Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
* These authors contributed equally
Многоэлектродные матрицы высокой плотности (HD-MEA) используются для изучения спонтанных волн сетчатки, которые играют решающую роль в развитии нейронных цепей. В этом протоколе изложены этапы подготовки ткани сетчатки мыши и выполнения электрофизиологических записей с использованием HD-MEA на электрофизиологической платформе.
Спонтанные волны сетчатки являются отличительной чертой активности сетчатки во время развития, играя решающую роль в формировании зрительной системы, влияя на уточнение аксонов, проницаемость сосудистой сети и общее созревание нейронных цепей. Эти волны обычно изучаются в препаратах сетчатки ex vivo с использованием многоэлектродных матриц (MEA), которые позволяют проводить электрофизиологическую регистрацию больших популяций активности ганглиозных клеток сетчатки (RGC). Электрофизиология на основе MEA стала мощным инструментом благодаря простоте использования для быстрого сбора данных с высокой пропускной способностью, что делает ее идеально подходящей для изучения активности сетчатки в различных экспериментальных условиях.
В этом протоколе мы описываем важнейшие этапы подготовки ткани сетчатки к получению электрофизиологических данных с помощью МЭА ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ (HD-MEA) на электрофизиологической платформе. Процесс начинается с тщательной изоляции интактной сетчатки от неонатальных животных в физиологических условиях. После подготовки сетчатка тщательно устанавливается на чип HD-MEA, который состоит из сетки из 26 400 электродов, способных выполнять одновременную внеклеточную запись не менее чем с 1000 RGC. Запись может длиться до нескольких часов. В конечном счете, этот методологический подход предлагает ценные приложения для изучения развития сетчатки, заболеваний и потенциально межвидовых сравнительных исследований, способствуя более широкому прогрессу в нейробиологии и исследованиях зрения.
Спонтанные волны сетчатки представляют собой периодические всплески коррелированной активности, наблюдаемые в развивающейся сетчатке перед началом зрения. У мышей цепи, которые инициируют и распространяют волны сетчатки, быстро изменяются во время развития, начиная эмбрионально и заканчивая открытием глаз (14-й день после рождения)1. По мере развития цепей сетчатки пространственно-временные свойства зубцов сетчатки резко изменяются 2,3. Несколько исследований подтверждают, что эти специфические пространственно-временные свойства управляют развитием зрит....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В этом протоколе изложены шаги по выделению и препарированию ткани сетчатки у неонатальных мышей для записи волн сетчатки на МЭА с использованием платформы Maxwell Biosystems HD-MEA. Процедура предназначена для сохранения физиологических условий, гарантируя, что ткань сетчатки остается структурно неповрежденной, свободной от повреждений и должным образом подготовленной к оптимальному контакту с электродами. Эти эксперименты были одобрены Программой Вандербильта по уходу за животными и их использованию под номером протокола M2200056-00. Мыши (в возрасте 1-2 недель, оба пола) были размещены в виварии с 12-часовым циклом дня и ночи и пит....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Высокопроизводительная запись и анализ зубцов сетчатки с помощью HD-MEA
Мы провели часовую запись спонтанных волн сетчатки в формате HD-MEA (рис. 2). Растровый график нейронной активности показывает структурированную картину волн сетчатки, где каждая точка представляет собой обнаруженный потенциал действия отдельного электрода (рис. 2A, внизу). Суммирование активности по электродам приводит к получению одной кривой, что облег.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Описанный здесь протокол представляет собой воспроизводимый и высокопроизводительный метод подготовки ткани сетчатки и выполнения записей HD-MEA, предлагая надежный метод изучения активности сетчатки сетчатки. Технология HD-MEA имеет значительные преимущества по сравнению с традиционными электрофизиологическими методами и методами визуализации, особенно при захвате данных с высокой пропускной способностью. HD-MEA обеспечивает запись спонтанной динамики волн сетчатки в режиме реального вр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
При поддержке грантов NIH R00EY030909 A.T.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Одноразовая переводная пипетка объемом 3 мл (с отрезанным концом) | Fisherbarnd | 13-711-9CM | Помогает при перемещении сетчатки между чашками Петри. |
| Искусственная спинномозговая жидкость (КСФ) | Поддерживает физиологическое состояние тканей сетчатки; состоит из NaCl, KCl,<суб>2PO<суб>4, NaHCO<суб>3, CaCl<суб>2, MgCl<суб>2, глюкозы и пузырчатого карбогена. | ||
| CaCl2 | Fisher Chemicals | C79-500 | Для приготовления искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) |
| Подача карбогена (95% O2, 5% CO2)Используется | для насыщения кислородом aCSF и поддержания жизнеспособности тканей. | ||
| Скальпель с изогнутым лезвием (#10) | Integra | 4-110 | Используется для точной резки тканей. |
| Диссекционный микроскоп (стереоскоп) | Zeiss | Stemi 508 | Незаменим для визуализации и работы с тканями сетчатки. |
| глюкоза | Fisher Chemicals | BP350-1 | Для приготовления искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) |
| Линейный нагреватель | Многоканальная система | TC02 | Подогревает aCSF до 32-34°° C для оптимальных условий. |
| Перфузионная система Ismatec | Ismatec | ISM4208 | Поддерживает непрерывный поток оксигенированного кислотномозгового СМЖ. |
| KCl | Fisher Chemicals | P271-500 | Для приготовления искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5504-100g | Для приготовления искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) |
| Записывающее устройство | MaxOne Maxwell Biosystems | MX1-BRD | Интерфейс между чипом MaxOne и системой |
| MaxOne System | Maxwell Biosystems | Система MX1-SYS | Core для электрофизиологических рекодировок на основе MEA. |
| Держатель салфеток MaxOne с 3-осевым микроманипулятором и сменными вставками | Maxwell Biosystems | MX1-HLD | Обеспечивает точное размещение сетчатки на чипе MEA. |
| Чип MEA (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems) | Maxwell Biosystems | MX1-S-CHP | Микроэлектродная матрица высокой плотности для регистрации нейронной активности. |
| MgCl2 | Fisher Chemicals | M33-500 | Для приготовления искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) |
| NaCl | Fisher Chemicals | S271-1 | Для приготовления искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | Для приготовления искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) |
| Игла (30 G x ½) | BD Biosciences | 305106 | Помогает делать разрезы на роговице. |
| Неонатальные животные (P1-P14; мыши)Модельные | организмы, такие как мыши, крысы или другие, используемые для исследований сетчатки. | ||
| ПК с программным обеспечением MaxLab Live Scope | HP | Z4 | Используется для сбора данных и анализа записей. |
| Чашка Петри (35 мм или 60 мм) | Pyrex | 3483E12 | Используется в качестве рабочего места для вскрытия. |
| Щипцы Roboz micro Adson (RS-5232, длина 4,75 дюйма, 1 x 2 зуба, наконечник 0,5 мм) | Специализированные | Roboz RS-5232 | для тонкой диссекции. |
| Пружинные ножницы Roboz (RS-5671, режущая кромка 10 мм, ширина наконечника 0,15 мм, 3¾ " габаритная длина) | Roboz | RS-5671 | Прецизионные ножницы для резки деликатных тканей. |
| Кисть | Маленькая кисть, модифицированная под один волос для работы с нежными тканями. | ||
| Два щипца с тонким наконечником | Roboz | RS-5060 | Используются для работы с деликатными тканями. |
| Ватман фильтровальная бумага (#1), нарезанная на мелкие кусочки | GE Healthcare | 1001-042 | Используется для обработки и сушки тканей сетчатки. |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно