Запись волн сетчатки с помощью многоэлектродной матрицы высокой плотности с использованием электрофизиологической платформы

Summary

Многоэлектродные матрицы высокой плотности (HD-MEA) используются для изучения спонтанных волн сетчатки, которые играют решающую роль в развитии нейронных цепей. В этом протоколе изложены этапы подготовки ткани сетчатки мыши и выполнения электрофизиологических записей с использованием HD-MEA на электрофизиологической платформе.

Abstract

Спонтанные волны сетчатки являются отличительной чертой активности сетчатки во время развития, играя решающую роль в формировании зрительной системы, влияя на уточнение аксонов, проницаемость сосудистой сети и общее созревание нейронных цепей. Эти волны обычно изучаются в препаратах сетчатки ex vivo с использованием многоэлектродных матриц (MEA), которые позволяют проводить электрофизиологическую регистрацию больших популяций активности ганглиозных клеток сетчатки (RGC). Электрофизиология на основе MEA стала мощным инструментом благодаря простоте использования для быстрого сбора данных с высокой пропускной способностью, что делает ее идеально подходящей для изучения активности сетчатки в различных экспериментальных условиях.

В этом протоколе мы описываем важнейшие этапы подготовки ткани сетчатки к получению электрофизиологических данных с помощью МЭА ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ (HD-MEA) на электрофизиологической платформе. Процесс начинается с тщательной изоляции интактной сетчатки от неонатальных животных в физиологических условиях. После подготовки сетчатка тщательно устанавливается на чип HD-MEA, который состоит из сетки из 26 400 электродов, способных выполнять одновременную внеклеточную запись не менее чем с 1000 RGC. Запись может длиться до нескольких часов. В конечном счете, этот методологический подход предлагает ценные приложения для изучения развития сетчатки, заболеваний и потенциально межвидовых сравнительных исследований, способствуя более широкому прогрессу в нейробиологии и исследованиях зрения.

Introduction

Спонтанные волны сетчатки представляют собой периодические всплески коррелированной активности, наблюдаемые в развивающейся сетчатке перед началом зрения. У мышей цепи, которые инициируют и распространяют волны сетчатки, быстро изменяются во время развития, начиная эмбрионально и заканчивая открытием глаз (14-й день после рождения)¹. По мере развития цепей сетчатки пространственно-временные свойства зубцов сетчатки резко изменяются ^2,3. Несколько исследований подтверждают, что эти специфические пространственно-временные свойства управляют развитием зрит....

Protocol

В этом протоколе изложены шаги по выделению и препарированию ткани сетчатки у неонатальных мышей для записи волн сетчатки на МЭА с использованием платформы Maxwell Biosystems HD-MEA. Процедура предназначена для сохранения физиологических условий, гарантируя, что ткань сетчатки остается структурно неповрежденной, свободной от повреждений и должным образом подготовленной к оптимальному контакту с электродами. Эти эксперименты были одобрены Программой Вандербильта по уходу за животными и их использованию под номером протокола M2200056-00. Мыши (в возрасте 1-2 недель, оба пола) были размещены в виварии с 12-часовым циклом дня и ночи и пит....

Results

Высокопроизводительная запись и анализ зубцов сетчатки с помощью HD-MEA
Мы провели часовую запись спонтанных волн сетчатки в формате HD-MEA (рис. 2). Растровый график нейронной активности показывает структурированную картину волн сетчатки, где каждая точка представляет собой обнаруженный потенциал действия отдельного электрода (рис. 2A, внизу). Суммирование активности по электродам приводит к получению одной кривой, что облег.......

Discussion

Описанный здесь протокол представляет собой воспроизводимый и высокопроизводительный метод подготовки ткани сетчатки и выполнения записей HD-MEA, предлагая надежный метод изучения активности сетчатки сетчатки. Технология HD-MEA имеет значительные преимущества по сравнению с традиционными электрофизиологическими методами и методами визуализации, особенно при захвате данных с высокой пропускной способностью. HD-MEA обеспечивает запись спонтанной динамики волн сетчатки в режиме реального вр.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Одноразовая переводная пипетка объемом 3 мл (с отрезанным концом)	Fisherbarnd	13-711-9CM	Помогает при перемещении сетчатки между чашками Петри.
Искусственная спинномозговая жидкость (КСФ)	Поддерживает физиологическое состояние тканей сетчатки; состоит из NaCl, KCl,<суб>2PO<суб>4, NaHCO<суб>3, CaCl<суб>2, MgCl<суб>2, глюкозы и пузырчатого карбогена.
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	Для приготовления искусственной спинномозговой жидкости (aCSF)
Подача карбогена (95% O2, 5% CO2)Используется			для насыщения кислородом aCSF и поддержания жизнеспособности тканей.
Скальпель с изогнутым лезвием (#10)	Integra	4-110	Используется для точной резки тканей.
Диссекционный микроскоп (стереоскоп)	Zeiss	Stemi 508	Незаменим для визуализации и работы с тканями сетчатки.
глюкоза	Fisher Chemicals	BP350-1	Для приготовления искусственной спинномозговой жидкости (aCSF)
Линейный нагреватель	Многоканальная система	TC02	Подогревает aCSF до 32-34°° C для оптимальных условий.
Перфузионная система Ismatec	Ismatec	ISM4208	Поддерживает непрерывный поток оксигенированного кислотномозгового СМЖ.
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	Для приготовления искусственной спинномозговой жидкости (aCSF)
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5504-100g	Для приготовления искусственной спинномозговой жидкости (aCSF)
Записывающее устройство	MaxOne Maxwell Biosystems	MX1-BRD	Интерфейс между чипом MaxOne и системой
MaxOne System	Maxwell Biosystems	Система MX1-SYS	Core для электрофизиологических рекодировок на основе MEA.
Держатель салфеток MaxOne с 3-осевым микроманипулятором и сменными вставками	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	Обеспечивает точное размещение сетчатки на чипе MEA.
Чип MEA (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)	Maxwell Biosystems	MX1-S-CHP	Микроэлектродная матрица высокой плотности для регистрации нейронной активности.
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	Для приготовления искусственной спинномозговой жидкости (aCSF)
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	Для приготовления искусственной спинномозговой жидкости (aCSF)
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500	Для приготовления искусственной спинномозговой жидкости (aCSF)
Игла (30 G x ½)	BD Biosciences	305106	Помогает делать разрезы на роговице.
Неонатальные животные (P1-P14; мыши)Модельные			организмы, такие как мыши, крысы или другие, используемые для исследований сетчатки.
ПК с программным обеспечением MaxLab Live Scope	HP	Z4	Используется для сбора данных и анализа записей.
Чашка Петри (35 мм или 60 мм)	Pyrex	3483E12	Используется в качестве рабочего места для вскрытия.
Щипцы Roboz micro Adson (RS-5232, длина 4,75 дюйма, 1 x 2 зуба, наконечник 0,5 мм)	Специализированные	Roboz RS-5232	для тонкой диссекции.
Пружинные ножницы Roboz (RS-5671, режущая кромка 10 мм, ширина наконечника 0,15 мм, 3¾ " габаритная длина)	Roboz	RS-5671	Прецизионные ножницы для резки деликатных тканей.
Кисть			Маленькая кисть, модифицированная под один волос для работы с нежными тканями.
Два щипца с тонким наконечником	Roboz	RS-5060	Используются для работы с деликатными тканями.
Ватман фильтровальная бумага (#1), нарезанная на мелкие кусочки	GE Healthcare	1001-042	Используется для обработки и сушки тканей сетчатки.