Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Экспресс-диагностика инфекции Mycobacterium tuberculosis и лекарственной устойчивости на основе флуоресцентной ПЦР в реальном времени

771 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68445

⸱

15 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Fifth Division Hospital of Xinjiang Production and Construction Corps, 2Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье представлен протокол выявления Mycobacterium tuberculosis и ее лекарственной устойчивости с помощью технологии флуоресцентной количественной ПЦР (кПЦР) в реальном времени.

Аннотация

Туберкулез (ТБ) является одной из основных проблем здравоохранения, которая в непропорционально большой степени затрагивает уязвимые группы населения. Появление и распространение лекарственно-устойчивого туберкулеза представляют серьезную угрозу для глобального общественного здравоохранения. Традиционные методы диагностики микобактерий туберкулеза (МТБ), такие как микроскопия мазка и бактериологическое исследование, имеют значительные ограничения и часто приводят к запоздалому клиническому лечению. Для решения этой проблемы была разработана эффективная схема диагностики на основе флуоресцентной ПЦР в реальном времени. Высококачественные нуклеиновые кислоты MTB могут быть экстрагированы из тестовых образцов, а статус резистентности может быть определен в ключевых местах резистентности. По сравнению с традиционными методами, этот подход значительно сокращает время обнаружения до нескольких часов, что позволяет определить статус инфекции и резистентности вскоре после первого визита пациента. Чувствительность обнаружения превышает 85%, а специфичность достигает 95%. Эта неинвазивная технология не только сводит к минимуму дискомфорт пациента, но и поддерживает точную диагностику в низовых медицинских учреждениях благодаря своей низкой стоимости и высокой эффективности. В целом, этот подход представляет собой значительное улучшение диагностики туберкулеза.

Введение

Туберкулез (ТБ), хроническое инфекционное заболевание, вызываемое микобактериями туберкулеза (МТБ), входит в десятку основных глобальных причин смертности1. Лекарственно-устойчивый туберкулез (ЛУ-ТБ) представляет собой серьезную проблему для борьбы с туберкулезом. В Плане действий по созданию сообществ, свободных от туберкулеза (2022-2027 гг.), опубликованном Китайским центром по контролю и профилактике заболеваний (China CDC), подчеркивается необходимость раннего скрининга лекарственной устойчивости у всех пациентов с бактериологически подтвержденным туберкулезом легких2. В нем содержится призыв к внедрению новых технологий молекулярной диагностики для расширения возможностей выявления ЛУ-ТБ, сокращения сроков диагностики, максимального выявления случаев ЛУ-ТБ, обеспечения стандартизированного лечения и ведения, а также осуществления необходимых мер инфекционного контроля3. Кроме того, Уведомление об усилении профилактики и борьбы с лекарственно-устойчивым туберкулезом (No 4, 2023 г.) предписывает продвижение передовых методов диагностики по всей стране. В нем содержится призыв к своевременному проведению скрининга на резистентность всех пациентов с бактериологически подтвержденным туберкулезом для достижения всеобщего скрининга, улучшения стандартизации диагностики и повышения доступности здравоохранения4.

Луб-ТБ относится к случаям ТБ, устойчивым по крайней мере к одному противотуберкулезному препарату. В настоящее время классификации включают рифампицин-резистентный (РР), монорезистентный, полирезистентный, мультиустойчивый (МЛУ), предэкстенсивно лекарственно-устойчивый (пре-ШЛУ) и широко лекарственно-устойчивый (ШЛУ) ТБ. Глобальный метаанализ эпидемиологии ЛУ-ТБ выявил тревожные показатели резистентности: МЛУ-ТБ – 11,6%, резистентность – 15,7%, резистентность к рифампицину – 9,4% и монорезистентность – 11,8%. Эти данные подчеркивают серьезность и сложность DR-TB5.

Рифампицин и изониазид являются краеугольными камнями в лечении туберкулеза. Тем не менее, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) отмечает, что, хотя технологии быстрой диагностики резистентности к рифампицину доступны, аналогичные инструменты для резистентности к изониазиду отсутствуют. Этот пробел препятствует своевременной диагностике туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ). Предварительное определение «рифампицин-резистентного туберкулеза» отражает это диагностическое ограничение, подчеркивая недостаточные возможности для быстрого выявления устойчивости к другим препаратам 6,7. По оценкам ВОЗ, случаи ТБ, устойчивые к изониазиду, в два раза чаще, чем случаи резистентности к рифампицину. Исключительная зависимость от рисков скрининга резистентности к рифампицину без учета изониазид-монорезистентного ТБ (Hr-ТБ)8. Пациенты с невыявленным Hr-TB, получающие лечение по стандартным схемам, сталкиваются с повышенным риском неэффективности лечения, рецидива и прогрессирования до МЛУ-ТБ9. Устойчивость к этамбутолу также вызывает беспокойство. В 2017 году базовое исследование лекарственно-устойчивого туберкулеза в Китае, которое является важнейшим препаратом для лечения туберкулеза и МЛУ-ТБ, показало, что уровень устойчивости к этамбутолу составляет 4,9% в новых случаях и 17,2% в случаях повторного лечения.

В настоящее время для выявления лекарственной устойчивости остаточного туберкулеза искусственное культивирование по-прежнему является предпочтительным методом в некоторых лабораториях, но технология флуоресцентной ПЦР в реальном времени превосходит традиционные методы в выявлении лекарственной устойчивости туберкулеза: обнаружение и количественная оценка: флуоресцентная ПЦР в реальном времени обеспечивает точный количественный анализ посредством мониторинга флуоресцентных сигналов в режиме реального времени, в то время как традиционные методы не имеют такой точности. Традиционные методы эксперимента требуют много времени и труда, требуют подготовки персонала и в высшей степени субъективны. Напротив, ПЦР в реальном времени захватывает флуоресцентные зонды и сигналы с помощью компьютера, сводя к минимуму человеческие ошибки. Традиционные методы анализа данных более субъективны, в то время как ПЦР в реальном времени обеспечивает точный и объективный анализ с помощью кривых амплификации, стандартных кривых и других методов анализа. Эти достижения делают флуоресцентную ПЦР в реальном времени предпочтительным методом выявления лекарственной устойчивости туберкулеза11.

Таким образом, лекарственно-устойчивый туберкулез (ЛУ-ТБ) превратился в глобальный кризис. Устойчивость к основным препаратам – изониазиду, рифампицину и этамбутолу – еще больше осложняет усилия по борьбе с туберкулезом. Своевременное и точное выявление лекарственной устойчивости имеет решающее значение для разработки индивидуальных схем лечения, повышения терапевтического успеха и снижения угрозы лекарственно-устойчивого туберкулеза.

Для решения диагностической задачи в этом исследовании использовался набор, который может идентифицировать Mycobacterium tuberculosis и обнаруживать лекарственно-устойчивые мутации в течение 3,5 часов с использованием образцов мокроты. Это было достигнуто с помощью флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени. Этот метод прост, экономичен и точен, что делает его ценным инструментом в борьбе с лекарственно-устойчивым туберкулезом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование было одобрено Комитетом по этике больницы пятого отделения Синьцзянского производственно-строительного корпуса; Этическое число равно LLWYH2025001, и этического конфликта нет. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Забор образцов

  1. Для сбора образцов мокроты используйте международно признанные бутылки с завинчивающейся крышкой, рекомендованные Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), или герметичные пластиковые коробки и коробки из вощеной бумаги.
  2. Наклейте на контейнеры с мокротой имя, номер пациента (порядковый номер амбулаторного пациента для новых пациентов или регистрационный номер для последующих пациентов), предметы для обследования и порядковые номера контейнеров 1, 2, 3 (1 = немедленная мокрота в тот же день, 2 = ночная мокрота, 3 = утренняя мокрота на следующий день). Для пациентов без мокроты соберите образцы с помощью аэрозольного сбора мокроты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Персонал должен оценить качество собранных образцов мокроты. Объем образца обычно следует поддерживать на уровне 3-5 мл. Квалифицированные образцы включают сухую мокроту, коричневую мокроту, окрашенную кровью, мокроту, содержащую небольшое количество свежей крови, или слизистую мокроту. Неквалифицированные образцы, такие как слюна, должны быть повторно представлены для тестирования после получения дальнейших указаний.

2. Предварительная обработка мокроты

  1. Добавьте в емкость с мокротой в 1-2 раза больше объема 4% раствора NaOH из расчета объема собранной мокроты. Встряхните и перемешайте содержимое в течение 2 минут.
  2. Поместите контейнер в шкаф биобезопасности при комнатной температуре на 15 минут, встряхивая его несколько раз за этот период, чтобы обеспечить полное разжижение мокроты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с NaOH осторожно из-за его коррозионной природы. Если мокрота не полностью разжижается, увеличьте время встряхивания. Этот шаг особенно важен на протяжении всего эксперимента.

3. Подготовка реагентов (участок пре-ПЦР)

  1. Приготовление реагентов: Подготовьте реагенты в специально отведенной зоне перед ПЦР. Разморозьте замороженные реагенты до комнатной температуры. Вихрь в течение 5-10 с. Центрифугировать при 3000 × г в течение 5-10 с при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот реагент является двухсистемным (A/B) и должен быть приготовлен отдельно.
  2. Приготовление мастер-смеси для ПЦР
    1. Смесь А: В микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл соедините (n + 3) × 19,6 мкл RIF PCR Mix A и (n + 3) × 0,4 мкл фермента TB. Вихрь в течение 5-10 с. Центрифугируйте при 3000 × г в течение 5-10 с при комнатной температуре (PCR Mix A: 60 μL).
    2. Смесь В: В другой микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл соедините (n + 3) × 19,6 мкл RIF PCR Mix B и (n + 3) × 0,4 мкл фермента TB. Вортекс и центрифуга, как указано выше (PCR Mix B: 60 μL).
  3. Хранение и применение: Готовые мастер-смеси хранить при температуре ≤−18 °C. Если вы не используете сразу, используйте в течение 4 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тот же протокол применяется к реагентам EMB и INH.
  4. Аликвотирование мастер-смеси для ПЦР: Диспонируйте 20 μL PCR Mix A и Mix B в отдельные тонкостенные реакционные пробирки для ПЦР. Перенесите аликвотированные пробирки в герметичных пакетах в зону экстракции.

4. Экстракция нуклеиновых кислот и загрузка образца (участок экстракции)

  1. Центрифугировать 1,2 мл полностью сжиженной мокроты при концентрации 15,058 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и оставьте гранулу. Дополнительно: Центрифугируйте весь переваренный образец, если позволяет оборудование.
  2. Повторно суспендируйте гранулу в 1,2 мл физиологического раствора, вортекса и центрифуги при 15 058 × г в течение 5 минут при комнатной температуре. Повторите этот этап стирки три раза.
  3. Добавьте в гранулу 250 мкл TB экстракционного буфера. Вортексируйте и проведите термический лизис при температуре 99 °C в течение 10 мин. Остудить до комнатной температуры. Центрифугировать при 15,058 × г в течение 1 мин при комнатной температуре и собрать надосадочную жидкость (экстрагированный образец).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для вязких образцов увеличьте объем буфера для сжижения или увеличьте время вихревой обработки. Если образцы предназначены исключительно для экстракции ДНК, продлите время разжижения, чтобы обеспечить полное разложение.
  4. С помощью микропипетки добавьте 5 мкл экстрагированного образца или отрицательного/положительного контроля в каждую тонкостенную реакционную пробирку для ПЦР. Немедленно запечатайте пробирки и наклейте соответствующую этикетку.
  5. Вихревую нагрузку в ПЦР-пробирки в течение 5-10 с и центрифугирование кратковременно (5-10 с). Переведите пробирки в зону амплификации ПЦР.

5. ПЦР-амплификация (зона амплификации)

ПРИМЕЧАНИЕ: Программы для определения резистентности к рифампицину, этамбутолу и изониазиду были установлены на термоамплификаторе Hongshi (Таблица 1, Таблица 2 и Таблица 3). Условия для езды на велосипеде включены в стоимость.

  1. Поместите загруженные тонкостенные реакционные пробирки ПЦР в термоамплификатор для амплификации.
  2. Получите доступ к интерфейсу амплификатора. Нажмите на кнопку Мастер экспериментов и выберите тип эксперимента Standard Melt Curve (как показано на рисунке 1).
  3. Нажмите на Plate Editor, горизонтально выберите две соседние пустые лунки и назначьте соответствующий шаблон лекарства на правой панели, чтобы определить один образец (как показано на рисунке 2).
  4. Настройте отрицательный/положительный контроль и информацию об образце. Нажмите « Пуск », чтобы запустить программу. Продолжительность 2 ч 22 мин.
  5. По завершении переложите тонкостенные реакционные пробирки ПЦР (запечатанные) в герметичный пакет. Закрепите крышку и уберите биологически опасные отходы.
  6. Нажмите « Анализировать » на термоамплификаторе для обработки данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пределы обнаружения этого метода следующие: Композитная группа: 10 бактерий/мл; Рифампицин: 20 000 бактерий/мл; Изониазид: 10 000 бактерий/мл; Этамбутол: 10 000 бактерий/мл. (Данные о пределе обнаружения (LoD) получены на основе статистического анализа 765 клинических случаев, представленного в руководстве по эксплуатации реагентов.)

6. Интерпретация результатов

  1. Определите мутации путем сравнения разницы температур плавления (Tm) между тестовыми образцами и положительными контрольными образцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Wild-тип (Drug-sensitive): Значения Tm образца соответствуют положительному контролю во всех четырех каналах (отклонение ≤1 °C). Мутантный (лекарственно-устойчивый): значение Tm в любом канале на ≥2 °C ниже, чем положительный контроль (ΔTm ≥2 °C).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом исследовании использовалась флуоресцентная ПЦР в реальном времени и анализ кривой плавления для тестирования образцов мокроты у 17 пациентов с туберкулезом. Кроме того, 30 пациентов прошли тестирование на резистентность к рифампицину , а 20 были протестированы на устойчивость к изониазиду и этамбутолу. Метод флуоресцентной ПЦР в реальном времени показал 88,2% положительных результатов выявления комплекса Mycobacterium tuberculosis .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Появление в мировом масштабе лекарственно-устойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) значительно усложнило лечение больных туберкулезом (ТБ). В частности, туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) представляет собой огромные проблемы для борьбы с ТБ12. Быстрое выявление лекарственной устойчивости имеет решающее значение для разработки соответствующих схем лечения, предотвраще...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было профинансировано за счет специального гранта от Corps Tuberculosis Project.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
центрифуга
Lysis BufferXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Набор для обнаружения мутаций устойчивости к этамбутолу Mycobacterium tuberculosisXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Набор для обнаружения мутаций резистентности к изониазиду Mycobacterium tuberculosisXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Обнаружение мутаций устойчивости к рифампицину Mycobacterium tuberculosis KiXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Система ПЦР в реальном времени SLAN-96PShanghai Hongshi Medical Technology Co., Ltd.SLAN-96P
Раствор для переработки мокротыXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
TopPette Pipettor
Высокоскоростная 2411070124030801240111012403100124110701

Ссылки

  1. Salari, N., et al. Global prevalence of drug-resistant tuberculosis: A systematic review and meta-analysis. Infect Dis Poverty. 12 (1), 57(2023).
  2. Cai, X., Xu, X., He, G., Jiang, X., Wu, L. Drug resistance in drug-resistant tuberculosis patients with and without diabetes mellitus: A comparative analysis. BMC Infect Dis. 24 (1), 807(2024).
  3. Egan, K. A., et al. Compensatory evolution in NusG improves fitness of drug-resistant M. tuberculosis. Nature. 628 (8006), 186-194 (2024).
  4. Sulis, G., Pai, M. Isoniazid-resistant tuberculosis: A problem we can no longer ignore. PLoS Med. 17 (1), e1003023(2020).
  5. Perumal, R., et al. Regimens for drug-resistant tuberculosis. N Engl J Med. 388 (2), 189(2023).
  6. Menzies, D., et al. Effect of duration and intermittency of rifampin on tuberculosis treatment outcomes: A systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 6 (9), e1000146(2009).
  7. Turkova, A., et al. Shorter treatment for nonsevere tuberculosis in African and Indian children. N Engl J Med. 386 (10), 911-922 (2022).
  8. Diagnosis of tuberculosis and detection of drug-resistance: rapid communication. , World Health Organization. https://www.who.int/publications/i/item/B09111 (2024).
  9. Xiang, X., et al. Mycobacterial ethambutol responsive genes and implications in antibiotics resistance. J Drug Target. 29 (3), 284-293 (2021).
  10. Deshpande, A., Likhar, R., Khan, T., Omri, A. Decoding drug resistance in Mycobacterium tuberculosis complex: Genetic insights and future challenges. Expert Rev Anti Infect Ther. 22 (7), 511-527 (2024).
  11. Sun, Q., et al. Mutations within embCAB are associated with variable level of ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from China. Antimicrob Agents Chemother. 62 (1), e01279-e01317 (2017).
  12. Noordhoek, G. T., et al. Sensitivity and specificity of PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis: A blind comparison study among seven laboratories. J Clin Microbiol. 32, 277-284 (1994).
  13. Lee, H., et al. Assessment of the quantitative ability of AdvanSure TB/NTM real-time PCR in respiratory specimens by comparison with phenotypic methods. Ann Lab Med. 34, 51-55 (2014).
  14. Murphy, S. G., et al. Direct detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using targeted next generation sequencing. Front Public Health. 11, 1206056(2023).
  15. Araya, B. T., et al. Performance of the Abbott RealTime MTB and RIF/INH resistance assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis and resistance markers in sputum specimens. PLoS One. 16, e0251602(2021).
  16. Motta, I., et al. Recent advances in the treatment of tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 30 (9), 1107-1114 (2024).
  17. Zhang, X., et al. A new method for the detection of Mycobacterium tuberculosis based on the CRISPR/Cas system. BMC Infect Dis. 23 (1), 680(2023).
  18. Sam, I. K., et al. TB-QUICK: CRISPR-Cas12b-assisted rapid and sensitive detection of Mycobacterium tuberculosis. J Infect. 83 (1), 54-60 (2021).
  19. Park, Y. K., et al. Correlation of the phenotypic ethambutol susceptibility of Mycobacterium tuberculosis with embB gene mutations in Korea. J Med Microbiol. 61 (4), 529-534 (2012).
  20. Global tuberculosis report. , World Health Organization. https://www.who.int/teams/global-programme-on-tuberculosis-and-lung-health/tb-reports/global-tuberculosis-report-2023 (2023).
  21. Parsa, S., et al. Detection of isoniazid and rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from sputum samples by high-resolution melting analysis. Curr Microbiol. 79 (9), 257(2022).
  22. Plinke, C., et al. embCAB sequence variation among ethambutol-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates without embB306 mutation. J Antimicrob Chemother. 65 (7), 1359-1367 (2010).
  23. Xie, L., et al. Accurate and affordable detection of rifampicin and isoniazid resistance in tuberculosis sputum specimens by multiplex PCR-multiple probes melting analysis. Infection. 52 (6), 2371-2398 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Диагностика туберкулезалекарственно-устойчивый туберкулезПЦР в реальном времениэкстракция нуклеиновых кислотопределение резистентностимикроскопия мазкаметод культурального исследованиядиагностическая чувствительность

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.