Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Гипоксия изменяет уровни микроРНК, участвующие в неменделевском наследовании расстройств аутистического спектра у мышей

41.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68435

⸱

11 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Gevher Nesibe Genome and Stem Cell Institute, Erciyes University, 2Betül Ziya Eren Genome and Stem Cell (GENKÖK) Center, Erciyes University, 3Department of Medical Biology, Erciyes University, 4Department of Histology and Embryology, Yozgat Bozok University, 5Department of Physiology, Erciyes University, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 7University of Nice Sophia Antipolis, 8Department of Medical Genetics, Erciyes University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол индуцирования гипоксии у неонатальных мышей путем доставки их в контролируемую среду с различной концентрацией кислорода. Мышиные модели, подвергшиеся кислородным вариациям при рождении, устойчиво варьировали экспрессию микроРНК, участвующих в индукции поведенческих фенотипических изменений, таких как аутизм.

Аннотация

Гипоксия может возникать в разной степени по разным причинам в течение перинатального периода, влияя на развитие. Мы стремимся изучить последствия легкой и тяжелой неонатальной гипоксии у мышей, уделяя особое внимание ее потенциальной связи с нейродегенеративными дисфункциями мозга плода, связанными с расстройствами аутистического спектра (РАС).

Мы индуцировали гипоксию у неонатальных мышей, доставляя их в контролируемую среду с различной концентрацией кислорода. Результаты показали повышенный уровень HIF-1α (маркер гипоксии) в коре головного мозга и гиппокампе, а также усиление нейродегенерации в этих областях. Кроме того, мы наблюдали измененную экспрессию микроРНК, связанных с РАС (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p и miR-499a-5p) в группах с гипоксией, что согласуется с предыдущими результатами на моделях РАС у человека и животных. Эти молекулярные изменения сопровождались поведенческими изменениями, такими как снижение движения, скорости, социального взаимодействия и повторяющегося поведения, а также повышенная склонность к поиску углов у мышей, подвергавшихся гипоксическим условиям. Хотя поведенческие и молекулярные изменения были обнаружены в группе с 12%O2 (легкая гипоксия), наиболее выраженные изменения наблюдались в группах с более тяжелой гипоксией, при 10%O2 и 8%O2.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что неонатальная гипоксия может вызывать длительные молекулярные изменения, связанные с нейродегенеративными заболеваниями с поведенческими последствиями. Более того, даже при нормальных родах воздействие гипоксии во время раннего развития может ухудшить память и обучение. Полученные результаты подчеркивают необходимость раннего выявления и вмешательства у новорожденных, подвергшихся воздействию гипоксии, для предотвращения долгосрочных неврологических проблем. Уровни микроРНК регулируются во время развития, и их модификации в тканях, особенно в половых клетках, представляют собой фактор риска для следующего поколения. Результаты анализа обеспечивают основу для изучения регуляторных путей, влияющих на функциональные и поведенческие изменения при гипоксии.

Введение

Определяемая как состояние дефицита кислорода, гипоксия может вызывать уникальные клеточные и молекулярные реакции, которые имеют решающее значение для понимания ее роли в различных патологиях. Это может нарушить последовательность развития, что приведет к молекулярным, клеточным и нейронным изменениям и травмам. Кроме того, раннее воздействие гипоксии прерывает развитие центральной нервной системы (ЦНС), нарушая аксональные связи и развитие синапсов1.

Кроме того, хотя было показано, что гипоксия оказывает неблагоприятное воздействие на развитие ЦНС, она также может играть важную физиологическую роль при определенных условиях, например, во время эмбриогенеза. Нормальная физиологическая гипоксия относится к ситуации, при которой уровень кислорода естественным образом низок во время эмбрионального развития. Этот процесс позволяет эмбриональным клеткам вырабатывать энергию, способствуя анаэробному метаболизму, поддерживает развитие системы кровообращения, ускоряя васкуляризацию, обеспечивает правильное развитие сердца и костей, а также стимулирует миграциюклеток нервного гребня. И наоборот, гипоксия, возникающая вне физиологического контекста, может оказывать неблагоприятное воздействие на развитие и общее состояние здоровья, включая эмбриональное развитие, что может привести к недоношенности или даже эмбриональнойлетальности. Таким образом, это серьезная проблема общественного здравоохранения, поскольку многие новорожденные испытывают гипоксические состояния во время нормальных родов, часто без немедленного распознавания со стороны лиц, осуществляющих уход, или медицинского персонала3. Кроме того, изменения в нейронных связях, связанные с гипоксией, связаны с нарушениями развития нервной системы, включая расстройства аутистического спектра (РАС) и интеллектуальныенарушения.

С молекулярной точки зрения, гипоксия может влиять на развитие нервной системы, изменяя экспрессию генов, регулирующих синаптические функции, тем самым нарушая нейронные связи и способствуя развитию нарушений развития нервнойсистемы.

Клинически неонатальная гипоксия влияет на развитие ЦНС через гормональные и метаболические пути1. В ответ на острую гипоксию гипоталамус быстро высвобождает кортикотропин-рилизинг-гормон и аргинин-вазопрессин, что затем вызывает выброс адренокортикотропного гормона из передней доли гипофиза, за которым следует выработка глюкокортикоидов в коре надпочечников плода, и степень этой реакции коррелирует с интенсивностью и продолжительностью гипоксии. Эта быстрая реакция оси гипоталамо-гипофизарно-надпочечников (HPA) на острый стресс подчеркивает критическую роль глюкокортикоидов в ограничении физиологических последствий стресса и поддержании гомеостаза плода путем влияния на связанную с этим экспрессию генов, синтез белка и клеточный метаболизм 5,6.

Снижение нормального уровня кислорода активирует различные реакции на гипоксию, большинство из которых регулируются факторами транскрипции, факторами, индуцируемыми гипоксией (HIFs), и клеточными сенсорами кислорода, такими как пролилгидроксилазы (PHD)1. HIF-1, регулятор гомеостазаO2 , как показано в исследованиях in vitro 7, представляет собой гетеродимер, состоящий из HIF-1α и HIF-1β8. В условиях гипоксии замещение атома водорода гидроксильной группой в комплексе снижается, что приводит к накоплению HIF-1α, который затем димеризуется с HIF-1β. В результате димер HIF-1 транслоцируется в ядро, где активирует транскрипцию сотенгенов1.

Кислородозависимая природа нейронов делает их особенно восприимчивыми к гипоксическому стрессу. Таким образом, гипоксия может оказывать значительное влияние на физиологию мозга с долгосрочными последствиями для функции нейронов, нарушая поиск аксональных путейи развитие синапсов. Эти изменения в нейронных связях могут предрасполагать к различным нарушениям развития нервной системы, таким как РАС иумственная отсталость.

Перинатальная асфиксия определяется как кислородное голодание во время родов и может возникнуть в результате перинатальных событий, таких как материнско-фетальное кровотечение, сдавление пуповины, плацентарные осложнения, разрыв матки, дистоция плечевого сустава или неспособность новорожденного сделать свой первый вдох. Это серьезное событие ежегодно затрагивает около четырех миллионов новорожденных во всем мире и приводит к одному миллиону неонатальных смертей 11,12,13. Хотя большинство младенцев выживают после эпизодов гипоксии, у некоторых пациентов развивается гипоксически-ишемическая энцефалопатия, которая может привести к постоянным неврологическим проблемам, таким как судорожные расстройства, церебральный паралич, когнитивные задержки и двигательный дефицит. Кроме того, асфиксия и ишемия могут вызывать дисфункцию различных органов и систем, таких как ЦНС (28%), сердечно-сосудистая система (25%), почки (50%) и легкие (23%)11.

Кроме того, незрелость сосудистой системы головного мозга и слабая ауторегуляция являются факторами, предрасполагающими новорожденных к ишемическим рискам. В таких процессах воспаление и окислительный стресс являются основными медиаторами гипоксически-ишемического повреждения новорожденных и связанных с ним механизмов гибели клеток. Аномальный апоптоз может подвергать развивающийся мозг риску двигательных и когнитивных расстройств14.

Учитывая сложность РАС, важно понимать лежащую в его основе генетику, которая, по-видимому, имеет полигенную структуру, а также факторы окружающей среды, определяющие его развитие. В частности, полигенная основа РАС подразумевает многофакторную этиологию, при которой генетическая предрасположенность взаимодействует с внешними факторами, в том числе с гипоксией. Конкордантность в 60-92%, наблюдаемая у монозиготных близнецов, подчеркивает важность генетических влияний, в то время как несогласованность указывает на то, что факторы окружающей среды также играют роль. Распространенность аутизма оценивается в 13 на 10 000, и считается, что этот показатель увеличился за последние15 лет. Исследования подтверждают гипотезу о том, что воздействие факторов окружающей среды во время беременности может увеличить риск развития аутизма, но результаты этих исследований часто противоречивы из-за различий в диагностических критериях, группах сравнения, размере выборкии методах оценки воздействия.

Хотя отличительные невропатологические данные неясны, исследования выявляют микроскопические и функциональные аномалии мозга. Эти аномалии позволяют предположить, что этиологически значимый период может быть внутриутробным и что патогенез может начаться в пренатальном периоде. Воздействие во время беременности является основным направлением эпидемиологических исследований потенциальных факторов риска аутизма. В частности, гипотеза о том, что акушерские осложнения могут увеличивать риск развития РАС, подтверждается многими исследованиями, но величина и последствия этих эффектов варьируются вразных исследованиях.

Помимо генетических факторов, ключевую роль в регуляции экспрессии генов в условиях гипоксии играют эпигенетические механизмы. Примечательно, что микроРНК представляют собой ключевой регуляторный механизм в клеточном ответе на гипоксию, например, их влияние на HIF. На ранних стадиях гипоксии специфические изменения уровней микроРНК могут способствовать накоплению HIF-1 и поддержанию стабильных уровней HIF-2 и HIF-318. Несмотря на то, что профиль экспрессии многих микроРНК изменяется в условиях гипоксии и ишемии, было показано, что ограниченное количество микроРНК, ассоциированных с гипоксией, играют функциональную роль и влияют на экспрессию HIF. Это объясняет, почему разные ткани человека различаются по гипоксическим реакциям из-за тканеспецифической экспрессии микроРНК18.

Новые данные также указывают на то, что специфические микроРНК вовлечены в патологию РАС. В нашей предыдущей работе мы продемонстрировали, что miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p и miR-499a-5p, которые, как известно, регулируют выживаемость клеток, дифференцировку и стрессовые реакции при раке, демонстрируют аберрантную экспрессию у пациентов с РАС, потенциально влияя на исходы развития нервной системы. Затем мы подтвердили эти результаты на образцах крови, гипоталамуса и спермы мышей с РАС, показав устойчивую связь изменений в генной регуляциис заболеванием. Эти результаты указывают на то, что подавление этих микроРНК на критических стадиях роста и развития может оказывать значительное влияние на развитие таких заболеваний, как РАС. Это еще раз демонстрирует глубокое влияние неонатальной гипоксии на молекулярные и поведенческие характеристики.

В этом исследовании мы проверили влияние легкой и умеренной неонатальной гипоксии на риск развития аутизма во взрослом возрасте. Для этого новорожденные мыши подвергались различным уровням гипоксии. Действительно, мыши, которые испытали гипоксию при рождении, демонстрируют поведенческие изменения во взрослом возрасте и, что более важно, на молекулярном уровне изменения, связанные с РАС. Таким образом, наши результаты предоставили ценную информацию о долгосрочных последствиях гипоксии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы экспериментов были одобрены Местным комитетом по этике экспериментов на животных Университета Эрджиес (HAYDEK) и проводились под номером лицензии 21/216.

1. Животные объекты

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании приняли участие мыши Balb/c из трансгенного подразделения Центра генома и стволовых клеток Бетюль-Зия ЭРЕН (GENKÖK) в Университете Эрджиес.

  1. Используйте 2-месячных мышей Balb/c весом в среднем 18-25 г. Поддерживайте мышей при температуре 20 ± 2°C, с влажностью 52 ± 3% в течение 12-часового цикла свет/темнота (6-18 часов).
  2. Кормите мышей стандартными мышиными гранулами, еженедельно меняя подстилку, и предоставляйте неограниченный доступ к еде и воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Молекулярные исследования проводились в лабораториях геномики и гипоксии GENKÖK и в лаборатории гистологии и эмбриологии университета Бозок. «Точка STOP» указывает, где вы можете приостановить и сохранить свою работу при указанной температуре.

2. Становление модели гипоксии

  1. Спланируйте эксперимент таким образом, чтобы включить в него 4 группы, в том числе 3 гипоксические и 1 фиктивную контрольную группу.
  2. Спаривайте здоровых самок мышей со здоровыми самцами мышей, чтобы сформировать здоровых беременных самок мышей, которые в конечном итоге будут классифицированы на следующие группы: тяжелая гипоксия (8% O2) (n = 4), умеренная гипоксия (10% O2) (n = 4), легкая гипоксия (12% O2) (n = 4) и нормоксия (21% O2) в качестве фиктивной контрольной группы (n = 4).
  3. Чтобы вызвать гипоксию, перенесите беременных мышей в лабораторию гипоксии и начните наблюдение за ними за 72 ч до дня E21.5.
  4. Определите точку рождения беременных мышей в гипоксических группах и немедленно поместите их в камеры гипоксии. Отрегулируйте уровень кислорода для каждой камеры, как описано для каждой группы (показано в шаге 2.2).
  5. Новорожденных подержать в гипоксических условиях всего 5 минут, затем немедленно перевести их в нормальные условия содержания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное содержание пациентов в гипоксических условиях может привести к летальному исходу.
  6. Используйте 2 новорожденных (случайно выбранных) из каждой группы, чтобы подтвердить повреждения, вызванные гипоксией, и определить пол. Оставьте остальных щенков рядом с их матерями в нормальных жилищных условиях до конца периода лактации для дополнительного молекулярного и поведенческого тестирования на этапе взрослой жизни (см. план эксперимента на дополнительном рисунке 1).

3. Определение пола для оценки потенциальных различий в гипоксических эффектах между полами на стадии новорожденности

  1. Взвесьте каждую мышь (случайно выбранную (x2/группа)) индивидуально, чтобы рассчитать необходимую дозировку анестетиков. Вводите кетамин в дозе 100 мг/кг и ксилазин в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно.
  2. После того, как мышь будет полностью обезболива, проведите эвтаназию через вывих шейки матки и немедленно соберите ткани хвоста в стерильные пробирки объемом 1,5 мл (точка STOP, -80 °C)
  3. Немедленно соберите и перенесите все ткани мозга в центрифужные пробирки, содержащие 10% формальдегида, для дальнейшего анализа (точка STOP, 25 °C).
  4. Подготовьте ткани для извлечения ДНК.
    1. Подготовить образцы хвостового оперения и разморозить при 25 °C (при необходимости). Добавьте в образцы 300 мкл лизисного буфера, содержащего 1 М Трис, 0,5 М ЭДТА, 4% SDS, dH2O и протеиназу К.
  5. Гомогенизируйте образцы.
    1. Тщательно перемешайте образцы с помощью вортекса и инкубируйте в течение ночи при температуре 55 °C.
    2. На следующий день добавьте 100 μL ацетата аммония и быстро перемешайте путем вортексирования. Центрифуга при 12 000 g в течение 20 мин при 25 °C
  6. Выполните разделение фаз.
    1. Осторожно переложите прозрачную водную фазу в новые стерильные, меченые пробирки объемом 1,5 мл.
    2. Добавьте 500 μL изопропанола и инкубируйте в течение 5 минут при 25 °C (точка STOP, -20 °C). Центрифуга при 12 000 g в течение 10 мин при 25 °C
  7. Промойте гранулу ДНК.
    1. Осмотрев гранулу на дне пробирки, осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
    2. Добавьте 1000 μл 70% этанола и осторожно постучите по трубке, чтобы таблетка всплыла. Центрифуга при 7500 г в течение 10 мин при 25 °C
  8. Очистите ДНК.
    1. Осмотрев гранулу на дне пробирки, осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
    2. С помощью микропипетки объемом 10 мкл удалите остатки этанола и дайте ему полностью высохнуть.
    3. Добавьте 100 μL воды без нуклеазы (NFW) для ресуспендирования гранулы. Выдерживать при температуре +4 °C в течение 10-15 минут.
  9. Количественное определение и хранение ДНК.
    1. Измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра. Хранить образцы ДНК при температуре +4 °C до дальнейшего использования. (точка STOP).
  10. Проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР).
    1. Проектируйте грунтовки SRY-F, SRY-R и непрямые грунтовки PAX6-F, PAX6-R (см. дополнительную таблицу 1).
    2. Приготовьте смесь для ПЦР следующим образом (на образец): 5 мкл ПЦР-буфера (10x), 4 мкл MgCl2, 4 мкл dNTP, по 0,5 мкл каждого из четырех праймеров, 31 мкл dH2O и 0,5 мкл Taq-полимеразы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Taq-полимераза должна быть добавлена в последнюю очередь и непосредственно перед использованием, чтобы обеспечить оптимальную амплификацию.
    3. Подготовьте помеченные пробирки для ПЦР и поместите их на охлаждающую решетку с температурой +4 °C. Распределите по пробиркам 45 μл смеси.
    4. Осторожно постучите по блоку, чтобы убедиться, что капли ПЦР-смеси оказались на дне пробирки.
    5. Добавьте 5 μL образцов ДНК и коротко пипеткуйте. Кратковременно обработайте вихрь, а затем центрифугируйте пробирки.
    6. Поместите пробирки в ПЦР-машину и установите программу на следующие условия: первоначально инкубация при 95 °C в течение 5 минут, 40 циклов денатурации при 94 °C в течение 1 минуты, отжиг при 57 °C в течение 45 с и удлинение при 72 °C в течение 1 минуты. После циклов окончательное продление при 72 °C в течение 10 минут, а затем удержание при 40 °C на неопределенный срок.
  11. Визуализируйте полученные образцы с помощью электрофореза в 2% агарозном геле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, показывающие две полосы, являются самцами, а те, у кого только одна полоса, являются самками.

4. Подтверждение поражения гипоксией у неонатальных мышей

  1. Микроскопическая оценка тканей мозга, собранных у умерщвленных мышей, для подтверждения гипоксического повреждения и иммуногистохимическое исследование для проверки HIF-1α.
    1. Зафиксируйте и парафин заделайте ткань.
      1. Сохранить ткани в формальдегиде в течение 12 ч, затем постирать в воде в течение 6 ч.
      2. Фиксируют ткани путем обезвоживания в этиловом спирте в течение 1 суток для каждой концентрации: 70%, 80%, 90%, затем 3 ч в 100% этиловом спирте. Поместите салфетки в ксилол на 15 минут, чтобы они очистились.
      3. Перенесите салфетки в парафин I, II и III ряда на 1 час каждая. По прошествии третьего часа правильно сориентируйте образцы мозга и погрузите их в чистый парафин.
      4. С помощью ротационного микротома вырежьте из парафиновых блоков участки толщиной 5 мкм.
    2. Подготовьте слайды.
      1. Для окрашивания гематоксилином и эозином (HE) поместите срезы на предметные стекла обычного стекла.
      2. Для иммуногистохимии разместите срезы на положительно заряженных предметных стеклах.
        ПРИМЕЧАНИЕ: (точка СТОП), слайды могут быть заархивированы на этом этапе для дальнейшей оценки и работы.
    3. Выполните окрашивание HE.
      1. Погрузите образцы в раствор ксилола I на 10 минут.
      2. Погрузите образцы в раствор ксилола II еще на 10 минут.
      3. Перенесите образцы в ряд убывающих концентраций алкоголя в течение 1 минуты: 100%, 96% и 80%.
      4. Промойте образцы дистиллированной водой в течение 2 минут.
      5. Погрузите образцы в гематоксилин на 8 минут, затем промойте их в дистиллированной воде в течение 2 минут.
      6. После промывки обработайте образцы кислым спиртом в течение 1 с, после чего следует 1-минутная промывка.
      7. Поместите образцы в аммиачную воду на 10 с, затем повторите 1-минутную промывку.
      8. Поместите образцы в 70% спирт на 30 секунд.
      9. Погрузите образцы в эозин на 10 минут.
      10. Постепенно переносите образцы, увеличивая концентрацию алкоголя в течение 1 мин каждая: 96%, 96% и 100%.
      11. Погрузите образцы в растворы ксилола I, ксилола II и ксилола III на 1 мин каждый.
      12. Накройте крышкой.
    4. Осмотрите с помощью микроскопа.
      1. После окрашивания HE исследуйте все ткани мозга каждой группы под световым микроскопом.
      2. Оцените области гиппокампа и коры головного мозга на предмет дегенерации нейронов и периклеточного/периваскулярного отека.
  2. Выполнить окрашивание HIF-1α.
    1. Инкубируйте образцы на положительно заряженных предметных стеклах в течение ночи при температуре 67 °C в инкубаторе, чтобы обеспечить достаточную фиксацию.
    2. Пропустите секции через растворы ксилола I и ксилола II для полной депарафинизации.
    3. Регидратируйте срезы, поместив их последовательно в 100%, 96%, 80% и 70% растворы этанола на 5 мин каждая, а затем промойте в дистиллированной воде в течение 5 мин.
    4. Демаскируйте эпитопы путем разогрева секций в микроволновой печи в 0,01 М лимонной кислоте (pH 6,0) при 665 Вт в течение двух 5-минутных циклов.
    5. Охладите секции при комнатной температуре (RT) в течение 20 минут.
    6. Очертите периметр секций гидрофобной ручкой, затем промойте срезы 3 раза в PBS по 5 мин каждая.
    7. Инкубировать секции в 3% перекиси водорода в метаноле в течение 10 мин для блокирования активности эндогенной пероксидазы.
    8. Снова промойте секции 3 раза в PBS в течение 5 минут каждый раз.
    9. Для предотвращения связывания неспецифических иммуноглобулинов инкубируют срезы с реагентом, блокирующим ультрафиолетовое излучение, в течение 7 мин.
    10. Инкубируйте срезы в течение ночи при 4 °C с первичным антителом против HIF-1α (разведение 1:200).
    11. Промойте срезы 3 раза в PBS по 5 минут каждый раз.
    12. Нанесите биотинилированное вторичное антитело на срезы и инкубируйте в режиме лучевой терапии в течение 40 минут.
    13. Снова промойте секции 3 раза в PBS в течение 5 минут каждый раз.
    14. Нанесите раствор стрептавидина на срезы и инкубируйте в течение 30 мин при РТ.
    15. Каждый раз 3 раза промывайте срезы в PBS по 5 минут.
    16. Развивайте реакцию окрашивания путем применения 3,3'-диаминобензидина (DAB) и наблюдения под световым микроскопом.
    17. Для окрашивания ядер срезы необходимо нанести модифицированному раствору гематоксилина Gill II.
    18. Обезвоживайте участки, пропуская их через возрастающие концентрации этанола (70%, 80%, 96% и 100% этанола).
    19. Очистите срезы, инкубировав их в растворах ксилола I и ксилола II в течение 10 мин каждая.
    20. Монтажные секции с монтажным носителем и покровным стеклом.
    21. Осмотрите смонтированные срезы под световым микроскопом и оцените участки гиппокампа и префронтальной коры.
    22. Измеряйте уровни иммунореактивности с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом для обработки изображений.

5. Поведенческие эксперименты

  1. После подтверждения гипоксии дайте оставшимся мышам завершить период лактации со своими матерями.
  2. Проведите определение пола на 21-й день после рождения на основе аногенитального расстояния, затем поместите животных в разные клетки в зависимости от их пола. Когда мыши в гипоксической и фиктивной контрольной группах достигнут 2-месячного возраста, подвергните их поведенческим экспериментам.
  3. Перед проведением поведенческих тестов акклиматизируйте испытуемых к тестовой среде за 15-30 минут до тестирования.
  4. Обязательно дезинфицируйте все устройства/аппараты между субъектами и испытаниями с использованием 70% этанола.
  5. Проведите тест на распознавание новых объектов (NOR).
    1. Установите камеру в положение, при котором объекты могут быть четко видны и контролироваться.
    2. Установите соответствующее программное обеспечение для отслеживания видео.
    3. Подготовьте тестовый манеж (коробку размером 60 см × 60 × см × 40 см) с двумя предметами размером не больше мыши. Убедитесь, что два объекта имеют одинаковый размер и форму и легко доступны (на расстоянии 10 см × 10 см от стен и параллельно).
    4. День 1: Ознакомительный этап:
      1. Поместите мышь на арену с двумя одинаковыми объектами. Позвольте мыши свободно исследовать объекты в течение определенного периода времени (например, 10 минут).
      2. Во время этого сеанса наблюдайте и записывайте количество времени, которое мышь проводит с каждым объектом. Кроме того, запишите, сколько раз мышь поворачивалась к каждому объекту или взаимодействовала с ним
    5. День 2: Знакомство с новым объектом:
      1. Замените один из знакомых объектов из первого дня на новый объект (другой по внешнему виду, текстуре или форме).
      2. Верните мышь на арену, позволив ей снова свободно исследовать в течение того же количества времени, что и в первой сессии.
    6. Запишите общее время, проведенное мышью со знакомым объектом (с Дня 1) и новым объектом. Запишите, сколько раз мышь поворачивалась к каждому объекту или взаимодействовала с ним.
    7. Рассчитайте индекс дискриминации (DI) для оценки памяти и обучения мыши по формуле:
      Индекс дискриминации (DI) = {(Время, проведенное с новым объектом − Время, проведенное со знакомым объектом)/(Общее время, проведенное с обоими объектами)} × 100.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокий DI указывает на больший интерес к новому объекту, предполагая лучшую память и способности к обучению. DI, близкий к 0, указывает на отсутствие предпочтений, что предполагает либо равный интерес, либо плохую память на знакомый объект.
    8. Используйте DI для объективной оценки способностей мыши к обучению и памяти, основываясь на ее природном любопытстве и способности распознавать и различать знакомые и новые объекты.
  6. Проведение испытания на заднюю подвеску (TST)
    1. Установите камеру в таком положении, чтобы мыши были хорошо видны и за ними можно было наблюдать. Установите соответствующее программное обеспечение для отслеживания видео.
    2. Подготовьте экспериментальную установку с пространством для одновременного содержания 3 мышей.
    3. Используйте картонные панели высотой 25 см с интервалом 20 см, чтобы изолировать мышей, чтобы они не могли видеть друг друга во время теста.
    4. Нарежьте полоски скотча длиной 12 см и аккуратно прикрепите их к хвосту каждой мыши, следя за тем, чтобы хвост был надежно прикреплен, не причинив повреждений. Расположите ленту на конце хвоста (2 см) так, чтобы мышь можно было подвешивать, не травмируя себя.
    5. Записывайте мышей в течение 6 минут, пока они находятся в подвешенном состоянии.
    6. По окончании длительности остановите запись, извлеките мышь и верните ее в клетку для корпуса. Проанализируйте видео, чтобы определить продолжительность активного движения и продолжительность неподвижности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это даст представление о реакции на стресс, так как неподвижность часто указывает на состояние выученной беспомощности или стресса. Степень неподвижности обычно используется для измерения поведенческого отчаяния или реакции на стресс у мышей, которые могут быть связаны с последствиями стресса или депрессивными состояниями.
    7. На основе наблюдаемых паттернов движения и неподвижности оценить эмоциональное состояние и механизмы совладания со стрессом мышей в ответ на вынужденную подвешивание.
  7. Проведение теста на закапывание мрамора
    1. Заполните пустую клетку (20 см × 35 см × 15 см) кукурузным початком высотой 5 см. Разложите 20 шариков в 5 рядов по 4 шарика в каждом. Убедитесь, что шарики равномерно распределены по поверхности.
    2. Поместите объект в угол клетки, обеспечив свободный доступ ко всей клетке.
    3. Дайте мышке 20 минут на изучение клетки. В течение этого времени мышь может проявлять некоторое закапывающее поведение, пытаясь покрыть шарики кукурузным початком. Через 20 минут выньте мышь из клетки.
    4. Подсчитайте общее количество шариков, которые мышь закопала под кукурузным початком за 20 минут. Запишите общее количество зарытых шариков, так как это ключевой показатель поведения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество захороненных шариков обычно используется в качестве индикатора тревоги, компульсивного поведения или неофобии у грызунов. Большее количество захороненных шариков часто связано с более высоким уровнем тревоги или компульсивных тенденций.
    5. Основываясь на общем количестве захороненных шариков, оцените тревожное поведение и компульсивные тенденции у мышей, которые можно использовать для оценки эффектов лечения или экспериментальных условий.
  8. Проведите тест на социальное взаимодействие.
    1. Установите камеру в таком положении, чтобы мыши были хорошо видны и за ними можно было наблюдать.
    2. Подключите камеру к компьютеру и настройте соответствующее программное обеспечение для слежения за видео. Установите прямоугольный ящик (60 см × 40 см × 25 см) с двумя стенками (40 см × 25 см) с двумя дверцами (8 см), чтобы разделить три камеры.
    3. Поставьте клетку (15 см × 10 см) с мышью, знакомой объекту эксперимента, и другую клетку (15 см × 10 см) с мышью, которая ранее не взаимодействовала с объектом эксперимента.
    4. Начните запись и поместите объект в среднее отделение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, используемые в этом тесте, кроме подопытных животных, должны быть того же пола и здоровыми.
    5. Наблюдайте за объектом в течение 5 минут и записывайте его на видеокамеру. По окончании длительности остановите запись, извлеките мышь и верните ее в каркас корпуса.
    6. Используя программное обеспечение SIT, проанализируйте время социального взаимодействия и тенденции социальной новизны мышей и сравните их с фиктивной контрольной группой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Больше времени, затрачиваемого на социальное поведение (например, груминг или обнюхивание) и меньше времени, затрачиваемое на избегание или проявление агрессии, можно интерпретировать как демонстрацию высокой общительности. Избегание общения, проведение большего количества времени в изоляции или проявление повышенной агрессии могут свидетельствовать о тревожности, социальной изоляции или снижении способности к социальному взаимодействию.
  9. Проведите испытание в открытом поле.
    1. Расположите камеру так, чтобы мыши были хорошо видны и контролировались. Подключите камеру к компьютеру и настройте подходящее программное обеспечение для видеослежения.
    2. Установите тестовую арену (коробку длиной 60 см × 60 см × 40 см) и разделите коробку воображаемыми линиями, чтобы получилось 16 квадратов.
    3. Начните запись и аккуратно расположите мышку в центре арены. Наблюдайте и записывайте поведение мыши в течение 5 минут.
    4. По окончании длительности остановите запись, извлеките мышь и верните ее в клетку для корпуса.
    5. Используя программное обеспечение для слежения, измерьте внешнее и внутреннее поведение, связанное с ходьбой, лазанием, побегом, грумингом, неподвижностью, тотальным переходом, дефекацией и мочеиспусканием, чтобы оценить уровень тревоги, двигательной, исследовательской и эмоциональной активности субъектов.
  10. Выполните тест водного лабиринта Морриса (MWM).
    1. Подготовьте лабиринт диаметром 120 см и глубиной 60 см в устойчивом положении в поведенческой лаборатории при температуре 23 ± 1 °C.
    2. Разделите лабиринт на четыре воображаемых квадранта и повесьте различные визуальные подсказки (по форме и цвету) в центре каждого квадранта стен лабиринта примерно в 20 см от основания. Расположите платформу длиной 17 см и диаметром 10 см на расстоянии 20 см от стены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лабиринт, подсказки и платформа не должны менять положение или местоположение, чтобы мыши могли точно тренировать свою память.
    3. Заполните лабиринт водой с температурой 21-26 °C на глубине 1 см ниже платформы и окрасьте его черным многоповерхностным акриловым красителем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае использования других линий мышей, вода должна быть окрашена в контрастный цвет мышей, чтобы иметь возможность наблюдать за ними.
    4. Установите камеру в положение, позволяющее получить полное изображение, и подключите ее к программному обеспечению MWM на компьютере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Место на платформе должно быть назначено в программе на пятый день испытания.
    5. Испытание длится 5 дней по четыре испытания в каждом. В течение первых четырех дней начинайте запись и начинайте испытание, осторожно помещая испытуемого каждый день в новый квадрант лицом к стенке резервуара.
    6. Назначьте местоположение платформы в расписании тестов на 5-й день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это препятствует формированию ассоциативной памяти у испытуемых. Осторожное размещение объектов в воде и поддержание правильной температуры имеет важное значение, чтобы избежать дополнительного внешнего напряжения. Пробные версии длятся 5 минут и автоматически завершаются, когда (i) достигнута платформа, (ii) истечет 5-минутный лимит времени. В течение нескольких дней испытуемые должны узнать местоположение платформы и найти ее за меньшее время.
    7. На пятый день уберите платформу и аккуратно поместите мышей в квадрат лабиринта, как описано ранее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пробная версия автоматически завершается, когда (i) мышь находит платформу и ступает на нее, (ii) 5-минутный лимит времени истекает. Здоровые испытуемые должны найти местоположение предыдущей платформы. Программное обеспечение будет автоматически рассчитывать время, затраченное мышью на поиск платформы в каждом испытании, и поможет оценить кратковременную и долгосрочную память и способности к обучению испытуемых.

6. Подтверждение поражения гипоксией у взрослых мышей

  1. После завершения поведенческого тестирования принесите испытуемых в жертву из-за вывиха шейки матки.
  2. Соберите образцы тканей гиппокампа и крови у 6 мышей каждой группы, включая фиктивную контрольную группу, для молекулярного анализа (раздел 7).
  3. Поместите мозг оставшихся 4 мышей в 10% раствор формальдегида, чтобы изучить влияние воздействия гипоксии в неонатальный период на морфологию мозга взрослого человека.
  4. Используйте ту же методику, которая ранее объяснялась в разделе 4, для проведения гистологического анализа мозга взрослых мышей.

7. Выделение общей РНК из образцов фазы взрослого человека

  1. Добавьте 500 мкл тризола в каждый образец ткани и 500 мкл крови.
  2. Для мозговой ткани гомогенизируйте образцы с помощью шприца.
  3. Инкубируйте смесь при RT в течение 5 минут.
  4. Добавьте 200 μL хлороформа в каждую пробирку и инкубируйте еще 5 минут при RT.
  5. Центрифуга при 12 000 г в течение 20 мин при +4 °C.
  6. Осторожно перенесите водную фазу (РНК) в новую стерильную пробирку.
  7. Добавьте изопропанол (соотношение 1:1 к водной фазе) и выдержите смесь в течение ночи. (точка STOP/ -20 °C).
  8. На следующий день центрифугируйте при 12 000 г в течение 10 минут при температуре +4 °C.
  9. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и добавьте в гранулу 1000 мкл 75% этанола.
  10. Центрифуга при 7 500 × г в течение 5 мин при +4 °C.
  11. Повторите этап промывки этанолом дважды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если гранулы слишком малы, достаточно одной стирки.
  12. Выбросьте надосадочную жидкость и дайте грануле высохнуть на воздухе при RT.
  13. После полного высыхания повторно суспендируйте гранулу 50 μл NFW и инкубируйте на льду при температуре +4 °C в течение 10-15 минут.
  14. Измерение концентрации РНК спектрофотометрическим способом.
  15. Храните образцы РНК при температуре -80 °C до дальнейшего анализа.

8. Синтез комплементарной ДНК (кДНК)

  1. Работая на охлаждающем штативе +4 °C, подготовьте образцы РНК, выделенные из крови и тканей мозга.
  2. Подготовьте пробирки для ПЦР с маркировкой.
  3. Смешайте реагенты из набора для синтеза кДНК в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Приготовьте в общей сложности 14 мкл реакционной смеси для каждого образца и распределите ее по пробиркам.
  5. Добавьте в смесь 6 мкл образца РНК.
  6. Синтез кДНК в ПЦР-устройстве проводят в соответствии с температурными и временными условиями, указанными производителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Синтезированная на этой стадии кДНК может храниться при температуре -80 °C до дальнейшего использования.
  7. Разбавляют синтезированную кДНК в соотношении 1:5.
  8. Храните разбавленную кДНК при температуре -80 °C для последующего количественного ПЦР-анализа.

9. Количественная ПЦР в реальном времени для микроРНК (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p, miR-499a-5p и малой ядерной РНК U6 в качестве контроля нормализации)

  1. Спроектируйте праймеры для каждой микроРНК (последовательности см. в дополнительной таблице 2 ).
  2. Приготовьте реакционную смесь для ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
  3. Диспонируйте по 14 мкл реакционной смеси в каждую лунку 96-луночного ПЦР-планшета.
  4. Добавьте 6 мкл разбавленной кДНК в соотношении 1:5 в каждую лунку, чтобы общий объем реакции составил 20 мкл.
  5. Выполните ПЦР в двух экземплярах для каждого образца, чтобы свести к минимуму вариации, следуя следующей программе: начальная денатурация при 95 °C в течение 120 с, 45 циклов денатурации при 95 °C в течение 10 с, отжиг и амплификация при 56 °C в течение 60 с и анализ кривой плавления при 60 °C в течение 15 с, затем при 95 °C.
  6. Проанализируйте результаты с использованием значений Ct (порог цикла) и нормализуйте данные с помощью метода 2-ΔΔCt .

10. Статистический анализ

  1. . Оцените нормальность данных с помощью гистограмм, графиков Q-Q и теста Шапиро-Уилка для анализа данных об экспрессии микроРНК.
    1. Если данные распределены обычным образом, используйте One-Way ANOVA.
    2. Если данные распределены неравномерно, примените критерий Краскела-Валли, t-критерий Стьюдента или U-критерий Манна-Уитни.
  2. При оценке гендерных различий в каждой группе используйте либо t-критерий студента, либо U-критерий Манна-Уитни, в зависимости от распределения данных. Статистическая значимость определяется p-значением, равным <0,05.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все анализы должны выполняться с использованием соответствующего статистического программного обеспечения. Здесь используется GraphPad Prism 8.
  3. Оценивайте нормальность данных с помощью гистограмм, графиков Q-Q и теста Шапиро-Уилка для анализа результатов поведенческих экспериментов.
    1. Если данные распределены нормально, используйте двустороннюю ANOVA.
    2. Для данных, которые обычно не распределены, выполните критерий Краскела-Валли, t-критерий Стьюдента или U-критерий Манна-Уитни.
    3. Оцените гендерные различия в каждой группе с помощью t-критерия Студента или U-критерия Манна-Уитни, в зависимости от распределения данных. Опять же, рассмотрим статистически значимые результаты, если p-значение равно < 0,05.
  4. Для иммуногистохимического анализа используйте двусторонний ANOVA с последующим тестом Тьюки для сравнения женских и мужских групп.
  5. Чтобы сравнить женские и мужские группы в каждом состоянии гипоксии, используйте апостериорный тест Сидака. Статистическая значимость определяется, если p-значение равно < 0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом исследовании беременные мыши Balb/c подвергались воздействию гипоксических состояний 8%O2 (тяжелая), 10%O2 (умеренная) и 12%O2 (легкая) во время родов, а новорожденные мыши содержались в этих гипоксических условиях в течение 5 минут для создания моделей легкой, умеренной и тяжелой неонатальной гипоксии. Группа, обозначенная как фиктивная контрольная группа, подвергалась нормоксическим (21%О2) условиям родов, а затем ей разрешало...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Перинатальная гипоксия, являющаяся одной из основных проблем со здоровьем новорожденных, может вызывать молекулярные, клеточные и нейронные изменения, нарушая важнейшие процессы развития, и связана с различными нарушениями развития нервной системы, включая расстройства аутистического спектра (РАС)1. В то время как тяжелая гипоксия широко изучалась на предмет ее непосредственных последствий, долгосрочные последствия легкой и умеренной гипоксии в перинатальный перио...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было профинансировано Советом по научным и технологическим исследованиям Турции (TÜBİTAK), и авторы благодарят Селалеттин Гёкташ (Центр трансгенных животных) и биолога Сельду Ташдемир (Поведенческая лаборатория).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(-20 &°; C) МорозильникSiemens KD86NAWE0N
(+4 &°; C) БлокировкаAntagen Biosciencehttps://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/
(+4 &°; C) ХолодильникSiemens KD86NAWE0N
(-20 &°; C) БлокировкаКливер Сиентификhttps://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/
Абсолютный этанолMerck1070172511
Ацетат аммонияSigma238074-500G
Аналитический баланс  Оборудование АдамаLAB214i
ХлороформMerck1024451000
Лимонная кислота Merck100241
КомпьютерHPhttps://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1
EDTASigmaE9884-1KG
Entellan Merck107961
ЭозинMerck109844
Эпендорф (1,5 мл)?solab078.03.021
Система EthovisionНолдусhttps://noldus.com/ethovision-xt
EtuvNUVEEN 400/500 N/A
Трубки Falcon (15 мл)Isolab078.02.001
ФормальдегидMerck104002
Тепловая камераSamsungSC2000
ГематоксилинMerck105175
HIF-1α АнтителаBiossbs-20398R 
Гипоксия Чемберс BiospherixA-Chamber
ИзопропональныйMerck1096342511
Light Cycler 480 IIРош5015278001
Клетка теста на захоронение мрамораVishnu https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel
Микроцентрифугные трубки (1,5 мл)Грейнер616201
Наконечники микропипеток (100 & micro; L)Грейнер774353
Наконечники микропипеток (1000 и микро; L)Грейнер778353
Микропипетты (10 & micro; L)ГилсонFD10001
Микропипетки (100 & micro; L)ГилсонFD10004
Микропипетки (1000 и микро; L)ГилсонFD10003
Насадки микропипеток (10 & micro; L)Грейнер772353
Микропипетки (2 и микро; L)ГилсонGFAM00064
МикроскопияОлимпBx53
Набор для синтеза cDNA (набор для синтеза кДНК) RCURY LNA RT (набор для синтеза ДНК)Цягэн339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR комплектЦягэн339346
Многоколодные пластиныРош4729692001
НаноспектрофотометрСимадзуC101-E112
Арена нового теста распознавания объектовГлобальная биотехнология137
Арена открытого тестаГлобальная биотехнология117
Oxycycler BiospherixA42OC
Парафин и bbsp;Leica 39602012
Планшет PBSSigmaP4417-50TAB
ПЦР-устройствоSensoquestT3-0140
Вращение пластинPeqlab91-PSPIN-P
ПризмаGraphPadhttps://www.graphpad.com/
Протеиназа KSigmaP6556-10MG
Изоляционный реагент QIAzol Lysis ReagentЦягэн79306
SDSSigma8170342500
Второе антитело AbcamA0545-1ML
Три камеры теста социального взаимодействияГлобальная биотехнология118
ВращениеГилсонPMC880
Шприц (2 мл)Байбиhttps://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler
Настройка теста подвески хвостаSelf Made, вы можете найти подобное на Harvard ApparatusSelf Made, вы можете найти похожие по адресу (https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html)
ТермомиксерЭппендорф#5355
База ТризмыSigma1503-1KG
ВихрьХайдольф541-10000-00-1
Xylenes Isolab 9,90,01,92,501

Ссылки

  1. Bonkowsky, J. L., Son, J. -H. Hypoxia and connectivity in the developing vertebrate nervous system. Dis Model Mech. 11 (12), dmm037127(2018).
  2. Dunwoodie, S. L. The role of hypoxia in development of the mammalian embryo. Dev Cell. 17 (6), 755-773 (2009).
  3. Beck, S., et al. The worldwide incidence of preterm birth: a systematic review of maternal mortality and morbidity. Bull World Health Organ. 88 (1), 31-38 (2010).
  4. Milash, B., et al. Temporal dysynchrony in brain connectivity gene expression following hypoxia. BMC Genomics. 17 (1), 334(2016).
  5. Adachi, K., Umezaki, H., Kaushal, K. M., Ducsay, C. A. Long-term hypoxia alters ovine fetal endocrine and physiological responses to hypotension. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 287 (1), R209-R217 (2004).
  6. Imamura, T., Umezaki, H., Kaushal, K. M., Ducsay, C. A. Long-term hypoxia alters endocrine and physiologic responses to umbilical cord occlusion in the ovine fetus. J Soc Gynecol Investig. 11 (3), 131-140 (2004).
  7. Fajersztajn, L., Veras, M. M. Hypoxia: from placental development to fetal programming. Birth Defects Res. 109 (17), 1377-1385 (2017).
  8. Ruas, J. L., Poellinger, L. Hypoxia-dependent activation of HIF into a transcriptional regulator. Semin Cell Dev Biol. 16 (4-5), 514-522 (2005).
  9. Mukandala, G., Tynan, R., Lanigan, S., O'Connor, J. J. The effects of hypoxia and inflammation on synaptic signaling in the CNS. Brain Sci. 6 (1), 6(2016).
  10. Lee, S., et al. Gene networks associated with non-syndromic intellectual disability. J Neurogenet. 32 (1), 6-14 (2018).
  11. Fattuoni, C., Palmas, F., Noto, A., Fanos, V., Barberini, L. Perinatal asphyxia: a review from a metabolomics perspective. Molecules. 20 (4), 7000-7016 (2015).
  12. Locci, E., et al. Exploring perinatal asphyxia by metabolomics. Metabolites. 10 (4), 141(2020).
  13. De Haan, M., et al. Brain and cognitive-behavioural development after asphyxia at term birth. Dev Sci. 9 (4), 350-358 (2006).
  14. Armstrong-Wells, J., Bernard, T. J., Boada, R., Manco-Johnson, M. Neurocognitive outcomes following neonatal encephalopathy. NeuroRehabilitation. 26 (1), 27-33 (2010).
  15. Gardener, H., Spiegelman, D., Buka, S. L. Prenatal risk factors for autism: comprehensive meta-analysis. Br J Psychiatry. 195 (1), 7-14 (2009).
  16. Hicks, S. D., Middleton, F. A. A comparative review of microRNA expression patterns in autism spectrum disorder. Front Psychiatry. 7, 176(2016).
  17. Cassidy, F. C., Charalambous, M. Genomic imprinting, growth and maternal-fetal interactions. J Exp Biol. 221 (Suppl_1), jeb164517(2018).
  18. Serocki, M., et al. miRNAs regulate the HIF switch during hypoxia: a novel therapeutic target. Angiogenesis. 21 (2), 183-202 (2018).
  19. Ozkul, Y., et al. A heritable profile of six miRNAs in autistic patients and mouse models. Sci Rep. 10 (1), 9011(2020).
  20. Siniscalco, D., et al. Autism spectrum disorders: is mesenchymal stem cell personalized therapy the future. J Biomed Biotechnol. 2012, 480289(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Неонатальная гипоксиядисрегуляция микроРНКповеденческое тестированиеводный лабиринт Моррисараспознавание нового объектатест с закапыванием шариковтест на социальное взаимодействиемаркеры нейродегенерациираннее вмешательство
Гипоксия изменяет уровни микроРНК, участвующие в неменделевском наследовании расстройств аутистического спектра у мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.