Быстрая диссекция и диссоциация обонятельного эпителия мыши при одноядерных суспензиях

Краткое содержание

В данной статье представлен упрощенный протокол диссекции и диссоциации обонятельного эпителия мыши с целью секвенирования одноядерной РНК.

Аннотация

Мышиный обонятельный эпителий является начальной точкой входа в обонятельную систему, в которой находятся различные типы клеток, включая обонятельные сенсорные нейроны, их регенерирующие предшественники и опорные клетки. Обонятельные сенсорные нейроны преобразуют химические запахи в нейронные сигналы, однако механизмы, лежащие в основе того, как эти клетки развиваются и оборачиваются, создают синапсы с обонятельной луковицей и регулируют их рецепторы запаха, остаются областями интенсивного изучения. Расположенный на дорсальной стороне носовой полости, обонятельный эпителий прилипает к сложным костным структурам, известным как носовые раковины. Эта анатомия создает уникальные проблемы для его экстракции и диссоциации, особенно в контексте получения жизнеспособных одиночных клеточных суспензий. Поскольку протоколы суспензии одиночных клеток часто включают подготовительные этапы (например, диссоциацию папаина, FACS), которые могут подорвать жизнеспособность клеток и/или задержать подготовку библиотеки, минимизация времени извлечения ткани имеет решающее значение. В данной статье представлен усовершенствованный метод быстрой диссекции обонятельного эпителия и протокол получения высококачественных одноядерных суспензий.

Введение

Мышиный обонятельный эпителий (ОЭ) является важным компонентом обонятельной системы и отвечает за обнаружение и передачу сигналов запаха в центральную нервную систему. Его самый поверхностный слой содержит реснички обонятельных сенсорных нейронов, обнаруживающие запахи, которые покрыты слоем слизистой оболочки и окружены поддерживающими их сустентакулярными и микровилларными^{клетками1,2}. ОСН являются биполярными, расширяя свои реснички апикально, образуя решетку в слое слизи, а их аксоны базально через костную крибриформную пластину сливаются в клубочки внутри обонятельной луковицы. Эти клубочки являются местом расположения синапсов между OSN и нижестоящими нейронами. Лежащие в основе OSN, нейронные клетки-предшественники, называемые шаровидными базальными клетками, постоянно пополняют OSN, поскольку^{они умирают} после прямого воздействия вредных веществ окружающей среды, таких как переносимые по воздуху токсины, патогены и физические травмы. Шаровидные базальные клетки образуются из резервного пула мультипотентных горизонтальных базальных клеток ^4,5, расположенных наиболее базально и прилегающих к базальной пластинке костных выступов, называемых носовыми носовыми раковинами. Носовые носовые раковины извилистые, что затрудняет отделение и гомогенизацию оригинальных запчастей. Кроме того, ОЭ окружена костями черепа, что затрудняет доступ к этой области и традиционно требует длительной процедуры.

Предыдущие исследования основывались на длительной инкубации папаина для высвобождения обонятельного эпителия из кости 6,7,8,9,10, что может еще больше замедлить последующую обработку суспензии одиночных клеток. Поскольку сдвиг аксонов OSN запускает апоптоз¹¹, крайне важно свести к минимуму время от экстракции ткани до подготовки библиотеки кДНК. Кроме того, архитектура ОЭ и ее проекции на обонятельную луковицу усложняют экстракцию интактных клеток для успешного секвенирования РНК одиночных клеток. К счастью, одноядерное секвенирование РНК (snRNA-seq) оказалось мощным инструментом для профилирования клеток при сохранении распределения по типам клеток, особенно в тканях, где диссоциация одиночных клеток затруднена или^{нецелесообразна.}

В то время как в ряде исследований 6,7,8,10,14,15 было проведено секвенирование одиночных клеток ОЭ мыши, ни в одном из них не предлагается детальная процедура диссекции, оптимизированная для последовательного и целесообразного сбора тканей, что необходимо, учитывая хрупкость ОЭ и его покрытость различными костями черепа. Кроме того, существующие руководства по вскрытию¹⁶ ориентированы на сохранение анатомической структуры, а не на скорость, что приводит к потенциально длительному времени вскрытия. Поскольку целесообразное препарирование тканей имеет важное значение для минимизации деградации РНК и максимизации качества подготовленных ядер^17,18, является оправданным оптимизированный протокол для быстрой диссекции и гомогенизации мышиной OE в одноядерную суспензию для использования в различных последующих приложениях.

Данный протокол (рис. 1) представляет собой оптимизированный метод, предназначенный для преодоления этих проблем, обеспечивающий быстрое рассечение мышиной ОЭ и эффективную диссоциацию ткани с целью выделения ядер. Такой подход способствует высококачественному одноядерному секвенированию19, обеспечивая надежную методику исследования молекулярных основ биологии обоняния.

Рисунок 1: Анатомия соответствующих швов и костей черепа мыши C57BL/6 и репрезентативное поперечное сечение обонятельного эпителия. (A) Швы черепа имеют цветовую кодировку. Швы имеют цветовую маркировку на одной стороне черепа, в то время как другая сторона остается неотмеченной для справки (слева). Названия швов имеют соответствующую цветовую кодировку (справа). (B) Кости черепа с цветовой кодировкой. Кости имеют цветовую маркировку на одной стороне черепа, в то время как другая сторона оставлена без маркировки для справки (слева). Названия костей обозначены соответствующим цветом (справа). (C) Поперечное сечение центральной части оригинальной кости (рассечено с помощью метода, описанного в этой статье) с носовыми раковинами с цветовой кодировкой на одной стороне и левым верхом без маркировки для справки (слева). Названия визуализированных носовых раковин (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Протокол

Все эксперименты на животных в этом исследовании были одобрены и проведены в соответствии с требованиями IACUC Медицинского колледжа Бейлора. Использовались самки мышей C57BL/6J (JAX:000664). Подробная информация о реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Диссекция обонятельного эпителия

1. Начните с глубокой анестезии мыши с использованием любого предпочтительного метода (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Подтвердите операционную плоскость анестезии крепким щипцом ноги и продолжайте транскардиальную перфузию не менее 10 мл ледяного холода 1x PBS. Снимите кожу, чтобы обнажить череп (рисунок 2A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Снятие головы с тела не является обязательным. Если кто-то решил удалить голову, рекомендуется удалить кожу и другие мягкие ткани вокруг черепа перед обезглавливанием.
2. С помощью тонких ножниц с острым концом сделайте два разреза, чтобы разорвать скуловые дуги от чешуйчатой кости двусторонне, поместив один кончик ножниц в заднюю орбиту, а другой рядом со слуховым проходом (зеленые линии на рисунке 2B).
3. Сделайте неглубокий разрез от орбиты к орбите вдоль самой передней части лобной кости. Надрезайте только дорсальную поверхность лобной кости (глубиной ~1-2 мм), стараясь не разрезать никакие нижележащие структуры или кости, составляющие глазницу (синяя линия на рисунке 2B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить неглубокий разрез между орбитами, держите ножницы перпендикулярно черепу и используйте только острые кончики для разреза.
4. Разрезают по средней линии черепа от большого затылочного отверстия, через сагиттальный и межлобный швы, до достижения межглазничного разреза, сделанного в лобной кости на шаге 1.3 (красная линия на рисунке 2В).
5. Вставьте пару щипцов в разрез, сделанный по средней линии черепа, и сильно потяните одно полушарие свода черепа в сторону. Это действие также удаляет кости глазницы (лобную, верхнечелюстную и слезную), обнажая латеральные аспекты обонятельных носовых раковин (Рисунок 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы случайно не повредить оригинальное оборудование с этого момента.
6. Придерживая носовую кость и резцовые зубы, отломите контралатеральный свод черепа с помощью щипцов. Позвольте мозгу (включая обонятельные луковицы) быть удаленным вместе с оторванным полушарием кости (рисунок 1E). Единственными видимыми костными структурами, которые должны остаться после этого этапа, являются основание черепа и кости, окружающие ОЭ (рис. 2F).
7. С помощью пары кусачек для костей или ронжеров удалите все оставшиеся лобные кости и предчелюстную (резцовую) кость до основания резцовых зубов (рисунок 2G).
8. Используйте костные кусачки для разрезания вдоль лобно-назального шва, чтобы освободить носовую кость от крибриформной пластины, соблюдая крайнюю осторожность, чтобы не повредить подлежащее обнаженное ОЭ или не сломать крибриформную пластину.
9. Поднимите носовую кость от крибриформной пластины с помощью щипцов, чтобы обнажить ОЭ (рисунок 2H). Если остаточная премаксиллярная кость скрывает дорсальную ОЭ, удалите ее перед тем, как продолжить работу (черные круги на рисунке 1I).
10. С помощью щипцов с тонкими наконечниками аккуратно закрепите дорсальную часть носовой перегородки в месте ее соединения с крибриформной пластиной и потяните кзади (рис. 2J,K). При минимальном сопротивлении основной обонятельный эпителий вырвется на свободу в виде полностью неповрежденной структуры (Рисунок 2L).
11. Немедленно приступайте к диссоциации оригинального оборудования или заморозьте ткань для последующей обработки.

Рисунок 2: Техника быстрой диссекции обонятельного эпителия. (А) Головка мыши после удаления окружающих мягких тканей. (B) Цветовые направляющие для разрезов свода черепа. (В) Появление после разрезов свода черепа. (D) Удаление первого полушария свода черепа вместе с частью орбиты, прилегающей к обонятельному эпителию. (E) Удаление контралатеральной части свода черепа вместе с мозгом. (F) Голова после удаления мозга и свода черепа. (G) Удаление самой передней лобной кости и задней предчелюстной кости после разреза на лобно-максиллярном шве. (H) Удаление носовых костей. (I) Черными кругами выделены участки остаточной предчелюстной кости, которые могут быть удалены по желанию. (J) Установка щипцов для удаления интактного обонятельного эпителия. (K) Потяните кзади, чтобы освободить обонятельный эпителий. (L) Общее выделение обонятельного эпителия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Диссоциация обонятельного эпителия и выделение одноядерного ядра

1. Положите на лед одну С-образную пробирку и две конические пробирки объемом 15 мл на образец.
2. Приготовьте буфер для лизиса путем добавления ингибитора РНКазы (до конечной концентрации 0,2 Ед/мкл) в заранее приготовленный буфер для экстракции ядер.
3. Добавьте 4 мл 1% BSA в каждую коническую пробирку объемом 15 мл, быстро перебейте и выбросьте излишки. При этом каждая из конических пробирок объемом 15 мл покрывается БСА, чтобы свести к минимуму адгезию ядер к трубке.
4. Для одного целого OE добавьте 2 мл ледяного буфера для лизиса в каждую С-образную трубку.
5. Добавьте образцы оригинального оборудования в С-образные пробирки. Используя щипцы #2, держите каждый образец над соответствующей С-образной трубкой и разрежьте его на мелкие кусочки с помощью ножниц с тонким кончиком.
6. Поместите С-образные пробирки, содержащие каждый образец, вверх ногами на блоки автоматического диссоциатора тканей. На экране диссоциатора квадрат, соответствующий каждому блоку, изменится с «Свободный » на «Выбранный».
7. Нажмите на значок папки, чтобы переключиться в папку Miltenyi . С помощью стрелок прокрутите до 4C_nuclei_1 программы (предварительно загруженной программы внутри диссоциатора). Нажмите OK , чтобы применить программу к каждому блоку, а затем нажмите Start, чтобы начать цикл. Извлеките С-образные трубки из диссоциатора сразу после завершения цикла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности держите С-образные трубки ледяными во время цикла диссоциации. Важно извлечь образцы из диссоциатора сразу после завершения цикла и приступить к следующим шагам протокола, чтобы избежать чрезмерного лизиса ядер.
8. С помощью пипетки отсадите гомогенизированную суспензию из С-образной трубки и отфильтруйте ее через сетчатое фильтр 70 мкм в первую коническую трубку с покрытием BSA. Избегайте аспирации костных отломков, которые скопились на дне С-образной трубки.
9. Промойте ситечко 1 мл ледяного 1x PBS, чтобы обеспечить полную фильтрацию.
10. Отфильтрованную суспензию центрифугировать при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C в центрифуге с качающимся ведром.
11. Аккуратно отсадите и выбросьте надосадочную жидкость, стараясь не потревожить гранулы. Полностью ресуспендируйте ядра гранул в 1 мл ледяного 1x PBS с помощью щадящего пипетирования.
12. Пропустите ресуспендированные ядра через сетчатое фильтр 30 мкм во вторую коническую трубку с покрытием BSA. Концентрация ядер может быть количественно определена с помощью гемоцитометра или автоматизированного клеточного счетчика.
13. Немедленно перейдите к выбранному нисходящему протоколу (с FACS или без него), чтобы сохранить целостность образца и предотвратить его деградацию (рис. 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется, чтобы пользователи выполняли тренировочные прогоны всего этого протокола, чтобы обеспечить плавное и своевременное завершение.

Рисунок 3: Процесс диссоциации обонятельного эпителия и выделения одного ядра. После вскрытия обонятельный эпителий механически и химически диссоциируется. Затем лизат фильтруют через ситечко 70 мкм, промывают 1x PBS и центрифугируют при 500 × г в течение 5 минут. Пеллета повторно суспендируется в 1x PBS перед фильтрацией через сетчатое фильтр 30 мкм. Полученная суспензия ядер доступна для различных последующих применений секвенирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Результаты

Чтобы обеспечить анатомический контекст для вскрытия и анализа, были визуализированы и обозначены цветом швы и кости черепа мыши C57BL/6, а также центральная часть обонятельного эпителия (OE). Одна сторона каждого изображения была аннотирована, чтобы выделить соответствующие швы, кости и носовые раковины, в то время как другая сторона была оставлена без пометок для справки. Поперечный срез ОЭ был получен в соответствии с установленными протоколами²⁰, а идентификация н...

Обсуждение

Описанная здесь процедура обеспечивает последовательное удаление неповрежденной ОЭ после внутрисердечной перфузии 1x PBS. Это представляет собой заметное улучшение скорости по сравнению с предыдущими методами¹⁶ и имеет особое значение, учитывая, что OSN начинают дегенерировать после аксотомии², которая происходит во время удаления мозга.

Тщательное удаление лобных, предчелюстных и носовых костей имеет решающее зн...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Центрифужная пробирка 15 мл	Клеточный тракт	229411
Костяные кусачки	Инструменты для точной науки	16102-11
Боннские миниатюрные ножницы с ирисом	Милтекс	18-1392
Раствор альбумина в сыворотке крупного рогатого скота	Сигма-Олдрич	А1595
Пинцы Dumont #3	Инструменты для точной науки	11231-30
Самки мышей C57BL/6J	Лаборатория Джексона	ДЖАКС: 000664
Трубы gentleMACS C	Милтеньи Биотек	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator	Милтеньи Биотек	130-096-427
MACS SmartStrainers 30 мкм	Милтеньи Биотек	130-098-458
MACS SmartStrainers 70 мкм	Милтеньи Биотек	130-098-462
Микро Фридман-Пирсон Ронгерс	Инструменты для точной науки	16220-14
Буфер для экстракции ядер	Милтеньи Биотек	130-128-024
Фосфатно-солевой буфер (PBS), 1x без кальция и магния, PH 7.4 ± 0.1	Корнинг	21-040-ЧВ
Ингибитор протекторной РНКазы	Миллипора Сигма	3335402001
Рефрижераторная центрифуга Sorvall Legend XTR	Термо Сайентиал	50119927-5