Высокопроизводительная трехмерная модель ткани для количественной оценки пороговых значений электропорации

Краткое содержание

Этот протокол использует вычислительное моделирование для количественной оценки обратимых и необратимых порогов электропорации с использованием пространственного распределения трансфицированных клеток в трехмерной имитации ткани для высокопроизводительного анализа протоколов электропорации.

Аннотация

Электропорация — это многообещающая технология, использующая электрические импульсы для доставки макромолекул и абляции мягких тканей, которая включает в себя профилактику нового поколения и лечение генетических заболеваний, таких как рак. В этом исследовании демонстрируется высокопроизводительная 3D-модель тканевой культуры для количественной оценки обратимых и необратимых порогов электропорации для данного протокола электропорации. Используя неоднородное электрическое поле и анализируя пространственное распределение трансфицированных клеток, можно идентифицировать как обратимые, так и необратимые пороги в пределах одного образца, что повышает эффективность характеристики протоколов электропорации, особенно для трансляции in vivo . Чтобы продемонстрировать эту способность, 3D-имитацию ткани, содержащую клетки HEK293, трансфицировали с помощью кольца и штифтового электрода для доставки плазмиды, кодирующей GFP. Затем на основе флуоресцентных микроскопических изображений трансфицированных образцов были получены пороги электропорации. Эта модель демонстрирует потенциал использования в качестве средства для оценки протоколов электропорации с высокой пропускной способностью, что является ключевым преимуществом по сравнению с существующими методами оценки этих пороговых значений, которые, как правило, требуют много времени и менее репрезентативны для условий in vivo .

Введение

Обратимая электропорация (РЭ) является хорошо зарекомендовавшей себя методологией доставки различных обычно непроницаемых для мембран соединений и молекул в клетки ^1,2,3. Здесь импульсные электрические поля (ПСВ) используются для достижения критической напряженности электрического поля, которое индуцирует переходные, локализованные нанопоры вдоль участков клеточной мембраны. РЖ используется для доставки различных молекул и соединений, начиная от красителей и нуклеиновых кислот и заканчивая химиотерапевтическими препаратами и другими лекарстве....

Протокол

Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка клеток

1. В боксе биобезопасности планшет 1 × 10⁵ клеток/мл клеточной линии HEK293 в объеме 10 мл на культуру ткани Т75 колба в среде Eagle's Minimum Essential Medium с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина.
2. Инкубируйте клетки HEK293 во влажном инкубаторе при температуре 37 °C с содержанием_CO2 5%.
3. Заготавливают клетки для экспериментов через 2 дня после посева, удаляя питате....

Результаты

Кольцевой и штифтовый электрод успешно доставил ДНК-плазмиду, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP), в 3D-коллагеновую ткань, имитирующую клетки HEK293. Успешная количественная оценка порога RE была достигнута путем измерения внешнего радиуса трансфицированной области и получения соответствующей напряженности поля из вычислительной модели экспериментальной установки, как показано на рисунке 2. Порог IRE был аналогичным образом количественно определен .......

Обсуждение

С помощью этого метода можно определить обратимые и необратимые пороги электропорации без необходимости тестирования нескольких образцов при дискретных напряжениях. Использование неоднородного электрического поля позволяет проводить количественную оценку на основе пространственного распределения трансфицированных клеток в модели. Однако существуют ограничения, связанные с этим неравномерным распределением. Прежде всего, описанные здесь пороговые значения RE и IRE являются пороговыми знач.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,25% трипсин-ЭДТА	Gibco	25200056
Наконечники для дозатора 1000 мкл	Научный центр Фишера	13-811-164
Коническая трубка 15 мл	Научный центр Фишера	14-959-70С
Наконечники для пипеток 200 мкл	Научный центр Фишера	13-811-139
304 иглы из нержавеющей стали с тупым наконечником	Макмастер Карр	75165А753
316 Трубки из нержавеющей стали	Макмастер Карр	89785К319
Акриловый	Макмастер Карр	8505К754
Шкаф биобезопасности	Научный центр Фишера	13-261-312
Программное обеспечение САПР	Дассо Системс	SolidWorks
Центрифуга	Нуайре	NU-C200R
Электропоратор	Хбио	45-0662	В этом исследовании использовалось специально созданное устройство и система BTX ECM 830
ЭМЕМ	Научный центр Фишера	MT10009CV	Это может быть по-разному  при использовании клеточной линии, отличной от HEK293
Falcon 12-луночный прозрачный планшет для культивирования клеток с плоским дном, обработанный TC, с крышкой	Корнинг	353043	Можно использовать любую 12-луночную пластину, просто убедитесь, что размеры лунки учтены при изготовлении держателя электрода.
ФБС	Научный центр Фишера	A5670701
Волоконно-оптический датчик температуры	Микронор Инк.	ТС5-20ММ-02
GFP-Плазмида	Альдеверон	gWiz-GFP
Элементы HEK293	АТКС	ЦРЛ-1573	Можно использовать и другие клеточные линии, просто убедитесь, что используется правильная питательная среда
Конфорка	Корпорация «Термоэлектрическое охлаждение Америка»	АХП-301КПВ
Ледяная или охлаждаемая ванна с шариками	Научный центр Фишера	10-876-001
Программное обеспечение для анализа изображений	Лейка	ЛАС Х
Инкубатор	Научный центр Фишера	15-015-2633
Инвертированный флуоресцентный микроскоп	Лейка	ДМи8
Лазерный резак	Макмастер Карр	7344Н11
Пенициллин-стрептомицин	Научный центр Фишера	15140122
Набор для пипеток	Научный центр Фишера	14-388-100
Программное обеспечение для моделирования	КОМСОЛЬ	COMSOL Multiphysics 6.2
Фляга T75	Научный центр Фишера	156499
Раствор бычьего коллагена I типа	Усовершенствованная биоматрица	5005	3 мг/мл