Моделирование стойкой инфекции Pseudomonas aeruginosa у раненых личинок данио-рерио

Краткое содержание

В настоящее время не хватает моделей in vivo , поддающихся скринингу лекарств против хронических бактериальных инфекций. В данной статье мы описываем протокол инфицирования раны клиническим изолятом Pseudomonas aeruginosa с целью создания персистирующей инфекции у личинок рыбок данио.

Аннотация

Pseudomonas aeruginosa является основным патогеном человека, особенно при хронических раневых инфекциях и хронических легочных инфекциях (особенно у пациентов с муковисцидозом (МВ)). Хронические бактериальные инфекции не поддаются лечению антибиотиками, и существует острая потребность в моделях хронических инфекций in vivo , поддающихся медикаментозному скринингу, для разработки эффективных методов лечения. Здесь мы описываем протокол инфицирования клиническим изолятом P. aeruginosa от пациента с муковисцидозом, конститутивно экспрессирующим зеленый флуоресцентный белок (GFP), для создания стойкой раневой инфекции у личинок рыбок данио. Эмбрионы, поврежденные хвостовым плавником, погружают в бактериальную суспензию на 1,5 ч, промывают и контролируют бактериальную нагрузку в течение 3 дней. Бактериальную нагрузку количественно оценивали ежедневно путем подсчета флуоресцентных колониеобразующих единиц (КОЕ) из лизированных инфицированных личинок, что способствовало персистирующей инфекции. Кроме того, стойкие бактерии P. aeruginosa были резистентны к лечению антибиотиками. Эта новая in vivo модель персистирующей инфекции P. aeruginosa дает возможность оценить эффективность инновационных методов лечения хронических инфекций.

Введение

Pseudomonas aeruginosa — грамотрицательная патогенная бактерия, ответственная за хроническую колонизацию у пациентов с муковисцидозом (МВ) и ранами ^1,2. P. aeruginosa принадлежит к группе патогенов ESKAPEE и признана Всемирной организацией здравоохранения в качестве критического приоритета для новых терапевтических средств³. Хронические бактериальные инфекции трудно поддаются лечению антибиотиками из-за адаптивной лекарственной устойчивости, которая связана с множеством факторов, включая биопленочный образ жизни, замедленный рост, низкую метаболическую активность⁴, а также внутриклеточный жизненный цикл⁵. Модели in vivo необходимы для лучшего понимания и лечения хронической инфекции P. aeruginosa.

В то время как несколько моделей in vivo были использованы для оценки вирулентности P. aeruginosa , очень немногие модели позволили имитировать персистирующую колонизацию и проверить эффективность лечения хронической инфекции⁶. Животные модели для изучения хронического патогенеза P. aeruginosa в основном основаны на введении бактерий, встроенных в шарики агара, в легкие⁷. Также была разработана модель хронической кожной инфекции у мышей⁸. Данио рерио (Danio rerio), обладающая многочисленными преимуществами (умеренные этические проблемы, низкая стоимость, высокая яйценоскость), является привлекательной моделью позвоночных in vivo для тестирования лекарств, которая также позволяет визуализировать P. aeruginosa и клетки-хозяина в режиме реального времени с высоким разрешением^{благодаря прозрачности} эмбриона.

Как сообщается в обзоре, в предыдущих исследованиях лабораторные штаммы P. aeruginosa (PAO1, PA14 и PAK) в основном использовались в модели инфекции рыбок данио, где они вызывали острую инфекцию⁹. Недавно мы разработали протокол лечения раневой инфекции, основанный на погружении эмбрионов с ампутированным хвостовым плавником штаммом P. aeruginosa PAO1, который вызвал острую инфекцию¹⁰. Инфекция путем погружения поврежденных эмбрионов, которая отражает естественный способ заражения P. aeruginosa, является способом инфекции, который является воспроизводимым и более легким, чем микроинъекция.

Нашей целью было разработать протокол персистирующей инфекции P. aeruginosa у рыбок данио. Для этой цели наша стратегия заключалась в использовании клинических штаммов P. aeruginosa, которые редко рассматривались в модели^{данио 11,12}, в сочетании с раневым путем инфекции. Здесь мы описываем протокол, который мы разработали для моделирования стойкой колонизации эмбрионов рыбок данио на основе раневой инфекции клиническими изолятами P. aeruginosa CF. Эта новая модель in vivo оправдывает наши ожидания и открывает новые возможности для оценки эффективности терапевтических средств в контексте стойкой колонизации, как описано здесь и в сопутствующей статье¹³.

Протокол

Все эксперименты с рыбками данио-рерио, описанные в настоящем исследовании, были проведены в Университете Монпелье в соответствии с принципами 3R (Замена, Сокращение и Уточнение) в соответствии с рекомендациями Европейского Союза по обращению с лабораторными животными и были одобрены Управлением санитарии и статистики в области здравоохранения и Этического комитета по использованию животных в области научных плавников под ссылочным документом CEEA-LR-B4-172-37. Все эксперименты с инфекцией проводились на эмбрионах в период до 5 дней после оплодотворения. Разведение взрослых рыбок данио (Danio rerio) из рыб AB или Golden Lines соответствовало международным рекомендациям, указанным в Директиве ЕС о защите животных 2010/63/EU. Аквариум из поликарбоната объемом 3,5 л (максимум 22 рыбы в аквариуме) Университета Монпелье со стандартными условиями, установленными в виде светового цикла: 12 часов: темноты, поликарбонатный аквариум объемом 3,5 л (максимум 22 рыбы в аквариуме), подключенный к рециркуляционной системе с соленостью 4% / проводимостью 400 μS и температурой воды 28 °C. Рыб кормили 2 раза в день кормом для рыб.

1. Приготовление растворов

1. Приготовьте рабочий раствор 1x для воды для рыб с метиленовым синим или без него для выращивания эмбрионов рыбок данио (см. Таблицу 1).
2. Приготовьте 20 раз бульон (0,4%) и 1 рабочий раствор трикаина, как описано в таблице 1. Чтобы избежать повторного замораживания и размораживания исходного раствора, приготовьте 10 мл аликвот 20x Tricaine и храните при температуре -20 °C.
3. Приготовьте 2% раствор тритона, разведенный в 1x Фосфатно-солевой буфер (PBS; Таблица 1).

2. Получение посевного материала флуоресцентного  P. aeruginosa, экспрессирующего GFP конститутивно

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся работа с P. aeruginosa проводится с соблюдением мер предосторожности BSL-2 в шкафу биобезопасности. Штаммы P. aeruginosa должны быть генетически модифицированы для конститутивной экспрессии флуоресцентного репортера, такого как GFP (как используется здесь и описан в¹³). Настоятельно рекомендуется использовать штаммы с хромосомно кодируемым флуоресцентным репортером, чтобы избежать потери плазмиды в случае плазмидного флуоресцентного репортера.

1. За 2 дня до заражения выпустить поголовье генетически модифицированного P. aeruginosa, экспрессирующего GFP, при температуре -80 °C на агаровых планшетах LB (табл. 1) и инкубировать в течение ночи при 37 °C.
2. Проверьте флуоресценцию колоний с помощью флуоресцентного микроскопа (увеличение 6x), чтобы инокулировать колонию GFP⁺P. aeruginosa в 1 мл бульона LB (Таблица 1) и вырастить в течение ночи при 37 °C с встряхиванием (180 об/мин).
3. В день заражения разведите вышеуказанную ночную культуру P. aeruginosa в дозе 1:20 в 5 мл свежего отвара LB. Выращивайте бактерии при температуре 37 °C с встряхиванием (180 об/мин) до тех пор, пока культура не достигнет наружного диаметра₆₀₀ = 0,8. На это должно уйти примерно 2-3 часа.
4. Центрифугируйте бактериальную культуру в течение 10 мин при комнатной температуре (RT) при 3584 x g. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 4 мл рыбьей воды без метиленового синего.
5. Отрегулируйте объем культуры с рыбной водой так, чтобы он составлял от 7 x 10⁷ до 1 x 10⁸ КОЕ/мл. Это соответствует внешнему диаметру₆₀₀ , равному примерно 0,15 (который должен быть адаптирован для каждого штамма).
6. Для количественного определения инокулюма проводят серийное разведение бактериальной суспензии, наносят 20 мкл разведения ^10-4 на агаровый планшет LB и инкубируют в течение ночи при 37 °C.
7. Подсчитайте колонии GFP⁺ под флуоресцентным микроскопом, чтобы определить КОЕ инокулюма.

3. Сбор и подготовка эмбрионов рыбок данио

1. За 3 дня до эксперимента по бактериальному погружению установите пары для размножения рыбок данио. Поместите племенного самца и самку в аквариум для скрещивания.
2. На следующее утро соберите яйца после оплодотворения с помощью мелкоячеистого ситечка. Собранные яйца поместите в чашку Петри, содержащую рыбью воду с метиленовым синим.
3. Чтобы избежать загрязнения, добавьте в чашку Петри 1 каплю отбеливателя. Через 5 минут замените воду для рыб метиленовым синим, чтобы удалить отбеливатель.
4. Отбраковывайте яйцеклетки с аномальным развитием эмбриона (неоплодотворенные яйцеклетки похожи на стадию 1-клеточного яйца) или мертвые (белый вид).
5. Утром в день заражения (при 2 dpf) провести дехорионацию эмбрионов двумя очень тонкими щипцами под стереомикроскопом (увеличение 11x). Разорвите хорион с помощью щипцов, не сжимая эмбрион, чтобы освободить его.
6. Поместите дехорионированные эмбрионы в чашку Петри, содержащую рыбу с метиленовым синим. Инкубируйте посуду при температуре 28 °C до момента заражения.

4. Повреждение эмбриона

1. Обезболите эмбрионы рыбок данио в рыбьей воде без метиленового синего, содержащего 0,02% трикаина, примерно за 5 минут до повреждения в чашке для клеточных культур (35 мм х 10 мм). Эмбрионы больше не двигаются и не реагируют на раздражители.
2. Поместите иглы 25G на верхнюю часть двух палочек для еды, чтобы облегчить работу с иглами.
3. Под стереомикроскопом отсейте эмбрионы с аномальным развитием или погибшие. С помощью круговых движений посуды соберите все зародыши в центре.
4. Изолируйте эмбрионы один за другим с помощью двух игл в вертикальном положении (голова вниз - хвост вверх) и поместите левую иглу у хвоста, чтобы он оставался прямым. Разрежьте плавник по краю хорды правой иглой. Сделайте разрез за один раз. Не более 10 минут между резкой и погружением в бактериальный раствор.

5. Инфицирование раненых эмбрионов

1. Под шкаф биологической безопасности типа II вскрыть и добавить раствор P. aeruginosa в концентрации примерно 1 х 10⁷ КОЕ/мл в 6-луночный планшет.
2. Соберите поврежденные эмбрионы с помощью одноразовой стеклянной пипетки Пастера и добавьте их в бактериальный раствор под постом микробиологической безопасности. Инкубируйте планшет при температуре 28 °C в течение 1,5 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо большое количество инфицированных личинок, сформируйте группы примерно из 50 личинок, сделайте рану, погрузите их в воду и повторите для следующей группы.
3. После заражения промойте эмбрионы под постом микробиологической безопасности, как описано ниже.
   1. Перенесите эмбрионы стеклянной пипеткой для промывки в 10 мл рыбьей воды без метиленового синего, добавляя как можно меньше жидкости, на 30 минут при комнатной температуре.
   2. Снова перенесите инфицированные эмбрионы с помощью стеклянной пипетки для повторного промывки в 4 мл рыбьей воды без метиленового синего на несколько минут.
   3. Перенесите 24 инфицированных эмбриона по отдельности в многолуночный планшет с 1 мл рыбьей воды без метиленового синего.
4. Поместите пластины в пластиковый ящик в инкубатор при температуре 28 °C. Увлажните коробку (например, влажными бумажными полотенцами), чтобы ограничить испарение.

6. Выживание инфицированных эмбрионов

1. Для исследований выживаемости эмбрионов проверяйте жизнеспособность под стереомикроскопом через 18 ч, 24 ч и 48 ч после заражения (hpi). Эмбрион считается мертвым, когда сердце и кровообращение прекращаются.
2. Представьте показатели смертности/выживаемости с помощью графических представлений лестницы Каплана-Мейера (GraphPad Prism 8.3.0) и проанализируйте данные с помощью логарифмического ранга или других соответствующих статистических тестов.

7. Подсчет бактериальной нагрузки в инфицированных эмбрионах (Рисунок 1)

1. Проводите определение КОЕ у инфицированных эмбрионов в четырех различных временных точках: 1,5 hpi, т.е. сразу после заражения, и после каждой промывки при 24, 48 и 72 hpi с 5 эмбрионами на временной потом. Выполняйте все действия под постом микробиологической безопасности.
2. Приготовьте для каждой инфицированной личинки 1,5 мл микроцентрифужных пробирок, содержащих 95 мкл 1x PBS. Объем личинок составляет около 5 мкл.
3. Перенесите личинок в 6-луночный планшет с 4 мл рыбьей воды без метиленового синего для промывки и уничтожения планктонных бактерий.
4. Поместите каждый эмбрион в микроцентрифужную пробирку, содержащую PBS, добавив как можно меньше жидкости. Просто прикоснитесь стеклянной пипеткой, содержащей личинки, к поверхности PBS, чтобы позволить личинкам погрузиться в микроцентрифужную пробирку без добавления жидкости.
5. Измельчите эмбрионы по отдельности с помощью пестика на боковой стороне микроцентрифужной пробирки. Держите пестик внутри трубки. Определите конечную точку, когда не осталось неповрежденного эмбриона.
6. Поднимите пестик и добавьте 100 μL PBS-Triton 2%, чтобы смыть остатки бактерий из пестика (конечная концентрация составляет 1%). Вихрь и ждем 10 мин. Не обрабатывайте более пяти эмбрионов одновременно.
7. Капните 3 раза, 10 мкл неразбавленных лизатов на агаровые пластины LB для каждого эмбриона. Проводите последовательное разведение лизатов в 96-луночном планшете до достижения разведения ^10-3 с помощью многоканальной пипетки. Капните 3x, 10 μL разбавления ^10-1, ^10-2 и ^10-3 рядом с неразбавленными на агаровые планшеты LB и инкубируйте планшеты в течение ночи при 37 °C.
8. Подсчитайте под микроскопом флуоресцентные колонии каждого разведения и рассчитайте КОЕ на одного инфицированного эмбриона.

Рисунок 1: График эксперимента для оценки вирулентности и персистенции бактерий в эмбрионе рыбки данио. Сокращения: КОЕ = колониеобразующие единицы, hpi = часы после заражения. Рисунок был создан с помощью BioRender.com. Цифра была изменена с¹³. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

8. Тестирование лечения против персистирующей инфекции (Рисунок 2)

1. Готовьте растворы антибиотиков в 40-кратном соотношении минимальной ингибиторной концентрации (MIC) для штамма P. aeruginosa . Перед экспериментом проверьте, что выбранная концентрация антибиотика не токсична для эмбриона.
2. Выполните шаги 7.1 и 7.2. Поместите 1 мл рыбьей воды с антибиотиками в 24-луночный планшет и проведите контроль без антибиотиков.
3. Перенесите пять эмбрионов с этапа промывки за одну процедуру в 24-луночный планшет, добавив как можно меньше жидкости.
4. Инкубировать с антибиотиками в течение 30 минут при комнатной температуре. Вернитесь к шагу 7.3. для количественной оценки бактериальной нагрузки после лечения.

Рисунок 2: Экспериментальная процедура, используемая для оценки эффективности лечения антибиотиками инфицированных эмбрионов. Сокращения: ATB 30' = лечение антибиотиками в течение 30 мин, КОЕ = колониеобразующие единицы, hpi = часы после заражения. Рисунок был создан с помощью BioRender.com. Цифра была изменена с¹³. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Результаты

Эмбрион рыбки данио является подходящей моделью для мониторинга персистирующей инфекции изолятами муковисцидоза P. aeruginosa
Мы использовали режим погружения поврежденных эмбрионов для оценки in vivo вирулентности трех изолятов CF (A6520, B6513 и C6490)⁹. Мы также оценили поведение хорошо охарактеризованного позднего изолята CF, RP73, известного своей долгосрочной колонизацией дыхательных путей мышей^14,15

Обсуждение

Моделирование бактериальной хронической инфекции in vivo имеет важное значение для понимания патогенеза и оценки эффективности лечения. Здесь мы создали модель персистирующей раневой инфекции у рыбок данио, подходящую для тестирования препаратов против P. aeruginosa. Это восполняет пробел в современной методологии из-за недостатка in vivo моделей, поддающихся скринингу лекарств против хронических бактериальных инфекций. Примечательно, что эта модель имитирует о...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Этил-3-аминобензоат метансульфонат	Сигма	Е50521
Поршневые шарики	Eppendorf, Dutscher	33522
морская соль	Мгновенный океан, аквариумные системы	218035
Тритон	Евромедекс	2000-Б