Высокопроизводительная трехмерная модель ткани для количественной оценки пороговых значений электропорации

Summary

Этот протокол использует вычислительное моделирование для количественной оценки обратимых и необратимых порогов электропорации с использованием пространственного распределения трансфицированных клеток в трехмерной имитации ткани для высокопроизводительного анализа протоколов электропорации.

Abstract

Электропорация — это многообещающая технология, использующая электрические импульсы для доставки макромолекул и абляции мягких тканей, которая включает в себя профилактику нового поколения и лечение генетических заболеваний, таких как рак. В этом исследовании демонстрируется высокопроизводительная 3D-модель тканевой культуры для количественной оценки обратимых и необратимых порогов электропорации для данного протокола электропорации. Используя неоднородное электрическое поле и анализируя пространственное распределение трансфицированных клеток, можно идентифицировать как обратимые, так и необратимые пороги в пределах одного образца, что повышает эффективность характеристики протоколов электропорации, особенно для трансляции in vivo . Чтобы продемонстрировать эту способность, 3D-имитацию ткани, содержащую клетки HEK293, трансфицировали с помощью кольца и штифтового электрода для доставки плазмиды, кодирующей GFP. Затем на основе флуоресцентных микроскопических изображений трансфицированных образцов были получены пороги электропорации. Эта модель демонстрирует потенциал использования в качестве средства для оценки протоколов электропорации с высокой пропускной способностью, что является ключевым преимуществом по сравнению с существующими методами оценки этих пороговых значений, которые, как правило, требуют много времени и менее репрезентативны для условий in vivo .

Introduction

Обратимая электропорация (РЭ) является хорошо зарекомендовавшей себя методологией доставки различных обычно непроницаемых для мембран соединений и молекул в клетки ^1,2,3. Здесь импульсные электрические поля (ПСВ) используются для достижения критической напряженности электрического поля, которое индуцирует переходные, локализованные нанопоры вдоль участков клеточной мембраны. РЖ используется для доставки различных молекул и соединений, начиная от красителей и нуклеиновых кислот и заканчивая химиотерапевтическими препаратами и другими лекарственными препаратами 4,5,6,7,8,9,10. Однако, если интенсивность электрического поля достаточно увеличена, оно может достичь более высокого критического порога, что приводит к быстрому снижению жизнеспособности клеток 1,2,11,12. Этот процесс известен как необратимая электропорация (IRE) и изучался для абляции мягких тканей, в том числе в качестве лечения неоперабельных опухолей и сердечных аритмий 11,12,13,14,15,16. Чтобы понять результаты лечения и информировать о будущих методах лечения, количественная оценка этих пороговых значений RE и IRE является обычной практикой в исследованиях электропорации 12,17,18,19,20. Тем не менее, пороговые значения RE и IRE варьируются в зависимости от многих факторов, включая тип ячейки, приложенное напряжение, длительность импульса, количество импульсов и скорость доставки импульсов 1,17,18,21,22.

Протоколы электропорации имеют ряд параметров, которые приводят к различным пороговым значениям RE и IRE 1,17,18,21,22. Оптимальные лечебные напряжения и формы волн уже давно исследуются. В большинстве коммерчески доступных технологий электропорации используются протоколы с монополярными ПСВ в диапазоне порядка 100 μс-10 мс²³. В то время как эти протоколы достигают клинически значимых результатов, они вызывают интенсивные мышечные сокращения in vivo 24,25,26. Из-за этого более короткие, биполярные микросекундные импульсы, которые облегчают эту стимуляцию, стали недавней темой интереса ^1,11,24. Однако эти импульсы вносят новые факторы, которые влияют на пороговые значения RE и IRE, включая симметрию импульсов, продолжительность всплеска и температурную зависимость 1,17,22,27. Кроме того, было показано, что тип клеток и свойства тканей значительно влияют как на исходы РЭ, так и на исходы ИРЭ 19,28,29. По мере того, как эта область продолжает развиваться, существует необходимость в дальнейшей характеристике того, как эти факторы и их взаимодействие друг с другом, а также другие возможные факторы окружающей среды влияют на пороговые значения RE и IRE, что делает все более необходимым повышение эффективности экспериментов для проведения экспериментов с более высокой производительностью.

Типичные эксперименты по электропорации in vitro проверяют протоколы обработки клеток в кювете параллельными проводящими пластинами, что приводит к равномерному распределению электрического поля внутри кюветы во время лечения 19,30,31,32,33,34. Как упоминалось выше, необходимо определить пороговые значения RE и/или IRE протокола для определения оптимального приложенного напряжения для данного лечения. Для того чтобы это было достигнуто в исследованиях кювет, необходимо обрабатывать несколько кювет, каждая из которых имеет дискретное приложенное напряжение. Для этого требуется значительное количество образцов, которые должны быть подготовлены, обработаны и проанализированы отдельно, что ограничивает производительность эксперимента. Для улучшения этого процесса были разработаны модели культур 2D^35,36 и 3D 13,20,27,37,38,39 для оценки континуума напряженности поля в одном образце с использованием электродов, создающих неравномерные распределения поля 13,20,27,37.^38,39. Пороговые значения RE и IRE затем выводятся из вычислительных моделей распределения электрического поля 13,20,27,37,38. Это значительно сокращает количество необходимых образцов, что позволяет использовать более высокопроизводительный подход к количественному определению пороговых значений.

Цель данной статьи — продемонстрировать этот подход к количественной оценке полей RE и IRE в 3D-модели in vitro , чтобы продемонстрировать его потенциал в качестве средства эффективной оценки протоколов электропорации в нескольких средах (например, типы клеток, параметры лечения, молекулы, которые должны быть доставлены).

Protocol

Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка клеток

1. В боксе биобезопасности планшет 1 × 10⁵ клеток/мл клеточной линии HEK293 в объеме 10 мл на культуру ткани Т75 колба в среде Eagle's Minimum Essential Medium с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина.
2. Инкубируйте клетки HEK293 во влажном инкубаторе при температуре 37 °C с содержанием_CO2 5%.
3. Заготавливают клетки для экспериментов через 2 дня после посева, удаляя питательные среды и обрабатывая клетки 4 мл 0,25% трипсина-ЭДТА.
4. Инкубируйте клетки и трипсин в течение 3-5 мин во влажном инкубаторе при температуре 37 °C с 5% содержанием_CO2 в среде или до тех пор, пока клетки не отделятся от поверхности культуры.
5. Инактивируйте ферментативную активность трипсина, добавив 4 мл питательной среды.
6. Гранулированные клетки центрифугируют в течение 5 мин при 180 × г и ресуспендируют в культуральной среде до конечной концентрации 8 × 10⁶ клеток/мл.

2. 3D создание модели ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте обратное пипетирование для этих шагов, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха в смесь.

1. В шкафу биобезопасности тщательно перемешайте приготовленную суспензию клеток 8 × 10⁶ клеток/мл с раствором бычьего коллагена I типа (3 мг/мл) в соотношении 1:1. Поместите на лед или в ванночку с холодными шариками, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию во время работы со смесью.
2. Пипеткой 500 мкл комбинированного раствора покрыть дно каждой лунки 12-луночным планшетом. Убедитесь, что гель равномерно покрывает дно, начав дозировать раствор в центре лунки, а затем осторожно двигаясь по спирали наружу.
3. Аккуратно покрутите пластину, чтобы края геля соприкасались со стенками лунки.
4. Инкубируйте гели во влажном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2 в течение 6 ч или до тех пор, пока гели не станут твердыми и не перестанут двигаться при наклоне планшета.
5. Наклоните луночный планшет и аккуратно добавьте 500 мкл питательной среды в каждую лунку, дав ей сползти вниз по стенке планшета не менее чем за 1 час до обработки. Гели должны быть обработаны в течение 48 часов после создания.

3. Изготовление электродов

1. Снимите пластиковое соединение Luer на двух иглах шприца из нержавеющей стали диаметром 1,64 мм 304 с тупым наконечником. Отложите одну иглу в сторону, чтобы она служила штифтовым электродом. Для другой иглы расплющите последние 5 мм одного конца.
2. Кольцевой электрод создается путем вырезания отрезка трубки из нержавеющей стали 316 диаметром 19 мм с внешним диаметром, длина которой достаточна для того, чтобы она располагалась заподлицо с нижней панелью лунки.
3. Спроектируйте держатель электрода, как показано на рисунке 1 , с помощью программного обеспечения CAD. Убедитесь, что в держателе есть центральное отверстие для штифтового электрода, канавка для кольцевого электрода и отверстие, которое пересекает канавку, чтобы можно было вставить сплющенную иглу для создания прессовой посадки, которая удерживает кольцевой электрод на месте.
   1. Кроме того, убедитесь, что держатель имеет кромку, спроектированную таким образом, чтобы плотно прилегать к 12-луночной пластине и центрировать кольцевые и штифтовые электроды в лунке таким образом, чтобы все электроды и лунка были коаксиальными³⁸.
4. Изготовьте держатель электрода из акрила с использованием проверенных технологий лазерной резки⁴⁰.
5. Соберите электрод, вставив кольцевой и штифтовый электроды в держатель электрода.
6. Закрепите кольцевой электрод путем запрессовки иглы с приплюснутым концом в держатель.

4. Обработка 3D модели ткани с помощью электропорации

1. В биобезопасном шкафу наклоните планшет и отасуньте 400 мкл питательных сред из каждой лунки. Следите за тем, чтобы не соприкасаться с гелем. В каждой аспирированной лунке следует оставлять 100 мкл среды для поддержания гидратации геля. Если жидкости для аспирации менее 400 мкл (пипетка не оставляет жидкости / втягивает воздух), добавьте 100 мкл питательной среды.
2. Добавьте 20 мкл 5 мкг/мкл плазмидного раствора GFP в эти аспирированные лунки (общий объем 120 мкл на лунку), наклонив планшет и добавив реагент в жидкость, которая накапливается у стенки каждой лунки. Аккуратно взболтайте, чтобы он равномерно распределился по поверхности геля.
3. Инкубируйте гели во влажном инкубаторе при температуре 37 °C и 5%_CO2 в течение 10 минут.
4. Вставьте волоконно-оптический датчик температуры в штифтовый электрод и начните считывать температуру.
5. Подсоедините положительный провод электропоратора к штифтовому электроду, а отрицательный — к игле, крепящей кольцевой электрод.
6. Включите конфорку и нагрейте гели так, чтобы они поддерживали температуру 37 °C.
7. Вставьте кольцевой электрод с волоконно-оптическим датчиком температуры в штифте в скважину. Убедитесь, что штифт расположен перпендикулярно пластине и что оба электрода полностью соприкасаются с гелем.
8. Убедитесь, что температура геля составляет 37 °C.
9. Проводите лечение электропорацией.
10. Добавьте 100 μл среды в любые гели, которые кажутся сухими.
11. Повторите шаги 4.7-4.10.
12. После завершения всех обработок инкубируйте гели во влажном инкубаторе при температуре 37 °C и 5%_CO2 в течение 10 минут.
13. Наклоните луночный планшет и аккуратно добавьте 500 μL питательной среды в каждую лунку, позволяя ей скользить вниз по стенке планшета.
14. Инкубируйте гели в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и 5%_CO2 в течение 24 часов.

5. Мойка и визуализация

1. Наклоните планшет и отсасывайте питательную среду из каждой лунки. Следите за тем, чтобы не соприкасаться с гелем.
2. Наклоните планшет и осторожно добавьте 500 μL фосфатно-солевого буфера (PBS) в каждую лунку, позволяя ему скользить вниз по стенке планшета.
3. Инкубировать гели во влажном инкубаторе при температуре 37 °C и 5%_CO2 в течение 5 минут.
4. Наклоните пластину и отсасывайте PBS из каждой лунки. Следите за тем, чтобы не соприкасаться с гелем.
5. Наклоните планшет и осторожно добавьте 500 μL фосфатно-солевого буфера (PBS) в каждую лунку, позволяя ему скользить вниз по стенке планшета.
6. Аккуратно поворачивайте пластину, наклоняйте ее и отсасывайте PBS из каждой лунки. Следите за тем, чтобы не соприкасаться с гелем.
7. Добавьте 100 мкл свежего PBS, чтобы гели оставались увлажненными для визуализации.
8. Рентгенографическая пластина с использованием стандартных методов флуоресцентной микроскопии. Это должно дать изображения гелей с отчетливой зеленой областью в форме тора, где обратимые и необратимые пороги электрического поля ограничивают внешний и внутренний края области соответственно.
9. Наклоните луночный планшет и аккуратно добавьте 500 μL питательной среды в каждую лунку, позволяя ей скользить вниз по стенке планшета.
10. Инкубируйте гели в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и 5%_CO2 в течение 24 часов.
11. Повторите шаги 5.1-5.10 для каждой временной точки.

6. Создание вычислительной модели

1. Откройте программное обеспечение для физического моделирования и создайте новую 2D-осесимметричную модель, которая использует физику электрических токов, теплопередачи в твердых телах и электромагнитного нагрева.
2. Создание параметров напряжения, температуры окружающей среды, температуры горячей пластины, заданного значения температуры, скорости подачи импульсов, интегрированной электрической дозы, а также размеров кольцевого и штифтового электродов, геля и луночной пластины экспериментальной установки.
3. Создайте доменную геометрию, представляющую радиальное поперечное сечение кольцевого и штифтового электродов, геля и луночной пластины экспериментальной установки, как показано на рисунке 2A.
4. Поместите точку зонда внутрь центрального электрода на половине высоты геля, чтобы представить волоконно-оптический температурный зонд, используемый во время экспериментов in vitro.
5. Создайте кусочную функцию, которая использует температуру в качестве входного аргумента.
6. Определите функцию таким образом, чтобы ее значение было равно 1, когда температура меньше заданного параметра температуры, определенного на шаге 6.2, и 0 в противном случае.
7. Примените граничное условие Voltage к самой верхней поверхности геометрии области, представляющей штифтовый электрод, и установите значение напряжения равным параметру напряжения, определенному на шаге 6.2, умноженному на кусочную функцию из шага 6.6, рассчитанную при температуре точки пробника, созданной на шаге 6.4.
8. Примените граничное условие Земля (Ground) к самой верхней поверхности геометрии области, представляющей кольцевой электрод.
9. Примените граничное условие Electrical Insulation (Электрическая изоляция) ко всем оставшимся границам области.
10. Создайте непрерывную функцию, использующую температуру.
11. Определите эту функцию с помощью установленной модели²⁷ температурно-зависимой проводимости коллагенового геля как 0,8277 + 0,0323*Тл.
12. Определите пользовательский материал и установите электропроводность на непрерывную функцию, определенную на шаге 6.11. Нанесите этот материал на гелевую область.
13. Определите материалы или используйте значения по умолчанию в программном обеспечении, если они доступны, чтобы назначить материалы из нержавеющей стали 304 и 316 областям штифтового и кольцевого электродов соответственно, а полистирол — областям пластин лунок.
14. Примените граничное условие Temperature к основанию модели и установите значение температуры на 37 °C.
15. Примените граничное условие Surface Ambient Radiation (Поверхностное излучение окружающей среды) ко всем остальным краям домена, которые не взаимодействуют с другим доменом, и установите коэффициент излучения 0,97, 0,9 и 0,075 в зависимости от того, был ли домен частью пластины, геля или электрода соответственно²⁷.
16. Добавьте свободную треугольную сетку к модели. Установите размер элемента на Finer.
17. При оценке различных уровней параметров создайте параметрический анализ, в котором будут перечислены все значения, при которых должен быть оценен параметр.
18. Запустите моделирование, нажав кнопку «Вычислить ».
19. По завершении создайте 2D-график электрического поля в разделе «Результаты».
20. Определите линию разреза, которая должна пройти от штифтового электрода к кольцевому электроду через середину гелевого домена. Это должно привести к экспоненциальному спаду от края штифтового электрода к краю кольцевого электрода.
21. Экспортируйте данные графика в виде файла .csv или .xlsx для создания таблицы подстановки.

7. Производные пороговых значений

1. С помощью программного обеспечения микроскопа измерьте диаметр наружных и внутренних краев торообразной области по вертикальной и горизонтальной осям. Если программное обеспечение не имеет такой возможности, используйте для этого ImageJ.
2. Усредните внешний и внутренний диаметры соответственно и разделите на два, чтобы рассчитать внешний и внутренний радиусы торообразной области. Внешний радиус обозначает порог RE. Внутренний радиус обозначает порог IRE.
3. Используя таблицу поиска, созданную на шаге 6.21, вычислите напряженность электрического поля по измеренным радиусам.

Results

Кольцевой и штифтовый электрод успешно доставил ДНК-плазмиду, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP), в 3D-коллагеновую ткань, имитирующую клетки HEK293. Успешная количественная оценка порога RE была достигнута путем измерения внешнего радиуса трансфицированной области и получения соответствующей напряженности поля из вычислительной модели экспериментальной установки, как показано на рисунке 2. Порог IRE был аналогичным образом количественно определен ...

Discussion

С помощью этого метода можно определить обратимые и необратимые пороги электропорации без необходимости тестирования нескольких образцов при дискретных напряжениях. Использование неоднородного электрического поля позволяет проводить количественную оценку на основе пространственного распределения трансфицированных клеток в модели. Однако существуют ограничения, связанные с этим неравномерным распределением. Прежде всего, описанные здесь пороговые значения RE и IRE являются пороговыми знач...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% трипсин-ЭДТА	Gibco	25200056
Наконечники для дозатора 1000 мкл	Научный центр Фишера	13-811-164
Коническая трубка 15 мл	Научный центр Фишера	14-959-70С
Наконечники для пипеток 200 мкл	Научный центр Фишера	13-811-139
304 иглы из нержавеющей стали с тупым наконечником	Макмастер Карр	75165А753
316 Трубки из нержавеющей стали	Макмастер Карр	89785К319
Акриловый	Макмастер Карр	8505К754
Шкаф биобезопасности	Научный центр Фишера	13-261-312
Программное обеспечение САПР	Дассо Системс	SolidWorks
Центрифуга	Нуайре	NU-C200R
Электропоратор	Хбио	45-0662	В этом исследовании использовалось специально созданное устройство и система BTX ECM 830
ЭМЕМ	Научный центр Фишера	MT10009CV	Это может быть по-разному  при использовании клеточной линии, отличной от HEK293
Falcon 12-луночный прозрачный планшет для культивирования клеток с плоским дном, обработанный TC, с крышкой	Корнинг	353043	Можно использовать любую 12-луночную пластину, просто убедитесь, что размеры лунки учтены при изготовлении держателя электрода.
ФБС	Научный центр Фишера	A5670701
Волоконно-оптический датчик температуры	Микронор Инк.	ТС5-20ММ-02
GFP-Плазмида	Альдеверон	gWiz-GFP
Элементы HEK293	АТКС	ЦРЛ-1573	Можно использовать и другие клеточные линии, просто убедитесь, что используется правильная питательная среда
Конфорка	Корпорация «Термоэлектрическое охлаждение Америка»	АХП-301КПВ
Ледяная или охлаждаемая ванна с шариками	Научный центр Фишера	10-876-001
Программное обеспечение для анализа изображений	Лейка	ЛАС Х
Инкубатор	Научный центр Фишера	15-015-2633
Инвертированный флуоресцентный микроскоп	Лейка	ДМи8
Лазерный резак	Макмастер Карр	7344Н11
Пенициллин-стрептомицин	Научный центр Фишера	15140122
Набор для пипеток	Научный центр Фишера	14-388-100
Программное обеспечение для моделирования	КОМСОЛЬ	COMSOL Multiphysics 6.2
Фляга T75	Научный центр Фишера	156499
Раствор бычьего коллагена I типа	Усовершенствованная биоматрица	5005	3 мг/мл