Методическая статья

Разработка инновационного устройства светодиодного освещения для применения in vitro фотодинамической терапии с розовой бенгалией

DOI:

10.3791/68462

⸱

12 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm, CHU Lille, U1189-ONCO-THAI-Assisted Laser Therapy and Immunotherapy for Oncology, University of Lille, 2CNRS, Inserm, CHU Lille, UMR9020-U1277-CANTHER-Cancer Heterogeneity Plasticity and Resistance to Therapies, University of Lille

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной рукописи представлено новое, инновационное, напечатанное на 3D-принтере устройство для изучения фотодинамической терапии in vitro, опосредованной Rose Bengal.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье описывается новое устройство фотодинамической терапии (ФДТ) для оценки эффективности ФДТ in vitro, опосредованной розовой бенгальской (RB). Устройство, получившее название CELL-LED-550/3, состоит из двух напечатанных на 3D-принтере частей, одна из которых генерирует зеленый свет с длиной волны 550 нм от одного светодиода (часть источника света), а другая распределяет этот свет на 96-луночную пластину для культивирования клеток (часть распределителя света). Часть источника света управляется драйвером с тремя различными режимами, что позволяет светораспределителю подавать три различных уровня излучения на нижнюю наружную поверхность лунок: 0,02 мВт/см2, 0,23 мВт/см2 или 0,62 мВт/см2. Светораспределительная часть была спроектирована таким образом, чтобы освещать колодцы по отдельности и одновременно. Чтобы продемонстрировать актуальность устройства CELL-LED-550/3, была оценена его способность индуцировать гибель клеток RB-опосредованной ФДТ на клетках гепатоцеллюлярной карциномы HepG2. Сначала клетки HepG2 обрабатывали в течение 2 ч возрастающими концентрациями Rose Bengal, фотосенсибилизатора с пиком поглощения (самым высоким) при длине волны около 550 нм. Затем обработанные клетки освещали с помощью устройства CELL-LED-550/3, настроенного на максимальный уровень излучения при световых дозах 0,3 Дж/см2, 0,6 Дж/см2 и 1,2 Дж/см2 соответственно при времени освещения 8 мин и 4 с, 16 мин и 8 с, а также 32 мин и 16 с). Наконец, жизнеспособность измеряли с помощью Cell-Titer Glo через 24 ч после ФДТ. Результаты эксперимента показывают, что RB-опосредованная ФДТ с использованием устройства CELL-LED-550/3 способна индуцировать снижение жизнеспособности клеток HepG2 в зависимости как от концентрации розового бенгала, так и от вводимой дозы света. Основываясь на доказательстве концепции, представленном в этой статье, устройство CELL-LED-550/3 добавляет еще один инструмент к изучению RB-опосредованной ФДТ.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В 2020 году было зарегистрировано более 905 000 новых случаев заболевания и 830 000 смертей, что делает первичный рак печени седьмым по распространенности раком и второй по значимости причиной смертности от рака во всеммире1. Среди первичных видов рака печени наиболее распространенной формой является гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК), на которую приходится примерно 90% случаев2. Из-за невыявленного хронического заболевания печени и плохого соблюдения эпиднадзора, только у 25% пациентов с ГЦК диагноз ставится на ранней стадии заболевания3. Эти пациенты с ранним диагнозом обычно лечатся резекцией печени, трансплантацией печени или местной абляционной терапией с лечебной целью и демонстрируют хороший прогноз с пятилетней выживаемостью более 70%4,5. Для остальных 75% пациентов (с промежуточной или поздней диагностированной ГЦК), несмотря нато, что инновационные методы лечения, включающие таргетную терапию, иммунотерапию и комбинированные схемы, приносят пользу в выживаемости6, прогноз остается очень плохим: пятилетняя выживаемость фактически не превышает 30% для этой группы пациентов и снижается до 2% для подгруппы пациентов с метастазами6. Таким образом, изучение альтернативных вариантов лечения имеет решающее значение для улучшения результатов лечения и продления выживаемости у пациентов с промежуточной или поздней стадией ГЦК. Фотодинамическая терапия (ФДТ), которая является противоопухолевой терапией, широко практикуемой в дерматологии7, может быть подходящим альтернативным кандидатом.

ФДТ — это фотохимическая обработка, которая сочетает в себе использование фотосенсибилизирующего агента (ФС), соответствующей длины волны видимого света и молекулярного кислорода для получения цитотоксических активных форм кислорода (АФК)8. Противоопухолевые эффекты ФДТ обусловленытремя механизмами, индуцированными АФК: во-первых, прямым цитотоксическим воздействием на злокачественные клетки, затем повреждением сосудистой сети опухоли, вызывающим гипоксию опухолевой ткани, лишением питательных веществ и регрессией, и, наконец, индукцией воспалительной реакции путем высвобождения сигналов опасности и опухолевых антигенов от поврежденных или умирающих опухолевыхклеток.. На протяжении более трех десятилетий ФДТ является предметом интенсивных исследований, направленных на оценку ее потенциала в лечении различных типов и форм рака 13,14,15,16,17,18. Основываясь на своей эффективности, доказанной этими исследованиями 19,20,21, ФДТ в настоящее время используется в дерматологии для лечения немеланомных раковых опухолей кожи 7. Что касается других показаний, то в последние годы количество клинических исследований увеличилось, что свидетельствует о значительных усилиях по внедрению ФДТ, используемой отдельно или в сочетании со стандартными методами лечения, в клиническую практику 22,23,24.

Существует множество фотосенсибилизирующих агентов, используемых для ФДТ25. Среди них было показано, что бенгальская роза (RB) действует как эффективный фотодинамический агент против опухолевых клеток гортани26, клеток меланомы27, клеток рака молочной железы28 и тканей рака предстательной железы29. Работа, представленная в данной статье, основана на необходимости оценить, эффективна ли RB-опосредованная ФДТ также для клеток ГЦК.

Такая оценка действительно потребовала предварительной разработки устройства на основе зеленого светодиода, предназначенного для освещения 550 нм 96-луночных клеточных культуральных планшетов. Для этого устройства30 была реализована конструкция в двух частях: часть источника света генерирует зеленый свет с длиной волны 550 нм от одного светодиода, в то время как часть-распределитель света распределяет этот свет с помощью пучка оптического волокна по 96 лункам по отдельности и в сторону от светодиода. Эта двухкомпонентная конструкция, во-первых, предотвращает вредное тепловое воздействие на клетки, которое может возникнуть из-за неконтролируемого нагрева, выделяемого внутри светодиода, и, во-вторых, позволяет освещать клетки внутри инкубатора для клеточных культур, сохраняя при этом часть источника света с его электронными компонентами (включая светодиод) снаружи. Эти инновационные особенности дают так называемому устройству CELL-LED-550/3 значительные преимущества по сравнению с уже опубликованными светодиодными системами, которые были специально разработаны для многолуночного освещения планшетов 31,32,33,34,35.

В этой статье впервые подробно описано устройство CELL-LED-550/3. Затем, в качестве доказательства концепции, исследование жизнеспособности клеток демонстрирует эффективность RB-опосредованной ФДТ с использованием CELL-LED-550/3 в 2D-модели клеточной культуры ГЦК (HepG2)30. Помимо того, что устройство CELL-LED-550/3 является недорогим и портативным, оно также является особенно актуальным инструментом для экспериментов с RB-опосредованной PDT.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Конструкция устройства

ПРИМЕЧАНИЕ: Две части устройства CELL-LED-550/3 изготавливаются отдельно и, только на последнем этапе, соединяются друг с другом.

  1. Конструкция части источника света
    1. Прикрепите узел теплоотвода с вентилятором подходящего размера к тыльной стороне печатной платы (PCB), на которой установлен светодиод мощностью 550 нм 3 Вт.
    2. Накройте светодиод прозрачной коллимационной линзой из ПММА (полиметилметакрилата), чтобы, во-первых, гомогенизировать световой луч, а во-вторых, уменьшить угол луча со 120° до 10°. Такое уменьшение позволяет увеличить количество света, подаваемого на светораспределительную часть.
    3. Подключите светодиод к текущему драйверу с помощью трехрежимного затемнения, что позволяет обеспечить различные уровни излучения.
    4. Соберите отдельно корпус, переднюю часть корпуса и крышку корпуса с помощью 3D-печати (красные прямоугольники на рисунке 1).
    5. Установите драйвер и светодиодный индикатор, оснащенный линзой и радиатором вентилятора в сборе, на специальные места в корпусе (синие прямоугольники на рисунке 1).
    6. Установите разъем питания и кулисный переключатель на свои места в крышке корпуса (синие прямоугольники на рисунке 1).
    7. Подключите драйвер и радиатор вентилятора в сборе к разъему питания через кулисный переключатель.
    8. Соберите корпус, крышку корпуса и переднюю часть корпуса.
    9. Убедитесь, что светодиод выровнен по оси цилиндрического отверстия передней части корпуса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цилиндрическое отверстие передней части корпуса предназначено для оптического соединения части источника света (гнездовой разъем) с светораспределительной частью (наружный разъем).

figure-protocol-1
Рисунок 1: Трехмерные виды спереди (A), сзади (B) и в разобранном виде (C) части источника света. По материалам Lefebvre, A. et al.30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

  1. Конструкция светораспределительной части
    1. Соберите отдельно нижнее закрытие корпуса, корпус и верхнее закрытие при 3D-печати (вместе они образуют полую коробку) (красные коробки на рисунке 2).
    2. Изготовьте 96-луночную дистанционную рамку для 3D-печати белым цветом (красная коробка на рисунке 2) так, чтобы она точно поместилась на полую коробку, упомянутую в 1.2.1. Белый цвет направлен на максимальное отражение света и, таким образом, на оптимизацию распределения света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр и межосевое расстояние между круглыми отверстиями, присутствующими в 96-луночном спейсере, должны быть равны диаметру и межцентровому расположению лунок 96-луночного планшета, используемого для биологических анализов.
    3. Просверлите 96 маленьких отверстий в верхнем затворе полого ящика так, чтобы они совпадали с центром 96 круглых отверстий в 96-луночной прокладке, когда последний помещается на верхний затвор.
    4. Вставьте пластиковое оптическое волокно диаметром 0,5 мм снизу вверх в каждое из 96 маленьких отверстий верхнего затвора.
    5. Нанесите полиэфирную смолу на нижнюю часть верхней крышки, чтобы приклеить 96 оптических волокон к верхней крышке.
    6. После того как смола высохнет, отполируйте дистальные концы оптических волокон до тех пор, пока они не прилегают к верхней части верхнего замыкания.
    7. Соберите оптические волокна внутри полой коробки, упомянутой в шаге 1.2.1, в единый пучок, защищенный оболочкой, которая выходит из коробки примерно на два метра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высота коробки должна быть достаточной, чтобы предотвратить изгиб оптических волокон и оптическое затухание, которое может быть вызвано.
    8. Соберите полый короб так, чтобы пучок волокон проходил через специальное отверстие корпуса.
    9. Установите проксимальные концы оптических волокон вместе в напечатанный на 3D-принтере штекерный разъем, что позволяет подключать его к части источника света (гнездовому разъему).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот соединитель не должен требовать использования клея для предотвращения затухания света, которое может вызвать этот клей.
    10. Поместите 96-луночную дистанционную рамку на полый ящик.
    11. Создать экран путем вставки кальки между прозрачной пластиной из ПММА (нижняя поверхность) и устойчивым к царапинам майларовым листом (верхняя поверхность) для того, чтобы диффузировать узкий луч, подаваемый на дистальный конец каждого оптического волокна, в луч размером с диаметр лунки 96-луночной пластины, используемой для биологических анализов.
    12. Постройте трафаретную раму с помощью 3D-печати (красный прямоугольник на рисунке 2) так, чтобы ее центральное отверстие точно соответствовало размеру 96-луночной пластины, используемой для биологических анализов, и, таким образом, лунки идеально совпадали с круглыми отверстиями 96-луночной распорки.
    13. Закрепите экран в верхней части 96-луночной проставки с рамкой экрана.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Трехмерные виды части распределителя света. По материалам Lefebvre, A. et al.30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

  1. Монтаж части источника света с частью светораспределителя
    1. Вставьте штекерный разъем светораспределительной части в гнездовой разъем части источника света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как штекерный разъем подключен к гнездовому, световой луч, подаваемый частью источника света, должен покрывать чуть больше, чем площадь поверхности светоприемного элемента светораспределительной части, тем самым обеспечивая подачу света на 96 оптических волокон.

2. Биологические анализы

  1. Процесс культивирования клеток
    1. Культивируют гепатокарциному клеточной линии HepG2 в среде RPMI 1640 с добавлением 10% термоинактивированной бычьей сыворотки и по 1% стрептомицина и пенициллина.
    2. Хранить колбы с культурами, содержащие клетки HepG2, в инкубаторе для клеточных культур с 5%CO2 при температуре 37 °C.
    3. Меняйте питательную среду каждые 3 дня, отсасывая питательную среду из колб и заменяя ее питательной средой RPMI 1640, предварительно нагретой до 37 °C.
    4. Используйте микроскоп, чтобы проверить слияние клеток в колбах с культурами до тех пор, пока они не достигнут 80%-90% конфлюенции.
  2. Процесс посева
    1. Извлеките клетки из инкубатора и поместите их под предварительно очищенную станцию микробиологической безопасности.
    2. Извлеките питательную среду из колб с культурами.
    3. Промыть колбы с культурой фосфатным буферным раствором.
    4. Нанесите на клетки 3 мл трипсина (0,25%, 0,53 мМ) и поместите колбы с культуральными культурами в инкубатор при температуре 37 °С на 5 мин для отделения клеток.
    5. Через 5 мин извлеките трипсин из культуральных колб с 7 мл питательной среды и восстановите весь раствор среды + трипсин + клетки в пробирке объемом 15 мл.
    6. Подсчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек. Для этого берут 20 мкл раствора, содержащего клетки, и помещают его в пробирку. Добавьте 20 μL раствора трипанового синего цвета и поместите раствор трипанового синего цвета на предметное стекло и вставьте в счетчик ячеек.
    7. После того, как клетки подсчитаны, разведите их в культуральной среде с концентрацией 150 000 клеток/мл и засейте клетки в белую 96-луночную пластину с прозрачным плоским дном из расчета 1,5x104 клеток/лунку. Белый цвет направлен на максимальное отражение и распределение света внутри колодцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек в лунке должно быть отрегулировано в соответствии с используемой линией клеток. Может потребоваться предварительный тест на плотность, чтобы найти нужное количество клеток для посева.
    8. Подготовьте две пластины для каждого времени чтения жизнеспособности. Одна тарелка будет освещена, а другая останется темной.
    9. Инкубируйте планшеты в течение 24 часов перед обработкой, чтобы обеспечить прикрепление клеток.
  3. Уход за розовой бенгальской
    1. Приготовьте стоковый раствор Розовой Бенгалии, восстановив порошок Розовой Бенгалии в 10% физиологическом растворе. Этот раствор должен быть приготовлен непосредственно перед обработкой клеток, чтобы избежать деградации розовой бенгальской розы из-за ее стабильности.
    2. Готовят растворы Rose Bengal в возрастающих концентрациях (0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM) путем разведения ранее приготовленного стокового раствора Rose Bengal в среде для культивирования клеток.
    3. После приготовления растворов удалите питательную среду из планшетов, содержащих клетки, и добавьте 100 мкл растворов для обработки Rose Bengal.
    4. Инкубируйте клетки с помощью Rose Bengal в течение 2 часов, чтобы обеспечить усвоение Rose Bengal.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации раствора Rose Bengal может отличаться в зависимости от используемой клеточной линии. Кинетика инкорпорации розовой бенгалии может нуждаться в точной настройке с помощью флуоресцентных измерений, чтобы найти правильное время инкубации для каждой изучаемой клеточной линии.
    5. Через 2 ч удалите растворы Rose Bengal, дважды промойте клетки PBS и добавьте 100 μL/лунку питательной среды, не содержащей Rose Bengal.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более высоких концентраций бенгальской розовой розы могут потребоваться дополнительные полоскания PBS. Может быть проведена визуальная проверка, чтобы убедиться, что клетки были вымыты правильно. После достаточного промывания, PBS не должен приобретать розовый цвет из-за присутствия бенгальской розы вне клеток.
    6. Накройте микропластины алюминиевой фольгой, чтобы защитить их от воздействия света. Осветите половину планшетов для анализа на ФДТ (см. шаг 2.4). Неосвещенные пластины будут предоставлять контрольные данные для результатов ФДТ (темное состояние). Они также предоставят данные о влиянии нефотоактивированной Rose Bengal на жизнеспособность клеток. Остальные микропланшеты будут использоваться для воздействия света в устройстве (состояние ФДТ).
  4. Порядок работы прибора CELL-LED-550/3
    1. Подсоедините штекерный разъем на распределителе света к гнездовому разъему источника света. Затем подключите источник света к электрической розетке.
    2. Извлеките две микропластины (PDT + темное состояние) из инкубатора, удалите алюминий для состояния PDT и поместите эту пластину на распределитель света.
    3. Установите диммер драйвера на максимальный уровень, чтобы максимизировать мощность, выдаваемую светодиодом, и получить среднюю мощность излучения 0,62 мВт/см2 на 96 лунках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диммер драйвера должен быть установлен на наиболее подходящее значение для биологических анализов (из трех доступных). Независимо от того, какой диммер установлен водителем, низкое подаваемое излучение не требует использования защитных очков.
    4. Подсвечивайте пластину до тех пор, пока не будет достигнута желаемая доза света на ячейках. Чтобы получить желаемую дозу света, можно настроить два параметра: Время и Излучение, ссылаясь на следующее уравнение:
      Доза света (Дж / см2 ) = Излучение (Вт / см2) × Время (с) (уравнение 1).
      Излучение можно модулировать, настроив диммер драйвера на получение 0,02 мВт/см2, 0,23 мВт/см2 или 0,62 мВт/см2 соответственно. Исходя из выбранной интенсивности излучения, уравнение 1 можно использовать для расчета времени освещения, необходимого для достижения целевой дозы света.
    5. Как только желаемая доза света будет достигнута, выключите устройство. Замените микропластину PDT на алюминиевую и верните ее в инкубатор вместе с контрольной пластиной до проведения теста на жизнеспособность.
    6. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: При необходимости подсветите другие пластины, используя ту же процедуру, которая описана выше.
  5. Анализ жизнеспособности клеток
    1. После проведения анализа ФДТ оставьте освещенный планшет в инкубаторе на 24 ч перед измерением воздействия ФДТ на освещенные клетки путем измерения их жизнеспособности. Время инкубации можно варьировать для изучения более или менее долгосрочных эффектов ФДТ на клетки. Для каждого времени инкубации после ФДТ в течение одного и того же периода следует инкубировать неосвещенную пластину (темное состояние).
    2. После инкубационного периода возьмите одну освещенную и одну неосвещенную пластины и добавьте 100 мкл реагента из набора для анализа жизнеспособности клеток в каждую лунку, чтобы измерить жизнеспособность клеток на основе метаболизма митохондрий и продукции АТФ клетками.
    3. Инкубируйте мультипланшет в темноте в течение 10 минут до измерения жизнеспособности клеток.
    4. После 10-минутной инкубации считайте люминесценцию, излучаемую в каждой лунке, с помощью мультимодального считывателя. Испускаемая люминесценция пропорциональна продукции АТФ живыми клетками в момент добавления раствора для анализа жизнеспособности клеток.
    5. Рассмотрите значение люминесценции необработанного состояния (NT) как 100% жизнеспособность и нормализуйте значения люминесценции обработанных состояний до NT-состояния, чтобы получить процент жизнеспособности, индуцированный каждым лечением.
    6. Повторяйте один и тот же протокол считывания жизнеспособности клеток для каждого времени чтения после ФДТ (например, через 24 ч, 48 ч и 72 ч после лечения).

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как показано на рисунке 3, устройство CELL-LED-550/3 обеспечивает равномерное освещение снизу 96-луночного планшета зеленым светом с длиной волны 550 нм.

figure-results-1
Рисунок 3: Изображения устройства CELL-LED-550/3 во время иллюстративного освещения 96-луночного планшета при включенном или выключенном (В) комнатном освещении. По материалам Lefebvre, A. et al.30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Каждая скважина освещается индивидуально и в стороне от одного светодиода (до двух метров) с помощью пучка оптических волокон (рис. 4).

figure-results-2
Рисунок 4: Волоконно-оптический пучок, обеспечивающий индивидуальное освещение лунок 96-луночного планшета вдали от одиночного LED. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Для установления эффективности устройства CELL-LED-550/3 была оценена его способность индуцировать RB-опосредованную ФДТ на клеточной линии гепатокарциномы HepG2. Клетки обрабатывали возрастающими концентрациями розовой бенгальской в диапазоне от 0 до 100 мкМ в течение 2 ч до освещения. Использование такого диапазона концентраций направлено на определение эффективной дозы (EC50) розовой бенгальской, которая убьет клетки HepG2 при воздействии зеленого света. Также изучалось влияние световой дозы, подаваемой устройством CELL-LED-550/3, на индукцию клеточной гибели в клетках HepG2. Для этого клетки подвергали воздействию света в течение 8 мин 9 с, 16 мин 18 с или 32 мин 36 с с интенсивностью 0,62 мВт/см2 с целью получения световых доз 0,30 Дж/см2, 0,60 Дж/см2 и 1,22 Дж/см2 соответственно.

Во-первых, было замечено, что освещение само по себе, в отсутствие Rose Bengal (световое состояние, рис. 5), не оказывает влияния на жизнеспособность клеток HepG2, независимо от получаемой дозы света. Также было замечено, что Bengal Rose сама по себе, в отсутствие света (состояние RB, рис. 5), не вызывала никаких изменений в жизнеспособности клеток ни при одном из испытуемых условий. В отличие от этого, результаты показывают, что RB-опосредованная ФДТ с использованием CELL-LED-550/3 способна убивать клетки HepG2. Кроме того, повышение эффективности наблюдалось в корреляции с увеличением световой дозы с максимальной эффективной концентрацией (EC50) 34,3 мкМ при дозе света 0,30 Дж/см2, 26,6 мкМ при дозе 0,60 Дж/см2 и 6,8 мкМ при дозе 1,2 Дж/см2.

Эти результаты подтвердили эффективность этого нового устройства ФДТ для RB-опосредованной ФДТ (Рисунок 5).

figure-results-3
Рисунок 5: Эффективность устройства в отношении жизнеспособности клеточной линии HepG2. Процент жизнеспособности через 24 ч после лечения HepG2. НТ, необработанные; RB, только фотосенсибилизатор (0 μМ, 5 μМ, 10 μМ, 25 μМ, 50 μМ, 75 μМ и 100 μМ); свет, освещенность на 0,30 Дж/см2, 0,60 Дж/см2 и 1,22 Дж/см2; ФДТ, освещение с обработкой RB. Результаты представлены в виде средних значений ± СЭМ трех независимых экспериментов, выраженных в процентах от ТН. Был проведен двухфакторный тест ANOVA с p ≤ 0,01 (**); p ≤ 0,0001 (****) считается статистически значимым, а p ≥ 0,05 считается незначимым (NS). По материалам Lefebvre, A. et al.30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. 

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье описывается как протокол разработки инновационного устройства освещения, предназначенного для RB-опосредованной ФДТ in vitro , так и протокол для реализации доказательства концепции для устройства CELL-LED-550/3, разработанного таким образом30.

CELL-LED-550/3 состоит из двух частей, каждая из которых выполняет определенную функцию. Цель первой части, называемой частью источника света, состоит в том, чтобы генерировать из одного светодиода однородный зеленый световой луч с диаметром больше, чем диаметр пучка оптического волокна второй части. Эта последняя, называемая светораспределительной частью, предназначена для распределения через оптоволоконный пучок света, подаваемого частью источника света, в отверстия 96-луночного планшета по отдельности и в сторону от светодиода. На расстоянии до 2,5 м от светодиода ячейки можно освещать столько, сколько необходимо, без риска вредного теплового воздействия, которое может возникнуть из-за неконтролируемого нагрева, выделяемого внутри светодиода.

Эта особенность дает первое существенное преимущество CELL-LED-550/3 по сравнению с другими светодиодными системами, специально разработанными для 96-луночного освещения планшетов 31,32,33,34,35,36. Действительно, все другие системы предполагают расположение светодиода (светодиодов) всего на несколько сантиметров ниже ячеек (обычно ниже 5 см), что недостаточно для устранения риска вредного теплового воздействия, связанного со светодиодами, для элементов. Чтобы ограничить такой риск, большинство этих других систем (к сожалению, некоторые из них этого не делают) включают в себя светодиодную систему охлаждения 32,34,35, иногда расположенную очень (слишком) близко к элементам, на которые в этом случае могут быть контрпродуктивно воздействуют результирующие тепловые колебания. Конструкция устройства CELL-LED-550/3 в двух частях дает еще одно существенное преимущество перед большинством других существующих светодиодных систем 31,32,33,35,36: это позволяет освещать клетки внутри инкубатора для клеточных культур без какого-либо риска для устройства. Светораспределительная часть, которая не включает в себя электронные компоненты, действительно может быть размещена внутри инкубатора, в то время как часть источника света, которая включает в себя электронные компоненты, чувствительные к влажной среде, находится снаружи, чтобы предотвратить риск коррозии или отказа. Некоторые существующие светодиодные системы, в том числе электронные компоненты, позволяют осуществлять подсветку внутри инкубатора, но такое использование, во-первых, не рекомендуется разработчиками/производителями и, во-вторых, требует «достаточной» сушки после использования33,34. Возможность освещения клеток внутри инкубатора и, таким образом, поддержания клеток в одних и тех же физиологических условиях (температура, влажность и концентрация CO2) во время протокола имеет решающее значение для предотвращения потенциальных смещений при оценке жизнеспособности клеток после ФДТ, особенно для протоколов, требующих длительного времени освещения. Следует также подчеркнуть, что прибор CELL-LED-550/3 включает в себя единый светодиод для освещения всех 96 скважин по отдельности и одновременно. Эта оригинальная и инновационная функция недоступна ни в одной из других вышеупомянутых систем на основе светодиодов 31,32,33,34,35,36. Большинство из этих систем включают в себя 96 светодиодов, по одному светодиоду размещен под каждой скважиной, и поэтому излучают 96 отдельных лучей 31,33,34,36, в то время как остальные системы передают, от 6 до 25 светодиодов, расположенных в нескольких сантиметрах от колодца, глобальный луч, охватывающий все или часть скважин 31,32,35 . Согласно имеющимся данным, генерация 96 отдельных лучей от одного светодиода, как это делает CELL-LED-550/3 с использованием оптического пучка, ранее не предлагалась.

В состав источника света входит светодиод мощностью 550 нм 3 Вт, подобранный по двум основным критериям. Во-первых, спектр излучения светодиода (и, следовательно, его центральная длина волны) должен перекрывать спектр поглощения фотосенсибилизатора RB. Такое перекрытие, которое отлично достигается при выборе светодиода (центральная длина волны: 554,4 нм; FWHM: 106,4 нм; обе оценки в соответствии с методологией, описанной в Lefebvre et al.30) (Рисунок 6), имеют важное значение для фотоактивации RB и, следовательно, для индукции RB-опосредованной ФДТ. Во-вторых, оптическая мощность светодиода должна быть ниже 5 Вт. Это ограничение мощности обусловлено допустимой мощностью коллиматорной линзы, входящей в состав источника света, и мощностью пучка оптического волокна, входящего в состав светораспределителя.

figure-discussion-1
Рисунок 6: Спектр поглощения розовой бенгальской рыбы в воде. Максимально нормализованный спектр поглощения Rose Bengal в воде построен в соответствии с левой осью, а средняя спектральная интенсивность излучения CELL-LED-550/3 масштабирована в соответствии с правой осью. Профиль среднего спектрального излучения согласуется с профилем светодиода, доступным на веб-сайте производителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Оптическая связь между двумя частями устройства является критическим фактором. Это соединение направлено, с одной стороны, на то, чтобы собрать максимум света, излучаемого светодиодом мощностью 3 Вт, в узкий луч, а с другой стороны, ввести этот луч в пучок оптического волокна. Что касается первой цели, то асферическая коллимационная линза с коротким фокусным расстоянием, специально разработанная для светодиодов, установленных на печатной плате (печатной плате), позволяет концентрировать светодиодный луч под углом 120 градусов в узкий луч под углом 10 градусов с пространственно равномерным распределением. Кроме того, полученный луч проецирует изображения квадратного светодиодного чипа, которые демонстрируют повышенную четкость и уменьшенные оптические аберрации по сравнению с теми, которые были получены при исходном луче. Что касается инжекции этого узкого луча в пучок оптического волокна, необходимо рассмотреть четыре важных момента. Во-первых, проксимальные концы оптических волокон из ПММА (полиметилметакрилата) диаметром 96 0,5 мм (числовая апертура: 0,2) собираются вместе в самодельный соединитель таким образом, что они образуют квадратную световосприимчивую поверхность со сторонами 5 мм (рис. 7). Квадратная форма, соответствующая квадратным проекциям светодиодного чипа лучом, была предпочтительнее обычной круглой формы разъема, чтобы ограничить потери света. Во-вторых, самодельный соединитель был разработан без использования клея и напечатан на 3D-принтере с использованием кристально чистой смолы, чтобы ограничить поглощение света и, таким образом, предотвратить перегрев/карбонизацию материала. В-третьих, световосприимчивая поверхность, а также конечная поверхность соединителя были отполированы с помощью полировального круга таким образом, чтобы через них проходило максимальное количество света. В-четвертых, и наконец, расстояние между линзой и квадратной световосприимчивой поверхностью было теоретически определено, а затем отрегулировано на оптическом стенде таким образом, чтобы наиболее однородная центральная часть квадратной светодиодной проекции перекрывалась немного больше, чем световосприимчивая поверхность.

При такой связи получается мощность 1,25 Вт для узкого луча на 10 градусов, в то время как общая мощность, передаваемая пучком из 96 оптических волокон, составляет 0,12 Вт (использовался фотодиодный датчик, подходящий для светодиодного света (OPHIR)).

figure-discussion-2
Рисунок 7: Квадратная световосприимчивая поверхность, полученная путем объединения 96 оптических волокон вместе в самодельный разъем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. 

CELL-LED-550/3 обеспечивает среднюю мощность излучения 0,62 мВт/см2 (стандартное отклонение: 0,09 мВт/см2) (Рисунок 8) на нижней наружной поверхности лунок. Это среднее значение, учитывающее упомянутую выше эффективность связи, было оценено и оказалось стабильным во времени (коэффициент вариации менее 0,6%) в соответствии с методологиями, подробно описанными в Lefebvre и al.30. При такой низкой интенсивности излучения (ниже, чем у других систем на основе светодиодов, специально разработанных для 96-луночного освещения), было доказано, что освещение само по себе не оказывает влияния на жизнеспособность клеток HepG2, в то время как для RB-опосредованной ФДТ была достигнута очень высокая эффективность. Для протоколов PDT, требующих более высокой интенсивности излучения для обеспечения эффективности, можно использовать несколько светодиодов, и, следовательно, можно реализовать несколько частей источника света, при условии, что мощность света, вводимого в каждое оптическое волокно, не превышает допустимую мощность в несколько десятков милливатт.

figure-discussion-3
Рисунок 8: Гистограмма, представляющая распределение излучений, подаваемых в 96 лунок пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Замена только светодиода в части источника света на другой подходящий позволяет получить еще одно устройство CELL-LED. Светодиод считается подходящим, если он излучает оптическую мощность ниже 5 Вт (по причинам, указанным выше) в видимом диапазоне (в соответствии со спецификациями оптоволоконного пучка). Поскольку существует значительное количество таких светодиодов, может быть разработан широкий спектр устройств CELL-LED и, таким образом, многие протоколы PDT могут быть оценены in vitro. Учитывая протокол PDT, светодиод, обеспечивающий наилучшее перекрытие со спектром поглощения рассматриваемого фотосенсибилизатора, очевидно, должен быть предпочтительным среди всех подходящих светодиодов. В случае замены светодиода особое внимание следует уделить узлу радиатора вентилятора. На самом деле, этот узел должен иметь соответствующий размер, чтобы предотвратить перегрев и последующую деградацию как светодиода, так и драйвера. Кроме того, для любого изменения светодиода потребуется новая оптическая и тепловая характеристика.

Как возможность фотоактивации большинства фотосенсибилизаторов путем простой замены одного светодиода, так и возможность подсветки клеток внутри инкубатора обеспечивают реальную добавленную стоимость этого устройства по сравнению с существующими.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Центральную больницу Лилля, Франция, и INSERM за их поддержку нашего исследования.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
550  нм 3  W светодиод, установленный на печатной плате Компания OSRAMОСТАР КП ЧСПМ1. Формула-1
75 см2 Колба с культуральными клеткамиСарштедт3911002
Пучок из 100 пластиковых оптических волокон (диаметр 0,5 мм)СВЕТОДИОД ARCENCIELволокно05egmТлеющий конец ПММА 0,5 диаметра - Lng  200 м&nбсп;       http://arcenciel-led.fr/accueil/193-fibre-optique-end-glow-05mm-prix-au-m.html
Счетчик ячеекТермоФишерAMQAF2000Опционально, можно посчитать под микркоскоп
Инкубатор для клеточных культурPHCI (Датчер)МСО-170АИКУВД-ПЭ
Клеточный титр GloКомпания PromegaГ7571
Прозрачная коллимационная линза из ПММАМагазин GleccОбъектив 14 мм 10 градусов;Алиэкспресс – коллиматорный объектив DEL с опорой 14 мм
Colorfab Ngen BlackКолорфаб  Артикул 020014Соответствие требованиям FDA к контакту с пищевыми продуктами
Colorfab Ngen белыйКолорфаб  Артикул 020013Соответствие требованиям FDA к контакту с пищевыми продуктами
Текущий драйвер с трехрежимным затемнением (CDM Driver)Драйвер CDMБД392200 мА
Эпоксидная смола Clé opatreХрустальный алмазКристалл Даймонд 150 мл
Радиатор с вентилятором в сбореБОЙД
Клетки HepG2АТКСНВ-8065
Мультимодальный считыватель (CLARIOstar Plus)BMG Labtech430-2927
Фосфатный буферный растворТермоФишер20012-068
Оптические волокна ПММА (полиметилметакрилат) (числовая апертура: 0,2)Гуанчжоу Майки Лайтинг Лимитед
Разъем питанияRSpro907-5680
РМПИ 1640ТермоФишер21875-091
Кулисный переключатель RSpro419-744
Роза БенгейлThermoFisher / MerckА17053.14 / 330000-1Г
Устойчивый к царапинам майларовый листRSproРС: 785-0802
НожныАУПРОТЕКТ& Ослаш; 8,5 мм / & Oslash; внешний диаметр 11 ммПолипропил полипропил и гравировка; Черная гофрированная оболочка с защитой от ультрафиолетового излучения не расколота
СВФЕвробиоCVF SVF00-01
КалькаКансон79368730
Прозрачная пластина из ПММАRSproРС: 284-6269
Трипан синийТермоФишер15250061
ТрипсинТермоФишер25200-072
Ультимакер 2+Ультимейкер
Белый 96-луночный планшет с прозрачным дномДатчер655098

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primer. 7 (1), 1-28 (2021).
  3. Erstad, D. J., Tanabe, K. K. Hepatocellular carcinoma: Early-stage management challenges. J Hepatocell Carcinoma. 4, 81-92 (2017).
  4. Tabori, N. E., Sivananthan, G. Treatment options for early-stage hepatocellular carcinoma. Semin Intervent Radiol. 37 (5), 448-455 (2020).
  5. Tsuchiya, N., et al. Biomarkers for the early diagnosis of hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 21 (37), 10573-10583 (2015).
  6. Puisieux, M. F., et al. Therapeutic management of advanced hepatocellular carcinoma: An updated review. Cancers. 14 (10), 2357(2022).
  7. Morton, C. A., et al. European dermatology forum guidelines on topical photodynamic therapy 2019 Part 1: treatment delivery and established indications - actinic keratoses, Bowen's disease and basal cell carcinomas. Eur Acad Dermatol Venereol. 33 (12), 2225-2238 (2019).
  8. Plaetzer, K., Krammer, B., Berlanda, J., Berr, F., Kiesslich, T. Photophysics and photochemistry of photodynamic therapy: Fundamental aspects. Lasers Med Sci. 24 (2), 259-268 (2009).
  9. Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: An update. CA Cancer J Clin. 61 (4), 250-281 (2011).
  10. Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: Part two-cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2 (1), 1-23 (2005).
  11. Krammer, B. Vascular effects of photodynamic therapy. Anticancer Res. 21 (6B), 4271-4277 (2001).
  12. Falk-Mahapatra, R., Gollnick, S. O. Photodynamic therapy and immunity: An Update. Photochem Photobiol. 96 (3), 550-559 (2020).
  13. Mosaddad, S. A., et al. Photodynamic therapy in oral cancer: A narrative review. Photobiomodul Photomed Laser Surg. 41 (6), 248-264 (2023).
  14. Guidolin, K., et al. Photodynamic therapy for colorectal cancer: A systematic review of clinical research. Surg Innov. 29 (6), 788-803 (2022).
  15. Osuchowski, M., Bartusik-Aebisher, D., Osuchowski, F., Aebisher, D. Photodynamic therapy for prostate cancer - A narrative review. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102158(2021).
  16. Gustalik, J., Aebisher, D., Bartusik-Aebisher, D. Photodynamic therapy in breast cancer treatment. J Appl Biomed. 20 (3), 98-105 (2022).
  17. Domka, W., et al. Photodynamic therapy in brain cancer: mechanisms, clinical and preclinical studies and therapeutic challenges. Front Chem. 11, 1250621(2023).
  18. Crous, A., Abrahamse, H. Photodynamic therapy of lung cancer, where are we. Front Pharmacol. 13, 932098(2022).
  19. Calzavara-Pinton, P. G., et al. Methylaminolaevulinate-based photodynamic therapy of Bowen's disease and squamous cell carcinoma. Br J Dermato. 159 (1), 137-144 (2008).
  20. Basset-Seguin, N., et al. Topical methyl aminolaevulinate photodynamic therapy versus cryotherapy for superficial basal cell carcinoma: A 5 year randomized trial. Eur J Dermatol. 18 (5), 547-553 (2008).
  21. Szeimies, R. M., et al. A clinical study comparing methyl aminolevulinate photodynamic therapy and surgery in small superficial basal cell carcinoma (8-20 mm), with a 12-month follow-up. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22 (11), 1302-1311 (2008).
  22. The IMmunotherapy Pleural 5-ALA PDT. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT04400539 (2025).
  23. Blue-Light Photodynamic Therapy and Sonidegib for Multiple Basal Cell Carcinomas. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT06623201 (2025).
  24. Neoadjuvant PDT in the Treatment of Cholangiocarcinoma. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT04824742 (2025).
  25. Correia, J. H., Rodrigues, J. A., Pimenta, S., Dong, T., Yang, Z. Photodynamic therapy review: principles, photosensitizers, applications, and future directions. Pharmaceutics. 13 (9), 1332(2021).
  26. Bartusik-Aebisher, D., Ożóg, Ł, Domka, W., Aebisher, D. Rose Bengal and future directions in larynx tumor photodynamic therapy. Photochem Photobiol. 97 (6), 1445-1452 (2021).
  27. Srivastav, A. K., et al. Photosensitized rose Bengal-induced phototoxicity on human melanoma cell line under natural sunlight exposure. J Photochem Photobiol. B, Biology. 156, 87-99 (2016).
  28. Uddin, M. M. N., et al. Encapsulated Rose Bengal enhances the photodynamic treatment of triple-negative breast cancer cells. Molecules (Basel, Switzerland). 29 (2), 546(2024).
  29. Osuchowski, M., et al. Photodynamic therapy-adjunctive therapy in the treatment of prostate cancer. Diagnostics (Basel, Switzerland. 12 (5), 1113(2022).
  30. Lefebvre, A., et al. Photodynamic therapy using a Rose-Bengal photosensitizer for hepatocellular carcinoma treatment: Proposition for a novel green LED-based device for in vitro investigation. Biomedicines. 12 (9), 2120(2024).
  31. Bounds, A. D., Bailey, R. D., Adams, C. T., Callaghan, D. C., Girkin, J. M. LightBox: A multi-well plate illumination system for photoactive molecule characterization. J Biophotonics. 14 (5), e202000481(2021).
  32. Zhang, K., Timilsina, S., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An open-source LED array illumination system for automated multi-well plate cell culture photodynamic therapy experiments. Sci Rep. 12 (1), 1-10 (2022).
  33. optoWELL. , opto biolabs. at https://optobiolabs.com/products/optowell/ (2025).
  34. Repina, N. A., et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Rep. 31 (10), 107737(2020).
  35. Hopkins, S. L., et al. An in vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochem Photobiol Sci. 15 (5), 644-653 (2016).
  36. Hadis, M. A., et al. Development and application of LED arrays for use in phototherapy research. J Biophotonics. 10 (11), 1514-1525 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

LED Illumination DeviceIn Vitro PDTHepG2 CellsCell Viability Assay96 Well PlatePhotosensitizer ApplicationGreen Light IrradiationCancer Cell Treatment

Похожие статьи