Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Эксплантная модель ex vivo для изучения глиальных взаимодействий в сетчатке мыши

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68482

⸱

15 июля 2025 г.

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Schepens Eye Research Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы подробно описываем методологию выделения сетчатки от глаза мыши для расширенных экспериментов ex vivo . Этот протокол подчеркивает, что этот технически сложный подход становится доступным для исследователей, которые хотели бы воспользоваться возможностями исследований, предоставляемыми сохранением глии сетчатки in situ в живых тканях.

Аннотация

Роль глии при глаукоме становится все более важной темой исследований, но многое остается неизвестным о том, как популяции этих вспомогательных клеток, а именно астроцитов и микроглии, влияют на выживаемость ганглиозных клеток сетчатки. В то время как модели in vivo и in vitro обеспечивают определенную степень понимания, оба подхода имеют существенные ограничения, такие как влияние периферического иммунного ответа в первом случае и изменения физиологической функции, вызванные выделением и культивированием клеток в случае последнего. Чтобы свести к минимуму эти искажающие факторы, мы разработали систему экспланта сетчатки ex vivo , в которой астроциты, микроглия и другие типы клеток сетчатки могут поддерживаться in situ в течение как минимум 3 дней, что позволяет проводить целенаправленные исследования с более высокой пропускной способностью, чем это обычно возможно при использовании моделей in vivo . Важно отметить, что этот подход в значительной степени поддается методологиям, которые были бы сложными или неосуществимыми на живом животном, но при этом остается совместимым с обычными последующими анализами неповрежденной нервной ткани. В данной работе мы представляем протокол, подходящий для выделения и культивирования интактных эксплантов сетчатки, а также репрезентативные результаты иммунофлуоресцентной микроскопии, документирующие изменения, претерпеваемые глией и ганглиозными клетками сетчатки в ex vivo .

Введение

Светочувствительная сетчатка, продолжение центральной нервной системы (ЦНС), расположенная в задней части глаза, имеет важное значение для зрения, но уязвима как к острым травмам, так и к хроническим заболеваниям. Как и в случае с другими областями ЦНС, нейроны в сетчатке взрослого человека не заменяются при утрате, а ганглиозные клетки сетчатки (РГК), которые агрегируют и передают визуальную информацию в мозг, особенно уязвимы к дисфункции и смерти при глаукоме, что приводит к необратимойпотере зрения. Глаукома является одной из основных причин слепоты во всем мире3, но, несмотря на разрушительное воздействие на больных людей и общие издержки для общества, многое остается неизвестным о том, как ранние стадии болезни способствуют потере РГК4. Роль глии является важной областью исследований в патофизиологии глаукомы, поскольку эти ненейрональные опорные клетки необходимыдля выживания РГК, но претерпевают фенотипические изменения при заболевании, которые могут снижать полезноеповедение или даже приводить к принятию вредных фенотипов. Несмотря на то, что термин «глия» охватывает ряд специализированных типов клеток в ЦНС8, их можно в целом разделить на двекатегории: те, которые имеют общую линию развития с нейронами и обеспечивают трофическую, энергетическую и структурную поддержку, и клетки миелоидного происхождения, которые выполняют специализированные задачи иммунного надзора и ответа.. Представители обеих категорий - астроциты и клетки Мюллера в первых, микроглия во вторых - заселяют сетчатку5 и претерпевают серьезные изменения при глаукоме, которые ставят важные вопросы об их роли в прогрессировании заболеванияи выживаемости РГК.

Попытки ответить на эти вопросы отчасти затруднены внутренними характеристиками глии сетчатки, которые представляют трудности как для исследований in vivo, так и in vitro. В отличие от нейронов, они относительно бесшумны в электрическом плане, что делает такие подходы, как ЭРГ, которые позволяют проводить функциональную оценку РГК и фоторецепторов in vivo, непригодными для исследования изменений глиальной функции и поведения. И хотя доступны индуцируемые12 и спонтанные13 модели глаукомы, многое остается неизвестным об изменениях в глии на самых ранних временных точках заболевания, которые могут предшествовать обнаруживаемой потере РГК, что усугубляется вариабельной пенетрантностью болезненного состояния во многих из этих моделей. Кроме того, данные как клинических, так и экспериментальных глауком, свидетельствуют о вкладе клеток периферического иммунитета, который может быть трудно отличить от клеток микроглии, несмотря на признаки того, что они могут действовать в разных «направлениях», влияя на прогрессирование заболевания14,15.

Также существует множество проблем при изучении глии сетчатки in vitro. Несмотря на то, что выделение и культивирование астроцитов16,17 и микроглии18 из мозга хорошо известны, недавняя работа подчеркивает обширную глиальную гетерогенность между областями ЦНС, особенно в астроцитах19, и фенотипы, присутствующие в одной области, могут отсутствовать в глии из другой, такой как сетчатка20,21. Тем не менее, прямое выделение астроцитов сетчатки и микроглии для изучения является особенно сложной задачей, поскольку оба типа клеток относительно редки - каждый из них составляет менее 1% от предполагаемых 6,5 миллионов клеток в сетчатке мышей 22,23,24. Кроме того, в отличие от нейронов, глии очень пластичны и быстро адаптируются к резким изменениям в окружающей среде 16,18,25; В результате, поведение, наблюдаемое в этих клетках in vitro, может представлять собой специфические адаптации к их новой среде, а не фенотипические паттерны, которые обычно наблюдаются в норме здоровья или болезни. Учитывая ограничения как экспериментов in vivo, так и первичной культуры глии сетчатки, мы искали промежуточный подход - экспланты сетчатки, при которых глия, РГК и другие элементы сетчатки сохраняются in situ в контексте ex vivo. По сравнению с моделями in vivo, этот подход предлагает сокращенный экспериментальный временной ход26, позволяет проводить прямые экспериментальные манипуляции с глией сетчатки27 и позволяет избежать потенциально искажающего влияния инфильтрации периферических иммунных клеток14. И наоборот, в отличие от первичной клеточной культуры, происходит минимальное нарушение внеклеточной среды, и глия остается интактной и морфологически узнаваемой, что устраняет проблемы, связанные с существенным повторным выращиванием и идентификацией этих клеток после ферментативного и механического разрушения16,25.

По сравнению с ранее описанными методологиями экспланта сетчатки, этот подход подчеркивает акцент на технической надежности, воспроизводимости и максимизации «удобства для пользователя» подхода для улучшения доступности26,28. В ходе личного общения с другими исследователями мы обнаружили, что технические проблемы, связанные с работой с живой сетчаткой, представляют собой серьезное препятствие для многих, кто хочет использовать экспланты, в то время как поддержание эксплантированной сетчатки в культуре было относительно простым для групп с подходящими условиями для культивирования клеток. Таким образом, этот протокол включает в себя ряд инноваций, призванных сократить кривую обучения, связанную с изоляцией сетчатки, и позволить исследователям быстрее начать сбор экспериментальных данных. Наконец, несмотря на то, что мы сделали особый акцент на потенциале этой эксплантной модели для изучения поведения глии сетчатки и охарактеризовали ее в первую очередь с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии, другие типы клеток и структуры сетчатки также в значительной степени консервативны, и эксплантированные сетчатки остаются поддающимися широкому спектру дополнительных исследовательских методов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) в Научно-исследовательском институте глаз им. Шепенса (протокол # 2022N000030, утвержден 04.03.2025). С животными обращались в соответствии с Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) об использовании животных в офтальмологии и исследованиях зрения.

Примечание: На рисунке 1 показаны ключевые этапы выделения живой сетчатки от энуклеированного мышиного глаза.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схематическое изображение ключевых этапов выделения живой сетчатки из энуклеированного мышиного глаза. Соответствующие номера ключевых шагов представлены в виде кружков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Подготовка

  1. Продезинфицируйте пипетку объемом 1 мл и пару угловых щипцов и поместите их в шкаф биобезопасности. Они будут необходимы в разделе 3 протокола.
  2. Модифицируйте передаточную дозатор, разрезав перпендикулярно ствол примерно на 2 см ниже резервуара, где отверстие наиболее широкое, чтобы укоротить пипетку и расширить отверстие. Обеспечьте чистый срез, на котором сетчатка не зацепится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот инструмент можно сохранить для повторного использования, если он чистый и промывать стерильной водой между использованиями.
  3. Асептически приготовьте 50 мл эксплантных сред в биобезопасном боксе, добавив 47,5 мл нейробазальной среды с 500 мкл добавки N-2, 1 мл добавки B-27, 500 мкл глутамакса и 500 мкл пенициллин-стрептомициновой смеси (конечная концентрация 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготавливайте свежие эксплантные среды для каждой серии изоляции; Избыток среды можно хранить при температуре 4 °C до 1 недели и при необходимости использовать для замены среды. После вскрытия заменить неиспользованную среду Нейробазал через 1 месяц. N-2 и B-27 следует хранить в замороженном виде в виде одноразовых аликвот, избегая циклов замораживания-размораживания.
  4. В шкафу биобезопасности асептически подготовьте культуральную тарелку (планшеты), добавив вставку в каждую лунку, которая будет использоваться, с помощью «зубцов», выходящих из края вкладыша, чтобы избежать соприкосновения с поверхностями, которые будут контактировать с питательной средой.
    1. Добавьте 1 мл эксплантной среды во вкладыш, а затем еще 3 мл добавьте в саму лунку. Добавьте 2-3 мл стерильной воды в все неиспользуемые лунки для контроля испарения.
    2. Перенесите планшет (планшеты) в инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2 для выравнивания примерно за 30 минут до выделения тканей.
  5. Подготовьте фильтрующие квадраты для создания субстрата для стабилизации и переноса тканей. Извлеките фильтр из набора для фильтрации на крышке бутылки, разрезав материал по периферии бритвой или скальпелем. Будьте осторожны, чтобы не получить травмы или не повредить фильтр из-за складывания или разрыва.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление прозрачного пластикового резервуара с помощью прочной бритвы для разрезания более податливого непрозрачного пластика там, где резьбовой адаптер встречается с резервуаром, упрощает процесс извлечения, но следует соблюдать дополнительную осторожность для предотвращения травм.
    1. После того как фильтр будет отсоединен путем разрезания, используйте щипцы для его извлечения. Обратите внимание на ориентацию фильтра во время и после экстракции; Матовая сторона (обращенная к резервуару) должна быть вертикальной для установки сетчатки на шаге 2.16 для переноса.
    2. Разрежьте светофильтр на небольшие квадратики примерно 7 мм × 7 мм; Для каждого экспланта сетчатки потребуется один квадрат. Предварительно замочите квадраты в стерильной воде в чашке Петри диаметром 100 мм не менее чем на 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрующие квадраты могут оставаться погруженными в стерильную воду до 1 недели перед использованием. Из-за того, что квадраты фильтра имеют тенденцию накапливать высокий уровень статического заряда перед погружением, подготавливайте только столько квадратов, сколько необходимо. Оставшийся сухой фильтрующий материал можно хранить неограниченное время в стерильной чашке Петри диаметром 100 мм для последующего использования.

2. Изоляция и монтаж

  1. Усыпьте мышь утвержденным методом перед подтверждением вторичным подходом; в этом исследовании использовалось удушение СО2 с последующим вывихом шейки матки. Заклейте оба глаза изогнутыми щипцами с тупыми кончиками и поместите их в стерильный PBS.
  2. Подготовьте рабочее пространство, заполнив чашку Петри диаметром 100 мм стерильным ПБС и поместив ее на столик бинокулярного эндоскопа.
    1. Отрежьте полоску лабораторной салфетки шириной 1 см и погрузите ее в посуду, чтобы она действовала как стабилизирующий субстрат.
    2. Перенесите один глаз в тарелку для вскрытия, другой оставьте в PBS и поместите на лед или в холодильник при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за чувствительности сетчатки к длительному посмертному интервалу, рекомендуется усыплять по одной мыши за раз.
  3. Расположите и обездвижьте глаз. С помощью щипцов переместите глаз на погруженную салфетку, которая поможет стабилизировать ситуацию.
    1. Определите подходящую точку удержания, захватите ее угловыми щипцами и аккуратно закатите глаз так, чтобы он держался сбоку или, в идеале, снизу. Убедитесь, что передняя и задняя ось (т.е. от роговицы до зрительного нерва) находится горизонтально. Такая ориентация улучшает видимость и сводит к минимуму давление на глаз во время рассечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, захватывайте внеглазничную ткань, чтобы избежать прокола или сдавливания глаза, отдавая предпочтение мышцам или конъюнктиве, а не зрительному нерву или жиру.
  4. Удерживая щипцы под углом, убедитесь, что глаз полностью погружен в воду и надежно обездвижен. Сделайте разрез кончиком скальпеля #11 параллельно и примерно на 0,5 мм позади лимба, где роговица переходит в склеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот разрез должен быть достаточно большим, чтобы поместиться на кончике одного лезвия пружинных ножниц. Поскольку острота кончика скальпеля имеет важное значение для чистого прокалывания глазного яблока, меняйте лезвие после каждых двух сетчаток.
    1. Вставьте одно лезвие пружинных ножниц внутрь шара и начните резать по кругу вокруг глаза, осторожно перемещая глаз по мере необходимости с помощью щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот разрез должен быть как можно более прямым и параллельным лимбусу; Для изменения положения глаза может потребоваться отложить ножницы и использовать по одной паре щипцов каждой рукой. После обнажения держите сетчатку погруженной в воду на протяжении всего диссекции.
  5. После того, как разрез очертил глаз, осторожно удалите передний сегмент и хрусталик, затем поверните наглазник лицевой стороной вверх, чтобы облегчить визуальный осмотр и удаление стекловидного тела. Если удлиненный кусочек зрительного нерва остается прикрепленным, обрежьте его до более короткой (1-2 мм) длины, чтобы облегчить это.
  6. Осмотрите сетчатку на предмет видимых повреждений и витреальную камеру на наличие мусора, такого как пигментные клетки из РПЭ или сосудистой оболочки, которые могли попасть во время удаления переднего сегмента. Используйте угловые щипцы для обездвиживания наглазника в таком положении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов необходимо удалить мусор в камере стекловидного тела, а также свести к минимуму остаточные остатки стекловидного тела и адгезивные остатки цилиарного тела на периферии сетчатки. Это может быть сложным процессом, и дополнительные примечания можно найти в разделах «Распознавание и устранение механических повреждений» и «Метаболические повреждения» Репрезентативных результатов.
    1. Используйте модифицированную передаточную пипетку для промывки стекловидного тела PBS с помощью PBS для удаления мелких частиц, избегая образования пузырьков воздуха, удерживая наконечник пипетки ниже поверхности жидкости и поддерживая достаточное количество PBS в баллоне резервуара.
    2. Удалите более крупный мусор тонкой акварельной кистью, сводя к минимуму контакт с поверхностью сетчатки. При необходимости удалите более стойкий мусор с помощью щипцов с тонким наконечником; Однако избегайте прямого контакта металлических наконечников инструментов с сетчаткой глаза, чтобы предотвратить повреждение.
  7. После удаления видимого мусора повторно (3-5 раз) промойте стекловидную камеру PBS из передаточной пипетки, как описано выше. Это удалит слабо прилипшее стекловидное тело, которое может остаться после удаления мусора. Используйте тонкую щетку, чтобы аккуратно прощупать камеру, особенно вблизи периферии, если элементы цилиарного тела остались. В то время как стекловидное тело оптически прозрачно, оно будет действовать как тормоз на волокнах щетки и может быть обнаружено таким образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тонкий остаточный слой стекловидного тела на сетчатке, по-видимому, не оказывает негативного влияния на изоляцию или сохранение сетчатки ex vivo, но присутствие значительных количеств на периферии сетчатки, часто связанное с остаточными структурами цилиарного тела, может вызвать складчатость сетчатки и потерю образца, если его не удалить.
    1. Если остаются значительные карманы стекловидного тела, используйте щетку, чтобы удалить их, осторожно проводя наружу по направлению к периферии, следя за тем, чтобы если волокна щетки соприкасаются с сетчаткой, они делали это под небольшим углом и следовали за щеткой, вытягивая, а не выталкивая стекловидное тело из камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление стекловидного тела требует особенно осторожного обращения, чтобы избежать повреждения сетчатки, которое может быть не видно макроскопически; Рекомендации по распознаванию и предотвращению этого повреждения можно найти в разделах «Распознавание и устранение механической травмы» и «Метаболическое повреждение» Репрезентативных результатов.
  8. После того, как камера стекловидного тела будет очищена от мусора и останется лишь минимальное количество стекловидного тела, аккуратно отделите внешнюю сетчатку от наглазника, продолжая стабилизировать образец с помощью угловых щипцов. Избегайте повреждения диска зрительного нерва и оставьте эту структуру нетронутой, чтобы закрепить сетчатку.
    1. Возьмите пару щипцов, держа их в закрытом положении, соприкасаясь кончиками, и осторожно вставьте их между сетчаткой и сосудистой оболочкой, по возможности используя уже существующий зазор от предыдущего обращения. Используйте плоские плечи щипцов, а не кончики, чтобы увеличить карман между сетчаткой и сосудистой оболочкой до тех пор, пока эти структуры не будут полностью разделены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Делайте упор на боковые движения, а не на кончики, чтобы расширить промежуток между сетчаткой и сосудистой оболочкой. Осторожное скручивание щипцов во время этих движений может улучшить разделение и снизить явное напряжение от трения между щипцами и тканью.
  9. Отделив наружную сетчатку от сосудистой оболочки, продолжайте стабилизировать образец, одновременно с помощью второй пары щипцов оттягивайте наглазник - склеру, сосудистую оболочку и т.д. - вниз. Если сетчатка была успешно отделена, она должна оставаться на месте, привязанная к диску зрительного нерва, в то время как наглазник может удерживаться одной парой щипцов. Если сетчатка прижимается наглазником, продолжайте осторожно зондировать и разделять точки соединения, отличные от диска зрительного нерва.
  10. Когда сетчатка закреплена на диске зрительного нерва, продолжайте иммобилизовать ткань и с помощью второй пары щипцов сгруппируйте наглазник ниже головки зрительного нерва.
    1. Убедитесь, что ни одна из периферий сетчатки не застряла в сложенном положении из-за избытка стекловидного тела в углу между сетчаткой и любым остаточным цилиарным телом. При необходимости промойте камеру PBS с помощью трансферной пипетки, чтобы удалить дополнительный мусор, и аккуратно используйте щетку, чтобы развернуть ткань и удалить излишки стекловидного тела, стараясь при этом не натягивать ткань слишком сильно.
  11. Обнажив сетчатку с обеих сторон, с помощью пружинных ножниц сделайте серию разрезов, расположенных на расстоянии примерно 90° друг от друга, проходящих по прямой линии от периферии к корешку зрительного нерва, останавливаясь примерно в 1 мм от центра. Это сводит к минимуму транссекцию аксонов ганглиозных клеток сетчатки в сетчатке, улучшая качество культивируемых эксплантов.
  12. Удерживая погруженную ткань на месте, осторожно снимите лабораторную салфетку с помощью щипцов, чтобы оттянуть ее от ткани сбоку, прежде чем вынуть ее из чашки. Избегайте контакта с сетчаткой, чтобы предотвратить адгезию к салфетке и возможную потерю образца.
  13. Затем продолжайте удерживать ткань и с помощью пружинных ножниц перережьте зрительный нерв прямо под сетчаткой, затем извлеките оставшуюся часть наглазника из чашки.
  14. После того, как сетчатка будет изолирована от остальной части глаза, заполните чашку Петри диаметром 35 мм PBS и с помощью щипцов поместите фильтрующий квадрат на дно более грубой матовой стороной вверх. Следите за тем, чтобы фильтр не сминался, так как это может помешать использованию фильтра в качестве подложки для перемещения сетчатки.
  15. Аккуратно аспирируйте сетчатку с помощью передаточной пипетки и осторожно перенесите ее в чашку диаметром 35 мм. Перемещайте сетчатку щеткой, чтобы убедиться, что внутренняя поверхность сетчатки находится вертикально, а ткань лежит прямо над квадратом фильтра.
  16. Медленно отсасывайте PBS из чашки с помощью передаточной пипетки, чтобы опустить сетчатку на фильтр. При необходимости сделайте паузу, чтобы скорректировать ткань, прежде чем продолжать, пока сетчатка не приложится к фильтру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Быстрая аспирация может привести к резкому боковому движению сетчатки, что приведет к повреждению или потере тканей. Во избежание повреждения сетчатка должна полностью лежать на квадрате; однако, если сетчатка оседает в проблемном положении, PBS можно добавить обратно в чашку до тех пор, пока сетчатка не будет восстановлена, и можно будет повторить попытку монтажа.
  17. Как только сетчатка остановится на фильтре, используйте щетку, чтобы развернуть всю периферическую сетчатку, которая могла сложиться. Тщательно сбалансируйте уровень PBS, чтобы сетчатка не могла легко отойти от фильтра, и при этом убедитесь, что его достаточно, чтобы образец не высыхал, а щетка могла двигаться плавно, не повреждая внутреннюю сетчатку.
  18. Еще раз осмотрите сетчатку глаза на предмет мусора. Чтобы избежать повреждения, очистите сетчатку без непосредственного обращения с помощью передаточной пипетки, чтобы капнуть PBS на сетчатку примерно на 1 см выше ткани. Это должно смыть оставшийся мусор, но если в тарелку добавить слишком много PBS, сетчатка может всплыть обратно. Если это произошло, проведите повторную аспирацию для повторного монтажа ткани.
    Примечание: «Фиктивные» образцы могут быть получены путем переноса сетчатки на 24-луночный планшет для фиксации, блокирования/пермеабилизации и окрашивания антителами, как описано в другом месте21. Эти фиктивные элементы управления полезны для устранения механических повреждений сетчатки, которые могут возникнуть во время изоляции.

3. Перенос на питательные среды и содержание

  1. Закройте крышку чашки диаметром 35 мм для транспортировки в шкаф биобезопасности, держа чашку ровно, чтобы не выбить сетчатку из фильтра. В этом случае выполните повторное крепление, как указано выше.
  2. Поместите закрытую 35-миллиметровую чашку с сетчаткой глаза в шкаф для биологической безопасности, стараясь не прикасаться к оборудованию или поверхностям внутри шкафа, прежде чем дезинфицировать или менять перчатки.
  3. Обеззаражьте перчатки этанолом и/или замените их, затем переместите 6-луночный планшет, предварительно загруженный средой для эксплантатов, из инкубатора в шкаф для биобезопасности. Выполните шаги 3.4 и 3.5 в шкафу биобезопасности, используя инструменты, помещенные туда на шаге 1.1.
  4. Снимите крышку 35-миллиметровой чашки, в которой находится сетчатка, и с помощью наклонных щипцов осторожно приподняйте квадрат фильтра, не касаясь сетчатки напрямую. Снимите крышку 6-луночной пластины и расположите фильтр над центром вставки соответствующего луночного колодца, затем медленно опустите его в фильтрующий материал. На этом этапе сетчатка отсоединится от фильтра и будет плавать чуть ниже границы раздела воздух-жидкость.
  5. После того, как сетчатка и фильтр разделятся, медленно отодвиньте фильтр от сетчатки и удалите его из среды. С помощью пипетки объемом 1 мл удалите 500 мкл среды из вкладыша, чтобы убедиться, что сетчатка лежит ровно, удерживая ее между дном вкладыша и воздушно-жидкостным интерфейсом.
  6. Установите на место крышку планшета и верните его в инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2, следя за тем, чтобы сетчатка находилась ближе к центру лунки. В одной пластине может храниться до 6 сетчаток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При хранении эксплантов в течение 24 часов или меньше, их можно оставить в инкубаторе до окончания эксперимента. При более длительном хранении рекомендуется 50% изменений среды через 1 день in vitro и через последующие дни.

4. Фиксация для иммуноокрашивания (опционально)

  1. При выполнении иммуноокрашивания обратитесь к следующим шагам для фиксации: В то время как иммуноокрашивание может быть выполнено с использованием параметров, ранее описанных для плоской сетчатки21, фиксация эксплантированной сетчатки требует особых соображений.
  2. Удалите вставки для клеточных культур с эксплантами и средами с 6-луночного планшета и поместите их на непористую поверхность (например, на пластиковую крышку культурального планшета), которую можно правильно утилизировать после фиксации, так как вставки имеют небольшую пористость, и небольшое количество фиксатора будет проходить через эту подстилающую поверхность.
  3. Аккуратно удалите питательные среды из вкладышей, затем добавьте в каждую по 1 мл 4% параформальдегида (PFA). Дайте сетчатке застыть в течение 15 минут в вытяжном шкафу, затем удалите PFA и утилизируйте его в соответствии с политикой учреждения.
    ВНИМАНИЕ: Параформальдегид опасен и является предшественником формальдегида, известного канцерогена. Соблюдайте осторожность и выполняйте фиксацию в вытяжном шкафу с соответствующими мерами предосторожности.
  4. Промойте сетчатку 3 раза (по 5 мин каждый) PBS для удаления PFA, затем используйте модифицированную передаточную пипетку для переноса сетчатки в PBS в отдельные лунки в 24-луночном планшете для блокирования, пермеабилизации и иммуноокрашивания, как описано в другом месте21. Утилизируйте пластик, загрязненный PFA (наконечники пипеток, вкладыши и непористую поверхность, используемую во время фиксации) в соответствии с политикой учреждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Передаточную пипетку можно держать для переноса неподвижной и окрашенной сетчатки на предметное стекло для монтажа и визуализации. Несмотря на то, что он не должен был иметь прямого контакта с PFA, рекомендуется использовать различные трансферные пипетки для работы с живыми и неподвижными тканями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В макроскопическом масштабе эксплантированная сетчатка остается практически неизменной как в 1-, так и в 3-дневный моменты, хотя к последнему времени они становятся относительно хрупкими, что требует осторожного обращения перед фиксацией или другими экспериментальными конечными точками. Сетчатка должна быть относительно плоской, без сворачивания (что может привести к локальному нарушению диффузии кислорода и питательных веществ) и должна быть подвешена в среде между воздушно-жидкостным интерфейсом и вставкой для клеточно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Подходы к органотипическим культурам32 , такие как экспланты сетчатки, используют экспериментальную гибкость и быстрое время обработки клеточной культуры, сохраняя при этом большую часть контекста in situ исследований in vivo , что делает их мощным средством для изучения сложных взаимодействий между типами клеток. Мы представляем этот протокол в качестве отправной точки для исследователей, которые могут иметь значительный опыт работы с глазом и ч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

M.A.M. был поддержан NIH/NEI R01EY035312, Фондом исследований глаукомы Catalyst for a Cure Award, Фондом Мелзы М. и Фрэнка Теодора Барра, Фондом Роберта М. Сински, доктора медицины, Благотворительным фондом семьи Руттгерс и Фондом Б.Л. Мангера. P.F.C. был поддержан NIH/NEI 2T32EY007145. Эта работа также стала возможной благодаря гранту NIH Core Grant for Vision Research P30 EY003176.  Рисунок 1 был сгенерирован с помощью Biorender. Авторы хотели бы поблагодарить доктора Насира Уддина за отзыв о рукописи и доктора Цюронг Чжу за помощь и поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#11 Лезвия скальпеляBard-Parker3,71,311
1 мл пипета ("Pipetman P1000')GilsonF144059M
100 мм чашка ПетриFalcon351029
16% параформальдегидаTed Pella Inc18,505Разбавленный до 4% для фиксации
24 Луночная пластинаFalcon353047Для фиксации, блокировки и инкубация антител
35 мм чашкаПетри Falcon351008
6-луночный планшет и набор вкладышейGreiner bio-one657641
Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-545-1521:800 разведение
Alexa Fluor 594 Donkey anti-Rat IgG (H+L) ВысокоадсорбированныйинвитрогенA-212091:800 разведение
Alexa Fluor 594-F(ab')2 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Джексон Иммуноисследовательские лаборатории, Инк. 715-586-1501:800 разведение
Alexa Fluor 647-Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 706-605-1481:800 разведение
Alexa Fluor 647-F(ab')2 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) Джексон Иммуноисследовательские лаборатории, Инк. 703-606-155Разведение 1:800
Угловые щипцы ('5/45')FST / Dumont11251-35
Антитело Anti-Brn3a (мышь)ChemiconMAB15851:200 разведение
Антитело Anti-CD206 (крыса)BioradMCA2235разведение 1:200
Антитело Anti-GFAP (курица)Abcamab46741:1000 разведение
Anti-Iba1 антитело (кролик)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation019-197411:500 разведение
Anti-Tmem119 антитело (морская свинка)Synaptic Systems400 0041:500 разведение
B-27, 50xGibco (Thermofisher)17504044
Тупые изогнутые щипцы ('Extra Fine Graefe)FST11152-10
Бычья сыворотка АльбуминSigma-AldrichA9647Используйте 1% w/v для блокировки и инкубации антител
Комплект фильтров (0,2 &; мембрана m aPES, бутылочный фильтр объемом 150 мл) FisherScientificFB12566508
Fine Brush, размер 3/0Princeton Art & Brush Co.06435-1030
GlutaMaxGibco (Thermofisher)35050061
Лабораторные салфетки (салфетки Кима) KIMTECH34155
N-2, 100xGibco (Thermofisher)17502048
Нейробазал-А Среда, минус фенол красныйGibco (Thermofisher)12349015
Нормальная ослиная сывороткаJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 017-000-121Использовать в концентрации 10% для блокирования и инкубации антител
Пенициллин-стрептомицинGibco (Thermofisher)15140122
Pipet Tips, 1000 &; LTipOne1126-7810
Весенние ножницы ('Cohan-Vannas')FST15000-11
Стерильная вода ('Dnase, Rnase free')Invitrogen10977-015
Стерильно-фильтрованный PBSGibco10010-023
Прямые щипцы ('mini')FST / Dumont11200-14
Transfer Pipet, 5,8 млfisherscientific13-711-9AMMD
Triton X-100Thermo Scientific ChemicalsA16046. APИспользование в концентрации 0,5% для блокирования и инкубации антител

Ссылки

  1. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).
  2. Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M. All roads lead to glaucoma: induced retinal injury cascades contribute to a common neurodegenerative outcome. Exp Eye Res. 183, 88-97 (2019).
  3. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  4. Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644 (2022).
  5. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  6. Livne-Bar, I., et al. Astrocyte-derived lipoxins A4 and B4 promote neuroprotection from acute and chronic injury. J Clin Invest. 127 (12), 4403-4414 (2017).
  7. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
  8. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  9. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiol Rev. 98 (1), 239-389 (2018).
  10. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
  11. Tezel, G. Molecular regulation of neuroinflammation in glaucoma: current knowledge and the ongoing search for new treatment targets. Prog Retin Eye Res. 87, 100998(2022).
  12. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  13. Schlamp, C. L., Li, Y., Dietz, J. A., Janssen, K. T., Nickells, R. W. Progressive ganglion cell loss and optic nerve degeneration in DBA/2J mice is variable and asymmetric. BMC Neurosci. 7, 66(2006).
  14. Paschalis, E. I., et al. Permanent neuroglial remodeling of the retina following infiltration of CSF1R inhibition-resistant peripheral monocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (48), E11359-E11368 (2018).
  15. Rutigliani, C., et al. Widespread retina and optic nerve neuroinflammation in enucleated eyes from glaucoma patients. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 118(2022).
  16. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  17. Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).
  18. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Front Cell Neurosci. 12, 242(2018).
  19. Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nat Commun. 11 (1), 1220(2020).
  20. Cullen, P. F., Sun, D. Astrocytes of the eye and optic nerve: heterogeneous populations with unique functions mediate axonal resilience and vulnerability to glaucoma. Front Ophthalmol (Lausanne). 3, 1217137(2023).
  21. Cullen, P. F., Gammerdinger, W. J., Ho Sui, S. J., Mazumder, A. G., Sun, D. Transcriptional profiling of retinal astrocytes identifies a specific marker and points to functional specialization. Glia. 72 (9), 1604-1628 (2024).
  22. Cullen, P. F., Mazumder, A. G., Sun, D., Flanagan, J. G. Rapid isolation of intact retinal astrocytes: a novel approach. Acta Neuropathol Commun. 11 (1), 154(2023).
  23. Li, F., Jiang, D., Samuel, M. A. Microglia in the developing retina. Neural Dev. 14 (1), 12(2019).
  24. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  25. Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (1), 149-170 (2017).
  26. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  27. Tao, C., Zhang, X. Retinal proteoglycans act as cellular receptors for basement membrane assembly to control astrocyte migration and angiogenesis. Cell Rep. 17 (7), 1832-1842 (2016).
  28. Schaeffer, J., Delpech, C., Albert, F., Belin, S., Nawabi, H. Adult mouse retina explants: from ex vivo to in vivo model of central nervous system injuries. Front Mol Neurosci. 13, 599948(2020).
  29. Vagaja, N. N., et al. Changes in murine hyalocytes are valuable early indicators of ocular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1445-1451 (2012).
  30. Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  31. Rodrigues, E. B., et al. The use of vital dyes in ocular surgery. Surv Ophthalmol. 54 (5), 576-617 (2009).
  32. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  33. Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
  34. Kinuthia, U. M., Wolf, A., Langmann, T. Microglia and inflammatory responses in diabetic retinopathy. Front Immunol. 11, 564077(2020).
  35. Reboussin, E., et al. Evaluation of neuroprotective and immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells in an ex vivo retinal explant model. J Neuroinflammation. 19 (1), 63(2022).
  36. Do, M. T. H. Melanopsin and the intrinsically photosensitive retinal ganglion cells: biophysics to behavior. Neuron. 104 (2), 205-226 (2019).
  37. Yu, A., et al. Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration. iScience. 28 (4), 112201(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ex vivoGFAP
Эксплантная модель ex vivo для изучения глиальных взаимодействий в сетчатке мыши
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.