Метод MALDI-ToF MS для характеризации синтетических полимеров с переменной дисперсностью и концевыми группами

Краткое содержание

Этот протокол содержит подробные инструкции и примеры для подготовки образцов, сбора данных и анализа данных для определения характеристик синтетических полимеров с различной дисперсностью и концевыми группами с использованием матричной лазерной десорбции/ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии.

Аннотация

Времяпролетная масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) является эффективным аналитическим инструментом для определения характеристик синтетических полимеров, обеспечивая точное определение молекулярной массы и структурную информацию, такую как повторяющиеся единичные массы и идентификация конечных групп. В этом протоколе подробно описаны этапы анализа полимеров, включая подготовку образцов с соответствующим выбором матрицы и катионов, сбор данных и метод калибровки для обеспечения точных измерений массы. В нем подчеркивается универсальность MALDI-ToF MS при анализе полимеров, от монодисперсных до высокодисперсных материалов, при этом соблюдаются ограничения в разрешении высокодисперсных образцов. Сравнивая теоретическую и наблюдаемую массы, в том числе изотопные структуры, этот метод позволяет уверенно подтверждать повторяющиеся единицы и концевые группы. Протокол поддерживает новых пользователей, предоставляя репрезентативные данные по выбору матрицы, спектральной интерпретации в диапазонах дисперсий и характеризации полимеров с уникальными изотопными свойствами или метастабильными ионными образованиями. Стратегии поиска и устранения неисправностей включают в себя решение таких проблем, как интерференция матрицы и ионизация образцов без добавления катиона во время подготовки образцов. В целом, данное руководство служит основой для использования MALDI-ToF MS в качестве быстрого и надежного метода анализа полимеров.

Введение

Времяпролетная масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) является высокоэффективным аналитическим методом для определения характеристик синтетических полимеров 1,2,3,4. Многие полимеры могут быть охарактеризованы с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для подтверждения повторяющейся структуры единицы. Тем не менее, большинство концевых групп представляют собой долю пиков повторяющихся звеньев, даже для низкомолекулярных полимеров, и по мере увеличения молекулярной массы полимера сигналы конечной группы кажутся трудными для количественной оценки в ЯМР⁵. Тем не менее, данные MALDI-ToF MS подтверждают, что это конечные группы, даже при более высоких молекулярных массах. Этот метод масс-спектрометрии известен своей способностью к мягкой ионизации и в основном генерирует однозарядные полимерные ионы с очень минимальной фрагментацией^. Это позволяет точно определить молекулярную массу и провести детальный структурный анализ, который дает быстрые и точные результаты, предоставляя ценную информацию, такую как повторяющиеся единичные массы, идентификация конечных групп, а для полимеров с низкой дисперсностью — определение среднечисленной молекулярной массы (M_n), среднемассовой молекулярной массы (M_w) и дисперсии (Đ)⁶.

MALDI-ToF MS может анализировать полимеры с различной дисперсностью, но имеет ограничения при более высокой дисперсности. Для монодисперсных полимеров, таких как дендримеры, этот метод идеально подходит для подтверждения их массы и идентификации конечных групп⁷. Для полимеров с низкой дисперсностью (1,01-1,09) и некоторых полимеров со средней дисперсностью (Tİ = 1,1-1,3) MALDI-ToF MS также можно использовать для определения массы повторяющейся единицы полимера, массы конечной группы, Tİ, M_n и M_w⁸. Однако для высокодисперсных полимеров (Ľ = 1,3-10) это становится сложной задачей. Для полимеров с широкой дисперсией более низкие фракции демонстрируют гораздо более высокую интенсивность, чем их аналоги с более высокой молекулярной массой, что приводит к искусственно более низкой дисперсности, чем другие методы характеризации, такие как эксклюзионная хроматография (SEC). Это описывается как «систематическая ошибка с низкой массой». Средняя масса повторяющихся единиц и концевые группы могут быть подтверждены по результатам с более низкой молекулярной массой, но невозможно определить истинные M_n, M_w и Đ для высокодисперсных полимеров из MALDI-ToF MS⁹. Следовательно, SEC должен быть добавлен в качестве метода определения характеристик для широко дисперсных полимеров для определения истинных M_n, M_w и Đ.

Оптимизация пробоподготовки имеет важное значение для получения высококачественного пикового разрешения в масс-спектре MALDI-ToF ^2,10. Первый шаг включает в себя выбор подходящей матрицы на основе полярности полимера. Для неполярных полимеров обычно используются такие матрицы, как транс-2-[3-трет-бутилфенил)-2-метил-2-пропенилиден] (DCTB), свободный радикал гальвиноксила (GFR) и 9-нитроантрацен (9-NA)¹¹. Полярные полимеры лучше подходят для таких матриц, как α-циано-4-гидроксикоричная кислота (CHCA), дитранол, 2-(4-гидроксифенилазо)бензойная кислота (HABA) и 2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB)12,13,14. Для этого протокола DCTB был выбран в качестве первичной матрицы из-за его эффективности с неполярными полимерами, а CHCA был использован для полярных полимеров. Выбор катионов также играет важную роль, так как щелочные металлы, такие как натрий и калий, эффективно ионизируют кислородсодержащие полимеры, в то время как переходные металлы, такие как серебро, лучше подходят для ненасыщенных углеводородов^10,14.

После выбора матрицы и аналита определяются оптимальные соотношения катион:аналит:матрица для смесей образцовых растворов. Эта смесь раствора образца будет добавлена в целевую пластину в количестве 1 μл. Отсутствие одного или нескольких правильных соотношений выборок катион:аналит:матрица может повлиять на чувствительность сбора данных MALDI-ToF MS. Для приведенных ниже репрезентативных данных подготовка образцов была оптимизирована для достижения наилучшего разрешения ^2,15.

После подготовки раствора образца и добавления его на целевую пластину MALDI-ToF MS этот образец вставляется в прибор MALDI-ToF MS для начала сбора данных. Для этого исследования данные собирались исключительно в режиме положительных ионов, и был использован более новый масс-спектрометр MALDI-ToF, основанный на предыдущей работе Пейна и ^{соавторов.} Важные параметры MALDI-ToF MS, такие как мощность лазера, диаметр лазерного луча, усиление детектора и время задержки импульсного извлечения, могут быть отрегулированы для повышения разрешения во время захвата. Для сбора данных МС MALDI-ToF доступны два режима: линейный и рефлектронный¹⁷. Рефлектронный режим предпочтителен для достижения более высокого разрешения сигнала по сравнению с линейной модой^18,19. В линейном режиме ускоренные ионы перемещаются непосредственно через пролетную трубу к детектору. В отличие от этого, рефлектронный режим включает в себя прохождение через полетную трубу один раз, а затем отражение ионов обратно через полетную трубу второй раз, прежде чем достичь второго детектора, что примерно удваивает траекторию их полета. Такой подход позволяет дифференцировать ионы с одинаковыми массами, но различными скоростями^20,21. Мощность лазера также может быть фактором увеличения отношения сигнал/шум или уменьшения фрагментации полимера²². Наименьшая возможная мощность лазера для абляции образца улучшит отношение сигнал/шум, а также уменьшит возможность фрагментации²². После оптимизации разрешения сигнала и максимизации отношения сигнал/шум сбор данных может обеспечить высокое качество данных для выбранного полимерного аналита.

Калибровка имеет важное значение для точного измерения массы в MALDI-ToF MS. Используются два основных метода: внутренняя и внешняя калибровка, оба основаны на калибрах с известными массами, которые охватывают ожидаемый диапазон аналита⁶. Для полимеров, проанализированных в репрезентативных данных, были выбраны монодисперсные дендримные калибранты для калибровки в широких диапазонах масс²³. Внутренняя калибровка, при которой калибр смешивается с катионом, аналитом и матрицей, повышает точность массы, поскольку калибр и аналит находятся в одних и тех же условиях, и любой сдвиг массы калибровки влияет на них в равной степени. Однако этот метод может привести к перекрытию пиков с результирующими полимерными сигналами, что усложняет анализ²⁴. В отличие от этого, внешняя калибровка, используемая в этом протоколе, позволяет избежать перекрытия пиков путем подготовки и обнаружения катион:калибр:матрица отдельно от катион:аналит:матрица на целевой пластине. Тем не менее, незначительные погрешности массы могут возникать из-за незначительных различий в размещении образца и местной реакции прибора, таких как изменения интенсивности лазера или эффективности ионизации по всей мишени, так что калибр и анализируемый материал должны находиться в непосредственной близости друг^{от друга.} В репрезентативных данных наблюдаемая разница масс при использовании метода внешней калибровки составила менее 0,100 Да от теоретического значения.

Наконец, для всех полимеров данные MALDI-ToF MS могут быть проанализированы для определения повторяющейся единичной массы и выполнения анализа концевых групп полимеров. Единичная масса повтора может быть подтверждена путем сравнения теоретической массы повторяющихся единиц с помощью программных средств с наблюдаемой массой повторяющихся единиц в масс-спектрах MALDI-ToF. Если они совпадают, полимер, скорее всего, будет иметь ожидаемую структуру повторяющегося звена (или изомер). Анализ концевых групп MALDI-ToF MS для полимеров начинается с расчета теоретической массы анализируемого вещества. Она включает в себя совокупную массу блока повторов, концевых групп и выбранного катиона в результате подготовки образца. В случае монодисперсных макромолекул расчет включает общую массу одного аналита вместе с массой выбранного катиона. Программные инструменты для рисования химических структур могут помочь в этих расчетах. Затем теоретическая масса из программного обеспечения сравнивается с наблюдаемой массой из масс-спектров MALDI-ToF, чтобы проверить, соответствует ли полимер ожидаемой молекулярной структуре. Однако, если наблюдаемая масса повторяющейся единицы приблизительно соответствует теоретическому значению, а общая масса указанного n-мера, включая концевые группы и катион, не совпадает, то это расхождение может указывать на наличие неожиданных конечных групп. Для идентификации неизвестных конечных групп условия реакции пересматриваются с целью определения альтернативных молекул или реагентов, которые могли бы вступить в реакцию с образованием наблюдаемых конечных групп. Этот шаг имеет решающее значение для точной характеристики всей структуры полимера.

Этот протокол представляет собой пошаговый метод MALDI-ToF MS-анализа синтетических полимеров, предназначенный для помощи пользователям, особенно начинающим, в подготовке образцов, оптимизации инструментального метода, сборе и анализе данных. Репрезентативные данные иллюстрируют выбор матрицы для данного полимера; спектры и анализ полимеров с различной дисперсностью, в том числе монодисперсных, среднедисперсных и высокодисперсных образцов; анализ концевых групп полимеров, который включает полимеры с различным изотопным разрешением (например, галогенированные) и склонные к образованию метастабильных ионов (например, с азидным окончанием); анализ данных полимеров с использованием MALDI-ToF MS, который включает в себя сравнение наблюдаемых и теоретических масс для подтверждения повторяющихся единичных масс и общей массы полимера, включая концевые группы и катионные аддукты; и пример поиска и устранения проблем матричной интерференции маломассовых полимеров и самоионизирующихся полимеров.

Этот протокол не только обеспечивает основу для определения характеристик полимеров MALDI-ToF MS, но и предлагает рекомендации по подготовке образцов, поэтапной оптимизации инструментального метода (рис. 1) и интерпретации спектров как для вновь синтезированных, так и для коммерческих синтетических полимеров.

Протокол

ВНИМАНИЕ: Перед использованием ознакомьтесь с паспортами безопасности (SDS) для всех химических веществ. Выполняйте все пробоподготовку и подготовку MALDI-ToF MS в вытяжном шкафу и надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая защитные очки, лабораторный халат и перчатки.

1. Подготовка образцов

1. Приготовление матричного, катионного, калибрантного и аналитного стокового раствора
   1. Приготовьте исходный раствор катионов щелочи, растворив 2 мг нужного катиона в 1 мл растворителя, выбранного по его совместимости с анализируемым веществом и катионом. Для образца 1 2 мг трифторацетата натрия растворяли в 1 мл ТГФ.
   2. Приготовьте матричный стоковый раствор, растворив 20 мг нужной матрицы в 1 мл совместимого растворителя в зависимости от растворимости анализируемого растворителя. Пример: Для получения репрезентативных данных (образец 1) растворите 20 мг DCTB в 1 мл тетрагидрофурана (ТГФ).
   3. Приготовьте решение для складских запасов калибра, следуя инструкциям поставщика.
   4. Приготовьте раствор аналита, растворив 10 мг аналита в 1 мл подходящего растворителя. Для образца 1 10 мг анализируемого вещества растворяют в 1 мл ТГФ.
2. Подготовка целевой пластины MALDI-ToF MS
   1. Очистите целевую пластину MALDI-ToF MS.
   2. Подготовьте образец для сбора аналита и раствор калибровочного образца. Добавьте исходные растворы катионов, аналита и матрицы в соотношении 1:5:20 мкл в пробирку А и вихрь. Для внешней калибровки: Добавьте катионные, калибрантные и матричные стоковые растворы в соотношении 1:5:20 мкл в пробирку B и вихрь.
   3. Добавьте смесь аналита и калибровочного раствора образца на целевую пластину MALDI-ToF MS. Пипетка 0,5 мкл смеси образцового раствора катион:аналит:матрица (пробирка А) на мишенную пластину MALDI-ToF MS методом высушенных капель. Пипетку 0,5 мкл смеси катион:калибрант:матрица (пробирка В) на место, прилегающее к анализируемому веществу на целевой пластине MALDI-ToF MS, методом высушенных капель. Запишите точное местоположение каждого места (букву строки и номер столбца), чтобы легко найти образец и калибр во время сбора данных.

2. Сбор данных

1. Вставьте целевую пластину MALDI-ToF MS и выберите метод сбора данных
   1. Вставьте целевую пластину MALDI-ToF MS в прибор. Поместите целевую пластину на держатель в правильной ориентации и не заталкивайте целевую пластину MALDI-ToF MS слишком глубоко.
   2. Закрепите целевую пластину MALDI-ToF MS на приборе с помощью программного обеспечения для управления прибором.
   3. Выберите и откройте файл метода в программном обеспечении для управления прибором. Выберите метод отражения положительного (RP) или линейного положительного (LP) метода в пределах диапазона масс анализируемого вещества.
   4. Следите за программным обеспечением управления прибором, чтобы убедиться, что целевая пластина вставлена и настройка метода завершена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти репрезентативные полимеры содержат кислород; Поэтому выбирается положительный режим (у большинства соединений сбор завершен в положительном режиме). Для репрезентативных данных был выбран метод RP для режима отражателя на всех образцах.
2. Сбор исходных данных
   1. В программном обеспечении для управления прибором найдите камеру, на которой отображается целевая пластина MALDI-ToF MS и схема скважин с буквами столбцов и номерами строк. Щелкните по лунке MALDI-ToF MS, содержащей смесь катион:аналит:матрица , чтобы выбрать ее для сбора данных.
   2. Отрегулируйте диапазон обнаружения массы в программном обеспечении для управления прибором до широкого диапазона 500–20000 Да, чтобы обеспечить полный захват ожидаемой массы анализируемого вещества. С помощью курсора отрегулируйте диапазон примерно в 2 раза ниже и выше ожидаемой массы анализируемого вещества после первоначального сбора.
   3. Сбор данных
      1. Нажмите кнопку «Пуск » в программном обеспечении для управления прибором, чтобы начать сбор данных MALDI-ToF MS.
      2. Нажмите Стоп или дождитесь автоматического завершения сбора данных MALDI-ToF MS.
      3. Нажмите кнопку Добавить , чтобы добавить одиночный спектр MALDI-ToF MS в буфер суммарного спектра.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Одиночный спектральный буфер MALDI-ToF MS хранит отдельный масс-спектр MALDI-ToF, а буфер суммарного спектра накапливает данные от нескольких сборов, увеличивая интенсивность сигнала.
      4. Измените положение лазера MALDI-ToF MS, просмотрев изображение с камеры, и нажмите «В любом месте в той же выбранной лунке », чтобы переместить лазер в новое положение.
      5. Повторите сбор данных MALDI-ToF MS, чтобы добавить одиночные спектры MALDI-ToF MS в буфер суммы. Повторяйте шаги с 2.2.3.1 по 2.2.3.4 до тех пор, пока результаты MALDI-ToF MS не станут удовлетворительными.
      6. Оцените масс-спектр MALDI-ToF по разрешению и базовому уровню шума. Если спектр MALDI-ToF MS демонстрирует высокое разрешение и минимальный базовый шум, перейдите к этапу калибровки. Если нет, рассмотрите возможность оптимизации метода сбора данных (например, отрегулировав мощность лазера, усиление детектора или настройки извлечения импульсных ионов).
3. Оптимизация сбора данных (см. Рисунок 1)
   1. Регулируйте мощность лазера MALDI-ToF MS, усиление детектора и импульсное выделение ионов по одному, чтобы улучшить разрешение и/или уменьшить фоновый шум
   2. Чтобы дублировать метод MALDI-ToF MS, скопируйте и вставьте метод MALDI-ToF MS LP или RP под новым именем. Откройте вставленный файл метода MALDI-ToF MS, который был создан, и переименуйте файл.
   3. Получите исходный масс-спектр MALDI-ToF, выполнив все действия, описанные в разделе 2.2 для первоначального сбора данных в разделе «Сбор данных». Увеличьте набор пиков MALDI-ToF MS с максимальной интенсивностью, чтобы оценить разрешение и базовый уровень шума в программном обеспечении для управления прибором.
   4. Оптимизация закупок
      1. Регулировка мощности лазера MALDI-ToF MS
         1. Начните с низкой мощности лазера MALDI-ToF MS ~ 4% и следуйте шагам 2.2.3.1 и 2.2.3.2 для начала и остановки первоначального сбора данных.
         2. Наблюдайте и сравнивайте разрешение и базовый шум одиночного буфера MALDI-ToF MS и начального спектра в буфере суммы.
         3. Увеличивайте мощность лазера MALDI-ToF MS с шагом 2–10% для усиления ионизации. Выполните шаги 2.2.3.1 и 2.2.3.2 для начала и остановки первоначального сбора данных после каждого приращения.
         4. Выберите самую низкую мощность лазера, которая обеспечит пики высокой интенсивности с минимальным шумом.
            ПРИМЕЧАНИЕ: Когда мощность лазера MALDI-ToF MS составляет 50% и выше, существует повышенная вероятность фрагментации образца.
      2. Оптимизация диаметра лазера MALDI-ToF MS
         1. Во вкладке «Детектор» отрегулируйте диаметр лазера MALDI-ToF MS для тестирования средних, больших и ультра настроек. Выполните шаги 2.2.3.1 и 2.2.3.2 для начала и остановки первоначального сбора данных.
         2. Наблюдайте и сравнивайте разрешение и базовый шум одиночного буфера MALDI-ToF MS и начального спектра в буфере суммы.
         3. Выберите диаметр лазера MALDI-ToF MS, обеспечивающий оптимальное разрешение с минимальным базовым шумом.
            ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр лазера MALDI-ToF MS регулирует диаметр лазерного луча.
      3. Регулировка усиления детектора MALDI-ToF MS
         1. С небольшими шагами увеличивайте или уменьшайте усиление детектора MALDI-ToF MS. Выполните шаги 2.2.3.1 и 2.2.3.2 для начала и остановки исходного сбора данных при каждом увеличении или уменьшении усиления детектора MALDI-ToF MS.
         2. Наблюдайте за интенсивностью и разрешением масс-спектров MALDI-ToF в программном обеспечении для управления прибором при каждой настройке одиночного буфера MALDI-ToF MS и начального спектра в буфере суммы.
         3. Сохраняйте коэффициент усиления детектора MALDI-ToF MS, который обеспечивает наилучшую интенсивность и хорошее разрешение сигнала.
      4. Модификация импульсной экстракции ионов MALDI-ToF MS
         1. Отрегулируйте импульсную экстракцию ионов MALDI-ToF MS с шагом 10 нс. Выполните шаги 2.2.3.1 и 2.2.3.2 для начала и остановки сбора исходных данных для каждого увеличения или уменьшения усиления детектора.
         2. Оцените, как изменения импульсной экстракции ионов улучшают разрешение сигнала MALDI-ToF MS.
            ПРИМЕЧАНИЕ: Импульсное извлечение ионов MALDI-ToF MS определяется как временная задержка между лазерной ионизацией. Увеличивая или уменьшая импульсную экстракцию ионов, ионы различных энергий будут оставаться в электрическом поле в течение более короткого или более длительного времени. Более длительное время может позволить аналитам той же массы и положительно заряженным ионам, которые абляются в несколько разное время, полностью разогнаться до той же скорости, что и ионы аналита той же массы при приложении напряжения. Это может быть использовано для увеличения разрешения и уменьшения фонового шума сигнала²⁵.
   5. После достижения оптимального разрешения и максимального соотношения сигнал/шум сохраните оптимизированный файл метода MALDI-ToF MS для текущего и будущего использования.
4. Калибровка MALDI-ToF MS
   1. Получите калибровочный масс-спектр MALDI-ToF, выбрав калибровочный образец на целевой пластине и выполнив все действия, описанные в разделе 2.2 для первоначального сбора данных
      1. Доступ к контрольным точкам калибровки. Перейдите на вкладку калибровки в программном обеспечении для управления прибором. Откройте соответствующий список управления массой, соответствующий используемому калибру.
   2. Сопоставьте пики калибровки масс-спектра MALDI-ToF с эталонными массами в списке управления массой.
      1. В списке управления массой выберите Масса, соответствующая первому пику калибровки в масс-спектре MALDI-ToF. Масс-спектр MALDI-ToF автоматически увеличится на выбранный пик калибра.
      2. Установите опорный пик, щелкнув слева от сигнала калибра. Пик будет выбран.
      3. Выберите Применить, чтобы установить сигнал калибра в качестве опорной массы в списке управления массой.
      4. Повторите этот процесс для всех дополнительных пиков калибровки. Выберите интересующую вас массу из списка управления массой, выровняйте соответствующий пик калибра и примените настройку эталона.
5. Отбор образцов калиброванного аналита полимера
   1. Найдите и выберите лунку, содержащую лунку для смеси катион:аналит:матрица в программном обеспечении для управления прибором.
   2. Выполните сбор данных, выполнив все действия, описанные в разделе 2.2, с открытым оптимизированным и откалиброванным методом.
   3. Добавьте соответствующее имя файла и сохраните откалиброванный масс-спектр аналита MALDI-ToF для дальнейшего анализа.
6. Снимите целевую пластину MALDI-ToF MS с помощью программного обеспечения для управления прибором. Очистка целевой пластины MALDI-ToF MS

Рисунок 1: Дерево решений для оптимизации метода инструмента. Данное руководство предназначено для того, чтобы помочь начинающим пользователям в систематической оптимизации параметров прибора. Начните со стандартных или начальных настроек и корректируйте по одному параметру за раз, увеличивая или уменьшая в зависимости от наблюдаемых улучшений. Затем продолжайте движение в направлении, которое повышает (1) пиковую интенсивность, (2) базовое качество (низкий уровень шума) и (3) обеспечивает узкое пиковое и изотопное разрешение. Такой подход помогает определить оптимальные условия для получения достоверных и высококачественных спектров. Если образец полимера не ионизируется или не выдает пригодный для использования спектр в режиме отражателя, переключитесь в линейный режим и используйте это же дерево решений для оптимизации параметров. Обратите внимание, что линейная мода часто приводит к более широким пикам и ограниченному изотопному разрешению или его отсутствию, но она может быть эффективной для полимеров с большей массой или полимеров, которые могут терять ионизацию в отражательной моде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Анализ и интерпретация данных

1. Откройте программное обеспечение для анализа данных MALDI-ToF MS и загрузите спектр образцов аналита MALDI-ToF MS.
2. Выберите правильный метод обработки MALDI-ToF MS для образцов аналита. Здесь все образцы имели изотопное разрешение, и для всех пиков был выбран первый пик с помощью выбранного метода обработки MALDI-ToF MS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры обработки MALDI-ToF MS могут быть адаптированы для образцов синтетических полимеров. Например, метод обработки полимеров методом MALDI-ToF MS был разработан во время технического обучения техником по приборам MALDI-ToF MS. Метод обработки средней массы MALDI-ToF MS был создан Payne et al. для конкретных применений¹⁶. Свяжитесь с технической группой производителя полимеров MALDI-ToF MS для получения информации и рекомендаций по редактированию метода обработки MALDI-ToF MS.
3. Находите пики с помощью аналитического программного обеспечения MALDI-ToF MS.
4. Сравните теоретическую и экспериментальную массу полимера
   1. Запишите теоретическую массу полимера. Нарисуйте ожидаемую структуру макромолекулы, включая катион, в программном обеспечении для химического черчения. Откройте окно анализа в программе химического черчения и запишите теоретическую массу.
      1. Монодисперсные макромолекулы: Запишите точную массу и молекулярную массу макромолекулы путем совместного выбора структуры и катиона.
      2. Полимеры с низкой, умеренной и высокой дисперсией: Для повторяющихся единиц массы выберите только полимерную основу, чтобы записать повторяющуюся единицу массы. Для общей массы указанного n-mer установите номер повторяющейся единицы измерения на массу в пределах диапазона спектра MALDI-ToF MS, отображаемого в программном обеспечении для анализа MALDI-ToF MS. Выберите всю структуру полимера, включая катионную и концевую группы, чтобы записать массу указанного n-мера.
   2. Сравните зарегистрированную теоретическую массу с наблюдаемой массой из спектра MALDI-ToF MS
      1. Для расчета общей массы монодисперсных макромолекул выполните действия, описанные ниже.
         1. Увеличьте масштаб пика с самой высокой интенсивностью в спектре MALDI-ToF MS, обеспечив диапазон масс как минимум в 2 раза ниже и выше теоретической массы.
         2. Сравните теоретическую массу с наблюдаемой массой в масс-спектре MALDI-ToF. Если разница составляет менее 0,100 Да, ожидаемая масса монодисперсной макромолекулы, скорее всего, является точной.
         3. Исследуйте спектр MALDI-ToF MS на наличие дополнительных пиков, которые могут указывать на наличие неожиданных структур.
         4. При обнаружении несоответствий оцените возможные структурные вариации. Просмотрите схему реакции и рассчитайте массы альтернативных структур для сравнения.
      2. Для повторного расчета массы единицы низко, умеренно и высокодисперсных полимеров выполните действия, описанные ниже.
         1. Выберите и увеличьте два пика, разделенных единицей повторяемости массы в спектре MALDI-ToF MS, которые демонстрируют наибольшую интенсивность.
         2. Для каждой пары соседних пиков вычтите наблюдаемую массу пика с более высокой массой из пика с более низкой массой, чтобы вычислить повторяющуюся единицу массы. Повторите этот процесс для следующего набора пиков, чтобы подтвердить постоянство повторяемой единицы массы.
         3. Сравните вычисленную единицу повторяемости с теоретической массой повторяемой единицы. Если наблюдаемые и теоретические значения совпадают и демонстрируют постоянную разницу в массе, то единица массы полимерного повтора, скорее всего, верна.
      3. Для определения общей массы определенного n-мера полимеров с низкой, умеренной и высокой дисперсией выполните действия, описанные ниже.
         1. Увеличьте пик в масс-спектре MALDI-ToF, соответствующий теоретической общей массе, а также пики на одну единицу повтора выше и ниже.
         2. Сравните теоретическую массу с наблюдаемой массой в масс-спектре MALDI-ToF. Если разница составляет менее 0,100 Да, ожидаемые конечные группы, скорее всего, точны.
         3. Изучите масс-спектр MALDI-ToF на наличие дополнительных пиков, которые могут указывать на неожиданные структуры.
         4. При выявлении расхождений оцените альтернативные конечные группы или структурные вариации. Просмотрите схему реакции и рассчитайте массы для потенциальных альтернативных концевых групп или циклических структур.

Результаты

Образец 1: Монодисперсный Tris[G1](OH)₆
Поколение 1 монодисперсного дендримера, состоящего из ядра 1,1,1-трис(гидроксиметил)пропана с тремя бензилиден-защищенными бис(гидроксиметил)пропионовой кислотой на периферии (Tris[G1]Bnz₃), взаимодействовали с газом Pd/C и_H2 в соотношении метанол:хлороформ 1:1 для удаления бензилиденовых групп и приводили к образованию дендримера с 6 гидроксильными группами с образованием трис[G1](OH)₆ (рис. 2A).

Tris[G1](OH)₆ анализировали с использованием NaTFA в качестве катионного агента с CHCA в качестве матрицы. CHCA был использован, потому что он очень эффективен с полярными соединениями и взаимодействует с гидроксильными группами Tris[G1](OH)₆ для получения однородного слоя на целевой пластине. Подготовку образцов MALDI-ToF MS начинали с получения исходных растворов NaTFA (1 мг/мл в ТГФ), аналита (5 мг/мл в ТГФ) и CHCA (5 мг/мл в ТГФ). После получения этих растворов 1 мкл раствора катионов Na⁺ , 5 мкл раствора аналита и 20 мкл матричного раствора объединяли в микроцентрифужной пробирке и вортексировали (соотношение 1:25:100 катион:аналит:матрица, что в сумме составило 26 мл). Далее 1 мкл этой смеси извлекали из микроцентрифужной пробирки и сушили на мишенной пластине MALDI-ToF MS. Этот образец был проанализирован в рефлекторном режиме, и пик был подтвержден в спектре MALDI-ToF MS путем сравнения теоретических и наблюдаемых значений (рис. 2B, красный).

Рисунок 2: (A) Схема реакции для модификации образца 1 в Tris[G1](OH)₆. Бензилиденовые группы удаляли с помощью реакции Pd/C и_H2 с образованием Tris[G1](OH)₆. Для определения завершения реакции использовали MALDI-ToF MS. (B) Наложены масс-спектры MALDI-ToF образца 1, Tris[G1](OH)₆ и наложен спектр пустой матрицы, включающий матрицу и соль ([CHCA + Na]⁺). Полный спектр MALDI-ToF MS и увеличение Tris[G1](OH)₆ показывают, что наблюдаемое значение массы для [Tris[G1](OH)₆ + Na⁺]⁺ составляет 505,239 Да и отличается на +0,013 Да от теоретической массы 505,226 Да. Сравнивая пустой спектр матрицы MALDI-ToF MS (черный) со спектром MALDI-ToF MS Tris[G1](OH)₆ (красный), можно пренебречь всеми пиками, кроме 505,26 Да. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Наблюдался аддукт Na⁺ для Tris[G1](OH)₆ . Теоретическое значение массы [Tris[G1](OH)₆ + Na]⁺ состоит из массы моноизотопного пика Tris[G1](OH)₆ (482,2362 Да) плюс масса катиона натрия (22,9892 Да), что дает общую массу 505,226 Да. Наблюдаемое значение массы для [Tris[G1](OH)₆ + Na]⁺ составляет 505,239 Да, что соответствует теоретическому значению с разницей +0,013 Да.

Чтобы обеспечить полное удаление всех трех бензилиденовых групп, спектр MALDI-ToF MS был дополнительно проанализирован в диапазоне 505-769 Да. Этот диапазон масс позволяет обнаруживать любые периферийные группы, которые не были обнаружены. Наличие пика [Tris[G1]Bnz₂(OH)₂ + Na]⁺ указывает на то, что один бензилиден удален при 681,289 Да ([Tris[G1]Bnz₃ + Na]⁺ 769,3194 Да - 88,0313 Да) и на пике 593,257 Да ([Tris[G1]Bnz₃ + Na]⁺ 769,3194 Да -176,0626 Да) для [Tris[G1]Bnz₁(OH)₄ + Na]⁺ , что указывает на то, что две бензилиденовые группы были удалены из Tris[G1]Bnz₃ (рис. 3). Эти пики и Tris[G1]Bnz₃ отсутствуют; Таким образом, реакция завершилась, и был синтезирован Tris[G1](OH)₆ .

Рисунок 3: Структуры и теоретические массы Tris[G1]Bnz₃, промежуточные продукты Tris[G1]Bnz₂(OH)₂, Tris[G1]Bnz₁(OH)₄ и образец 1 Tris[G1](OH)_6. Черная точка указывает на товар. Структуры и теоретические массы одной и двух бензилиденовых групп удалены, а полностью гидроксилированный Tris[G1](OH)₆ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В области с низкой молекулярной массой ниже 900 присутствуют множественные пики, которые не совпадают с массой монодисперсии Tris[G1](OH)₆ . Большинство матриц имеют незначительные проблемы с шумом ниже 1000, поэтому для подтверждения того, что Tris[G1](OH)₆ является чистым, включается пустой спектр MALDI-ToF MS. В образец матрицы входили матричные (CHCA) и катионные (Na⁺) исходные растворы. Для анализа образцовой смеси использовали то же катионное отношение к матричному соотношению концентраций из Tris[G1]OH₆ (1:100 мг/мл). Далее в планшет с образцом добавляли 1 мкл смеси и высушивали для анализа.

Был завершен сбор предварительных данных, калибровочный сбор и сбор данных для получения пустого спектра матрицы MALDI-ToF MS. На рисунке 2B (черный) пустая матрица MALDI-ToF MS (черный) и спектр образца Tris[G1](OH)₆ (красный) были наложены на анализ изгиба для сравнения и подтверждения, какие пики не связаны с продуктом. Любые пики, идентифицированные в пустом спектре матрицы MALDI-ToF MS и Tris[G1](OH)₆ , могут быть проигнорированы, и поэтому единственным пиком является 505,226 Да, что соответствует образцу 2. Например, пики 445,016 Да и 656,141 Да в спектре MALDI-ToF MS Tris[G1](OH)₆ (рисунок 2B красный) также расположены в пустом спектре матрицы MALDI-ToF MS (рисунок 2B черный) на 445,017 Да и 656,144 Да и имеют разницу +0,001 Да и +0,003 Да соответственно. Эти пики не будут включены в анализ, так как они совпадают и имеют схожие отличия от пустой матрицы и спектра Tris[G1](OH)₆ MALDI-ToF MS. Таким образом, масса Tris[G1](OH)₆ подтверждается с помощью MALDI-ToF MS, но для подтверждения чистоты образца потребуются другие анализы, такие как SEC и NMR.

Образец 2: Поли(2,2-диметилпропаноат) с хлоридом и протонной концевой группой
3-Хлор-2,2-диметилпропановую кислоту полимеризовали с использованием карбоната калия в качестве основы (рис. 4А). Образец поли(2,2-диметилпропаноата) (PDMP) с хлоридом на одном конце и протоном на другом конце (M_n = 980 Да) ионизировали с помощью MALDI-ToF MS для определения полимерных архитектур, образующихся в ходе реакции, и анализа различных концевых групп. Подготовку образца MALDI-ToF MS начинали с изготовления исходных растворов NaTFA (2 мг/мл в ТГФ), аналита (5-7 мг/мл в ТГФ) и DCTB (20 мг/мл в ТГФ). После получения этих растворов 5 мкл раствора катиона Na⁺ , 5 мкл раствора аналита и 10 мкл матричного раствора объединяли в микроцентрифужной пробирке и подвергли вортексу (соотношение 10:25:200 катион:аналит:матрица, что в сумме составило 20 мл). Далее 1 мкл этой смеси извлекали из микроцентрифужной пробирки и сушили на мишенной пластине MALDI-ToF MS. Для матрицы был выбран DCTB, так как он работает со многими другими полиэфирами, однако были опробованы и другие матрицы, такие как CHCA, HABA, GFR и DHB. CHCA, HABA и GFR хорошо ионизировали образец, однако DHB оказался неудачным. Ион NaTFA работает лучше по сравнению с трифторацетатом калия (KTFA), трифторацетатом цезия (CsTFA), трифторацетатом лития (LiTFA) и трифторацетатом серебра (AgTFA), поскольку он лучше взаимодействует с кислородами сложных эфиров.

Спектр MALDI-ToF MS (рис. 4B) подтвердил молекулярно-массовое распределение PDMP с хлоридной концевой группой для образца 3 в диапазоне от 600 Да до 1600 Да. Это означает, что образец имел низкую дисперсию, что привело к тому, что значения M_n, M_w и Đ составили 980 Да, 1070 Да и 1,09 соответственно, используя программное обеспечение для анализа MALDI-Tof MS. Моноизотопный пик был достаточно разрешен в рефлектронном режиме, что позволило использовать точную идентификацию массы.

Рисунок 4: Схема реакции и масс-спектр MALDI-ToF MS образца 2. (А). Схема реакции синтеза PDMP с использованием 3-хлор-2,2-диметилпропановой кислоты. (B) MALDI-ToF MS масс-спектр образца 2. Этот полный спектр MALDI-ToF MS показывает общее распределение образца PDMP с хлоридной конечной группой (M_n = 980 Da), ионизированной Na⁺. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Для подтверждения массы единицы полимерного повтора была рассчитана разность масс между двумя соседними пиками. Повторяющаяся единица полимера имеет наблюдаемую среднюю молекулярную массу 100,056 Да, и это было подтверждено взятием средней массы восьми пиков (основное распределение) в диапазоне от 600 Да до 1300 Да, что всего на +0,004 Да ниже теоретической повторяющейся единицы PDMP (100,052 Да) и, кроме того, имеет массу конечной группы, которая соответствует одному водороду (на переднем конце) и одному хлориду (на обратной стороне) конец).

Спектр MALDI-ToF MS выявил три различных распределения, каждое из которых соответствует результирующему полимеру с различными концевыми группами. Эти концевые группы были идентифицированы и подтверждены путем расчета их теоретических масс и сравнения их с наблюдаемыми массами в спектре MALDI-ToF MS. Для дальнейшей идентификации конечных групп для анализа был выбран отдельный n-мер (рис. 5).

Основное распределение PDMP показало, что полимер имеет один водород (на переднем конце) и один хлорид (на заднем конце; синий). Теоретическое значение массы 8-мера PDMP (рис. 5) состоит из массы повторяющихся единиц (100,0524 Да x 8) плюс масса концевой группы Cl (+ 34,9689 Да) и массы водородной концевой группы (+ 1,0078 Да) плюс масса катиона натрия (+ 22,9892 Да), что дает общую массу 8-мера 859,385 Да. Наблюдаемое значение массы 8-мера [H-PDMP_8-Cl + Na]⁺ составляет 859,426 Да, что всего на +0,041 Да отличается от теоретического значения.

Следующее распределение (оранжевое) показало, что полимер заменяет протон на переднем конце натрием и хлоридом на заднем конце. Теоретическое значение массы 8-мера депротонированного PDMP состоит из массы повторяющихся звеньев (100,0524 Da x 8) плюс масса группы Cl конца (+ 34,9689 Da) и массы двух натриевых групп (+ (22,9892 Da x 2)), что дает общую массу 8-мера 881,367 Da. Наблюдаемое значение массы 8-мера [Na-PDMP_8-Cl + Na]⁺ составляет 881,413 Да, что всего на +0,046 Да отличается от теоретического значения.

Наконец, третье распределение (зеленое) PDMP подтвердило наличие циклических олигомерных видов. Теоретическое массовое значение 8-мера циклического PDMP состоит из массы повторяющихся единиц (100,0524 Да × 8) плюс масса одной натриевой группы (+ 22,9892 Да), что дает общую массу 8-мера 823,409 Да. Наблюдаемое значение массы для циклического 8-мера [PDMP8 + Na]+ составляет 823,448 Да, что отличается от теоретического значения всего на +0,039 Да.

Наличие галогенов на полимере можно определить с помощью MALDI-ToF MS. Конечная группа линейного полимера имеет один Cl, который обозначается соотношением пиков [M⁺] и [M+2]⁺ примерно 3:1. Разница между наблюдаемыми и теоретическими пиками [M⁺] и [M+2]⁺ показана в таблице 1. Теоретическая и наблюдаемая процентная распространенность для второго пика на уровне 761,3 Da [M+2]⁺ составляют 42,3 % и 42,2 % соответственно (при этом первый пик составил 100 %), что подтверждает наличие одной Cl-группы на полимерной конечной группе. Было обнаружено, что циклические вещества находятся на 36 Да ниже линейного содированного соединения и на 58 Да ниже дезодиированного соединения. Кроме того, это циклическое соединение не имело соотношения 3:1, которое есть у монохлорированных веществ. Этот хлорид мог быть удален с помощью атаки S_N2 с карбоксилатом на противоположном конце, что привело к замыканию кольца.

Рисунок 5: Масс-спектр MALDI-ToF MS отдельного повтора образца 2. Этот спектр MALDI-ToF MS показывает основной пик в виде PDMP с водородными и хлоридными концевыми группами (M_n = 980 Da), ионизированных Na⁺. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Сравнение наблюдаемого и теоретического пикового процентного содержания и пиковой изотопной интенсивности пиков [M⁺] и [M+2]⁺ пиков (с [M⁺] = 100 %) линейного PDMP с водородом и хлоридом в конечной группе (M_n = 980 Da) из MALDI-ToF MS. Конечная группа линейного полимера имеет один Cl, который является показательным по соотношению пиков [M⁺] и [M+2^]+ в соотношении приблизительно 3:1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Образец 3: Поли(2,2-диметилпропаноат) с четвертичным аммониевым и протонным концевыми группами.
3-Бромо-2,2-диметилпропановую кислоту полимеризовали с использованием триэтиламина (ТЭА) в качестве основания, однако было установлено, что ТЭА заменяет Br в конечной группе (рис. 6А). Образец PDMP с четвертичным аммонием на одной стороне и протоном на другом конце (M_n = 1410 Da) был использован для сравнения распределения изотопов с теми, которые имеют концевую группу Cl. Подготовку образцов MALDI-ToF MS начинали с изготовления исходных растворов КТФА (2 мг/мл в ТГФ), аналита (5-7 мг/мл в ТГФ) и ДКТБ (20 мг/мл в ТГФ). После получения этих растворов 5 мкл раствора катиона K⁺ , 5 мкл раствора аналита и 10 мкл матричного раствора объединяли в микроцентрифужной пробирке и вортексировали (соотношение 10:25:200 катион:аналит:матрица, что в сумме составило 20 мл). Далее 1 мкл этой смеси извлекали из микроцентрифужной пробирки и сушили на мишенной пластине MALDI-ToF MS. Для матрицы был выбран DCTB, так как он работает со многими другими полиэфирами. Катион калия был добавлен, чтобы подтвердить, является ли образец самоионизирующимся.

Полимер содержит четвертичный азот (положительно заряженный) на концевой группе, который может самоионизироваться. Это было подтверждено спектрами МС MALDI-ToF, так как отношение массы к заряду (m/z) не изменялось независимо от того, использовался ли K⁺ или Na⁺ в пробоподготовке. Кроме того, спектры MALDI-ToF MS подтвердили наличие положительно заряженного четвертичного аммония на конечной группе, так как Br является хорошей уходящей группой.

Спектры МС MALDI-ToF подтвердили, что молекулярно-массовое распределение PDMP с четвертичной аммониевой концевой группой находится в диапазоне от 600 Да до 2200 Да (рис. 6B). Это означает, что образец имел низкую дисперсию, что привело к тому, что значения M_n, M_w и Đ составили 1410 Да, 1540 Да и 1,08 соответственно при использовании аналитического программного обеспечения MALDI-Tof MS.

Рисунок 6: Схема реакции и масс-спектр MALDI-ToF MS образца 3. (A) Схема реакции для образца 3. Схема реакции синтеза PDMP с использованием 3-бромо-2,2-диметилпропановой кислоты с триэтиламином в качестве основания. (B) Этот полный спектр MALDI-ToF MS показывает общее распределение линейного PDMP с четвертичной аммониевой концевой группой (M_n = 1410 Da). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Чтобы подтвердить, имеет ли полимер одну и ту же повторяющуюся единицу (мономер), была рассчитана разница между двумя соседними пиками. Повторяющаяся единица полимера имеет наблюдаемую среднюю молекулярную массу 100,0535 Да. Это было подтверждено путем изучения среднего значения двенадцати пиков (основное распределение) в диапазоне от 900 Да до 2300 Да, что всего на +0,0011 Да выше теоретической единицы повторения (100,0524 Да).

Спектр MALDI-ToF MS имеет два различных распределения. Одно из распределений показало, что полимер имеет карбоновую кислоту и положительно заряженный четвертичный аммоний в качестве конечных групп (черные), в то время как другое распределение (фиолетовое) показало потерю протона из карбоновой кислоты и добавление иона калия. Для дальнейшей идентификации конечных групп для анализа был выбран отдельный n-мер (рис. 7).

Теоретическое значение массы 12-мерной группы PDMP с четвертичным аммониевым концом состоит из массы повторяющихся единиц (100,0524 x 12) плюс масса четвертичной аммониевой концевой группы (+ 101,1199) и массы водородной концевой группы (+ 1,0078), что дает общую массу 12 мер 1302,757 Да. Наблюдаемое значение массы для 12-мера [H-PDMP_12-TEA]⁺ составляет 1302,730 Да, что всего на -0,027 Да ниже теоретического значения.

Теоретическое значение массы 12-мера PDMP с четвертичной аммониевой концевой группой с одной стороны и заменой протона другим ионом калия складывается из массы повторяющихся единиц (100,0524 × 12) плюс масса четвертичной аммониевой концевой группы (+ 101,1199) и масса калийной конечной группы (+ 38,9637), что дает общую массу 12-мера 1340,713 Да. Наблюдаемое значение массы для 12-mer [K-PDMP_12-TEA]⁺ составляет 1340,700 Да, что всего на -0,013 Да ниже теоретического значения.

Рисунок 7: Масс-спектр MALDI-ToF MS отдельного повтора образца 3. Этот спектр MALDI-ToF MS показывает первичное распределение линейного PDMP с четвертичной аммониевой концевой группой (M_n = 1410 Da). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Образец 4: Линейный поли(этиленбрассилат)
Следующим образцом полимера, характеризуемым MALDI-ToF MS, является линейный полиэтиленбрасилат (l-PEB). Он был синтезирован из макроциклического мономера этиленбрассилата, который имеет семнадцатичленное кольцо, содержащее две эфирные группы (рис. 8A). Чтобы понять функциональную группу и архитектурные изменения в полимерной структуре, были изучены четыре различных метода характеризации: MALDI-ToF MS, ¹H-ЯМР, SEC и инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR). ¹H-ЯМР, СЕК и ИК-Фурье подтверждают удаление циклического диэфира и образование α-пропаргил-ω-гидрокси-ПЭБ. Тем не менее, эти методы не обнаружили какого-либо типа образования побочных продуктов. С другой стороны, спектр MALDI-ToF MS (рис. 8B) l-PEB демонстрирует три различных распределения массы, которые указывают на образование трех различных PEBs: α-гидрокси-ω-гидрокси-ПЭБ (1), α-пропаргил-ω-пропаргил-ПЭБ (2) и α-пропаргил-ω-гидрокси-ПЭБ (3) соответственно (рис. 8B).

Рисунок 8: Спектр MALDI-TOF l-PEB с Na⁺. (А) Линейные структуры полиэтиленбрассилата. (1) α-гидрокси-ω-гидрокси-ПЭБ (2) α-пропаргил-ω-пропаргил-ПЭБ (3) α-пропаргил-ω-гидрокси-ПЭБ. (B) Были идентифицированы три распределения, включая α-гидрокси-ω-гидрокси-ПЭБ (1), α-пропаргил-ω-пропаргил-ПЭБ (2) и α-пропаргил-ω-гидрокси-ПЭБ (3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Образец l-PEB анализировали на МС MALDI-ToF с использованием DCTB в качестве матрицы для неполярных полимеров. Подготовку образцов MALDI-ToF MS начинали с получения исходных растворов NaTFA (1 мг/мл в ТГФ), аналита (5 мг/мл в ТГФ) и DCTB (20 мг/мл в ТГФ). После получения этих растворов 1 мкл раствора катиона Na⁺ , 5 мкл раствора аналита и 20 мкл (4) матричного раствора объединяли в микроцентрифужной пробирке и вортексировали (соотношение 1:25:400 катион:аналит:матрица, что в сумме составило 26 мл). Далее 1 мкл этой смеси извлекали из микроцентрифужной пробирки и сушили на мишенной пластине MALDI-ToF MS. Наблюдаемые MW для каждого распределения находились в пределах отклонения в 0,03 Да от точной молекулярной массы ионов [M + Na]⁺ .

Теоретическое значение массы 6-мера α-гидрокси-ω-гидрокси-ПЭБ (1) состоит из массы повторяющихся звеньев (270,1831 Да x 6), плюс масса концевой группы 2-гидроксиэтокси (+ 61,0290 Да), плюс масса водородной концевой группы (+ 1,008 Да) плюс катион натрия (+ 22,9892 Да), что дает в сумме 1706,124 Да. Наблюдаемое массовое значение 6-мера α-гидрокси-ω-гидрокси-ПЭБ (1) составляет 1706,133 Да, что всего на +0,009 Да выше теоретического значения.

Теоретическое значение массы 5-мера α-пропаргил-ω-пропаргил-ПЭБ (2) состоит из массы повторяющихся звеньев (270,1831 Да х 5) плюс масса этиленбрассалата минус ОХ₂CH₂O (+ 210,1620 Да), плюс масса двух концевых групп пропаргилового эфира (+ 55,0184 Да х 2) плюс катион натрия (+ 22,9892 Да), что дает в сумме 1694,103 Да. Наблюдаемое значение массы 5-мера α-пропаргил-ω-пропаргил-ПЭБ (2) составляет 1694,127 Да, что всего на +0,024 Да выше теоретического значения.

Теоретическое значение массы 6-мера α-пропаргил-ω-гидрокси-ПЭБ (3) состоит из массы повторяющихся звеньев (270,1831 Да x 6) плюс масса конечной группы пропаргилового эфира (+ 55,0184 Да), плюс масса водородной конечной группы (+ 1,008 Да) плюс катион натрия (+ 22,9892 Да), что дает в общей сложности 1700,113 Да. Наблюдаемое массовое значение 6-мера α-пропаргил-ω-гидрокси-ПЭБ (3) составляет 1700,139 Да, что всего на +0,026 выше теоретического значения.

Образец 5: Азидифицированный линейный поли(этиленбрассилат)
Кроме того, I-PEB (образец 6) функционализировали 6-азидогексановой кислотой путем этерификации ее алкогольных концевых групп (рис. 9), в результате чего получали азидированный l-PEB (образец 7). Полученный продукт также анализировали на МС MALDI-ToF (рис. 10) с использованием методик пробоподготовки в качестве исходного полимера (образец 6). Наблюдаемые MW для каждого распределения находились в пределах отклонения в 0,04 Да от точной молекулярной массы ионов [M + Na]⁺. После этерификации ионы [M + Na]⁺ l-PEB с двумя гидроксильными концевыми группами (1) демонстрируют сдвиг массы из-за их преобразования из (1) в α-azido-ω-azido-PEB (4). Кроме того, l-ПЭБ с одной гидроксиконечной группой и одной пропаргильной концевой группой (3) были преобразованы в α-пропаргил-ω-азидо-ПЭБ (5). Тем не менее, (2) остается нереагирующим из-за обеих его алкиновых концевых групп.

Рисунок 9: Этерификация линейного полиэтиленбрассилата с концевой группой спирта по схеме реакции 6-азидугексановой кислоты. α-гидрокси-ω-гидрокси-ПЭБ (1) преобразуется в α-азидо-ω-азидо-ПЭБ (4), а α-пропаргил-ω-гидрокси-ПЭБ преобразует (3) в α-пропаргил-ω-азидо-ПЭБ (5). α-пропаргил-ω-пропаргил-ПЭБ (2) остается непрореагировавшим из-за концевых групп алкинов, которые не подвергаются реакции этерификации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Теоретическое значение массы 6-мера α-пропаргил-ω-азидо-ПЭБ (5) состоит из массы повторяющихся звеньев (270,1831 Да × 6), плюс масса конечной группы пропаргилового эфира (+ 55,0184 Да), плюс масса конечной группы азидогексаноата (+ 140,0824 Да) плюс катион натрия (+ 22,9892 Да), что дает в общей сложности 1839,188 Да. Наблюдаемое массовое значение 6-мера α-пропаргил-ω-азидо-ПЭБ (5) составляет 1839,184 Да, что всего на -0,004 Да ниже теоретического значения. Более того, наличие пиков метастабильных ионов (5-N₂) для (5) является еще одним признаком функционализации азида, поскольку метастабильные ионы образуются только в том случае, если в молекуле присутствует азид.

Теоретическое значение массы для 6-мера метастабильного пика (5-N₂ + Na⁺) составляет 1815,126 Да, что определено с помощью уравнения из графика разности масс метастабильного пика и пиков α-azido-ω-гидрокси-ПЭГ (рис. 11). Наблюдаемое значение массы для 6-мера метастабильного пика составляет 1815,089 Да, что всего на -0,031 Да ниже теоретического значения. График показывает, что в диапазоне масс от 1000 до 2000 Да теоретическое значение массы метастабильного пика на 24-24,1 Да ниже, чем у (5).

Теоретическое значение массы 6-мера α-азидо-ω-азидо-ПЭБ (4) состоит из массы повторяющихся звеньев (270,1831 Да × 6), плюс масса концевой группы 6-азидогексаноата (+ 140,0824 Да), плюс масса концевой группы 2-оксиэтил-6-азидогексаноата (+ 200,1035 Да) плюс катион натрия (+ 22,9892 Да), что дает в общей сложности 1994,273 Да. Наблюдаемое значение массы 6-мер α-азидо-ω-азидо-ПЭБ (4) составляет 1994,296 Да, что на +0,023 Да выше теоретического значения.

Рисунок 10: Спектр MALDI-ToF азидированных l-PEB с Na⁺. К ним относятся три распределения α-пропаргил-ω-пропаргил-ПЭБ (2), α-азидо-ω-азидо-ПЭБ (4) и α-пропаргил-ω-азидо-ПЭБ (5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 11: Графическая иллюстрация разницы масс между α-азидо-ω-гидрокси-ПЭГ и его метастабильным соединением относительно массы α-азидо-ω-гидрокси-ПЭГ (средняя масса 1700 Да). Этот график получен из спектра MALDI-ToF α-azido-ω-гидрокси-ПЭГ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Образец 6: Широко дисперсный гребенчатый полимер
Конечная схема реакции представляет собой гребенчатый полимер, который имеет тиоэфирные повторяющиеся звенья с боковыми цепями полиэтиленгликоля⁹. Образец гребенчатого полимера изготовлен из 400 М_n метилового эфира-ПЭГ-пропаргила и 1,6-гексанедитиола (CP MeO-PEG-400 HDT; Рисунок 12А) был проанализирован с использованием NaTFA. Натрий был выбран в качестве противоиона, потому что эфиры и тиоэфиры легче ионизируются натрием, литием и калием, а не более высокощелочноземельными металлами, такими как цезий. Эти образцы были проверены с неполярной матрицей, DCTB, хотя дополнительные матрицы (CHCA и DT) также были протестированы с плохими результатами. Подготовку образцов MALDI-ToF MS начинали с получения исходных растворов NaTFA (1 мг/мл в ТГФ), аналита (5 мг/мл в ТГФ) и DCTB (20 мг/мл в ТГФ). После получения этих растворов 1 мл раствора катиона, 5 мл раствора аналита и 20 мл раствора матрицы объединяли в микроцентрифужной пробирке и подвергали вортексу (соотношение 1:25:400 катион:аналит:матрица, что в сумме составило 26 мл). Далее 1 мл этой смеси извлекали из микроцентрифужной пробирки и сушили на целевой пластине MALDI-ToF MS. Поскольку NaTFA был добавлен в образец в качестве противоиона, масс-спектр MALDI-ToF MS демонстрировал ожидаемые Na⁺ аддукты известного образца. Кроме того, наблюдалось увеличение примерно на 16 Да, 32 Да и 48 Да выше этих пиков, что будет обсуждаться далее в этой статье.

Рисунок 12: Схема реакции для образца 6 и масс-спектра MALDI-ToF образца 6 (А) Химическая структура и условия реакции гребенчатого полимера на основе дитиол-ина с несколькими прокладками HDT и боковыми цепями 400 М_н ПЭГ. (B) Масс-спектр MALDI-ToF образца 6, CP MeO-PEG-400 HDT. Большая единица повтора = 550,30 Да, Малая единица повтора = 44,02 Да Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

MALDI-ToF MS подтвердил широкое распространение (дисперсность по SEC = 2,88; Рисунок 12В) CP MeO-PEG-400 HDT. Моноизотопный пик (включающий исключительно наиболее распространенные элементарные изотопы, а именно ¹²C, ¹H, ¹⁶O и ³²S) был достаточно разрешен, что позволило использовать точную идентификацию массы. Все теоретические расчеты массы определялись с использованием моноизотопных масс для каждого элемента. Из-за широкой дисперсии образца (2,88 по SEC) масс-спектр MALDI-ToF не мог быть использован для расчета M_n, M_w или Đ. MALDI-ToF MS отлично справляется с характеризацией узкодисперсных полимеров (Đ < 1,3), но может испытывать трудности с полной характеризацией широко дисперсных полимеров. При описании полимеров с широкими дисперсиями только нижняя молекулярно-массовая часть спектра будет хорошо разрешена и видна с помощью MALDI-ToF MS, исключая любые виды с более высокой молекулярной массой. Это явление называется смещением малой массы. В связи с этим полное определение характеристик гребенчатых полимеров только с помощью MALDI-ToF MS не представляется возможным. По этой причине SEC использовался в тандеме с MALDI-ToF MS для получения точных значений M_n, M_w и Đ.

Для подтверждения наличия гребенчатого полимера был использован аналогичный подход для стандартного линейного или циклического полимера. Каждая повторяющаяся единица гребенчатого полимера содержит узкое распределение M_n = 400 боковых цепей PEG, поэтому повторяющиеся единицы гребенчатого полимера были исследованы для определения наличия предполагаемого продукта в каждой из них. Кроме того, в реакционном растворе оставалось небольшое количество исходного материала от полимеризации (300-700 Да), которое также было охарактеризовано.

Во всем спектре МС MALDI-ToF можно увидеть более низкую и высокую МВт для 6-15-меров MeO-PEG-OH. Первоначально в спектре MALDI-ToF MS исходного материала MeO-PEG-пропаргила эти MeO-PEG-OH не были видны (рис. 13; верхний спектр). Появление этих пиков обусловлено относительной концентрацией MeO-PEG-пропаргила по отношению к MeO-PEG-OH. По мере протекания гребенчатой полимерной реакции MeO-PEG-пропаргил встраивается в продукт. Из-за этого соотношение исходного материала алкина по сравнению с MeO-PEG-OH начинает уменьшаться, что показывает нефункционализированный MeO-PEG-OH в спектре MALDI-ToF MS (рис. 13; нижний спектр).

Что касается распределения массы продукта, то для всех последующих расчетов использовались точные значения массы. Теоретическое значение массы одной повторяющейся единицы исходного материала [MeO-(PEG₁₀)-CH₂CCH + Na]⁺ составляет 44,0262 Да. Эта масса повторяющейся единицы, умноженная на число повторяющихся единиц, которое будет равно 10 для каждой боковой цепи (44,0262 Да x 10) плюс масса α-метокси-группы конца (+31,0183 Да) и масса ω-пропаргильной группы конца (+ 39,0235 Да) плюс масса катиона натрия (+ 22,9892 Да) дает общую массу 10-мера 533,2932 Да. Наблюдаемое значение массы для 10-мерного ПЭГ + Na⁺ составляет 533,239 Да, что на -0,054 Да ниже теоретического значения (Рисунок 13). В полных спектрах MALDI-ToF MS для этой серии есть от 6 до 9 мер ниже и от 11 до 15 мер выше. Последовательность меньших, смещенных пиков в низкомолекулярном спектре соответствует нефункционализированному исходному материалу MeO-PEG-OH, где теоретическое значение массы 11-мера состоит из массы повторяющихся звеньев (44,0262 Да x 11) плюс масса α-метокси-концевой группы (+ 31,0184 Да) и массы ω-водородной конечной группы (+ 1,008 Да) и массы катиона натрия (+ 22,9892 Да), что дает в сумме 11-мер масса 539.304. Наблюдаемое значение массы для 11-мер + Na⁺ составляет 539,252 Да, что всего на -0,052 Да ниже теоретического значения.

Рисунок 13: Масс-спектры MALDI-ToF (увеличенные с 530-615 Да) исходного материала (вверху) и низкомолекулярных форм образца 8 (внизу), CP MeO-PEG-400 HDT. Соотношение исходного материала алкина по сравнению с MeO-PEG-OH (верхний спектр и красный) начинает уменьшаться, что показывает нефункционализированный MeO-PEG-OH (нижний спектр и синий) в масс-спектре CP MeO-PEG-400 HDT MALDI-ToF (нижний спектр). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Что касается циклических гребенчатых полимеров, то их массы с разной степенью полимеризации могут быть умножены на отдельные части искомого n-мера. Теоретическое значение массы 2-мера [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ состоит из массы повторяющихся звеньев каждой цепи ПЭГ, которых примерно 8 на цепь (44,0262 Da x 16) плюс масса концевых метильных концевых групп каждой цепи ПЭГ (+ 15,0235 Da x 2) плюс масса атомов углерода, которые когда-то были пропаргильной группой и теперь вступили в реакцию с тиолами (+ 41,0391 Да x 2) плюс масса HDT, вступившего в реакцию с алкинами (+ 148,0380 Da x 2) и масса катиона натрия (+ 22,9892 Da), что дает общую массу 2-мера 1167,599 Da. Наблюдаемое значение массы 2-мера [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ составляет 1167,626 Да, что на +0,027 Да выше теоретического значения (рис. 14). Несмотря на то, что наблюдались циклические структуры с более низкой молекулярной массой, линейные соединения с тиолами на обоих концах или двойными связями на обоих концах наблюдаться не удалось.

Эти полимеры, содержащие тиоэфиры, также могут подвергаться окислению, превращая тиоэфиры в сульфоксиды⁹. Этим объясняется добавление множественных кислородов (+15,9949 Da x n) в зависимости от степени окисления; это отличается от аддукта K+, который отличается на +15,9739 Да от аддукта Na⁺. Для одиночного окисления 2-мера [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ теоретическое значение массы составляет 1183,594 Да, в то время как наблюдаемое значение массы составило 1183,620 Да, увеличившись всего на +0,026 Да от теоретического значения. Для двойного окисления 2-мера [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ теоретическое значение массы составляет 1199,590 Да, в то время как наблюдаемое значение массы составило 1199,613 Да, увеличившись всего на +0,023 Да от теоретического значения. Наконец, для тройного окисления 2-мера [CP-MeO-PEG16 HDT + Na]⁺ теоретическое значение массы составляет 1215,585 Да, в то время как наблюдаемое значение массы составило 1215,617 Да с увеличением всего на +0,032 Да от теоретического значения.

Рисунок 14: Масс-спектр MALDI-ToF образца 8, CP MeO-PEG-400 HDT. Увеличенное изображение с 1165-1254 Da показывает циклические 2-мерные гребенчатые полимерные изделия с различным количеством присоединенных повторяющихся звеньев ПЭГ и разной степенью окисления тиоэфира. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Окисление может быть подтверждено дальнейшим проведением исследования с использованием противоионных ионов. Это влечет за собой использование другого ионизирующего катиона, такого как K⁺, и сравнение сдвига пиков в спектрах MALDI-ToF MS. Образец CP MeO-PEG-400 HDT был запущен на MALDI-ToF MS с использованием KTFA, а не NaTFA (рис. 15). Это смещает все массы пиков вверх на +15,9739 Да из-за разницы масс между Na⁺ и K⁺. Для анализа с помощью аддукта K⁺ в спектрах MALDI-ToF MS не присутствовал неокисленный полимер (1183.574 Da_Theo). Для одиночного окисления 2-мера [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ теоретическое значение массы составляет 1199,569 Да, в то время как наблюдаемое значение массы составило 1199,567 Да (всего -0,002 Да), для двойного окисления 2-мера [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ теоретическое значение массы составляет 1215,564 Да, в то время как наблюдаемое значение массы составило 1215,572 Да, охватывающее разницу (всего +0,008 Да), для тройного окисления 2-мера [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ теоретическое значение массы составляет 1231,558 Да, в то время как наблюдаемое значение массы составило 1231,563 Да (всего +0,005 Да), а для вновь образованного четырехкратного окисления 2-мера [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ теоретическое значение массы составляет 1247,553 Да, в то время как наблюдаемое значение массы составило 1247,551 Да (всего -0,002 Да). Следует отметить, что полимеры далее окисляются между прохождением Na⁺ и K⁺ аддуктов, что приводит к потере неокисленного продукта и образованию четырехкратного окисления CP MeO-PEG-400 HDT. Можно также отметить, что, хотя полимер действительно работает с аддуктами Na⁺ и K⁺ , соотношение сигнал/шум значительно выше для аддуктов Na⁺ , что подчеркивает возможность использования Na⁺ для первичной характеристики.

Рисунок 15: Масс-спектр MALDI-ToF образца 8, CP MeO-PEG-400 HDT. Увеличение с 1195-1254 Да показывает циклические 2-мерные гребенчатые полимерные изделия с различным количеством прикрепленных повторяющихся звеньев ПЭГ и различной степенью окисления тиоэфира. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

MALDI-ToF MS — это высокоэффективный метод определения характеристик синтетических полимеров, обеспечивающий точные измерения с минимальной фрагментацией благодаря механизму мягкой ионизации. В этом методе матрица поглощает энергию от лазера и передает ее анализируемому веществу²⁶. Эта энергия заставляет полимер испаряться, ионизироваться за счет взаимодействия с агентом катионизации и десорбироваться в вакуум. Ионизированные аналиты проходят через полетную трубу, где они обнаруживаются на основе их отношения массы к заряду (м/з)^26,27. Этот метод пригоден для определения массы монодисперсных молекул и одинаково эффективен для среднедисперсных (Д = 1,1-1,3) и высокодисперсных полимеров, где можно определить повторяющуюся единицу массы и концевые группы. Для умеренно дисперсных полимеров MALDI-ToF MS также обеспечивает дисперсность (Р), среднечисленную молекулярную массу (M_n) и среднемассовую молекулярную массу (M_w).

Однако следует отметить несколько ограничений методики. MALDI-ToF MS демонстрирует смещение малой массы при анализе полимеров с высокой дисперсностью (Đ > 1,3), что означает, что полимеры с меньшей массой в распределении доминируют в спектре, в то время как вещества с более высокой массой имеют пики низкой интенсивности или отсутствуют^28,29. Кроме того, разрешение значительно снижается для полимеров с температурой выше 10 000 Да, а полимеры с силой более 15 000 Да могут быть лучше проанализированы в линейном режиме. Тем не менее, линейная мода жертвует изотопным пиковым разрешением по сравнению с отражательной модой. Кроме того, MALDI-ToF MS основан на способности полимера эффективно ионизироваться. Полимеры с сопряженными системами или гетероатомы ионизируются легче, чем насыщенные углеводороды, такие как полиэтилен или полипропилен, которые часто требуют химических модификаций для^{ионизации.}

Подготовка образцов является важным этапом для достижения успешных результатов. Одним из наиболее важных аспектов является выбор подходящей матрицы для полимерного аналита^11,32. Например, такие матрицы, как DCTB и GFR, хорошо работают для неполярных полимеров, в то время как DHB и CHCA можно сравнить для полярных полимеров, чтобы определить, какая матрица обеспечивает наибольшее разрешение пиков. Кроме того, выбор подходящего растворителя для растворения как матрицы, так и аналита обеспечивает надлежащую сокристаллизацию, что улучшает лазерную абляцию и улучшает разрешение в полученных спектрах MALDI-ToF MS 33,34,35. Аналогичным образом, выбор подходящего катионизационного агента имеет важное значение для максимизации эффективности ионизации и получения четких, различимых пиков.

После выбора матрицы и агента катионизации можно оптимизировать соотношение матрица:аналит:катион. Начните с приготовления исходных растворов выбранного катиона (1 мг/мл в ТГФ), аналита (5 мг/мл в ТГФ) и матрицы (20 мг/мл в ТГФ). Рекомендуется исходное объемное соотношение 1:5:20 мкл (катион:аналит:матрица), что соответствует соотношению концентраций приблизительно 1:25:400 мг/мл в общем объеме 26 мкл. Если эта исходная смесь не дает спектров с хорошим разрешением, можно провести систематическую оптимизацию с использованием сеточного подхода (Таблица 2)^10,16. В этой конфигурации объем аналита фиксирован, в то время как объем матрицы постепенно умножается на 4 по столбцам, а объем катионов умножается на 4 вверх по строкам. Эта сетка позволяет пользователям определить оптимальное соотношение ионизации и разрешения. Если одно из условий внешней сетки обеспечивает повышенную производительность, можно создать новую сетку с центром этого соотношения, продолжая корректировку, кратную 4, для дальнейшего уточнения. Хорошей отправной точкой является оценка того, содержит ли спектр пики высокой интенсивности, низкий базовый шум и хорошо ли разрешенное изотопное разрешение. Этот процесс может занять много времени, особенно для новых или сложных полимеров, для которых может потребоваться тестирование нескольких матриц и катионов в подготовительной сетке 3 x 3.

Таблица 2: Систематическая сетка экспериментальных соотношений может быть создана и проверена. Соотношение катиона, аналита и матрицы 1:5:20 мкл соответственно будет использовано для начала (1:25:400 мг/мл) катион:аналит:матрица, что в сумме составит 26 мл. Объем аналита фиксирован на уровне 5 мкл (25 мг/мл). Матрица и отношение катионов постепенно умножаются на 4 по столбцам и вверх по строкам соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

После нанесения образца на целевую пластину MALDI-ToF MS методом высушенных капель пластина MALDI-ToF MS затем загружается в прибор MALDI-ToF MS. Параметры сбора данных MALDI-ToF MS, такие как мощность лазера, диаметр лазерного луча, усиление детектора и импульсная экстракция ионов, могут быть точно настроены для достижения более высокого разрешения и более четкого разделения пиков. Их можно систематически изменять для определения пиковой интенсивности, снижения базового шума и улучшения пикового разрешения (Рисунок 1).

Оптимизация инструментальных параметров и соотношений пробоподготовки не является строго линейным рабочим процессом. Операторы могут начать с предпочтительного метода подготовки образцов и проводить скрининг в линейном режиме, чтобы оценить, ионизируется ли полимер, или они могут сначала точно настроить метод прибора (например, мощность лазера, импульсная экстракция) перед изменением соотношений смеси образцов с использованием сетки подготовки 3 x 3. Гибкость рабочего процесса часто необходима, особенно при анализе новых, неизвестных или плохо охарактеризованных материалов.

После завершения оптимизации протокол пробоподготовки можно использовать повторно, хотя небольшая межоператорская или междневная изменчивость все еще может иметь место. Выполнение калибровки для каждого прогона сбора данных сводит к минимуму вариации, а различия в пиковой массе обычно остаются ниже 0,1 Да при соблюдении согласованных протоколов. Таким образом, воспроизводимость для разных пользователей и дней достижима, если метод прибора и подготовка образцов остаются неизменными. Если проблемы не устранены, в таблице 3 представлена таблица с общими проблемами, с которыми может столкнуться пользователь, и их решениями.

Таблица 3: Распространенные проблемы и стратегии их устранения, основанные на практическом опыте. Таблица помогает решить проблемы, возникающие во время подготовки образцов, сбора и анализа данных. Для поиска и устранения неисправностей для конкретного прибора обратитесь к руководству производителя MALDI-ToF MS или к квалифицированному техническому специалисту. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Калибровка является критически важным этапом для обеспечения точности измерений массы. Можно использовать как внешнюю, так и внутреннюю калибровку, но жизненно важно, чтобы используемые калибранты находились в диапазоне масс полимерного аналита. Правильная калибровка гарантирует, что масса анализируемого вещества будет правильно определена.

Анализ данных выполняется там, где масс-спектр MALDI-ToF MS открыт, и можно выбрать пиковый пик для дальнейшего анализа. Масса монодисперсных макромолекул, а также низко, средне- и высокодисперсных полимеров заданного n-мера может быть подтверждена путем сравнения наблюдаемой массы с теоретическими значениями, рассчитанными с помощью программного обеспечения для химического волочения. Эти сравнения позволяют проверить общую массу монодисперсной макромолекулы или, в случае низко, средне- и высокодисперсных полимеров заданного n-мера, идентифицируются концевые группы и подтверждается повторяющаяся единица массы.

Таким образом, оптимизация матрицы, условий катионизации и экспериментальных соотношений имеет решающее значение для получения данных MALDI-ToF MS с высоким разрешением. Калибровка обеспечивает точные измерения массы. Анализ данных с использованием пикового отбора и теоретического сравнения массы позволяет тщательно охарактеризовать полимер, включая идентификацию конечных групп и повторяющейся единицы массы. Этот метод может быть использован для монодисперсных макромолекул, а также для низкодисперсных, среднедисперсных и высокодисперсных синтетических полимеров. Будущие направления включают расширение характеризации сложных полимерных архитектур, таких как полимерные смеси тонких пленок, циклические полимеры и гиперразветвленные полимеры, с помощью методов пробоподготовки без растворителей и тандемной масс-спектрометрии (MS/MS)36,37,38. Комбинации приборов, такие как использование эксклюзионной хроматографии (SEC) для фракционирования образца с последующим использованием MALDI-ToF MS для структурного анализа, могут быть использованы для идентификации структур с малой массой, определения фракционной дисперсности и характеристики конечных групп в высокодисперсных образцах полимеров 39,40,41. Кроме того, новые подходы к анализу данных, включая ручной ввод или программную генерацию графиков массовых дефектов Кендрика, позволяют преобразовывать масс-спектры в двумерные карты, облегчая идентификацию нескольких конечных групп в выборке ^2,42.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид	Химические вещества ОТК	Д1601	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/D1601
1,1,1-Трис(гидроксиметил)пропан	Миллипора Сигма	148083	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/148083?srsltid=AfmBOoqaMzcy1xravp1h2QE<чел/> 0myfY5gjuEBfOIv2o882Wb _xcB4Ol4CMW
1,5,7-Triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene	Миллипора Сигма	345571	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/345571?srsltid=AfmBOooLQXIhWaMnO63nE<чел./> xu-Y5MJoJID6RJiby0NXyu DHOxXYjle_kMT
1,6-гексанедитиол 98% (HDT)	ОТК	Н0334	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/H0334
2-(4-гидроксифенилазо)бензойная кислота) (ХАБА)	Миллипора Сигма	Н5126	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/h5126
2,2-бис(гидроксиметил)пропионовая кислота	Миллипора Сигма	106615	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/106615?srsltid=AfmBOopCRoa1N_UiDK<чел/> 56NKhDKdlAN8feUrMxVYhul Muz2en6NYEGIh4b
2,2-диметокси-2-фенилацетофенон 99% (ДМПА)	Сигма-Олдрич	196118	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/196118?srsltid=AfmBOoqVTif6KNwIr6A<чел./> -bIgnXbkrvWKIUNH6qOsc RseQLNVKi0DMWPb-
2,5-дигидроксибензойная кислота (ДГВ)	Миллипора Сигма	149357	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/149357
4-(Диметиламино)пиридин	Миллипора Сигма	522821	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/522821?focus=products&page=1&perpage= 30& sort=relevance& term=522821 & type=product
6-Бромогексановая кислота	Миллипора Сигма	150452	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/6-bromohexanoic-acid?focus=products&page=1<чел./> & perpage=30& sort=relevance& term= 6-бромогексановый%20acid& type=product
Бензальдегид диметилацеталь	Миллипора Сигма	226076	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/226076?srsltid= AfmBOorbjP7zD9MO3g5Xk LL3rNZ02PhfkXoRfe3EjRK7 TrqJ-kEOrTCN
Бензойная кислота	Миллипора Сигма	242381	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/242381?srsltid=AfmBOook_iIcMnwuB3e<чел/> _j-KetQyyHJ6Qq86jSK8 ZVxC3BorQgkO8Xg5I
Bruker UltraFlextreme	Bruker Daltonics		https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/maldi-tof/ultraflextreme.html
Хлороформ	Научный центр Фишера	AA32614K7	https://www.fishersci.com/shop/products/chloroform-acs-99-8-thermo-scientific/AA32614K7 ?searchHijack=true& searchTerm= chloroform-acs-99-8-thermo-scientific & searchType=Быстрый и matchedCatNo =AA32614M6
Дитранол, АД, 98,5-101% (DT)	Научный центр Фишера	18-602-270	https://www.fishersci.com/shop/products/dithranol-bp-98-5-101-spectrum-chemical/18602270
Этиленбрассилат	Миллипора Сигма	W354309	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/w354309?utm_source=google&utm_medium= КТК и КТК utm_campaign=8692675663& utm _content=86098110623& gad_source= 1& gclid=CjwKCAiApY-7BhBjEiwAQMr rEdJTcKN5TEFkP1uHvRlVign3lwg2cj5 _spBUCrfi6exZ3Ur5sJkARxoCfWsQ AvD_BwE
Гальвиноксил, свободные радикалы	Миллипора Сигма	Г307	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/g307?srsltid= AfmBOopoWGDMXtLk5Erf0rVyl 7j442uyg8rIWkfBjhHZ2z0dDktH3y8-
Метанол	Научный центр Фишера	А456	https://www.fishersci.com/shop/products/methanol-optima-lc-ms-grade-thermo-scientific/A4564
Палладий, 10% углерода, тип 487, сухой	Научный центр Фишера	AAA1201206	https://www.fishersci.com/shop/products/palladium-10-carbon-type-487-dry-thermo-scientific-1/AAA1201206#?keyword=palladium%20on%20carbon
Полиэтилен гликоль) монометиловый эфир 350  Mn  (MeO-PEG-OH 360)	Научный центр Фишера	AA4156022	https://www.fishersci.com/shop/products/polyethylene-glycol-monomethylether-350-thermo-scientific/AA4156022
Трифторацетат калия (КТФА)	Миллипора Сигма	281883	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/281883
Пропаргиловый спирт	Научный центр Фишера	А10295.0Ф	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A10295.0F?SID=srch-hj-A10295.0F
Пропаргил бромид 97% (80% по массе в толуоле, стабилизированном MgO)	Научный центр Фишера	AAL1059514	https://www.fishersci.com/shop/products/propargyl-bromide-97-80-w-w-toluene-stab-magnesium-oxide-thermo-scientific/AAL1059514#?keyword=Propargyl%20bromide%2097%%20(80%%20w/w%20in%20toluene%20stabilized%20with%20MgO)
Азид натрия	Миллипора Сигма	С2002	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/s2002
Гидрид натрия 60% дисперсия в минеральном масле	Миллипора Сигма	452912	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/452912?srsltid= AfmBOooZhbCm_qtgKU99922Y91zI qEOWONlEGxjZn0mdSJF2L5hW1uVn
Трифторацетат натрия (NaTFA)	Дубрава	MFCD00013217	https://www.oakwoodchemical.com/ProductsList.aspx?CategoryID=-2&txt<чел/> Поиск=1549& ExtHyperLink=1
SpheriCal Neat Low Range Kit (250 - 7,500 Da)	Полимерный завод	ПФС-104	https://www.polymerfactory.com/product-page/spherical-low-range-kit-500-7-500-da
Тетрагидрофуран (ТГФ)	Научный центр Фишера	Т427	https://www.fishersci.com/shop/products/tetrahydrofuran-optima-fisher-chemical-3/T4274#?keyword=tetrahydrofuran%20optima
транс-2-[3-(4-трет-бутилфенил)-2-метил-2-пропенилиден]малонитрил (ДКТБ)	ОТК	В3635	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/B3635
α-циано-4-гидроксикоричная кислота (CHCA)	ОТК	Ок1768 г.	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/C1768