Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Управление после трансплантации печени и сбор образцов у даурских сусликов для секвенирования РНК одиночных клеток

584 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68443

⸱

16 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hepatic Surgery and Liver Transplantation Center of the Third Affiliated Hospital, Organ Transplantation Institute, Sun Yat-sen University; Organ Transplantation Research Center of Guangdong Province, Guangdong Province Engineering Laboratory for Transplantation Medicine, 2Guangdong Key Laboratory of Liver Disease Research, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 3Collage of Life Science, Shenyang Normal University, 4Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology; Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education, Chinese Academy of Medical Sciences, NHC Key Laboratory of Organ Transplantation, 5The School of Life Science, Peking University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описываются процедуры длительного хранения печени в холоде и ортотопической трансплантации даурского суслика (DGS; Spermophilus dauricus), типичный сезонный зимовка. Он включает в себя методы забора печеночных трансплантатов и образцов крови для прогностических оценок и обработки их для исследований на основе одиночных клеток.

Аннотация

Функциональное восстановление трансплантата и иммуносовместимость трансплантата с хозяином представляют собой основные прогностические проблемы после трансплантации печени. Важно отметить, что обычные модели грызунов с использованием крыс или мышей дают ограниченное представление о механизмах повреждений трансплантатов, вызванных гипотермией, во время консервации. Этот разрыв подчеркивает необходимость альтернативных моделей. Поскольку пересадки печени от адаптированного к холоду даурского суслика (DGS; Spermophilus dauricus) могут выдерживать длительное хранение в холоде и, следовательно, поддерживать высокую выживаемость при посттрансплантационных ДГС, следовательно, в этом протоколе подробно описывается необходимый послеоперационный уход за животными и физиологический мониторинг, необходимые для трансплантированных пациентов с ДГС. Кроме того, он предоставляет стандартизированные процедуры подготовки высококачественных образцов печеночных трансплантатов для последующих аналитических методов, включая секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq) для транскриптомного профилирования и гистопатологического исследования. Успешное получение хорошо подготовленных образцов трансплантата DGS является важным первым шагом в применении как традиционных, так и передовых методологий для изучения этой нетрадиционной, но очень актуальной модели. Этот протокол учитывает мультиомическую информацию для DGS, тем самым облегчая будущие исследования хирургических вмешательств и моделирования заболеваний не только у грызунов, находящихся в спячке, но и у других специализированных организмов.

Введение

В последние два десятилетия все больше и больше исследователей признают, что превосходные адаптационные способности зимующих видов открывают неоценимые возможности для раскрытия новых механизмов биологической адаптации и могут вдохновить на прорывы в различных областях медицины, таких как сохранение органов и метаболическаяреабилитация.. Первый комплексный хирургический протокол для пролонгированного холодосохранения печени и ортотопической трансплантации у гибернатора, даурского суслика (DGS; Spermophilus dauricus), был недавно создан. По-видимому, холодоадаптационный характер DGS позволяет продлить хранение донорских трансплантатов в холоде и повысить посттрансплантационную выживаемость животных-реципиентов. Таким образом, необходим протокол последующего наблюдения для контроля послеоперационного восстановления животных и подготовки образцов для различных гистопатологических и омиксных исследований.

Учитывая значительные физиологические различия между DGS и стандартными моделями грызунов, а также сложные и динамичные физиологические изменения у животных-реципиентов после трансплантации печени, получение высококачественных образцов от них имеет решающее значение для последующих анализов и, следовательно, для понимания физиологии трансплантата и хозяина после трансплантации. Помимо получения, обработки и исследования образцов крови и тканей печени традиционными методами, успешная диссоциация паренхиматозных клеток печени, которые являются гепатоцитами, и непаренхиматозных клеток (NPC), которые включают эндотелиальные клетки, звездчатые клетки, клетки Купфера и другие иммунные клетки, позволила бы пролить свет на сложные постоперационные клеточные и молекулярные взаимодействия с быстро развивающимися мультиомами на основе одноклеточных клеток. С этой целью с начала 1950-х годов был разработан классический метод, основанный на перфузии коллагеназы, который постоянно совершенствовался. Тем не менее, четкая анатомическая структура печени DGS, послеоперационные спайки, вызванные сосудистой реконструкцией, и физиологические изменения в трансплантатах печени, вызванные хирургическим вмешательством, требуют тонкой настройки условий удаления.

Этот протокол содержит подробные рекомендации по послеоперационному ведению и сбору образцов в DGS после трансплантации печени. В частности, этот протокол позволяет выделять гепатоциты из трансплантатов печени с высоким выходом и жизнеспособностью клеток, а также подробно описывает последующую обработку выделенных гепатоцитов для секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом Пекинского университета по уходу за животными и их использованию (LSC-WangSQ-2). DGS, использованные в этом исследовании, были получены в лаборатории беременными самками DGS, пойманными на пастбище города Чжанцзякоу. На момент эксперимента животным было около 1-2 лет. В качестве доноров и реципиентов использовались ДГС, как мужские, так и женские, весом от 180 г до 400 г. Вес реципиента был немного больше, чем у донора, с разницей менее 50 г. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Посттрансплантационный уход

  1. Размещайте DGS после трансплантации печени в теплой и чистой среде в соответствии с циклом свет/темнота 12:12, со стандартной лабораторной пищей и водой в неограниченном количестве.
  2. Ежедневно контролируйте массу тела, оценивайте разрез брюшной полости на предмет кровотечения, а также наблюдайте за психическим состоянием и уровнем активности реципиента.
  3. Сразу после операции вводят подкожно цефуроксим (16 мг/кг) и бупренорфин (0,05 мг/кг) каждые 12 ч в течение 3 дней.
  4. Внутримышечно вводите такролимус (1 мг/кг) ежедневно в течение 24 ч до забора ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку DGS в основном получены из диких животных, иммунологические факторы трансплантата не остаются пренебрежимо малыми. Трансплантация между ДГС считается аллогенной трансплантацией (а не сингенной трансплантацией). Если в исследовании необходимо исключить иммунологические факторы, такие как отторжение, обеспечьте стандартизацию такролимуса в послеоперационном периоде.

2. Подготовка образца печеночного трансплантата

  1. Приготовление растворов и инструментов
    1. Приготовьте 50 мл HBSS с 500 мкМ EGTA ( Ca2+- и Mg2+-free; pH 7,4). Перед применением предварительно подогреть на водяной бане при температуре 40 °C.
    2. Коллагеназу в/в (0,4 мг/мл) растворить в 50 мл HBSS (с Ca2+ и Mg2+) и инкубировать при 40 °C на водяной бане в течение 30 минут.
    3. Раствор Percoll: Смешайте Percoll с 10× PBS в соотношении 9:1 (v/v) и разбавьте 1× PBS в соотношении 9:1 (v/v) в пробирке объемом 15 мл. Держите раствор на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 5 мл 90% раствора Percoll достаточно для DGS.
    4. Перед использованием погрузите хирургические инструменты в 70% этанол на 30 минут.
    5. Соберите перфузионную систему, состоящую из перистальтического насоса с регулируемой скоростью, силастической трубки и водяной бани. Промойте трубку теплым физиологическим раствором, чтобы удалить пузырьки воздуха, и прикрепите стерильный фильтр 0,22 мкм к выходному отверстию трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед продувкой пузырьков воздуха необходимо промыть повторно используемые трубки, тщательно прокачав 70% этанол в течение 15 минут, а затем полностью промыть ddH2O в течение 15 минут для удаления остаточного этанола.
  2. Процедура с животными
    1. Обезболивают посттрансплантационные СГС путем внутрибрюшинного введения 2,5% триброметанола в дозе 1 мл/100 г массы тела. Проведите тесты на потерю рефлексов, таких как реакция на защемление пальцев ног, чтобы обеспечить полную анестезию.
    2. Сбрейте шерсть брюшной полости и зафиксируйте ДГС на операционной доске брюшной стороной вверх.
    3. Распылите 70% этанол на область живота животного, а затем откройте брюшную полость, сделав большой крестообразный разрез кожи и брюшины острыми ножницами и зубчатыми щипцами.
    4. Осторожно переместите кишечник вправо наружу брюшной полости с помощью ватного тампона до тех пор, пока трансплантат печени, воротная вена (ВП) и нижняя полая вена (НПВ) не станут четко обнажены (Рисунок 1А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за послеоперационных спаек в брюшной полости после трансплантации печени аккуратно рассеките спайки с помощью влажного ватного тампона.
    5. Введите шприц объемом 5 мл в НПВ ниже стомы анастомоза, чтобы собрать 1-2 мл крови, и немедленно приложите легкое давление к месту прокола сухим ватным тампоном для достижения гемостаза после извлечения иглы из сосуда (рисунок 1В).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму кровотечение, иглу можно заменить на иглу из шприца объемом 1 мл, что составляет около 30 г.
    6. В ориентации скоса аккуратно проколите ЛВ с помощью катетера 22-G под углом 15° относительно поверхности сосуда с последующим втягиванием иглы катетера. Как только будет подтвержден успешный прокол, аккуратно продвиньте канюлю еще на 1-1,5 см по сосуду. Зафиксируйте положение канюли с помощью сосудистого зажима (рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если канюля установлена правильно, будет виден обратный поток крови. Если канюляция ЛВ не удалась или сталкивается с техническими проблемами, переключитесь на канюлирование внутрипеченочного НПВ и назначьте ФВ в качестве пути оттока перфузата.
    7. Запустите перфузионный насос с теплым физиологическим раствором со скоростью 6-8 мл/мин, затем подключите упомянутый выше фильтр 0,22 мкм к канюле.
    8. После начала перфузии с помощью ПВ сделайте разрез в НПВ, чтобы обеспечить дренаж крови. Для адекватной перфузии требуется 50-80 мл физиологического раствора (Рисунок 1D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная перфузия подтверждается, когда трансплантированная печень приобретает бледный желто-белый цвет во время этого процесса. Некоторые темно-красные участки застойных явлений могут оставаться на поверхности печени и не могут быть полностью удалены, вероятно, в результате интраоперационной травмы печени, такой как ишемическое реперфузионное повреждение.
    9. После адекватной перфузии 50-80 мл теплого физиологического раствора приостановите помпу.
    10. Перевязка левой боковой доли у ее основания с помощью шелкового шва 2-0 с последующим иссечением доли дистальнее места лигирования. Аналогичным образом, срединная доля лигируется у основания и резецируется тем же методом (рис. 1E, F).
      Частичная гепатэктомия проводится для максимального использования трансплантированной печени для нескольких экспериментальных целей и для снижения потребления буфера коллагеназы при одновременном содействии тщательному перевариванию печени.
    11. Разделите резецированную ткань печени на несколько частей: одну часть используют для выделения NPC с последующим секвенированием scRNA, другие части фиксируют в 4% параформальдегиде для гистологического среза или замораживают в жидком азоте для других экспериментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 2.2.11 может быть выполнен другим человеком одновременно со следующими шагами для экономии времени.
    12. Выделение NPC. Разрежьте ткани примерно на1-2 мм по 3 части в среде RPMI-1640 и ферментативно расщепите с помощью gentleMACS в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Жизнеспособность клеток и концентрацию клеток определяли с помощью автоматизированного счетчика клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 2.2.12 и шаги 2.2.13-2.3.5 выполняются одновременно.
    13. Разрежьте диафрагму и зажмите надпеченочный НПВ (Рисунок 1G).
    14. Перенесите входную трубку в предварительно прогретый буфер EGTA. Перезапустите насос со скоростью 6-8 мл/мин.
    15. Периодически зажимайте НПВ в течение 5-10 с, чтобы обеспечить равномерное распределение перфузионного раствора по всей печеночной паренхиме. Печень заметно набухает во время пережатия и расслабляется при освобождении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно избегать длительного прерывания дренажа, так как длительная закупорка может привести к разрыву тонкой соединительной ткани, окружающей печень, нарушив перфузию или динамику жидкости в печеночном капиллярном русле. Кроме того, устойчивая обструкция может поставить под угрозу жизнеспособность клеток и снизить выход из-за чувствительности гепатоцитов к механическим силам.
    16. После перфузии 40-50 мл раствора EGTA инициируют перфузию коллагеназного буфера со скоростью 4-6 мл/мин в течение 8-10 мин. Кратковременно зажмите вышестоящий кровеносный сосуд, как описано выше (рисунок 1H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После 5-6 мин перфузии коллагеназой печень становится заметно мягче, появляются поверхностные трещины. Если эти морфологические изменения отсутствуют, уменьшите скорость перфузии до 3-4 мл/мин и увеличьте общее время разложения до 12-13 минут. По завершении перфузии 50 мл коллагеназы печень приобретает рыхлую, похожую на тофу консистенцию, что является показателем достаточного пищеварения (рис. 1I).
    17. Остановите насос и снимите канюлю. Отрежьте печень от тела, поместите ее в 5-сантиметровую посуду с 10 мл ледяной среды DMEM/F12.
  3. Очищение гепатоцитов
    1. Разорвите печень, чтобы освободить клетки, и перелейте клеточный раствор в коническую камеру объемом 50 мл с фильтром 70 мкм, расположенным сверху.
    2. После центрифугирования клеточной суспензии при 50 x g в течение 3 мин при 4 °C удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу 20 мл 1× PBS. Повторите этот шаг 3 раза. После последнего центрифугирования суспендируйте клеточную гранулу 5 мл среды DMEM/F12.
    3. Аккуратно смешайте клеточную суспензию с равным объемом 90% раствора Percoll в пробирке объемом 15 мл. Центрифугируйте при 200 x g в течение 10 минут при 4 °C.
      Примечание: После центрифугирования по методу Перколла смесь разделяется на три отдельных слоя: верхний слой (примерно 0,5-1 мл) содержит мертвые клетки, в то время как жизнеспособные гепатоциты сосредоточены в нижнем слое (примерно 0,5-0,8 мл) (Рисунок 2). При использовании этого протокола обычно получают выход 5-8 ×10-7 жизнеспособных гепатоцитов с жизнеспособностью >80%. (Рисунок 3А, В).
    4. Тщательно отсасывайте мертвые клетки и надосадочную жидкость, избегая энергичного нарушения слоев, и ресуспендируйте жизнеспособные клетки средой 10 мл DMEM/F12. Центрифугируйте при 50 x g в течение 5 минут при 4 °C.
    5. Отбросить надосадочную жидкость и ресуспендировать очищенные гепатоциты с 1-5 мл 1× PBS с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки до конечной концентрации 500-1200 клеток/мкл.
    6. Смешивают гепатоциты и NPC в соотношении 1:1, т.е. клеточную суспензию получают путем смешивания 10 000 гепатоцитов и 10 000 NPC.
  4. ScRNA-seq
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.4.1-2.4.3 выполняли в соответствии с руководством пользователя набора для подготовки библиотеки экспрессии генов 3'-генов на основе капель12. Была использована микрофлюидная платформа для разделения и штрихкодирования одиночных клеток на основе капель, которая охватывает важнейшие этапы создания гелевых гранул в эмульсиях (GEM), построения библиотеки кДНК и секвенирования Illumina в соответствии со стандартными протоколами.
    1. Для получения GEM и штрихкодирования используйте клеточную суспензию, содержащую 20 000 гепатоцитов и NPC. Эффективность захвата клеток составляет не менее 60%.
    2. Для амплификации кДНК очистите образцы после GEM-RT в соответствии с руководством пользователя12.
    3. Строительство библиотеки
    4. Секвенирование библиотек РНК одиночных клеток с использованием платформы секвенирования для достижения глубины 150 Гб на образец; Демультиплексируйте необработанные базовые файлы вызовов в файлы FASTQ с помощью Cell Ranger (v8.0.0).
    5. Согласуйте файлы FASTQ с геномом Ictidomys tridecemlineatus (NCBI: GCF_016881025.1) для количественной оценки экспрессии, завершив экспериментальный рабочий процесс.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Гистологическое исследование трансплантатов, хранившихся при температуре 4 °C в течение 24 ч и трансплантированных в DGS, показало нормальную архитектуру долек печени с минимальными признаками воспаления, некроза или холестаза на 3 и 6 сутки после операции, что сопоставимо с группой симуляции (рис. 4A-C).

Выделение первичных гепатоцитов из послеоперационного ДГС занимает примерно 1 ч. Используя описанный протокол, можно получить б...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В соответствии с протоколом, описывающим сохранение и трансплантацию донорской печени при СГС, описанные здесь процедуры подробно описывают послеоперационное наблюдение и индивидуальное фармакологическое лечение СГС, трансплантированных с помощью печени, хранящейся в холоде не менее 24 часов. Этот протокол обеспечивает выживаемость реципиента по истечении 7 дней после трансплантации, демонстрируя явные преимущества гибернаторов в качестве исследовательских моделей для сохранения органов<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным крупным проектом по науке и технике «Неинфекционные хронические заболевания» (2023ZD0507600), грантами Национального фонда естественных наук Китая (82170671, 92254301, 32230048, 82371794, 32301306), Национальной программой исследований и разработок (2024YFA0916804) и Фондом талантов академика Шусэна Ланьцзюаня Образовательного фонда Чжэцзянского университета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1&раз; ПБССервисбиоГ4202
в 10 раз; ПБССервисбиоГ4207
4% параформальдегидаБиошарпБЛ539А
БупренорфинШафейH12020276
Канюля (22 г)ББРАУН4254090Б
ЦефуроксимСеллекЕ4838
Чашка для клеточных культур (60 мм)ГНЕЗДО705001
Коллагеназа IVСигма-ОлдричС5138
Коническая трубка (15 мл)ГНЕЗДО601052
Коническая трубка (50 мл)ГНЕЗДО602052
Ватный тампонМагазин товаров для дома
Countstar Автоматизированный подсчет ячеекЖуйюйГраф Стар Ригель S2
DMEM/F12ГибикоC11330500BT
ЭГТАСигма-ОлдричЕ4378
ФБСGibco10099-141
Фильтр (0.22 μ m)Мерк МиллипорSLGP033RB
Фильтр (70 μ m)Биология15-1070
gentleMACSМилтеньи130-093-235
HBSS (с Ca2+ и Mg2+)СервисбиоГ4204
HBSS (без Ca2+ и Mg2+)СервисбиоГ4203
Набор для диссоциации NPCМилтеньи130-096-730
ПерколлЦитива17-0891-09
Перистальтический насосЮйяньБТ100
РПМИ-1640ГибикоC11875500BT
СолянойСРБСРБ009
СеквенаторИллюмина НоваSeq X Плюс
Силастические трубкиТайгонЕ-3603
Шелковый шовETHICONСА845Г
Шприц (1 мл)Наука о лигеЛГ05-124Понадобится только игла или шприц
Шприц (2 мл)Наука о лигеЛГ05-124Понадобится только бочка со шприцем
ТакролимусСеллекС5003
Передаточная пипеткаБиология30-0138А1
Трибромэтиловый спиртСигма-ОлдричТ48402
Водяная баняГрантСАП2

Ссылки

  1. Ou, J., et al. IPSCs from a hibernator provide a platform for studying cold adaptation and its potential medical applications. Cell. 173 (4), 851-863 (2018).
  2. Zhang, X., et al. 5-aminolevulinate improves metabolic recovery and cell survival of the liver following cold preservation. Theranostics. 12 (6), 2908-2927 (2022).
  3. Zhang, X., et al. Cold-induced Foxo1 nuclear transport aids cold survival and tissue storage. Nat Commun. 15 (1), 2859(2024).
  4. Zhang, L., et al. Cross-species metabolomic profiling reveals phosphocholine-mediated liver protection from cold and ischemia/reperfusion. Am J Transplant. 24 (11), 1979-1993 (2024).
  5. Chen, L., et al. Synergy of 5-aminolevulinate supplement and cx3cr1 suppression promotes liver regeneration via elevated igf-1 signaling. Cell Rep. 42 (8), 112984(2023).
  6. Arnold, C. Hibernation science harnessed to treat obesity and modify metabolism. Nat Med. 30 (10), 2700-2703 (2024).
  7. Bao, Z., et al. Fatty acid metabolization and insulin regulation prevent liver injury from lipid accumulation in Himalayan marmots. Cell Rep. 42 (7), 112718(2023).
  8. Carey, H. V., Andrews, M. T., Martin, S. L. Mammalian hibernation: Cellular and molecular responses to depressed metabolism and low temperature. Physiol Rev. 83 (4), 1153-1181 (2003).
  9. Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-c14. J Exp Med. 94 (5), 431-453 (1951).
  10. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic Cells. J Vis Exp. (64), e3917(2012).
  11. Breuer, E., Humar, B. Isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. J Vis Exp. (190), e64493(2022).
  12. User guides. , X Genomics. https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1725314293/support-documents/CG000731_ChromiumGEM-X_SingleCell3v4_UserGuide_RevB.pdf (2024).
  13. Hadj-Moussa, H., Storey, K. B. Bringing nature back: Using hibernation to reboot organ preservation. FEBS J. 286 (6), 1094-1100 (2019).
  14. Ratigan, E. D., McKay, D. B. Exploring principles of hibernation for organ preservation. Transplant Rev (Orlando). 30 (1), 13-19 (2016).
  15. Merriman, D. K., Lahvis, G., Jooss, M., Gesicki, J. A., Schill, K. Current practices in a captive breeding colony of 13-lined ground squirrels (Ictidomys tridecemlineatus). Lab Anim (NY). 41 (11), 315-325 (2012).
  16. Vaughan, D. K., Gruber, A. R., Michalski, M. L., Seidling, J., Schlink, S. Capture, care, and captive breeding of 13-lined ground squirrels, Spermophilus tridecemlineatus. Lab Anim (NY). 35 (4), 33-40 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.