждение глаз,
Раздражитель кожи и дыхательных путей, Острая токсичность
<сильный>Безопасное обращение: Работайте в проветриваемом помещении, надевайте перчатки
Стандарт cGMP ELISA (в комплекте cGMP)Каймановы химические компании481024калия фосфат двухосновный, натрия хлорид,  калийфосфат моноосновный, бычий альбумин,  азид натрия, ЭДТА, стандарт cGMP
<сильный>Опасность: Опасность для здоровья: токсичность для органов при повторном воздействии,
Коррозионный: повреждение глаз,
Раздражитель кожи и дыхательных путей
<сильный>Безопасное обращение: Работайте в проветриваемом помещении, надевайте перчатки
Циклический набор GMP ELISA KitКаймановы химические компании581021
Буферный концентрат ELISA 10X (в наборе cGMP)Каймановы химические компании4000601 М фосфат, 1% БСА, 4 М хлорид натрия, 10 мМ ЭДТА, 0,1% азид натрия
<сильный>Опасность: Опасность для здоровья: токсичность для органов при повторном воздействии,
Коррозионный: повреждение глаз,
Раздражители кожи и дыхательных путей
<сильный>Безопасное обращение: Работать в проветриваемом помещении, хранить в контейнере с закрывающейся крышкой, надевать перчатки
Резервуар для реагентов ELISAПирс (теперь Thermo Fisher Scientific)15075
Реагент Эллмана (в наборе cGMP)Каймановы химические компании400050Калия фосфат двухосновный, Хлорид натрия, Калия фосфат моноосновный, ацетилтиохолин (йодид), 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота)
Опасность: Острая токсичность, Опасность для здоровья: Токсичность для органов, Коррозионный: Повреждение глаз, Раздражение кожи, Респираторный раздражитель
Безопасное обращение: Работайте в проветриваемом помещении, надевайте перчатки
Соляная кислотаСигма-Олдрич320331<сильный>Опасный: Коррозионный: разъедает металл, сильно обжигает кожу, Повреждение глаз, Респираторный раздражитель
<сильный>Безопасное обращение: Работайте в проветриваемом помещении, надевайте перчатки
Жидкий азотКислород РобертаАзот
<сильный>Опасность: Сжатый газ: Риск криогенных ожогов, фросбита, удушья
<сильный>Безопасное обращение: Работайте в проветриваемом помещении, надевайте перчатки
Пластина с покрытием IgG против кролика для мыши (в комплекте cGMP)Каймановы химические компании400006
Опасность: Нет
Новый классический баланс MFMettler Toledo
Орбитальный встряхиватель Стовалл Лайф Сайенс Инк. (сейчас IBI Scientific)15-453-211 (Варьируется)
ПарафильмКомпания Bemis, Inc.3023-4526 (Варьируется)
Полисорбат 20 (в наборе cGMP)Каймановы химические компании400035
Опасность: Нет
Гидроксид калия (в наборе cGMP)Каймановы химические компании40002985% чистый<бр/> <сильный>опасный: Коррозионный: разъедает металлы и кожу, <бр/> Повреждение глаз, Острая токсичность<бр/> <сильный>Безопасное обращение: Работайте в проветриваемом помещении, надевайте перчатки
Гомогенизатор Precellys EvolutionБертин ТехнолоджисPE000062-ПЭВО0-А
Precellys Lysing Kit для гомогенизации твердых тканейБертин ТехнолоджисP000911-ЛЫСК0-А
Считыватель микропланшетов SenseХИДЭКС425-301
Центрифуга Sorvall Legend Micro 17RThermo Fisher Scientific75002441
Измельчитель тканейКлеточная дробилкаКомплект для дробилки
Вихревой джинн 2Научные отрасли СИ-0246
Бутылка для мытьяСигма-ОлдричZ423092
Буферный концентрат для промывки 400X (в комплекте cGMP)Каймановы химические компании400062калия фосфат двухосновный, калийфосфат моноосновный, вода
<сильный>Опасность: Коррозионный: Повреждение глаз, Острая токсичность, Раздражитель кожи, Органная токсичность
<сильный>Безопасное обращение: Работайте в проветриваемом помещении, надевайте перчатки

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dierks, E. A., Burstyn, J. N. Nitric oxide (NO), the only nitrogen monoxide redox form capable of activating soluble guanylyl cyclase. Biochem Pharmacol. 51 (12), 1593-1600 (1996).
  2. Koglin, M., Behrends, S. A functional domain of the alpha1 subunit of soluble guanylyl cyclase is necessary for activation of the enzyme by nitric oxide and YC-1 but is not involved in heme binding. J Biol Chem. 278 (14), 12590-12597 (2003).
  3. Olson, L. J., Knych, E. T., Herzig, T. C., Drewett, J. G. Selective guanylyl cyclase inhibitor reverses nitric oxide-induced vasorelaxation. Hypertension. 29 (1), 254-261 (1997).
  4. Bailey, S. J., et al. Dietary nitrate supplementation reduces the O2 cost of low-intensity exercise and enhances tolerance to high-intensity exercise in humans. J Appl Physiol (1985). 107 (4), 1144-1155 (2009).
  5. Vanhatalo, A., et al. Acute and chronic effects of dietary nitrate supplementation on blood pressure and the physiological responses to moderate-intensity and incremental exercise. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (4), R1121-R1131 (2010).
  6. Qin, X., et al. Balancing role of nitric oxide in complement-mediated activation of platelets from mcd59a and mcd59b double-knockout mice. Am J Hematol. 84 (4), 221-227 (2009).
  7. Radomski, M. W., Palmer, R. M., Moncada, S. An l-arginine/nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation. PNAS. 87 (13), 5193-5197 (1990).
  8. Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: Implications for the perivascular dynamics of NO and O2. PNAS. 98 (1), 355-360 (2001).
  9. Park, J. W., et al. Preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements. J Vis Exp. (173), e62427(2021).
  10. Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166(2020).
  11. Srihirun, S., et al. Nitrate uptake and metabolism in human skeletal muscle cell cultures. Nitric Oxide. 94, 1-8 (2020).
  12. Montoliu, C., et al. Correlation of nitric oxide and atrial natriuretic peptide changes with altered cGMP homeostasis in liver cirrhosis. Liver Int. 25, 787-795 (2005).
  13. Origlia, C., et al. Platelet cGMP inversely correlates with age in healthy subjects. J Endocrinol Invest. 27 (2), RC1-RC4 (2004).
  14. Calamera, G., et al. Fret-based cyclic GMP biosensors measure low cGMP concentrations in cardiomyocytes and neurons. Commun Biol. 2, 394(2019).
  15. Rutkowski, N., et al. Real-time imaging of cGMP signaling shows pronounced differences between glomerular endothelial cells and podocytes. Sci Rep. 14, 26099(2024).
  16. Straub, A. C., Beuve, A. A primer for measuring cGMP signaling and cGMP-mediated vascular relaxation. Nitric Oxide. 117, 40-45 (2021).
  17. Huang, K. T., Lin, T. J., Hsu, M. H. Determination of cyclic GMP concentration using a gold nanoparticle-modified optical fiber. Biosens Bioelectron. 26 (1), 11-15 (2010).
  18. Cyclic gmp elisa kit. , https://cdn.caymanchem.com/cdn/seawolf/insert/581021.pdf (2024).
  19. Park, J. W., et al. Dietary nitrate metabolism in porcine ocular tissues determined using 15N-labeled sodium nitrate supplementation. Nutrients. 16 (8), 1154(2024).
  20. Cgmp enzyme immunoassay kit, direct technical bulletin. , https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/289/571/cg200bul.pdf?srsltid=AfmBOoqWnOVurQ549ESXk_E7DJoqNs7v268ktTabHHYc6I_6NZkc-j_V (2025).
  21. Cyclic gmp competitive elisa lysate and homogenate samples. , https://assets.thermofisher.com/TFS Assets/LSG/certificate/Certificates%20of%20Analysis/RA229061_EMSCGMPL.pdf (2025).
  22. Hamad, A. M., Range, S., Holland, E., Knox, A. J. Regulation of cGMP by soluble and particulate guanylyl cyclases in cultured human airway smooth muscle. Am J Physiol. 273 (4), L807-L813 (1997).
  23. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. J Biol Chem. 279 (25), 26149-26158 (2004).
  24. Corbin, J. D., et al. [3h]sildenafil binding to phosphodiesterase-5 is specific, kinetically heterogeneous, and stimulated by cGMP. Mol Pharmacol. 63 (6), 1364-1372 (2003).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи